WO2020122646A1 - 생리활성 물질이 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법 - Google Patents

생리활성 물질이 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2020122646A1
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resveratrol
luteolin
microorganism
curcumin
forskolin
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PCT/KR2019/017616
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정대균
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경희대학교 산학협력단
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a microbial agent in which a bioactive substance is accumulated in a cell and a method for manufacturing the same, specifically, one or more physiological activities selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, pandureatin A, and forskolin It relates to a microbial agent having a substance accumulated in cells and a method for manufacturing the same.
  • Lactobacillus is one of the most beneficial microorganisms available to humans, and refers to bacteria that produce lactic acid by decomposing carbohydrates such as glucose or lactose during fermentation.
  • the identity of lactic acid bacteria was discovered by French microbiologist Louis Pasteur, and Russian immunologist Ilya Mechinikov advocated "Fertilization by fermented milk” in the later years after receiving the Nobel Prize for Physiology of Medicine in 1908.
  • a full-scale study has started since claiming that it is in, so far, about 300 lactic acid bacteria have been found.
  • Lactic acid bacteria live in the intestines of most mammals, including humans. In particular, in the intestine of the human body, there are more than 100 trillion bacteria in 100 species, including beneficial and harmful bacteria. It is known to act as a bacterium that inhibits the growth of harmful bacteria and reduces the production of ammonia or carcinogens due to abnormal fermentation, as it induces acidification of the intestine by making lactic acid as a metabolite.
  • the physiological activity of lactic acid bacteria mainly suppresses the proliferation of harmful bacteria in the intestine by producing organic acids and lowers the pH in the intestine, maintains normal intestinal flora, and produces ⁇ -glucosidase to produce useful glycosides for the human body It is known to have a function of converting to a non-glycoside that is easily absorbed.
  • Resveratrol is a secondary metabolite contained in crops and plants, and is known to have antioxidant, anti-cancer, cardiovascular, and diabetes effects. In particular, naturally occurring molecules found in grapes and red wines have been studied in major fields in recent years. According to a recent study, it is known that resveratrol is effective for breast cancer, prostate cancer, and lung cancer.
  • Curcumin is a diarylheptanoid compound contained in turmeric and is a curcuminoid family, and is a type of alkaloid. As a yellow pigment component, it is contained in large amounts in plant roots such as turmeric and turmeric, and is widely used as a pigment or food additive. Curcumin has anti-cancer activity against various types of cancer such as ovarian cancer, pancreatic cancer, colon cancer, blood cholesterol reduction, anti-inflammatory, fat cell differentiation suppression, and hepatoprotective activity. Recently, curcumin has been known for its antioxidant effects, such as diabetes, obesity, It was further confirmed that it can have various effects such as dementia.
  • Luteolin is a flavones compound contained in peanut shells, parsley, rosemary, celery, thyme, and carrots. Luteolin's known physiological activities include respiratory diseases, nervous system diseases, immune system regulation, antioxidant, memory loss, and anticancer effects on pancreatic cancer and skin cancer.
  • Panduratin-A is a chalcone (Chalcone)-based compound contained in the fingerroot contained in the fingerroot (fingerroot).
  • Fingerroot is a scientific name Boesenbergia pandurata, and it is a typical medicinal plant native to Indonesia and is used in the treatment of diseases such as muscle pain, cold, arthritis, tooth decay and gastrointestinal disorders. In addition, according to various studies recently, it is effective in reducing body fat, and thus is widely used as a raw material for diet.
  • the main component of fingerroot, Panuratin-A is known to have various effects such as anti-cariogenic, anti-inflammatory, anti-cancer, anti-proliferative, proapoptotic, and antioxidant.
  • Forskolin is a labdane diterpene-based compound contained in the roots of Coleus forskoli.
  • Coleus forskoli is a plant native to India and is a medicinal plant from Aurvedic, a traditional Indian medicine. Has been used as Coleus forskoli has been known to have various effects, such as heart disease, skin disease, and respiratory distress.
  • physiological activity of forskolin a representative component of coleus forskoli, reduces body fat and creates muscle.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the bioavailability can be increased by using the microorganisms or crushed products of the bioactive substances accumulated in the body as a raw material using microorganisms.
  • a microbial agent comprising a microorganism or a fragment thereof having accumulated bioactive substances.
  • Another object of the present invention provides a method for producing a microbial agent in which bioactive substances are accumulated.
  • Another object of the present invention provides a composition comprising the microbial agent prepared above.
  • the present invention is a resveratrol (Resveratrol), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin A (Panduratin-A) and forskolin (forskolin) selected from the group consisting of microorganisms or accumulated bioactive substances or Provided is a microbial agent comprising a crushed product thereof.
  • the present invention a) resveratrol (Resveratrol), microbial culture medium, curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin A (Panduratin-A) and one or more selected from the group consisting of forskolin (forskolin) A primary culture step of culturing microorganisms by adding a bioactive material; And b) recovering the microorganism cultured in step a), selected from the group consisting of Resveratrol, Curcumin, Luteolin, Panduratin-A and Forskolin.
  • a second culture step of further culturing in a medium containing at least one bioactive substance Including, Resveratrol (Resveratrol), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin A (Panduratin-A) and forskolin (forskolin) selected from the group consisting of microorganisms accumulated It provides a method of cultivation.
  • the present invention provides a composition comprising the microbial agent.
  • the microbial preparation according to the present invention is selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A and forskolin in the natural state without genetic manipulation of microorganisms. After accumulating at least one physiologically active substance in a microorganism, it can be delivered and released into the body, and can be used stably and efficiently by improving the low bioavailability of the existing bioactive substance.
  • Figure 1 shows the mechanism of drug absorption of the microbial agent according to the present invention.
  • Figure 2 shows the resveratrol content by culture conditions (conditions 1 to 6) of Streptococcus thermophilus according to the present invention.
  • Figure 3 shows the content of curcumin contained in Lactobacillus plantarum according to the present invention.
  • Figure 4 shows the curcumin content by culture conditions (conditions 1 to 6) of Lactobacillus plantarum according to the present invention.
  • Figure 5 shows the content of luteolin contained in Lactobacillus plantarum according to the present invention.
  • Figure 6 shows the bioavailability of PM-Luteolin according to the present invention.
  • Figure 7 shows the content of pandulatin A accumulated in Lactobacillus plantarum K8 according to the present invention.
  • Figure 8 shows the bioavailability according to the probiotics-microcarrier (PM) method according to the present invention.
  • the present invention relates to a microbial agent in which bioactive substances are accumulated in cells and a method for manufacturing the same.
  • the microbial preparation according to the present invention provides a microbial preparation capable of solving the disadvantages (low solubility, low stability, toxicity, poor cell membrane permeability, etc.) of existing drugs.
  • the microorganism used in the preparation according to the present invention utilizes a property that absorbs the bioactive substance contained in the microbial culture medium into the body and accumulates it in cells, and then acts as a delivery carrier. Due to this effect, not only the efficacy of the microorganism itself, but also the efficacy of the bioactive substance as a functional component, and the bioavailability of the bioactive substance (Bio availability) can be increased.
  • the microbial preparation of the present invention means that the bioactive substance, which is an active ingredient, includes microorganisms that are absorbed into the body of the microorganism and can be formulated in an accumulated form.
  • a microbial agent that includes a microorganism in which resveratrol is accumulated or a fragment thereof.
  • a microbial agent comprising a microorganism in which curcumin is accumulated or a fragment thereof is disclosed.
  • a microbial agent that includes a microorganism in which luteolin is accumulated or a fragment thereof.
  • a microbial agent comprising a microorganism in which panduratin-A is accumulated or a fragment thereof is disclosed.
  • a microbial agent comprising a microorganism in which forskolin is accumulated or a fragment thereof is disclosed.
  • microbial preparation of the present invention is a preparation containing microorganisms containing the lactic acid bacteria mentioned in the present invention, pharmaceutical composition, health food composition, food composition, food additive, beverage, cosmetic, external preparation for skin, animal feed, It is a concept that includes all formulations that can be used for fertilizers for plants.
  • the microbial preparation of the present invention the microorganism and the active ingredient are not individually mixed, and when the microorganism is cultured, the culture medium (or medium) contains the active ingredient in a certain concentration or more to prepare the active ingredient to accumulate in the body of the microorganism. It is characterized by.
  • the microorganism is not limited to the type, but may be included without limitation as long as it belongs to the classification of lactic acid bacteria, preferably Lactobacillus sp., Streptococcus sp.), Bifidobacteria sp. , Lactococcus sp. , Leuconostocs sp. , Yeast or Aspergilli sp. More preferably, it may be Lactobacillus plantarum .
  • the Lactobacillus plantarum may be Lactobacillus plantarum K8 strain isolated from kimchi, and preferably deposited by the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC: Korean Collection for Type Cultures) It may be a Lactobacillus plantarum K8 strain that has been assigned an accession number of KTCT 10887BP. When using the new strain, it may be the best bioaccumulation amount and bioavailability of the microbial agent according to the present invention compared to other strains.
  • KCTC Korean Collection for Type Cultures
  • microorganisms used in the microbial preparations according to the present invention are used in the form of live bacteria, and after the drug is accumulated in the microorganisms, they are delivered to the large intestine and absorbed by macrophages (resident macrophages) present in the mucosal layer (laminar limba mucosae) and Through phagocytosis, it has a characteristic that the drug is released into the body.
  • uptake of drugs by microorganisms may be caused by active transport, carrier-mediated transport, and diffusion.
  • the microbial agent when administered orally, the microbial agent is delivered to the blood by macrophages or dendritic cells in the colon due to phagocytosis or lysis, or after the microbial agent is absorbed by the colonic epithelial cells.
  • microorganisms are lysed and pharmacologically active substances can be absorbed into the body by diffusion (probiotic carrier and active transport).
  • the microbial agent according to the present invention is absorbed by macrophages (uptake) and passes through the intestinal cell membrane, resulting in poor cell membrane permeability. It can increase (active transport efficacy), after which the microbes are destroyed by the phagocytosis of macrophages, and the drug exerts the effect of being released into the body.
  • Resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A or forskolin which are pharmacologically active substances absorbed by the microorganisms used in the present invention, are bioactives of microorganisms. However, it is accumulated in the cell without being used for energy metabolism, and the active substance is stably preserved in the body of the cell until the microorganism is destroyed by various methods (physical crushing and phagocytosis). The amount of bioactive substances absorbed by microorganisms is in the order of tens of micrograms to several milligrams, which is significantly lower than the hundreds of milligrams of drugs normally consumed.
  • the drug's efficacy is sufficient for hundreds of micrograms to several milligrams of the drug, so the drug using the microbial agent of the present invention, Resveratrol, curcumin ( Intra-body delivery of curcumin, luteolin, panduratin-A, or forskolin can reduce unwanted side effects and toxicity by preventing excessive drug abuse.
  • resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A and forskolin are selected from the group consisting of resveratrol, curcumin in nature without genetic manipulation of microorganisms. After accumulating one or more physiologically active substances in microorganisms, they can be released from the body and can be used stably and efficiently by improving the low bioavailability of the existing bioactive substances.
  • resveratrol (Resveratrol), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin A (Panduratin-A) and forskolin (forskolin) are selected from the group consisting of 1
  • a microbial agent comprising a microorganism or a fragment thereof having accumulated more than one bioactive substance.
  • the microbial agent contains one or more bioactive substances selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A, and forskolin. It can be provided as a probiotic-microcarrier (PM), a microbial preparation, and by preventing lactic acid bacteria from acting as carriers, it can prevent the destruction of bioactive substances by stomach acid and safely deliver them into the intestine.
  • PM probiotic-microcarrier
  • the present invention one or more selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, luteolin, panduratin-A and forskolin in lactic acid bacteria by probiotics-microcarriers
  • the bioavailability increases as the bioactive substance is actively transported to the lamina intestinal or lymph node by the macrophages (tissue resident macro phage) present in the intestinal cells and discharged into blood vessels.
  • the microbial agent has a feature that bioactive substances accumulated in the microorganism can be released into the body through absorption and phagocytosis by macrophages present in the intestinal cells.
  • the microorganisms used in the present invention are lactic acid bacteria, Lactobacillus sp. , Streptococcus sp. , Bifidobacteria sp. , Lactococcus sp. , Leuconostocs sp. ), Yeast or Aspergilli sp. It may be a lactic acid bacteria belonging to the genus, more preferably Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum) . In one embodiment of the present invention, Lactobacillus plantarum was used, and cultured in a medium containing physiologically active substances during cultivation, and the strain cultured in this manner was named Lactobacillus plantarum K8.
  • the Lactobacillus plantarum may be Lactobacillus plantarum K8 strain isolated from kimchi, and preferably deposited by the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC: Korean Collection for Type Cultures) It may be a Lactobacillus plantarum K8 strain that has been assigned an accession number of KTCT 10887BP. When using the new strain, it may be the best bioaccumulation amount and bioavailability of the microbial agent according to the present invention compared to other strains.
  • KCTC Korean Collection for Type Cultures
  • the resveratrol may use extracts or fractions of one or more plants selected from the group consisting of grapes, audi, peanuts, and mulberry leaves, or may use resveratrol compounds isolated therefrom.
  • the curcumin may be an extract of one or more plants selected from the group consisting of turmeric and turmeric or a fraction thereof, or a curcumin compound separated therefrom.
  • the luteolin may be an extract of one or more plants selected from the group consisting of peanut shell, parsley, rosemary, celery, thyme and carrot, or a fraction thereof, or a luteolin compound isolated therefrom may be used. .
  • the pandulatin A may use an extract of (Fingerroot, Boesenbergia pandurata ) or a fraction thereof, or a pandulatin A compound isolated therefrom.
  • the forskolin may be, but is not limited to, a choleus forskolii extract or a fraction thereof, or a forskolin compound isolated therefrom.
  • each compound resveratrol, curcumin, luteolin, pandulatin A, or forskolin
  • extraction method or fractionation method generally known in the art, without limitation such as cold immersion, heat extraction, ultrasonic extraction, and pressure extraction.
  • polar solvents such as water, methanol, ethanol, propanol or butanol, alcohol, acetic acid, DMF (dimethylformamide) or (v) DMSO (dimethyl sulfoxide), or acetone, acetonitrile, ethyl acetate , Methyl acetate, fluoroalkane, pentane, hexane, 2,2,4-trimethylpentane, decane, cyclohexane, cyclopentane, diisobutylene, 1-pentene, 1-chlorobutane, 1-chloropentane, o- Xylene, diisopropyl ether, 2-chloropropane, toluene, 1-chloropropane, chlorobenzene, benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, chloroform, dichloromethane,
  • the microorganism cultured in the present invention has a resveratrol accumulation in the body of 0.01 to 2.0 mg/mg, preferably 0.1 to 2.0 mg/mg, more preferably 0.5 to 1.5 mg/mg, and a resveratrol-containing microorganism preparation It is suitable as.
  • the microorganisms cultured in the present invention have curcumin accumulated in the body in an amount of 0.01 to 1.0 mg/mg, preferably 0.1 to 1.0 mg/mg, and more preferably 0.5 to 1.0 mg/mg, in which curcumin is accumulated. It is suitable as a microbial agent.
  • luteolin accumulates when luteolin accumulates in the body in an amount of 0.01 to 10.00 mg/mg, preferably 5.0 to 10.0 mg/mg, and more preferably 8.0 to 10.0 mg/mg. It is suitable as a microbial agent.
  • the microorganisms cultured in the present invention have pandulatin A having a body accumulation of 0.01 to 1.0 mg/mg, more preferably 0.01 to 1.0 mg/mg, or a total content of 0.1 to 1.0 mg, It is suitable as an accumulated microbial agent.
  • the microorganisms cultured in the present invention have forskolin when the accumulated content of forskolin in the body is 0.01 to 10.00 mg/mg, preferably 0.1 to 1.0 mg/mg, more preferably 0.1 to 0.2 mg/mg, forskolin It is suitable as an accumulated microbial agent.
  • the lysate used herein refers to a cell lysate obtained by crushing the microorganism by a chemical method or a physical method of treating the microorganism with detergent, for example, bead mills, presses of microorganisms , Using a sonicator (Sonicator) or a microfluidizer (Microfluidizer) can be obtained crushed.
  • a sonicator Sonicator
  • a microfluidizer Microfluidizer
  • the present invention is selected from the group consisting of a) resveratrol (Curcumin), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin-A (Panduratin-A) and forskolin (forskolin) in a microorganism culture medium in one embodiment.
  • step b) recovering the microorganism cultured in step a), selected from the group consisting of Resveratrol, Curcumin, Luteolin, Panduratin-A and Forskolin A second culture step of further culturing in a medium containing one or more bioactive substances;
  • Resveratrol Resveratrol
  • curcumin Curcumin
  • luteolin luteolin
  • panduratin A Panduratin-A
  • forskolin forskolin
  • the microorganism is at least one bioactive selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A, and forskolin. Cultivated in a medium containing a substance to accumulate the physiologically active ingredient in the microorganism, specifically, the microorganism is Resveratrol, Curcumin, Luteolin, Panduratin A, and And culturing in a medium containing at least one bioactive substance selected from the group consisting of forskolin or reacting with the bioactive substance-containing reactant to accumulate the bioactive substance in the microorganism.
  • the culture is a step of first culturing the microorganism for the activation of the microorganism, and the cultured microorganism is resveratrol, curcumin, luteolin, luteolin, panduratin-A, and forskolin.
  • It may include the step of secondary culturing in a medium containing one or more physiologically active substances selected from the group consisting of, specifically, microorganisms resveratrol (Resveratrol), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), pandu
  • a medium containing one or more physiologically active substances selected from the group consisting of, specifically, microorganisms resveratrol (Resveratrol), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), pandu
  • the cultured cells are resveratrol, curcumin ( Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin A (Panduratin-A) and forskolin (forskolin) selected from the group consisting of one or more physiologically active substances can be transferred to the MRS medium for secondary culture.
  • the MRS medium of the primary culture includes at least one bioactive selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A, and forskolin. It is preferred to add substances.
  • the cultured cells can be used directly after washing or by crushing cells using a microfluidizer. In addition, the cultured cells can be used in the form of crushed powder by freeze-drying.
  • the method for preparing a microbial preparation comprises one or more bioactive substances selected from the group consisting of resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A, and forskolin. Since the composition that accumulates in microorganisms is identically included, the above description applies equally to a method of manufacturing a microbial agent.
  • the medium used for cultivation a known medium used for culturing microorganisms can be used, and any medium can be selected depending on the type of microorganism.
  • M9 minimal medium Luria-Bertani (LB) medium, deMan Rogosa Sharpe (MRS) solid or broth medium, APT (All Purpose with Tween) medium, BHI (Brain Heart Infusion) medium or YPD (yeast extract-peptone) Dextrose
  • a solid or liquid medium can be used alone or in combination.
  • the medium may be used as a primary or secondary medium when culturing the microorganism of the present invention, and the secondary medium is characterized in that forskolin is further included.
  • Resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin-A and forskolin contained in the medium are limited to one or more bioactive substances selected from the group consisting of It may be, but may be included in a concentration of 0.01 to 20 g/L, more preferably, it may be included in a concentration of 0.01 to 10 g/L, the concentration is skilled in the art depending on the type of microorganism to be cultured and the composition of the culture medium. It can be appropriately adjusted according to the skill level of.
  • the microorganism may be that the bioactive substance contained in the medium is absorbed by macrophages present in intestinal cells or released into the body through phagocytosis.
  • composition comprising a microbial agent
  • the present invention in one embodiment resveratrol (Resveratrol), curcumin (Curcumin), luteolin (luteolin), panduratin A (Panduratin-A) and one or more physiological activity selected from the group consisting of forskolin (forskolin)
  • a composition comprising a microbial agent comprising a microbial substance or a crushed material accumulated therein.
  • compositions according to the present invention can be used as a composition containing the microbial agent.
  • the composition according to the present invention may be, for example, a pharmaceutical composition comprising the microbial agent, a health food composition, a food composition, a food additive, a beverage, a cosmetic, or a feed composition for animals, particularly as an oral intake preparation.
  • a pharmaceutical composition comprising the microbial agent, a health food composition, a food composition, a food additive, a beverage, a cosmetic, or a feed composition for animals, particularly as an oral intake preparation.
  • composition according to the present invention may be prepared for oral administration, and may be prepared in a solid or liquid form, a gel form. That is, the composition is usually mixed with a carrier and a fragrance to be used for tablets, tablets, troches, capsules, elixirs, syrups, powders, suspensions ( suspension) or granules, and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the microbial preparation, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose And it can be prepared by mixing gelatin, etc.
  • liquid preparations for oral administration include suspensions, intravenous solutions, emulsions and syrups, etc.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose
  • liquid preparations for oral administration include suspensions, intravenous solutions, emulsions and syrups, etc.
  • water, liquid paraffin various excipients, For example, wetting agents, sweetening agents, fragrances and preservatives may be included.
  • the dosage can be appropriately selected according to the absorption rate, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, the age, sex, and condition of the recipient. Preferably, it can be administered at an effective dose of 10 mg to 1,000 mg per day, and the optimal number of bacteria in the composition may be 10 8 to 10 12 CFU/day.
  • strains used in Examples and Experimental Examples of the present invention were used to receive Lactobacillus plantarum K8 isolated from Korean traditional fermented food kimchi.
  • the strain was isolated from the Korean traditional fermented food kimchi, and the isolated cells were identified and identified by 16S rRNA sequencing and biochemical tests, and were named Lactobacillus plantarum K8. As a result, it has been deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC: Korean Collection for Type Cultures) and has been assigned a number of KTCT 10887BP.
  • KCTC Korean Collection for Type Cultures
  • Lactobacillus plantarum K8 strain was stored in a stock state in an ultra-low temperature freezer, and was thawed at room temperature in the following Examples and Experimental Examples.
  • Lactobacillus plantarum K8 (OD 1.0) stored in a stock state in the cryogenic freezer of Preparation Example 1 at room temperature, inoculate into broth containing resveratrol, curcumin, luteolin, pandulatin A, and forskolin, respectively. Incubated at 36.5° C. for 5-20 hours.
  • the cultured Lactobacillus plantarum K8 was inoculated into MRS broth containing resveratrol, curcumin, luteolin, panduratin A, and forskolin, respectively, and cultured secondaryly.
  • the cultured cells were subjected to a pre-treatment process for analysis, and then quantitatively analyzed for accumulated matter through LC/MS-MS.
  • lactic acid bacteria washing solution washing 1-3 After lactic acid bacteria culture solution, lactic acid bacteria washing solution washing 1-3, lactic acid bacteria lysate, or resveratrol used in the experiment was fractionated using EtOAC and BuOH, the fractions were concentrated under reduced pressure to obtain fractions, and analysis was performed on the BuOH fraction containing resveratrol. Did. Each resveratrol was dissolved in MeOH and prepared and analyzed at a concentration of 100 ppm. Resveratrol, washing 1-3, lactic acid bacteria culture solution, lactic acid bacteria crushed BuOH fraction was prepared and analyzed at 2000 ppm concentration.
  • Time(min.) B% One 0 5 2 5 15 3 10 30 4 15 60 5 20 100 6 25 100 7 27 5 8 35 5
  • Lactobacillus lysate that absorbed resveratrol was analyzed by LC-MS/MS. At this time, experiments were conducted under six conditions according to the concentration of resveratrol contained in the medium. As a result of analyzing resveratrol, it was confirmed that the content of resveratrol in the cultured microorganism was changed according to the culture conditions.
  • S. thermophillus instead of Lactobacillus plantarum of Example 1 was used. Cells were accumulated. S. thermophillus (OD 1.0) stored in a stock state in a cryogenic freezer was melted at room temperature, inoculated into a broth containing lasveratrol, and cultured at 36.5°C. The entire cultured S. thermophillus was inoculated into MRS broth to which resveratrol was added and cultured secondary.
  • the Streptococcus thermophilus lysate that absorbed resveratrol was analyzed using LC-MS/MS in the same manner as in Experimental Examples 1-1 and 1-2.
  • experiments were conducted under six conditions according to the concentration of resveratrol contained in the medium, and the resveratrol content in the cultured microorganisms was confirmed as shown in FIG. 2. That is, as a result of analyzing resveratrol, it was confirmed that the content of resveratrol in the microorganism was changed according to the culture conditions.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae was added to broth containing rasveratrol. After inoculation and primary culture, the cultured yeast was further cultured by inoculating the secondary culture medium containing resveratrol. After incubation, this was centrifuged and washed to obtain yeast pellets.
  • the washed Saccharomyces cerevisiae was crushed three times using a microfluidizer, and the non-glycoside resveratrol compound was analyzed through LC/MS-MS. As a result, non-glycosylated resveratrol was detected in the bacterial lysate.
  • the amount of non-glycoside in Saccharomyces cerevisiae before crushing was about 45 mg, and when it was crushed, 1,222 mg of non-glycoside resveratrol was detected.
  • Bifidobacterium (Bifidobacterium) was inoculated into a broth containing rasveratrol, followed by primary incubation, followed by secondary incubation in resveratrol containing medium in the same manner as Experimental Examples 1-2 to 1-4. After incubation, in order to separate the Bifidobacterium, the process of centrifugation and washing was repeated two or more times and the supernatant was removed to obtain a Bifidobacterium pellet.
  • the washed Bifidobacterium was crushed using a microfluidizer, and the non-glycoside resveratrol compound was analyzed through LC/MS-MS. As a result, non-glycosylated resveratrol was detected in the bacterial lysate. This means that even in the case of Bifidobacterium, it means that the pharmacologically active substance can be absorbed and contained in cells, and the microorganisms that can be used in this development are not limited to lactic acid bacteria.
  • the content of curcumin contained in Lactobacillus plantarum prepared in this example is shown in FIG. 3.
  • the content of curcumin accumulated in the Lactobacillus plantarum K8 was measured for each solvent fraction, and the curcumin content in each solvent fraction was 0.36 mg/mg for the ethyl acetate fraction and 0.18 for the butanol fraction. It was found to be mg/mg, and the total content was found to be 4.01 mg by summing all the fractions. From the above results, it was confirmed that in the case of microorganisms cultured by the culture method of the present invention, curcumin in the body can be accumulated.
  • Lactobacillus plantarum debris that absorbed curcumin was analyzed using LC-MS/MS. At this time, experiments were conducted under six conditions according to the concentration of curcumin contained in the medium, and the content of curcumin in the cultured microorganisms was confirmed as shown in FIG. 4. That is, as a result of analyzing the curcumin, it was confirmed that the content of curcumin in the microorganism was changed according to the culture conditions.
  • MeOH methanol
  • the content of luteolin contained in Lactobacillus plantarum prepared in this example is shown in FIG. 5.
  • the amount of luteolin accumulated in Lactobacillus plantarum K8 was measured for each solvent fraction, and the luteolin content in each solvent fraction was 8.94 mg/mg in the ethyl acetate fraction, butanol fraction The case was 0.29 mg/mg, and the total content was found to be 36.79 mg by summing each fraction. From the above results, it was confirmed that in the case of microorganisms cultured by the culture method of the present invention, luteolin can be accumulated in the body.
  • Example 1 An in vivo experiment was conducted to confirm the improvement in bioavailability of Lactobacillus plantarum cultured in Example 1.
  • the experimental method was divided into a group that ingested luteolin as it was and a group that ingested lactic acid bacteria (PM-luteolin) that accumulated luteolin of Example 1, and proceeded to 2 groups, and a 6-week-old balb/c mouse was used.
  • PM-luteolin ingested lactic acid bacteria
  • the intake amount is 1,500 mg for luteolin and 6 mg for PM-luteolin of the present invention.
  • blood was collected and centrifuged at 8,000 g for 10 minutes to separate serum, and the obtained serum was filtered using an amicon filter (10k).
  • the filtered sample was concentrated under reduced pressure, prepared using MeOH at 10,000 ppm, and then analyzed. As a result, it was confirmed that the bioavailability is improved as shown in FIG. 6.
  • panduratin-A After performing a pre-treatment process for Lactobacillus plantarum K8 cultured in this example, it was quantitatively analyzed for panduratin-A through LC/MS-MS. As a result of the analysis, the content of panduratin-A was confirmed as in FIG. 7.
  • Table 4 is the concentration gradient.
  • Table 5 is the control conditions.
  • EtOAC ethyl acetate
  • EtOAC fraction of forskolin and lactic acid bacteria lysate was prepared and analyzed at a concentration of 10,000 ppm.
  • Table 6 is the concentration gradient.
  • the content of forskolin contained in Lactobacillus plantarum prepared in this example is shown in FIG. 9.
  • the amount of forskolin accumulated in Lactobacillus plantarum K8 was measured, and the amount of forskolin contained in each solvent fraction was 0.14 mg/mg for the ethyl acetate fraction, and the total content was determined for each fraction. All were found to be 1.68 mg in total. From the above results, it was confirmed that in the case of microorganisms cultured by the culture method of the present invention, forskolin can be accumulated in the body.
  • Intra-body delivery of a bioactive substance that is a drug using the microbial agent of the present invention can reduce unwanted side effects and toxicity by preventing excessive drug abuse
  • the composition containing the microbial agent includes, for example, the microbial agent It can be used as a pharmaceutical composition, health food composition, food composition, food additives, beverages, cosmetics or animal feed composition, especially when used as an oral intake formulation, the advantages of the microbial formulation of the present invention Can be maximized.

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Abstract

본 발명은 생리활성 물질이 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물 제제는 기존 약물이 갖는 단점들(낮은 용해성, 낮은 안정성, 원치 않는 독성, 저조한 세포막 투과성 등)을 해결할 수 있는 미생물 제제를 제공하며, 본 발명의 미생물은 미생물 배양배지 내에서 생리활성 물질을 흡수하여 세포에 축적 시킨 후, 전달 캐리어(delivery carrier)로 역할하여 장까지 안전하게 전달할 수 있다.

Description

생리활성 물질이 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법
본 발명은 생리활성 물질이 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 레스베라트롤, 커큐민, 루테올린, 판두레아틴A 및 포스콜린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유산균은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물의 한 종류로써 발효과정 중에 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해하여 젖산을 생성하는 세균을 의미한다. 1858년 프랑스의 미생물학자인 루이 파스퇴르에 의하여 유산균의 실체가 밝혀졌고 러시아의 면역학자인 일리야 메치니코프가 1908년 노벨 생리의학상 수상 이후 말년에 "발효유에 의한 불로장생설"을 제창하고 불가리아 민족의 장수 원인이 유산균 발효유에 있음을 주장하면서부터 본격적인 연구가 시작되어, 지금까지 300여종의 유산균이 발견되었다. 유산균은 인간을 포함한 대부분의 포유류의 장내에 서식하는데 특히 인체의 장에는 건강에 유익한 균과 해로운 균을 합하여 100여 종에 달하는 세균이 100조 마리 이상 존재한다. 대사산물로 젖산을 만들어 장을 산성화 시켜주기 때문에 유해 세균의 증식을 억제하고 이상발효에 의한 암모니아나 발암물질의 생성을 줄여주는 역할, 즉 정장 작용을 하는 세균으로 알려져 있다.
또한, 유산균의 생리 활성은 주로 유기산을 생산하여 장내의 pH를 저하시킴으로써 장내 유해세균의 증식을 억제하며 정상적인 장내 균총을 유지시켜 주는 기능을 하고 β-글루코시다아제를 생산하여 인체에 유용한 배당체를 체내에서 흡수가 용이한 비배당체로 전환하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
레스베라트롤(Resveratrol)은 작물이나 식물 등에 함유되어 있는 이차대사산물로, 항산화, 항암, 심혈관질환, 당뇨 등에 효과를 갖는다고 알려져 있다. 특히, 포도 및 적색 와인 내에 발견된 자연 발생적 분자가 최근 주요 분야로 연구된 바 있다. 최근 연구에 의하면 레스베라트롤른 유방암, 전립선암, 폐암 등에 효과가 있음이 알려지고 있다.
커큐민(curcumin)은 울금에 함유되어 있는 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 화합물로, 커큐미노이드(curcuminoid)계열이며, 알칼로이드의 일종이다. 노란색의 색소 성분으로서 울금이나 강황과 같은 식물의 뿌리에 다량 함유되어 있고, 색소 또는 식품 첨가제로서 널리 사용되고 있다. 커큐민은 난소암, 췌장암, 대장암 등 다양한 종류의 암에 대한 항암 활성, 혈중 콜레스테롤 감소, 항염증, 지방세포 분화억제 그리고 간보호 활성을 가지며, 최근에는 커큐민의 항산화 효과가 알려지면서 당뇨, 비만, 치매 등 다양한 효능을 가질 수 있다는 점이 추가로 확인되었다.
루테올린(luteolin)은 땅콩 껍질, 파슬리, 로즈마리, 샐러리, 타임, 당근 등에 함유되어 있는 플라본(flavones) 화합물이다. 루테올린의 알려진 생리활성으로는 호흡기 질환, 신경계 질환, 면역체계조절, 항산화, 기억력 감퇴 그리고 췌장암, 피부암 등에 대한 항암 효과가 있다.
판두라틴 에이(Panduratin-A)는 핑거루트(fingerroot)에 함유되어 있는 핑거루트에 함유되어 있는 칼콘(Chalcone)계열 화합물이다. 핑거루트는 학명이 보에센베르기아 판두라타(Boesenbergia pandurata)이고, 인도네시아에 자생하는 대표적인 약용 식물로써 현지에서 근육통, 감기, 관절염, 충치, 위장장애 등의 질병 치료에 사용된다. 그리고 최근 다양한 연구에 의하면 체지방 감소에도 효과가 있어 다이어트 원료로 많이 사용되고 있다. 핑거루트의 주성분인 판두라틴 에이(Panduratin-A)는 anti-cariogenic, anti-inflammatory, anti-cancer, anti-proliferative, proapoptotic, antioxidant와 같이 다양한 효과가 있다고 알려져 있다.
포스콜린(forskolin)은 콜레우스 포스콜리(coleus forskoli)의 뿌리에 함유되어 있는 labdane diterpene 계열 화합물로서, 콜레우스 포스콜리(coleus forskoli)는 주로 인도에 자생하는 식물로 인도 전통 의학인 Aurvedic의 약용식물로 사용되어 왔다. 콜레우스 포스콜리(coleus forskoli)는 전통적으로 심장질환, 피부질환, 그리고 호흡기 진환 등 다양한 효능이 있다고 알려져 있다. 또한, 콜레우스 포스콜리(coleus forskoli)의 대표적인 성분인 포스콜린(forskolin)의 생리활성으로는 체지방 감소와 근육생성이 있다.
그러나, 상기와 같은 레스베라트롤, 커큐민, 루테올린, 판두라틴A 및 포스콜린의 다양한 효과에도 불구하고, 낮은 생체 이용률 (bio availability)로 인해 체내 흡수가 어렵다는 문제점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 상기 생리활성 물질이 체내에 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 원료로 사용함으로써 생체 이용률을 높일 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생리활성 물질이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 생리활성 물질이 축적된 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 제조된 미생물 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 미생물 배양 배지에 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 첨가하여 미생물을 배양하는 1차 배양 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 배양된 미생물을 회수하여, 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 포함된 배지에서 추가 배양하는 2차 배양 단계; 를 포함하는, 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물의 배양 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 미생물 제제는 미생물의 유전자 조작없이 자연상태에서 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 미생물에 축적시킨 후 전달하여 체내로 방출시킬 수 있고, 기존 생리활성 물질의 낮은 생체 이용률을 개선시켜 안정적이고 효율적으로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 미생물 제제의 약물이 흡수되는 기작을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스의 배양 조건별(condition1 내지 6) 레스베라트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 내 함유된 커큐민 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸의 배양 조건별(condition 1 내지 6) 커큐민 함량을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 내 함유된 루테올린 함량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 PM-루테올린의 생체이용률을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 Lactobacillus plantarum K8에 축적된 판두라틴 에이의 함량을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 probiotics-microcarrier (PM)공법에 따른 생체이용률을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 내 함유된 포스콜린 함량을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 생리활성 물질이 세포 내에 축적되어 있는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물 제제는 기존 약물이 갖는 단점들 (낮은 용해성, 낮은 안정성, 독성, 저조한 세포막 투과성 등)을 해결할 수 있는 미생물 제제를 제공한다. 본 발명에 따른 제제에 사용된 미생물은 미생물 배양 배지 내에 함유된 생리활성 물질을 체내로 흡수하여 세포에 축적 시킨 후, 전달 캐리어(delivery carrier)의 역할을 수행하는 특성을 이용한 것이다. 이러한 효과로 인하여, 미생물 자체가 가지는 효능 뿐만 아니라, 기능성 성분인 생리활성 물질의 효능까지 함께 가지게 되며, 특히 생리활성 물질의 생체 이용률(Bio availability)을 높일 수 있는 효과를 가질 수 있다.
즉, 본 발명의 미생물 제제는 유효성분인 생리활성 물질이 미생물의 체내에 흡수되어 축적된 형태로 제제화될 수 있는 미생물을 포함하는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 레스베라트롤(Resveratrol)이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제가 개시된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 커큐민(Curcumin)이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제가 개시된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 루테올린(luteolin)이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제가 개시된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 판두라틴 에이(Panduratin-A)가 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제가 개시된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 포스콜린(forskolin)이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제가 개시된다.
본 발명의 용어 “미생물 제제”는 본 발명에서 언급된 유산균을 포함하는 미생물이 포함된 제제로서, 약학적 조성물, 건강식품 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제, 음료, 화장품, 피부 외용제, 동물용 사료, 식물용 비료 등에 사용 가능한 모든 제제를 포함하는 개념이다. 특히 본 발명의 미생물 제제는, 미생물과 유효성분이 각각 개별적으로 혼합된 것이 아니며, 미생물 배양 시, 배양액(혹은 배지)에 상기 유효성분을 일정 농도 이상 포함하도록 하여 상기 미생물의 체내에 유효성분이 축적되도록 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미생물은 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 유산균의 분류에 속하는 것이면 어느 것이든지 제한없이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 류코노스톡스(Leuconostocs sp.), 이스트(Yeast) 또는 아스퍼질리(Aspergilli sp.) 속에 속하는 유산균일 수 있고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 상기 락토바실러스 플란타룸은 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 K8 균주인 것일 수 있고, 바람직하게는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 KTCT 10887BP의 수탁번호를 부여받은 락토바실러스 플란타룸 K8 균주일 수 있다. 상기 신균주를 이용할 경우, 다른 균주 대비 본 발명에 따른 미생물 제제의 생리활성 물질 축적량 및 생체 이용율이 가장 우수한 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미생물 제제에 사용된 미생물은 생균 형태로 사용되고, 약물을 미생물에 축적 시킨 후 대장으로 전달하여 점막고유층 (laminar propria mucosae)에 존재하는 대식세포 (resident macrophages)에 의한 흡수 및 식균 작용을 통해, 약물이 체내로 방출되도록 하는 특징을 가진다.
미생물에 의한 약물의 흡수(uptake)는 도 1에 나타낸 바와 같이 능동 수송 (active transport), 캐리어 매개 수송 (carrier-mediated transport), 확산 (diffusion)에 의해 발생될 수 있다. 구체적으로, 경구 투여시 미생물 제제가 대장 내에서 대식세포 또는 수지상세포에 의해 식균 또는 용균작용으로 인하여 혈액으로 약리학적 활성물질이 전달되거나, 대장 외피 세포 (epithelial cells)에 의해 미생물 제제가 흡수된 후 세포 내에서 미생물이 용균되고 약리학적 활성물질이 확산에 의해 체내로 흡수될 수 있다(프로바이오틱 캐리어 및 액티브 트랜스포트). 이러한 기작은 약리학적 활성물질의 구조적 특성에 따라 다른 방법을 사용함으로 하나로 특정지을 수는 없으나, 결국 본 발명에 따른 미생물 제제는 대식세포에 의해 흡수 (uptake)된 후 장 세포막을 통과하여 저조한 세포막 투과성을 높일 수 있고 (능동 수송 효능), 이 후 대식세포의 식균작용에 의해 미생물이 파괴되어 약물은 체내에 방출되는 효과를 발휘하게 된다.
본 발명에 사용된 미생물에 의해 흡수된 약리학적 활성물질인 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 또는 포스콜린(forskolin)은 미생물의 생리활성이나 에너지 대사에는 사용되지 않으면서 세포에 축적되며, 상기 활성물질은 미생물이 다양한 방법에 의해 파괴(물리적인 파쇄 및 식균작용 등)될 때까지 안정적으로 세포의 체내에 보존된다. 미생물에 의해 흡수되는 생리활성 물질의 양은 수십 마이크로그람~수 밀리그람 단위로, 일반적으로 섭취하는 약물 수백 밀리그람에 비해 현저하게 낮다. 반면, 환자의 체내에서의 약물의 효능을 보여주는 약동학(pharmacokinetics)에 의하면 약물의 효능은 수백마이크로그람에서 수 밀리그람의 약물이면 충분하므로, 본 발명의 미생물 제제를 이용한 약물인 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 또는 포스콜린(forskolin)의 체내 전달은 과도한 약물의 남용을 막음으로써 원치 않는 부작용 및 독성을 낮출 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 미생물의 유전자 조작 없이 자연상태에서 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 미생물에 축적시킨 후 체내에서 방출시킬 수 있고, 기존 생리활성 물질의 낮은 생체 이용률을 개선시켜 안정적이고 효율적으로 이용할 수 있다.
생리활성 물질이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제
본 발명을 보다 구체적으로 설명하면, 일실시예에서 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명에서 미생물 제제는 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물 제제인 프로바이오틱스-마이크로캐리어(Probiotics-microcarrier, PM)로 제공될 수 있고, 유산균이 캐리어의 역할을 함으로써 위산에 의한 생리활성 물질의 파괴를 방지하고 안전하게 장내로 전달시킬 수 있다.
본 발명에서 프로바이오틱스-마이크로캐리어에 의해 유산균내 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질은 장 세포내에 존재하는 대식세포 (tissue resident macro phage)에 의해 능동적으로 점막고유층(lamina propria) 또는 림프절(lymp node)로 이동되어 혈관으로 배출됨으로써 생체이용률(bio avaliability)이 높아지게 된다. 본 발명에서 상기 미생물 제제는 미생물 내에 축적된 생리활성 물질이 장 세포내에 존재하는 대식세포에 의한 흡수 및 식균작용을 통해 체내로 방출될 수 있는 특징을 가진다.
본 발명에서 사용되는 미생물은 유산균으로서, 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 류코노스톡스(Leuconostocs sp.), 이스트(Yeast) 또는 아스퍼질리(Aspergilli sp.) 속에 속하는 유산균일 수 있고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 락토바실러스 플란타룸을 사용하여, 배양 시 생리활성 물질 함유 배지에서 배양하였으며, 이러한 방식으로 배양된 상기 균주를 락토바실러스 플란타룸 K8로 명명하였다. 보다 더 바람직하게는 상기 락토바실러스 플란타룸은 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 K8 균주인 것일 수 있고, 바람직하게는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 KTCT 10887BP의 수탁번호를 부여받은 락토바실러스 플란타룸 K8 균주일 수 있다. 상기 신균주를 이용할 경우, 다른 균주 대비 본 발명에 따른 미생물 제제의 생리활성 물질 축적량 및 생체 이용율이 가장 우수한 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 레스베라트롤은 포도, 오디, 땅콩 및 뽕잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물의 추출물 또는 이의 분획물을 이용하거나, 또는 이로부터 분리된 레스베라트롤 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 커큐민은 강황 및 울금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물의 추출물 또는 이의 분획물을 이용하거나, 또는 이로부터 분리된 커큐민 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 루테올린은 땅콩 껍질, 파슬리, 로즈마리, 샐러리, 타임 및 당근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물의 추출물 또는 이의 분획물을 이용하거나, 또는 이로부터 분리된 루테올린 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 판두라틴 에이는 (Fingerroot, Boesenbergia pandurata)의 추출물 또는 이의 분획물을 이용하거나, 또는 이로부터 분리된 판두라틴 에이 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 포스콜린은 이에 제한되는 것은 아니나, 콜레우스 포스콜리(coleus forskolii) 추출물 또는 이의 분획물을 이용하거나, 또는 이로부터 분리된 포스콜린 화합물을 사용할 수 있다.
여기서 상기 각 화합물(레스베라트롤, 커큐민, 루테올린, 판두라틴 에이 또는 포스콜린)의 분리 방법은 당업계에 일반적으로 알려진 추출 방법 또는 분획방법으로서, 냉침, 열추출, 초음파 추출, 가압추출법 등을 제한 없이 이용할 수 있고, 극성용매 또는 비극성 용매로서, 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등 알코올, 아세트산, DMF(dimethylformamide) 또는 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide) 등 극성용매 또는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르 또는 사염화탄소 등 비극성 용매 중에 하나 또는 그의 혼합 용매를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 배양된 미생물은 레스베라트롤의 체내 축적 함량이 0.01 내지 2.0 mg/mg이며, 바람직하게는 0.1 내지 2.0 mg/mg일 때, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5 mg/mg일 때, 레스베라트롤 함유 미생물 제제로서 적합하다.
본 발명에서 배양된 미생물은 커큐민의 체내 축적 함량이 0.01 내지 1.0 mg/mg이며, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/mg일 때, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.0 mg/mg일 때, 커큐민이 축적된 미생물 제제로서 적합하다.
본 발명에서 배양된 미생물은 루테올린의 체내 축적 함량이 0.01 내지 10.00 mg/mg이며, 바람직하게는 5.0 내지 10.0 mg/mg일 때, 보다 바람직하게는 8.0 내지 10.0mg/mg일 때, 루테올린이 축적된 미생물 제제로서 적합하다.
본 발명에서 배양된 미생물은 판두라틴 에이의 체내 축적 함량이 0.01 내지 1.0 mg/mg이며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1.0 mg/mg일 때 또는 총 함유량이 0.1 내지 1.0mg 일 때, 판두라틴 에이가 축적된 미생물 제제로서 적합하다.
본 발명에서 배양된 미생물은 포스콜린의 체내 축적 함량이 0.01 내지 10.00 mg/mg이며, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/mg일 때, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.2mg/mg일 때, 포스콜린이 축적된 미생물 제제로서 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 파쇄물은 미생물을 세제(detergent)로 처리하는 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 예를 들어, 미생물을 비드 밀(bead mills), 프레스 (Presses), 소니케이터(Sonicator) 또는 마이크로플루다이저 (Microfluidizer)를 사용하여 파쇄물을 수득할 수 있다.
생리활성 물질이 축적된 미생물의 배양 방법
또한, 본 발명은 일실시에에서 a) 미생물 배양 배지에 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 첨가하여 미생물을 배양하는 1차 배양 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 배양된 미생물을 회수하여, 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 포함된 배지에서 추가 배양하는 2차 배양 단계;
를 포함하는, 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서 미생물을 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 함유된 배지에서 배양하여 상기 미생물 내에 상기 생리활성 성분을 축적시킬 수 있으며, 구체적으로 미생물을 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질 함유 배지에서 배양하거나, 상기 생리활성 물질 함유 반응물과 반응시켜, 상기 미생물 내에 상기 생리활성 물질을 축적시키는 단계를 포함한다.
여기서 배양은 미생물 활성화를 위해 미생물을 1차 배양하는 단계 및, 배양된 미생물을 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 포함된 배지에서 2차 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 미생물을 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 첨가시킨 MRS 배지에서 1차적으로 배양한 후, 상기 배양된 세포를 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 포함된 MRS 배지로 옮겨 2차 배양 할 수 있다. 이때, 1차 배양의 MRS 배지에는 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 첨가하는 것이 바람직하다. 배양된 세포는 세척 후 직접 사용하거나 또는 바이크로 플로다이져(microfluidizer)를 사용하여 세포를 파쇄하여 사용할 수 있다. 또한, 배양된 세포는 동결 건조 시켜 분쇄된 분말 형태로도 사용할 수 있다.
미생물 제제를 제조하는 방법은 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 미생물 내에 축적하는 구성을 동일하게 포함하므로, 앞서 기재된 설명은 미생물 제제를 제조하는 방법에도 동일하게 적용된다.
또한, 배양에 이용되는 배지로는 미생물 배양에 사용되는 공지된 배지를 사용할 수 있으며, 미생물의 종류에 따라 임의의 배지 선택이 가능하다. 예를 들어, M9 최소배지, LB(Luria-Bertani) 배지, MRS(deMan Rogosa Sharpe) 고상 또는 브로스 배지, APT(All Purpose with Tween) 배지, BHI(Brain Heart Infusion) 배지 또는 YPD(효모 추출물-펩톤 덱스트로즈) 고상 또는 액상 배지를 단독 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 상기 배지는 본 발명의 미생물 배양 시 1차 또는 2차 배지로 사용될 수 있으며, 상기 2차 배지는 포스콜린이 추가로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 배지에 포함되는 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 0.01 내지 20 g/L의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 g/L의 농도로 포함될 수 있고, 상기 농도는 배양하는 미생물의 종류 및 배양 배지의 조성에 따라 당업자의 기술 수준에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
상기 미생물은 배지에 포함된 생리활성 물질이 장세포 내에 존재하는 대식세포에 의하여 흡수되거나, 식균작용을 통해 체내로 방출되는 것일 수 있다.
미생물 제제를 포함하는 조성물
나아가, 본 발명은 일실시예에서 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서 상기 미생물 제제를 함유하는 조성물로서 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 예를 들어, 상기 미생물 제제를 포함하는 약학적 조성물, 건강식품 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제, 음료, 화장품 또는 동물용 사료 조성물일 수 있으며, 특히 경구용으로 섭취되는 제제로서 사용되는 것일 경우, 본 발명의 미생물 제제의 장점을 극대화할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 경구 투여용으로 제조될 수 있으며, 고상 혹은 액상, 젤상으로 제조될 수 있다. 즉, 상기 조성물은 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키 (troche), 캡슐 (capsule), 엘릭실 (elixir), 시럽 (syrup), 산제 (powder), 현탁제 (suspension) 또는 과립제 (granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 미생물 제제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있으며, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀(liquid paraffin) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는 1일 10 mg~1,000 mg의 유효용량으로 투여할 수 있고, 조성물 내 적정 균수는 108~1012CFU/일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<준비예 1> 락토바실러스 플란타룸 K8 균주 분리 및 동정
본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용된 균주는 한국의 전통 발효식품인 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 K8 (Lactobacillus plantarum K8)를 제공받아 사용하였다.
상기 균주는 한국의 전통 발효식품인 김치에서 균체를 분리되었고, 분리한 균체는 16S rRNA sequencing 및 생화학 테스트로 확인하여 동정한 결과, 락토바실러스 플란타룸 K8 (Lactobacillus plantarum K8)로 명명하였으며, 신균주로서, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 KTCT 10887BP의 번호를 부여받은 바 있다.
상기 Lactobacillus plantarum K8 균주는 초저온냉동고에 Stock 상태로 보관하며, 하기 실시예 및 실험예에서는 상온에서 해동시켜 사용하였다.
<실시예 1> 생리활성 물질 함유 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) K8의 제작
상기 준비예 1의 초저온냉동고에 Stock 상태로 보관한 Lactobacillus plantarum K8 (O.D. 1.0)을 상온에서 녹인 후 레스베라트롤, 커큐민, 루테올린, 판두라틴A, 포스콜린이 각각 함유된 배지(broth)에 접종한 후 5-20시간 동안 36.5℃에서 배양하였다. 상기 배양된 Lactobacillus plantarum K8 전량을 레스베라트롤, 커큐민, 루테올린, 판두라틴A, 포스콜린이 각각 함유된 MRS broth에 접종하여 2차 배양하였다.
배양된 세포는 분석을 위한 전처리 과정을 거친 후 LC/MS-MS를 통하여 축적물에 대하여 정량분석하였다.
<실험예 1> 유산균 내 축적된 레스베라트롤 함량 분석
1-1. 유산균 내 축적된 레스베라트롤 함량의 분획별 분석
유산균 배양액, 유산균 세척액 washing1-3, 유산균 파쇄물, 또는 실험에 사용된 레스베라트롤을 EtOAC, BuOH를 이용하여 분획 한 후 각 분획물을 감압농축 하여 분획물을 획득하였고, 레스베라트롤이 존재하는 BuOH 분획에 대하여 분석을 진행하였다. 각 레스베라트롤은 MeOH에 녹여 100ppm농도로 조제하여 분석하였다. 레스베라트롤, washing1-3, 유산균 배양액, 유산균 파쇄물의 BuOH 분획은 2000ppm농도로 조제하여 분석하였다.
분석 조건은 다음과 같다:
- Instrument: Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)
- Column: C18 (2.1 mm X 150 mm, 2.7 μm)
- Solvent: A; 0.1% Formic acid in Water, B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile
- Flow rate: 0.2 ml/min
- 농도기울기: 하기 표 1 참조.
Time(min.) B%
1 0 5
2 5 15
3 10 30
4 15 60
5 20 100
6 25 100
7 27 5
8 35 5
MS condition:
- Ionization Mode -ESI, sim mode
- Gas temp. 350℃
- Capillary volt. 4000 V
- Nebμlizer 40 psig
- Fragmentor 190 V
분석 결과, 본 발명의 배양 방법에 의하여 배양된 미생물의 경우, 체내 레스베라트롤을 축적할 수 있음을 확인하였다.
1-2. 배양조건에 따른 유산균 내 축적된 레스베라트롤 함량 분석
레스베라트롤을 흡수한 유산균의 파쇄물을 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 이때, 배지에 포함된 레스베라트롤 농도에 따라 6가지 조건으로 실험을 진행하였다. 레스베라트롤을 분석한 결과 배양 조건에 따라 배양된 미생물 내의 레스베라트롤의 함유량이 변화되는 것을 확인하였다.
분석 결과 배양된 세포 내에 레스베라트롤, 커큐민, 루테올린, 판두라틴A, 포스콜린의 축적된 함량이 확인되었다.
1-3. 스트렙토코커스 써모필러스를 이용한 레스베라트롤의 세포 축적
상기 조건에 따라, 다른 균주에서도 동일한 방식으로 레스베라트롤의 축적량이 증가될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1의 락토바실러스 플란타룸 대신 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophillus) (O.D. 1.0)를 이용하여, 세포를 축적하였다. 초저온냉동고에 Stock 상태로 보관한 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophillus) (O.D. 1.0)을 상온에서 녹인 후 라스베라트롤이 함유된 배지(broth)에 접종한 후 36.5℃에서 배양하였다. 상기 배양된 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophillus) 전량을 레스베라트롤이 첨가된 MRS broth에 접종하여 2차 배양하였다.
이에 대하여 상기 실험예 1-1 및 1-2와 동일한 방법으로 레스베라트롤을 흡수한 스트렙토코커스 써모필러스 파쇄물을 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 이때, 배지에 포함된 레스베라트롤 농도에 따라 6가지 조건으로 실험을 진행하였으며, 배양된 미생물 내의 레스베라트롤 함량은 도 2와 같이 확인할 수 있었다. 즉, 레스베라트롤을 분석한 결과 배양 조건에 따라 미생물 내의 레스베라트롤의 함유량이 변화되는 것을 확인하였다.
1-4. 효모(Yeast)를 이용한 레스베라트롤의 세포 축적
상기 조건에 따라, 다른 균주에서도 동일한 방식으로 레스베라트롤의 축적량이 증가될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 라스베라트롤이 함유된 배지(broth)에 접종하여 1차 배양하고, 배양된 효모를 레스베라트롤이 함유된 2차 배양 배지에 접종하여 추가적으로 배양하였다. 배양 후, 이를 원심분리하고, 세척하는 과정을 거쳐 효모 펠렛을 얻었다.
세척된 사카로마이세스 세레비지애는 microfluidizer를 이용하여 3회 파쇄하고, LC/MS-MS를 통하여 비배당체 레스베라트롤 화합물을 분석하였다. 그 결과 상기 균의 파쇄체에서 비배당체 레스베라트롤이 검출되었다. 파쇄전 사카로마이세스 세레비지애에 묻어 있는 비배당체의 양은 약 45 mg 정도 이며 이를 파쇄하면 약 27배 높은 1,222 mg의 비배당체 레스베라트롤이 검출되었다.
이는 효모의 경우에서도 약리학적 활성이 있는 물질을 흡수 하여 세포에 함유하고 있음을 의미하며, 본 개발에 이용될 수 있는 미생물이 유산균에 제한되지 않음을 보여준다.
1-5. 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 이용한 레스베라트롤의 세포 축척
비피도박테리움(Bifidobacterium)을 라스베라트롤이 함유된 배지(broth)에 접종하여 1차 배양 후, 실험예 1-2 내지 1-4와 동일한 방법으로 레스베라트롤이 함유된 배지에서 2차 배양하였다. 배양 후, 상기 비피도박테리움을 분리하기 위하여, 원심분리 및 세척하는 과정을 2회 이상 반복하고 상층액을 제거하여 비피도박테리움 펠렛을 얻었다.
세척된 비피도박테리움은 microfluidizer를 이용하여 파쇄하고, LC/MS-MS를 통하여 비배당체 레스베라트롤 화합물을 분석하였다. 그 결과 상기 균의 파쇄체에서 비배당체 레스베라트롤이 검출되었다. 이는 비피도박테리움의 경우에서도 약리학적 활성이 있는 물질을 흡수 하여 세포에 함유할 수 있음을 의미하며, 본 개발에 이용될 수 있는 미생물이 유산균에 제한되지 않음을 보여준다.
<실험예 2> 유산균 내 축적된 커큐민 함량 분석
2-1. 유산균 내 축적된 커큐민 함량의 분획별 분석
상기 배양된 유산균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 대하여, 배양액, 균주 세척액(1~3회), 파쇄물, 및 실험에 사용된 커큐민을 에틸아세테이트(EtOAC) 또는 부탄올(BuOH)를 이용하여 각각 분획한 후, 각 분획물을 감압농축 하여 분획물을 획득하였고, 각 분획별 커큐민의 함량 분석을 진행하였다. 커큐민은 MeOH에 녹여 100ppm농도로 조제하여 분석하였다. 커큐민, washing1-3, 유산균 배양액, 유산균 파쇄물의 EtOAC 그리고 BuOH 분획은 10,000ppm 농도로 조제하여 분석하였다.
분석 조건은 다음과 같다:
- Instrument: Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)
- Column: C18 (2.1 mm X 150 mm, 2.7 μm)
- Solvent: A; 0.1% Formic acid in Water, B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile
- Flow rate: 0.4 ml/min
- 농도 기울기: 하기 표 2 참조.
time(min.) B%
1 0 5
2 30 100
3 32 100
MS condition:
- Ionization Mode -ESI, scan mode
- Gas temp. 300℃
- Capillary volt. 4,000 V
- Nebulizer 40 psig
- Fragmentor 135 V
본 실시예에서 제조된 락토바실러스 플란타룸 내에 함유된 커큐민 함량을 도 3에 나타내었다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 축적된 커큐민의 함량을 각 용매의 분획별로 측정하였고, 각각의 용매 분획에 포함된 커큐민 함량은 에틸아세테이트 분획의 경우 0.36mg/mg, 부탄올 분획의 경우 0.18 mg/mg이었고, 총 함유량을 각각의 분획을 모두 합하여 4.01mg인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 배양 방법에 의하여 배양된 미생물의 경우, 체내 커큐민을 축적할 수 있음을 확인하였다.
2-2. 배양 조건에 따른 커큐민 함량 분석
커큐민을 흡수한 락토바실러스 플란타룸 파쇄물을 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 이때, 배지에 포함된 커큐민 농도에 따라 6가지 조건으로 실험을 진행하였으며, 배양된 미생물 내의 커큐민 함량은 도 4와 같이 확인할 수 있었다. 즉, 커큐민을 분석한 결과 배양 조건에 따라 미생물 내의 커큐민의 함유량이 변화되는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 유산균 내 축적된 루테올린 함량 및 생체 이용율 분석
3-1. 유산균 내 축적된 루테올린 함량의 분획별 분석
상기 배양된 유산균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 대하여, 배양액, 균주 세척액(1~3회), 파쇄물, 및 실험에 사용된 루테올린을 에틸아세테이트(EtOAC) 또는 부탄올(BuOH)를 이용하여 각각 분획한 후, 각 분획물을 감압농축 하여 분획물을 획득하였고, 각 분획별 루테올린의 함량 분석을 진행하였다. 루테올린은 메탄올(MeOH)에 녹여 100ppm농도로 조제하여 분석하였다. 루테올린, washing1-3, 유산균 배양액, 유산균 파쇄물의 EtOAC 그리고 BuOH 분획물은 10,000ppm 농도로 조제하여 분석하였다.
분석 조건은 다음과 같다:
- Instrument: Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)
- Column: YMC-triart-C18 (2.1 mm × 100 mm, 2.0 ㎛)
- Solvent: A; 0.1% Formic acid in Water, B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile
- Flow rate: 0.4 ml/min
Injection vol.: 5 uL
time(min.) B%
1 0 5
2 30 100
3 32 100
상기 표 3은 농도기울기이다.
MS condition:
- Ionization Mode -ESI, scan mode
- Gas temp. 300℃
- Capillary volt. 4,000 V
- Nebulizer 40 psig
- Fragmentor 135 V
본 실시예에서 제조된 락토바실러스 플란타룸 내에 함유된 루테올린 함량을 도 5에 나타내었다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 축적된 루테올린의 함량을 각 용매의 분획별로 측정하였고, 각각의 용매 분획에 포함된 루테올린 함량은 에틸아세테이트 분획물의 경우 8.94mg/mg, 부탄올 분획의 경우 0.29 mg/mg이었고, 총 함유량은 각각의 분획물을 모두 합하여 36.79mg인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 배양 방법에 의하여 배양된 미생물의 경우, 체내 루테올린을 축적할 수 있음을 확인하였다.
3-2. probiotics-microcarrier에 의한 생체이용률 향상
실시예 1에서 배양된 락토바실러스 플란타룸의 생체이용률 향상을 확인하기 위하여 in vivo 실험을 진행 하였다. 실험 방법은 루테올린을 그대로 섭취한 그룹과, 실시예 1의 루테올린을 축적 시킨 유산균(PM-루테올린)을 섭취한 그룹으로 나누어 2 그룹으로 진행하였으며, 6주령 balb/c mouse를 사용 하였다.
섭취량은 루테올린은 1,500mg, 본 발명의 PM-루테올린은 6mg이다. 시료 전처리는 채혈 후 원심분리기로 8,000g에서 10분간 진행하여 혈청을 분리 하였으며, 얻어진 혈청을 아미콘필터(10k)를 사용하여 필터링 하였다. 필터링된 시료를 감압 농축하였고, MeOH를 이용하여 10,000ppm으로 조제 후 분석 하였다. 그 결과 도 6과 같이 생체이용률이 향상되는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 유산균 내 축적된 판두라틴 에이 함량 및 생체 이용율 분석
4-1. 유산균 내 축적된 판두라틴 에이(Panduratin-A) 함량 분석
본 실시예에서 배양된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 대하여 전처리 과정을 수행한 후 LC/MS-MS를 통하여 판두라틴 에이(panduratin-A)에 대하여 정량분석하였다. 분석한 결과 도 7에서와 같이 판두라틴 에이(panduratin-A)의 함량이 확인되었다.
4-2. probiotics-microcarrier(PM) 공법에 따른 bioavaliability 향상
probiotics-microcarrier (PM)에 의한 bioavaliability 향상을 확인하기 위하여 In vivo 실험을 진행 하였다. 두 그룹(제1그룹: panduratin-A 섭취, 제2그룹: PM-panduratin-A 섭취)으로 나누어 진행 되었으며, 6주령 balb/c mouse를 사용 하였다(도 8). 섭취량은 도 8과 같으며 시료전처리는 채혈 후 centrifuge를 8,000g에서 10분간 진행하여 serum을 분리 하였으며, 얻어진 serum을 아미콘필터 (10k)를 사용하여 filter 하였다. filter 된 시료를 감압농축하였고, MeOH를 이용하여 100,000ppm으로 조제 후 분석 하였다.
분석 조건은 다음과 같다:
-Instrument: Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)
-Column: YMC-triart-C18 (2.1 mm × 100 mm, 2.0 ㎛)
-Solvent: A; 0.1% Formic acid in Water, B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile
-Flow rate: 0.4 uL/min
-Injection vol.: 5 uL
time(min.) B%
1 0 5
2 30 100
3 32 100
표 4는 농도기울기 이다.
Ionization Mode +ESI, scan mode
Gas temp. 300 ℃
Capillary volt. 4000 V
Nebulizer 40 psig
Fragmentor 135 V
표 5는 컨트롤 조건이다.
그 결과 도 8과 같이 생체 이용률(Bioavaliability)이 향상 된다는 것을 확인 하였다.
<실험예 5> 유산균 내 축적된 포스콜린 함량 분석
5-1. 유산균 내 축적된 포스콜린 함량의 분획별 분석
상기 배양된 유산균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 대하여, 배양액, 균주 세척액(1~3회), 파쇄물, 및 실험에 사용된 포스콜린을 에틸아세테이트(EtOAC) 또는 부탄올(BuOH)를 이용하여 각각 분획한 후, 각 분획물을 감압농축 하여 분획물을 획득하였고, 각 분획별 포스콜린의 함량 분석을 진행하였다. 컨트롤로서 포스콜린은 에틸아세테이트(EtOAC)에 녹여 10,000ppm농도로 조제하여 분석하였다. 포스콜린, 유산균 파쇄물의 EtOAC 분획물은 10,000ppm 농도로 조제하여 분석하였다.
분석 조건은 다음과 같다:
- Instrument: Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)
- Column: YMC-triart-C18 (2.1 mm × 100 mm, 2.0 ㎛)
- Solvent: A; 0.1% Formic acid in Water, B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile
- Flow rate: 0.4 ml/min
- Injection vol.: 5 uL
time(min.) B%
1 0 5
2 30 100
3 32 100
상기 표 6은 농도 기울기이다.
MS condition:
- Ionization Mode -ESI, scan mode
- Gas temp. 300℃
- Capillary volt. 4,000 V
- Nebulizer 40 psig
- Fragmentor 135 V
본 실시예에서 제조된 락토바실러스 플란타룸 내에 함유된 포스콜린 함량을 도 9에 나타내었다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8에 축적된 포스콜린의 함량을 측정하였고, 각각의 용매 분획에 포함된 포스콜린 함량은 에틸아세테이트 분획물의 경우 0.14mg/mg이었고, 총 함유량은 각각의 분획물을 모두 합하여 1.68mg인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 배양 방법에 의하여 배양된 미생물의 경우, 체내 포스콜린을 축적할 수 있음을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 미생물 제제를 이용한 약물인 생리활성 물질의 체내 전달은 과도한 약물의 남용을 막음으로써 원치 않는 부작용 및 독성을 낮출 수 있고, 상기 미생물 제제를 함유하는 조성물은 예를 들어, 상기 미생물 제제를 포함하는 약학적 조성물, 건강식품 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제, 음료, 화장품 또는 동물용 사료 조성물로 이용될 수 있으며, 특히 경구용으로 섭취되는 제제로서 사용되는 것일 경우, 본 발명의 미생물 제제의 장점을 극대화할 수 있다.
[미생물기탁증]
기탁기관명: 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)
기탁 번호: KCTC 10887BP
기탁 일자: 2006년 1월 20일
[규칙 제91조에 의한 정정 11.03.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-226

Claims (20)

  1. 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 미생물 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 류코노스톡스(Leuconostocs sp.), 이스트(Yeast) 또는 아스퍼질리(Aspergilli sp.) 중에 선택되는 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미생물은 락토바실러스 플란타룸 K8(Lactobacillus plantarum K8) 균주(수탁번호: KTCT 10887BP)인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 레스베라트롤은 포도, 오디, 땅콩 및 뽕잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 커큐민은 강황 및 울금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 루테올린은 땅콩 껍질, 파슬리, 로즈마리, 샐러리, 타임 및 당근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 판두라틴 에이는 핑거루트의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 포스콜린은 콜레우스 포스콜리(coleus forskolii)의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 내 레스베라트롤 축적량은 0.01 내지 2.0 mg/mg인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 내 커큐민 축적량은 0.01 내지 1.0 mg/mg인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 내 루테올린 축적량은 0.01 내지 10.00 mg/mg인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 내 판두라틴 에이 축적량은 0.01 내지 1.0 mg/mg인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 내 포스콜린 축적량은 0.01 내지 10.00 mg/mg인 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  14. a) 미생물 배양 배지에 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질을 첨가하여 미생물을 배양하는 1차 배양 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서 배양된 미생물을 회수하여, 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 포함된 배지에서 추가 배양하는 2차 배양 단계;
    를 포함하는, 레스베라트롤(Resveratrol), 커큐민(Curcumin), 루테올린(luteolin), 판두라틴 에이(Panduratin-A) 및 포스콜린(forskolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생리활성 물질이 축적된 미생물의 배양 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 류코노스톡스(Leuconostocs sp.), 이스트(Yeast) 또는 아스퍼질리(Aspergilli sp.) 중에 선택되는 것을 특징으로 하는, 미생물의 배양 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 미생물은 락토바실러스 플란타룸 K8(Lactobacillus plantarum K8) 균주(수탁번호: KTCT 10887BP)인 것을 특징으로 하는, 미생물의 배양 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 배양 배지 내에 0.01 내지 20 g/L의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 미생물의 배양 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 미생물은 배지에 포함된 생리활성 물질이 장세포 내에 존재하는 대식세포에 의하여 흡수되거나, 식균작용을 통해 체내로 방출되는 것을 특징으로 하는, 미생물의 배양 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 미생물 제제를 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 사람 또는 동물에 대한 경구 투여를 목적인 것을 특징으로 하는 조성물.
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