JP2020120657A - 非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物製剤の製造方法およびこれにより製造された微生物製剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】β−グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体から転換された非配糖体を製造する方法の提供。【解決手段】β−グルコシダーゼを発現する微生物を人参抽出物含有M9最小培地で培養することによって微生物内に転換されたジンセノサイドを蓄積する段階を含む、転換されたジンセノサイドが細胞内に蓄積された、転換されたジンセノサイドの高い体内吸収率を示す微生物製剤を製造する方法であって、微生物の細胞中に蓄積された前記転換されたジンセノサイドの濃度が培地中の前記転換されたジンセノサイドの濃度の2倍より高い、前記方法。【選択図】なし
Description
本発明は、非配糖体を含む微生物製剤を製造する方法に関し、具体的には、β‐グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体を非配糖体の形態に転換した後、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物を製造する方法に関する。
乳酸菌は、ヒトが利用可能な最も有益な微生物の一種であり、発酵過程中にブドウ糖または乳糖といった炭水化物を分解し乳酸を生成する細菌を意味する。1858年、フランスの微生物学者であるルイ・パスツールにより乳酸菌の実態が明らかになっており、ロシアの免疫学者であるイリヤ・メチニコフが、1908年にノーベル生理医学賞を受賞した後、末年に「発酵乳による不老長寿説」を提唱し、ブルガリア民族の長寿が乳酸菌発酵乳に由来することを主張してから本格的な研究が始まり、今まで約300種の乳酸菌が発見された。乳酸菌は、ヒトをはじめほとんどの哺乳類の腸内に生息するが、特に、人体の腸には健康に有益な細菌と有害な細菌を合わせて約100種に達する細菌が100兆以上存在している。乳酸菌は、代謝産物として乳酸を作り腸を酸性化させることから有害細菌の増殖を抑制し、異常発酵によるアンモニアや発がん物質の生成を低減する役割、すなわち整腸作用をする細菌として知られている。
乳酸菌の生理活性は、主に有機酸を生産して腸内のpHを低下させることで腸内有害細菌の増殖を抑制し正常な腸内菌叢を維持させる働きをし、β‐グルコシダーゼを生産して、配糖体イソフラボンを体内での吸収が容易な非配糖体に転換する働きをすると知られている。
特に、イソフラボンの場合、糖が付いている配糖体(glycoside)、糖が除去された非配糖体(aglycone)、アセチルグルコシド(acetylglucoside)、マロニルグルコシド(malonylglucoside)の4種の形態で存在しており、このうち、非配糖体イソフラボンは、腸内のβ‐グルコシダーゼによって加水分解されて、活性型非配糖体であるアグリコン(aglycone)に転換され吸収される。しかし、一般的な食品に含有されたイソフラボンは糖が結合された配糖体の形態で存在し、食餌で摂取されたイソフラボンが吸収されるためには、腸内微生物によって非配糖体の形態に転換されなければならない。したがって、β‐グルコシダーゼの活性を有する微生物は、イソフラボンの生体利用性において非常に重要な役割を果たすことができる。
既存のイソフラボンの抽出方法は、イソフラボンを含有する植物体の粉末を水で抽出し、抽出液を酸性化した後、スラッジと分離して吸着性樹脂が充填されたカラムに通過させ、抽出液中のイソフラボンを前記樹脂に吸着、カラムにアルコール性溶媒を通過させて、樹脂に吸着したイソフラボンを回収する方法がある。他の方法としては、イソフラボンが含有された植物体または植物加工品をシクロデキストリンまたはその誘導体またはその重合体の溶液に添加してイソフラボンを前記シクロデキストリンまたはその誘導体またはその重合体に結合させて抽出する第1ステップと、前記抽出により形成された抽出液に凝集剤を投与して、前記抽出液からイソフラボンとシクロデキストリンの結合体を分離する第2ステップとを含むことを特徴とするイソフラボンの抽出方法がある。特に、在来種の大豆から非配糖体イソフラボンを抽出するために様々な機械的および化学的方法を使用するが、その方法としては、超音波を用いてイソフラボンを抽出した後、液体クロマトグラフィーにより精製する方法がある。しかし、かかる抽出方法は、複数のステップの工程を含んでおり、生産率の低下、生産コストの増加、精製過程での汚染可能性などの問題を内包している。
微生物による配糖体イソフラボンの非配糖体イソフラボンへの生物転換について研究されており(Kuo et al.,Appl Microbiol Biotechnol 2006.73:314‐320;Lee et al.,J Agric Food Chem 2013.61:12101‐12110)、その中でも乳酸菌による配糖体イソフラボンの非配糖体イソフラボンへの生物転換が可能で、これに関する研究が活発に進められている(Cavallini et al.,Alim.Nutr.2010.21:175‐182)。一例として、Aliとその仲間は乳酸菌によるイソフラボングリコシドの物質代謝の活性形態であるアグリコンへの転換および脂肪とコレステロール代謝に及ぼす影響について調査した。その結果、乳酸菌は、イソフラボンの効能増進を誘導することができないことが明らかになった。かかる理由は、乳酸菌による生物転換効率が低いからであると考えられる(Ali、et al.,J Nutr Biochem.2004.15:583‐90)。さらに他の報告によると、乳酸菌ビフィドバクテリウムによる非配糖体への転換は、豆乳を添加しなかった場合、73〜74%以下と認められた。しかし、豆乳を添加した場合、84〜85%と転換率が増加した(2007 11.Newhope360.com)。
一方、サポニン(saponin)は、ステロイド(steroid)、ステロイドアルカロイド(steroid alkaloid)あるいはトリテルペン(triterpene)の配糖体であり、水に溶けて石鹸のように発泡作用を示す物質の総称である。サポニンは人体免疫力を増強させる成分であり、特に、オタネニンジンに含有されたサポニンが有名である。オタネニンジンには、32種に至る様々なサポニンが多量含有されている。特に、オタネニンジンを加工した紅参にだけ入っているサポニンは、長期服用した場合、成人病の治療に相当な効果を奏するものと知られている。オタネニンジンサポニンは、すべてのがん細胞を抑制することができる。白内障に関する実験でもオタネニンジンサポニンは、優れた効果を示した。ジンセノサイド(オタネニンジンの配糖体サポニン)は、同分子内に炭水化物(糖体;glycone)と非炭水化物残基(無糖体;aglycone)を有している化合物である。炭水化物残基が非炭水化物残基と1番の炭素位置でacetal linkageで結合する。非糖類成分をアグリコン(aglycone)とし、糖類成分をグリコン(glycone)とする。炭水化物部位がブドウ糖の場合にはグルコシド(glucoside)とする。したがって、オタネニンジンの配糖体であるジンセノサイドを加水分解すると、糖体と非配糖体であるサポゲニン(sapogenin)に分解される。
イソフラボン配糖体を加水分解する微生物は、ビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)、ラクトバチルスブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、アスぺルギルスニガー(Aspergillus niger)およびサッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora erythraea)などがあり、これらはいずれも共通してβ‐グルコシダーゼを生産する細菌である。その他にも配糖体イソフラボンを非配糖体イソフラボンに効率よく転換することができる高い力価のβ‐グルコシダーゼを生産する微生物を開発するための研究が行われ続けている。
しかし、従来の技術は、複雑で複数のステップの工程を含んでおり、生産率の低下、生産コストの増加、精製過程での汚染可能性などの問題がある。
かかる技術的背景下で、本出願の発明者らは、β‐グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体を非配糖体に転換した後、微生物内に転換された非配糖体を細胞内に蓄積し、これを含有する微生物またはその破砕物を原料として使用することにより既存の問題点を改善することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、β‐グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体から転換された非配糖体を高濃度に製造することができる微生物を製造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記方法により製造された非配糖体を細胞内に蓄積した、非配糖体含有微生物またはその破砕物およびその用途を提供することにある。
本発明は、β‐グルコシダーゼを発現する微生物を配糖体含有培地で培養するか、配糖体含有反応物と反応させて、前記微生物内に配糖体から転換された非配糖体を蓄積させるステップを含む、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物を製造する方法を提供する。
また、本発明は、前記方法により製造され、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物またはその破砕物を提供する。
また、本発明は、前記微生物またはその破砕物を含有する組成物を提供する。
また、本発明は、前記微生物またはその破砕物を含有する食品を提供する。
さらに、本発明は、前記微生物またはその破砕物を含有する肌機能改善用組成物を提供する。
従来、微生物を用いた配糖体の非配糖体への転換が試みされたが、微生物が転換された非配糖体を細胞内に含有していることは未だに報告されておらず、そのため、本発明に係る微生物による非配糖体への生物転換および微生物の細胞内蓄積に関する結果は新規のものである。本出願の発明者らは、微生物の細胞内に蓄積された非配糖体の濃度は微生物培養培地の中で非配糖体の濃度より2倍以上高く、高濃度の非配糖体を生産することができることを確認した。
プロバイオティクスの作用メカニズムとしては、腸内環境のリモデリング、病原体の抑制、proinflammatory factor抑制、上皮細胞分化に対する影響、腸内腸壁効果の強化などが知られている。大腸がん抑制に対するプロバイオティクスの作用は、様々な生化学的経路があるが、細胞周期、活性酸素、細胞自滅、特定の細菌性酵素の生産、および宿主代謝により大腸がんの発生を抑制する。また、乳酸菌は、免疫系統を活発化する免疫活性化作用により疾病から身体を保護する。腸表面の絨毛で乳酸菌は白血球やリンパ球のような兔疫細胞とinteractionをし、免疫力の活性を促進させる。乳酸菌は、human colon cancer cellsでhBD2(human beta defensin)の発現を誘導することで腸内免疫を調節する。また、腸細胞であるCaCO2でのlactobacillusの露出によってinflammatory cytokineであるIL‐8の生成とHsp70の発現の抑制が行われるとされている。これにより、乳酸菌がcytokineを調節することで炎症反応を調節するが、直接関与していることが分かる。また、腸内細胞でLactobacillusは自己免疫反応とTLR(Toll‐like receptor)の発現を調節する。これは、乳酸菌による腸内の健康調節作用がTLR signalingと関連することを意味する。
ラクトバチルスプランタルムK8は、オタネニンジンサポニンを配糖体の形態で吸収した後、β‐glucosidaseを用いて糖と非配糖体とに分解する。糖は、乳酸菌の代謝過程で使用される一方、非配糖体の場合、乳酸菌の新陳代謝に不要な物質であるため、体内に蓄積した後、時間が経つにつれて細胞外に排出させると思われる。非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8を動物を用いた実験で変形させていないオタネニンジンサポニン(サポニン抽出物)を摂取した場合に比べて1,300倍以上高い体内吸収率を示した(実施例7)。かかる高い吸収率は、乳酸菌がカプセルの働きをすることで、胃でサポニンの破壊を防止し安全に腸内に伝達することができることが一つの理由である。また、非配糖体サポニン含有乳酸菌は、腸細胞内に存在する大食細胞(Tissue Resident Macrophage)により選択的にup takeされた後、lamina propriaまたはlymph nodeに移動されて非配糖体サポニンを血管に排出すると予想される(図5)。
これに基づき、一観点から本発明は、β‐グルコシダーゼを発現する微生物を配糖体含有培地で培養するか、配糖体含有反応物と反応させて、前記微生物内に配糖体から転換された非配糖体を蓄積させるステップを含む、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物を製造する方法に関するものである。
本発明で使用される微生物は、非配糖体生産活性を示す。具体的に、β‐グルコシダーゼ活性により配糖体を非配糖体の形態に転換する能力を有している。嫌気的条件下で配糖体の形態(genistin、diadzin)を非配糖体の形態(genistein、diadzein)のイソフラボンを生産する能力がある。かかる微生物を破砕する場合、細胞内に蓄積されている非配糖体を検出することができる(図1)。
前記微生物は、β‐グルコシダーゼを生産する微生物であれば特に制限されないが、例えば、乳酸菌、ラクトコッカス、コリネバクテリウム、GRAS(Generally recognized as safe)微生物、ビフィダス、酵母、バチルス、アスペルギルスおよびクロストリジウムから構成される群から選択された一つ以上であってもよい。前記乳酸菌は、ラクトバチルスプランタラム(L.plantarum)、ラクトバチルスサケイ(L.sakei)、ラクトバチルスラムノーサスGG(L.rhamnosus GG)、ラクトバチルスデルブリッキー(L.delbrueckii)、ラクトバチルスアシドフィルス(L.acidophilus)、ラクトバチルスジョンソニー(L.johnsonii)、ラクトバチルスカゼイ(L.casei)、ラクトバチルスガセリ(L.gasseri)およびリューコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroid)から構成される群から選択された一つ以上であってもよい。
本出願の発明者らは、韓国の伝統発酵食品であるキムチからβ‐グルコシダーゼを生産するラクトバチルスプランタルムK8を分離・同定した。先ず、キムチとキムチ汁を滅菌生理食塩水を使用して10倍ずつ段階的に希釈した後、原液と希釈液をラクトバチルス選択培地(Lactobacillus selective agar、LBS agar、Difco)に塗抹した。37℃で2〜3日間培養して示されたコロニーを形および色別に区別しまた純粋分離した。分離したコロニーに対してグラム染色および顕微鏡観察を行い、グラム陽性で棒状のコロニーのみを選別しており、これらをpH6.8のLactobacilli MRS液体培地(Difco)で37℃、24時間培養して培養液のpHが4.5以下に減少するコロニーを再選別した。次に、pH2.0のMRS培地で2時間培養した後、また0.3%のoxgallが添加されたMRS培地内で9時間培養した場合に生存が可能な耐酸性、耐胆汁性Lactobacillus菌株を分離した。分離した菌株はAPI CHL 50 kitを用いた生化学テストと16S rRNA sequencingにより同定した。同定の結果、Lactobacillus plantarum種に属する菌株であることを確認しており、これを「Lactobacillus plantarum K8」と名付けた(寄託番号:KCTC 10887BP)。
他の実施例において、前記β‐グルコシダーゼを生産する微生物は、GRAS(Generally recognized as safe)微生物、ビフィダス、酵母、Bacillus licheniformis、S.thermophilus、L.casei、Streptomyces sp.Bifidobacteria、Lactobacillus delbrueckii Rh2、Sporosarcina sp.,Saccharomyces cerevisiae、Pyrococcus furiosus、Lactobacillus plantarum、Aspergillus ochraceus、Lactobacillus delbrueckii Rh2、Pseudomonas sp.,Aspergillus niger、Pseudomonas fluorescens、Bifidobacterium adolescentis、Aspergillus sojae、Cunninghamella blakesleeana、Bifidobacteria and Lactobacillus、lactic acid bacteria、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Penicillium melinii、Eubacterium ramulus、Clostridium orbiscindens、Aspergillus awamori、Lactobacillus brevis、Aspergillus parasiticus Speare BGB、Aspergillus aculeatus、Aspergillus nigerから構成される群から選択された一つ以上であってもよい。
非配糖体イソフラボンまたはサポゲニン含有乳酸菌を作製するために、Lactobacillus plantarum K8を大豆抽出物または配糖体サポニンを添加した培地に培養し、microfluidizerを用いて破砕した後、破砕された乳酸菌を溶媒系統分画により分画した。イソフラボンまたはサポゲニンが存在するEtOAc分画に対して2,000ppm濃度で調剤した後、LC‐MS/MSを使用して分析を行った。破砕後、非配糖体イソフラボンであるdaidzeinとgenisteinの含有量とアグリコンサポゲニンであるRg3の含有量が増加することを確認することができた。
Lactobacillus plantarum K8をsonicatorまたはmicrofluidizerを用いて破砕した後、凍結乾燥させることで、「Lactobacillus plantarum K8‐LTA」細胞破砕物を製造した。具体的に、前記ステップ(a)は、微生物活性化のために静置培養するステップ、振盪培養するステップ、および流加培養するステップを順に含むことができる。この際、37℃で12時間微生物を静置培養し、37℃で12時間6rpmの条件で振盪培養することができる。微生物を培養するために、炭素源、窒素源、ビタミンおよびミネラルから構成される培地(例えばMRS培地)を使用することができる。
場合に応じて、ステップ(a)前に配糖体含有植物体をタンパク質分解酵素で前処理するステップをさらに含んでもよい。前記タンパク質分解酵素は、例えば、プロモード(promod)、アルカラーゼ(alkalase)、ニュートラーゼ(neutrase)およびパパイン(papain)から構成される群から選択される一つ以上であってもよい。
具体的に、詳細な製造工程は、以下の「製造工程表」と表1に記述した。
[製造工程表]
菌体循環生物反応器(Membrane Cell‐recycling Reactor:MCR)製造工程
1)発酵ライン殺菌:スチームを用いて発酵管に流入されるラインを殺菌する。
2)発酵槽、フィーディングタンク空殺菌:Sparger、samplingおよび下部steamを用いてタンク内部にsteamを注入させて121±1℃1.2〜1.5kgf/cm2の条件で15〜20分間殺菌する。
3)原料秤量および培地殺菌:製品の規格に応じて培養培地の原料を各々正確に秤量した後、これをいずれも発酵槽およびフィーディングタンク内に挿入して容量に合わせて水量を調節した後、2)の条件通りに滅菌する。
4)冷却:滅菌後、37℃まで冷却する。
5)種菌活性化:凍結された乳酸菌体を37℃恒温槽で急速に解凍させた後、滅菌された培養培地1.5Lに接種して12時間静置培養する。
6)本培養:滅菌された本培養培地30Lに1/100で希釈させた種菌を培養する。
7)流加培養:培養条件が常に維持されるように随時に点検する。Optical Density(OD)値が設定値に至ると、メンブレンを循環させて使用培地を除去し、排出された量だけの新しい培地をフィーディングタンクに投入する。約200Lの培地を連続して除去および投入し菌体を培養する。
8)濃度調節:drainラインをスチームで30分間殺菌した後、drainラインに液を流して遠心分離し、適正量の逆浸透圧蒸留水で希釈して濃度を調節する。
9)生菌回数および製品包装または菌体破砕:濃度調節された菌体を菌体破砕器で破砕する。
10)死菌化:破砕菌体を80℃で30分間維持させて培養液を死菌化しまた冷却させる。目的に応じて死菌化は除いてもよい。
11)菌体回収および包装:冷却した液をタンクドレインラインを用いてポリエチレン(PE)ビンに入れて包装する。
菌体循環生物反応器(Membrane Cell‐recycling Reactor:MCR)製造工程
1)発酵ライン殺菌:スチームを用いて発酵管に流入されるラインを殺菌する。
2)発酵槽、フィーディングタンク空殺菌:Sparger、samplingおよび下部steamを用いてタンク内部にsteamを注入させて121±1℃1.2〜1.5kgf/cm2の条件で15〜20分間殺菌する。
3)原料秤量および培地殺菌:製品の規格に応じて培養培地の原料を各々正確に秤量した後、これをいずれも発酵槽およびフィーディングタンク内に挿入して容量に合わせて水量を調節した後、2)の条件通りに滅菌する。
4)冷却:滅菌後、37℃まで冷却する。
5)種菌活性化:凍結された乳酸菌体を37℃恒温槽で急速に解凍させた後、滅菌された培養培地1.5Lに接種して12時間静置培養する。
6)本培養:滅菌された本培養培地30Lに1/100で希釈させた種菌を培養する。
7)流加培養:培養条件が常に維持されるように随時に点検する。Optical Density(OD)値が設定値に至ると、メンブレンを循環させて使用培地を除去し、排出された量だけの新しい培地をフィーディングタンクに投入する。約200Lの培地を連続して除去および投入し菌体を培養する。
8)濃度調節:drainラインをスチームで30分間殺菌した後、drainラインに液を流して遠心分離し、適正量の逆浸透圧蒸留水で希釈して濃度を調節する。
9)生菌回数および製品包装または菌体破砕:濃度調節された菌体を菌体破砕器で破砕する。
10)死菌化:破砕菌体を80℃で30分間維持させて培養液を死菌化しまた冷却させる。目的に応じて死菌化は除いてもよい。
11)菌体回収および包装:冷却した液をタンクドレインラインを用いてポリエチレン(PE)ビンに入れて包装する。
さらに他の実施例において、培地に微生物を接種してから培養した後、配糖体が含有された最小培地に移して1〜36時間、例えば、4〜24時間さらに培養することができる。本発明の実施例6によれば、微生物を配糖体が含有された最小培地を用いて培養する場合、同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたMRS培地で培養した対照群に比べて非配糖体の細胞内蓄積が増加することができることを確認した。
一つの実施例において、前記配糖体は、オタネニンジン、山参、大豆、ツルニンジン、ソバ、キキョウ、セリ、緑豆、ニンニク、タマネギ、イチョウ、クズから構成される群から選択される一つまたはこれらの混合物来由であってもよい。
前記配糖体は、イソフラボン配糖体、サポニン配糖体、フェノール配糖体(フェノール)、青酸配糖体(ニトリル配糖体)、アントラキノン配糖体、強心配糖体、苦味配糖体(苦味物質)、クマリン配糖体(クマリン)、硫黄配糖体(チオグリコシド、硫黄)またはフラボノイド配糖体(フラボノイド)であってもよく、例えば、本発明に係る方法は、ダイジン(daidzin)、ゲニスチン(genistin)、グリシテイン(glycitin)、サポニン(saponin)、procyanidin、naringenin、quercetin、rutinose、hesparidin、baicalin、wogonoside、Mogroside V、amygdalinおよび3‐Phenyl coumarinから構成される群から選択された一つ以上の配糖体をゲニステイン(genistein)、ダイゼイン(daidzein)、グリシテイン(glycitein)、サポゲニン(sapogenin)、3,4‐Hydroxyphenylactic acid、4‐HPA、m‐coumaric acid、p‐coumaric acid、O‐beta‐D‐glucuroniodes、stilbenoids、rutin、quercetin、hesparetin、baicalein、wogonin、Mogroside IIIE、mendelonitrile、benzaldehyde、およびcoumarin‐derivated compoundsから構成される群から選択された一つ以上の非配糖体に転換するものであってもよい。
かかる製造方法により生産された非配糖体は細胞内に蓄積されてもよい。これに基づき、本発明は、他の観点から、前記製造方法により生産された非配糖体を細胞内蓄積した微生物またはその破砕物に関するものである。前記細胞内蓄積された非配糖体の濃度は、微生物培養培地の中で非配糖体の濃度より2倍以上高いことを確認した。
前記破砕物は、物理的な方法を使用して作製することができる。例えば、微生物をビーズミル(bead mills)、プレス(Presses)、ソニケータ(Sonicator)またはマイクロフルイダイザー(Microfluidizer)を使用して4〜9回破砕させた後、凍結乾燥して粉末化させることができる。必要に応じて破砕菌体を80℃で30分間維持させて培養液を死菌化しまた冷却させてもよい。
本発明は、さらに他の観点から、前記微生物またはその破砕物を含有する組成物に関するものである。
前記微生物またはその破砕物は、抗酸化用組成物、整腸用組成物、化粧品原料組成物、生菌用組成物として使用され得る。特に、飼料用組成物、食品添加用組成物およびその他の発酵製品としても使用され得る。本発明に係る微生物またはその破砕物の破砕された細胞壁の分画、生菌、死菌、乾燥菌または培養物を有効成分として含んでもよく、賦形剤または担体をさらに含んでもよい。
前記培養物は、液体培地で培養した培養液自体、前記培養液をろ過または遠心分離して菌株を除去したろ液(遠心分離した上澄み液)、前記培養液を超音波処理または酵素(lysozyme)処理して得た細胞破砕液などを含む。本発明の組成物内の微生物またはその破砕物に対する含有量は組成物の用途および剤形に応じて異なり得る。
本発明に係る組成物は、様々な剤形と方法で製造および投与され得る。例えば、微生物またはその破砕物または培養物を薬剤学的分野において通常使用する担体および香料と混合し、タブレット(tablet)、トローチ(troche)、カプセル(capsule)、エリキシル(elixir)、シロップ(syrup)、散剤(powder)、懸濁剤(suspension)または顆粒剤(granule)などの形態に製造および投与されてもよい。前記担体としては、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤などを使用してもよい。投与方式は、経口、非経口または塗布法を使用してもよく、投与容量は、体内で活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、被投与者の年齢、性別、状態などに応じて適宜選択してもよい。好ましくは、1日10mgの有効容量で投与してもよく、生菌剤用組成物の場合、組成物内の生菌数は108〜1010CFU/日であることが好ましい。
前記抗酸化用組成物は、活性酸素を除去するために用いられてもよく、整腸用組成物または生菌剤組成物は、イソフラボンの体内吸収を促進して消化不良または下痢を予防または改善することができる。
また、前記飼料用組成物は、発酵飼料、配合飼料、ペレット形態およびサイレージ(silage)などの形態に製造され得る。前記発酵飼料は、本発明における微生物またはその破砕物と様々な他の公知の微生物または酵素を添加することで有機物を発酵させて製造されてもよく、前記配合飼料は、様々な種類の一般飼料と本発明の乳酸菌を混合して製造されてもよい。ペレット形態の飼料は、発酵飼料または配合飼料をペレット機械で剤形化して製造されてもよく、サイレージは、青刈飼料を本発明に係る乳酸菌で発酵させることで製造されてもよい。
また、微生物またはその破砕物またはその培養物は、離乳食、キムチ、飲料、乳製品などの食品に対する食品添加剤として使用され得る。
また、本発明は、微生物またはその破砕物を含有する食品に関するものである。
本発明に係る微生物またはその破砕物またはその培養物は、化粧品組成物として使用されてもよく、具体的には、基礎化粧用、化粧用化粧品用、毛髪用化粧品用、美白用化粧品用、シワ改善用化粧品用、老化抑制化粧品用などの様々な用途に用いられてもよい。
さらに、本発明は、微生物またはその破砕物を含有する肌機能改善用組成物を提供する。前記肌機能改善は、肌保湿、肌色、肌弾力、シワまたは真皮緻密度を改善することを意味し得る。
さらに、本発明に係る微生物またはその破砕物は、発酵製品の製造のための種菌として使用され得る。前記発酵製品は、ハムおよびソーセージのような発酵肉製品、発酵生食製品、発酵乳製品、発酵大豆液、キムチなどを含む。発酵製品は、当業界において公知の通常の方法により製造され得る。例えば、前記発酵生食製品は、玄米とハトムギなどの穀類粉末、果菜類粉末、キノコ類粉末に微生物またはその破砕物原末を混合して製造されるか、前記穀類粉末を微生物またはその破砕物またはこれを含む2〜5種の混合乳酸菌で適正温度で発酵させた後、果菜類、キノコ類粉末を栄養的なバランスと嗜好性に優れるように適宜配合して製造されてもよい。また、前記発酵乳製品は、原乳または脱脂粉乳を本発明に係る乳酸菌またはこれを含む2〜5種の混合乳酸菌で適正温度で発酵させて製造されてもよく、前記発酵大豆液は、大豆液を本発明に係る乳酸菌またはこれを含む2〜5種の混合乳酸菌で適正温度で発酵させて製造されてもよい。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
実施例1:ラクトバチルスプランタルムK8の生化学的特性の検査
韓国の伝統発酵食品であるキムチから分離・同定したラクトバチルスプランタルムK8の抗酸化活性を評価するためにAPI test(Biomerieux、France)を行った。前記乳酸菌の生化学的な特性と糖利用性は、下記の表2と表3に記載の通りである。
韓国の伝統発酵食品であるキムチから分離・同定したラクトバチルスプランタルムK8の抗酸化活性を評価するためにAPI test(Biomerieux、France)を行った。前記乳酸菌の生化学的な特性と糖利用性は、下記の表2と表3に記載の通りである。
実施例2:ラクトバチルスプランタルムK8の非配糖体生産
ラクトバチルスプランタルムK8を大豆抽出物を添加した培地に培養し、マイクロフルイダイザーを用いて破砕した後、破砕された乳酸菌を溶媒系統分画により分画した。イソフラボンが存在するEtOAc分画に対して2000ppm濃度に調剤した後、LC‐MS/MSを使用して分析を行った。その結果、大豆原料の場合、配糖体イソフラボンであるdaidzinとgenistinの含有量が高い一方、ラクトバチルスプランタルムK8との培養後、非配糖体イソフラボンであるdaidzeinとgenisteinの含有量が増加することを確認することができた。一方、配糖体イソフラボンの含有量は、ラクトバチルスプランタルムK8との培養後に減少した(図1)。本発明に係るラクトバチルスプランタルムK8を接種する前に、1ml/Lのアルカラーゼ、1ml/Lのニュートラーゼおよび0.2g/Lのパパインを加えて60℃で8時間攪拌する前処理過程を含む場合、非配糖体への転換後、細胞内蓄積率が約10%増加した(表4)。
ラクトバチルスプランタルムK8を大豆抽出物を添加した培地に培養し、マイクロフルイダイザーを用いて破砕した後、破砕された乳酸菌を溶媒系統分画により分画した。イソフラボンが存在するEtOAc分画に対して2000ppm濃度に調剤した後、LC‐MS/MSを使用して分析を行った。その結果、大豆原料の場合、配糖体イソフラボンであるdaidzinとgenistinの含有量が高い一方、ラクトバチルスプランタルムK8との培養後、非配糖体イソフラボンであるdaidzeinとgenisteinの含有量が増加することを確認することができた。一方、配糖体イソフラボンの含有量は、ラクトバチルスプランタルムK8との培養後に減少した(図1)。本発明に係るラクトバチルスプランタルムK8を接種する前に、1ml/Lのアルカラーゼ、1ml/Lのニュートラーゼおよび0.2g/Lのパパインを加えて60℃で8時間攪拌する前処理過程を含む場合、非配糖体への転換後、細胞内蓄積率が約10%増加した(表4)。
実施例3:非配糖体生産活性の評価
乳酸菌の非配糖体イソフラボン転換能および細胞内非配糖体イソフラボン蓄積能を確認するために、ラクトバチルスデルブリッキー(L.delbrueckii)、ラクトバチルスラムノーサスGG(L.rhamnosus GG)、ラクトバチルスプランタルムK8(L.plantarum K8)、ラクトバチルスサケイ(L.sakei)を大豆extractsが含有された培養培地に接種し、37℃で12時間培養した後、microfluidizerを用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、LC/MS‐MSによりイソフラボンの含有量を測定し図2に示した。その結果、4種の乳酸菌のすべてから非配糖体daidzeinとgenisteinが検出された(図2)。かかる結果は、β‐グルコシダーゼを分泌する全種類の乳酸菌または微生物によって配糖体イソフラボンを非配糖体イソフラボンに生物転換することができるということを意味し、また、転換された非配糖体イソフラボンを細胞内に蓄積することができるということを示す結果である。
乳酸菌の非配糖体イソフラボン転換能および細胞内非配糖体イソフラボン蓄積能を確認するために、ラクトバチルスデルブリッキー(L.delbrueckii)、ラクトバチルスラムノーサスGG(L.rhamnosus GG)、ラクトバチルスプランタルムK8(L.plantarum K8)、ラクトバチルスサケイ(L.sakei)を大豆extractsが含有された培養培地に接種し、37℃で12時間培養した後、microfluidizerを用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、LC/MS‐MSによりイソフラボンの含有量を測定し図2に示した。その結果、4種の乳酸菌のすべてから非配糖体daidzeinとgenisteinが検出された(図2)。かかる結果は、β‐グルコシダーゼを分泌する全種類の乳酸菌または微生物によって配糖体イソフラボンを非配糖体イソフラボンに生物転換することができるということを意味し、また、転換された非配糖体イソフラボンを細胞内に蓄積することができるということを示す結果である。
実施例4:乳酸菌の工程別の非配糖体イソフラボン生産活性
乳酸菌破砕物の作製過程中のイソフラボンの含有量を測定する実験を行った。大豆抽出物が含有された培地にラクトバチルスラムノーサスGG、ラクトバチルスデルブリッキー、ラクトバチルスプランタルムK8を37℃で12時間培養した後、滅菌水を用いて3回洗浄した。洗浄した洗浄液と乳酸菌破砕物をそれぞれLC/MS‐MSを用いてイソフラボンの含有量を測定した。その結果、3回の洗浄液および乳酸菌破砕物から配糖体イソフラボンは検出されなかった。一方、非配糖体イソフラボンの場合、洗浄液から少量検出され、乳酸菌破砕物から高濃度に検出された(図3)。さらに他の実験において、ラクトバチルスプランタルムK8培養培地(Media)、培養後の培地(Culture sup.)、洗浄液(Wash 1、2、3)、乳酸菌破砕物(Lysates)、乳酸菌破砕物上澄み液(Lysates sup.)、乳酸菌破砕物沈殿液(Lysates ppt.)での配糖体および非配糖体イソフラボンの含有量を測定した。その結果、乳酸菌破砕物(Lysates)、乳酸菌破砕物上澄み液(Lysates sup.)、乳酸菌破砕物沈殿液(Lysates ppt.)においてイソフラボン、特に非配糖体イソフラボンの含有量が大幅に増加したことを確認した(表5)。かかる結果は、非配糖体イソフラボンが乳酸菌に付いていたとか、残留培養液から起因したと言えず、つまり、乳酸菌内に蓄積されていることを意味する。
乳酸菌破砕物の作製過程中のイソフラボンの含有量を測定する実験を行った。大豆抽出物が含有された培地にラクトバチルスラムノーサスGG、ラクトバチルスデルブリッキー、ラクトバチルスプランタルムK8を37℃で12時間培養した後、滅菌水を用いて3回洗浄した。洗浄した洗浄液と乳酸菌破砕物をそれぞれLC/MS‐MSを用いてイソフラボンの含有量を測定した。その結果、3回の洗浄液および乳酸菌破砕物から配糖体イソフラボンは検出されなかった。一方、非配糖体イソフラボンの場合、洗浄液から少量検出され、乳酸菌破砕物から高濃度に検出された(図3)。さらに他の実験において、ラクトバチルスプランタルムK8培養培地(Media)、培養後の培地(Culture sup.)、洗浄液(Wash 1、2、3)、乳酸菌破砕物(Lysates)、乳酸菌破砕物上澄み液(Lysates sup.)、乳酸菌破砕物沈殿液(Lysates ppt.)での配糖体および非配糖体イソフラボンの含有量を測定した。その結果、乳酸菌破砕物(Lysates)、乳酸菌破砕物上澄み液(Lysates sup.)、乳酸菌破砕物沈殿液(Lysates ppt.)においてイソフラボン、特に非配糖体イソフラボンの含有量が大幅に増加したことを確認した(表5)。かかる結果は、非配糖体イソフラボンが乳酸菌に付いていたとか、残留培養液から起因したと言えず、つまり、乳酸菌内に蓄積されていることを意味する。
実施例5:乳酸菌によるサポニンのサポゲニンへの転換
オタネニンジンサポニンの非配糖体サポゲニンへの転換および細胞内蓄積を確認するために、ラクトバチルスプランタラムK8を人参抽出物が添加された培養液で培養した後、microfluidizerを使用して乳酸菌を破砕した。破砕後、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。その結果、イソフラボンでの結果と同じ脈絡でラクトバチルスプランタルムK8がジンセノサイドをuptakeしたことを確認した(washingと破砕物のarea値比較)。すなわち、洗浄液および人参抽出物では認められなかったピークが乳酸菌破砕物で認められたが、これは、乳酸菌の酵素によってtransfomationされたことが分かる(点線で表されたボックスで表示)。人参ジンセノサイド転換の核心は、量が多く活性が良好でないジンセノサイド、すなわち、rg1とrb1などで量は少ないが活性には優れたrg3、rc、f2などのジンセノサイドへの転換である。本実験結果でもラクトバチルスプランタルムK8によって高級サポニンの一種であるrg3に転換されたことを確認することができる。
オタネニンジンサポニンの非配糖体サポゲニンへの転換および細胞内蓄積を確認するために、ラクトバチルスプランタラムK8を人参抽出物が添加された培養液で培養した後、microfluidizerを使用して乳酸菌を破砕した。破砕後、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。その結果、イソフラボンでの結果と同じ脈絡でラクトバチルスプランタルムK8がジンセノサイドをuptakeしたことを確認した(washingと破砕物のarea値比較)。すなわち、洗浄液および人参抽出物では認められなかったピークが乳酸菌破砕物で認められたが、これは、乳酸菌の酵素によってtransfomationされたことが分かる(点線で表されたボックスで表示)。人参ジンセノサイド転換の核心は、量が多く活性が良好でないジンセノサイド、すなわち、rg1とrb1などで量は少ないが活性には優れたrg3、rc、f2などのジンセノサイドへの転換である。本実験結果でもラクトバチルスプランタルムK8によって高級サポニンの一種であるrg3に転換されたことを確認することができる。
実施例6:最小培地を用いた非配糖体の細胞内蓄積の増大
ラクトバチルスプランタルムK8をMRS培地5mLに接種した後、37℃で24時間静置培養してからMRS培地50mLに移して12時間さらに培養した。培養された細胞を1LのMRS培地に移した後、15時間培養してからPBSで3回洗浄をした。洗浄した細胞は、配糖体サポニンが含まれたM9 Minimal medium(最小培地)1L、配糖体サポニンとlysozyme(0.5g/L)が含まれたMRS培地に同数を接種した後、6時間静置培養をした。他の実験では、配糖体サポニンが含まれたMRS培地に細胞を移した後、42℃で6時間を培養した。対照群としては同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたMRS培地で6時間培養した。培養された細胞は、洗浄後、microfluidizerを使用して細胞を破砕し、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。M9最小培地を使用した細胞の場合、対照群に比べて3.84倍以上非配糖体サポゲニン化合物が増加すると示された(表6)。
ラクトバチルスプランタルムK8をMRS培地5mLに接種した後、37℃で24時間静置培養してからMRS培地50mLに移して12時間さらに培養した。培養された細胞を1LのMRS培地に移した後、15時間培養してからPBSで3回洗浄をした。洗浄した細胞は、配糖体サポニンが含まれたM9 Minimal medium(最小培地)1L、配糖体サポニンとlysozyme(0.5g/L)が含まれたMRS培地に同数を接種した後、6時間静置培養をした。他の実験では、配糖体サポニンが含まれたMRS培地に細胞を移した後、42℃で6時間を培養した。対照群としては同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたMRS培地で6時間培養した。培養された細胞は、洗浄後、microfluidizerを使用して細胞を破砕し、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。M9最小培地を使用した細胞の場合、対照群に比べて3.84倍以上非配糖体サポゲニン化合物が増加すると示された(表6)。
実施例7:マウスの血液からの人参ジンセノサイド検出
3日間、オタネニンジン抽出物と機能性非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8を摂取したマウスから分離した血液でオタネニンジンサポニンの含有量を測定した。オタネニンジン抽出物の場合、全摂取量1,085,630ngのうち約150ngのオタネニンジンサポニンが吸収されていることが認められた。一方、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8によって摂取されたオタネニンジン抽出物の量は11,653ngであり、このうち、血液から検出されたオタネニンジンサポニンの全含有量は約2160ngである(図6)。これを割合で換算すると、オタネニンジン抽出物の場合には0.014%の吸収率を示した一方、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8によるオタネニンジンサポニンの吸収率は約20%に達する(図7)。
3日間、オタネニンジン抽出物と機能性非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8を摂取したマウスから分離した血液でオタネニンジンサポニンの含有量を測定した。オタネニンジン抽出物の場合、全摂取量1,085,630ngのうち約150ngのオタネニンジンサポニンが吸収されていることが認められた。一方、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8によって摂取されたオタネニンジン抽出物の量は11,653ngであり、このうち、血液から検出されたオタネニンジンサポニンの全含有量は約2160ngである(図6)。これを割合で換算すると、オタネニンジン抽出物の場合には0.014%の吸収率を示した一方、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8によるオタネニンジンサポニンの吸収率は約20%に達する(図7)。
特に、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8を摂取したマウスではF2とRg3オタネニンジンサポニンが多量吸収されると示されたが、F2とRg3はオタネニンジンサポニンの中でも最大の機能性を有していると知られている。
オタネニンジン抽出物は、多量摂取しても吸収率が低いため、摂取量の面であまり意味がない。一方、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8の場合、抽出物を直接摂取することに比べて約1300倍以上高い吸収率を示す。すなわち、同一の100gのオタネニンジン抽出物を摂取する場合、直接摂取する場合には摂取した量の99%以上が吸収されず捨てられる一方、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8は20gを吸収することができる。かかる結果は、非配糖体含有ラクトバチルスプランタルムK8内に存在する低分子オタネニンジンサポニンがマウスの消化過程を経る間に乳酸菌によって自然に保護されたことを意味する。
実施例8:Yeastを用いた非配糖体サポニンの細胞内蓄積
saccharomyces cerevisiaeを5mlのYPD培地に接種し、37℃で24時間振盪培養した後、オタネニンジン抽出物(1g/L)が添加された500mlのYPD培地に移した後、12時間さらに培養した。遠心分離後、上澄み液は別に冷蔵保管、pelletは滅菌蒸留水を用いて3回洗浄した。洗浄した酵母はmicrofluidizerを用いて3回破砕し、LC/MS‐MSにより非配糖体ジンセノサイド化合物を分析した。本実験において分析のために準備した試料は、培養後上澄み液(1)、洗浄1回(2)、洗浄2回(3)、洗浄3回(4)、破砕前(5)、破砕後(6)の総6群のsampleを準備した。その結果を以下の表7に示す。
saccharomyces cerevisiaeを5mlのYPD培地に接種し、37℃で24時間振盪培養した後、オタネニンジン抽出物(1g/L)が添加された500mlのYPD培地に移した後、12時間さらに培養した。遠心分離後、上澄み液は別に冷蔵保管、pelletは滅菌蒸留水を用いて3回洗浄した。洗浄した酵母はmicrofluidizerを用いて3回破砕し、LC/MS‐MSにより非配糖体ジンセノサイド化合物を分析した。本実験において分析のために準備した試料は、培養後上澄み液(1)、洗浄1回(2)、洗浄2回(3)、洗浄3回(4)、破砕前(5)、破砕後(6)の総6群のsampleを準備した。その結果を以下の表7に示す。
実施例9:ラクトバチルスプランタルムK8破砕物を含有する飴に対する臨床試験の結果
ラクトバチルスプランタルムK8破砕物(Lactobacillus plantarum K8‐LTA)に対する人体の肌保湿および肌色改善効能を評価するために臨床試験を行った。本研究は、依頼人の要請内容と人体適用試験ガイドライン(食品医薬品安全処、2011.12制定)、健康機能食品の人体適用試験(食品医薬品安全処、2008.12)および人体試験管理基準(Good Clinical Practice、GCP)に基づいて行われており、慶煕大学校臨床研究審議委員会の承認(研究番号KHUSBC 2012‐011)を得た。
ラクトバチルスプランタルムK8破砕物(Lactobacillus plantarum K8‐LTA)に対する人体の肌保湿および肌色改善効能を評価するために臨床試験を行った。本研究は、依頼人の要請内容と人体適用試験ガイドライン(食品医薬品安全処、2011.12制定)、健康機能食品の人体適用試験(食品医薬品安全処、2008.12)および人体試験管理基準(Good Clinical Practice、GCP)に基づいて行われており、慶煕大学校臨床研究審議委員会の承認(研究番号KHUSBC 2012‐011)を得た。
乾燥肌で肌色がくすみ始めたり既にくすみが進んだ25歳〜60歳の女性被験者41名を試験対象者として選定し、空腹に製品(表27)を朝2錠、夕方2錠を摂取した。選定された被験者に試験製品(2.1%Lactobacillus plantarum K8‐LTA含有飴)と対照製品(2.1%Lactobacillus plantarum K8‐LTAが含有されていない飴)を二重盲検の無作為割り付けで8週間服用するようにした後、試験製品の使用前、使用4週後、8週後の各時点で肌色の目視評価、肌水分、角質量、TEWL、肌色(L*value)およびアンケート評価、安全性評価、食餌調査、体重(BMIを含む)調査を行い、肌改善効果を評価した。また製品の服用前と製品服用8週後の時点で血液分析を行った。Lactobacillus plantarum K8‐LTAを含有する飴をLC/MS‐MSで分析して非配糖体イソフラボンが含まれていることを確認した(表8)。
1.目視評価の結果
製品の服用前と比較すると、製品服用4週後、8週後の時点で対照群、試験群のいずれも統計的に肌色(明度)が有意に改善(減少)した。群間比較の際に、製品服用4週後、8週後でグループ間の統計的な有意の差はなかった(p<0.05)。
製品の服用前と比較すると、製品服用4週後、8週後の時点で対照群、試験群のいずれも統計的に肌色(明度)が有意に改善(減少)した。群間比較の際に、製品服用4週後、8週後でグループ間の統計的な有意の差はなかった(p<0.05)。
2.機器の評価
2‐1.肌水分量
製品の服用前と比較すると、製品服用4週後の時点では、顔、前膊部位のいずれも試験群で、8週後の時点では顔部位では試験群と対照群のいずれも、前膊部位では試験群で統計的に有意に肌水分量が増加した。群間比較の際、顔部位では製品服用4週後、8週後の時点で、前膊部位では製品服用4週後の時点で対照群に比べて試験群で統計的に有意に肌水分量が増加した(p<0.05)(表8)。
2‐1.肌水分量
製品の服用前と比較すると、製品服用4週後の時点では、顔、前膊部位のいずれも試験群で、8週後の時点では顔部位では試験群と対照群のいずれも、前膊部位では試験群で統計的に有意に肌水分量が増加した。群間比較の際、顔部位では製品服用4週後、8週後の時点で、前膊部位では製品服用4週後の時点で対照群に比べて試験群で統計的に有意に肌水分量が増加した(p<0.05)(表8)。
2‐2.経皮水分蒸散量(TEWL)
製品の服用前と比較すると、製品服用8週後の時点で顔、前膊部位のいずれも試験群で統計的に有意にTEWLが減少した。群間比較の際、製品服用8週後の時点で前膊部位で対照群に比べて試験群で統計的に有意にTEWLが減少した(p<0.05)(表9)。
製品の服用前と比較すると、製品服用8週後の時点で顔、前膊部位のいずれも試験群で統計的に有意にTEWLが減少した。群間比較の際、製品服用8週後の時点で前膊部位で対照群に比べて試験群で統計的に有意にTEWLが減少した(p<0.05)(表9)。
2‐3.肌角質量
製品の服用前と比較すると、製品服用4週後、8週後に顔部位では試験群、前膊部位では対照群と試験群のいずれも肌角質量が統計的に有意に減少した。群間比較の際、顔、前膊部位のいずれも製品服用4週後、8週後の時点で対照群に比べて試験群で統計的に有意に肌角質量が減少した(p<0.05)(表10)。
製品の服用前と比較すると、製品服用4週後、8週後に顔部位では試験群、前膊部位では対照群と試験群のいずれも肌角質量が統計的に有意に減少した。群間比較の際、顔、前膊部位のいずれも製品服用4週後、8週後の時点で対照群に比べて試験群で統計的に有意に肌角質量が減少した(p<0.05)(表10)。
2‐4.肌色の明度(L*value)
製品の服用前と比較すると、頬の部位では製品服用4週後に試験群で、製品服用8週後の時点では対照群、試験群のいずれも有意に肌色の明度程度が増加し、色素沈着部位では製品服用4週後、8週後で対照群と試験群のいずれも有意に肌色の明度(L*value)程度が増加した(p<0.05)。群間比較の際、頬の部位では製品服用4週後、8週後の時点で色素沈着部位では製品服用8週後の時点で対照群に比べて試験群で有意に肌色の明度(L*value)程度が増加した(p<0.05)(表11)。
製品の服用前と比較すると、頬の部位では製品服用4週後に試験群で、製品服用8週後の時点では対照群、試験群のいずれも有意に肌色の明度程度が増加し、色素沈着部位では製品服用4週後、8週後で対照群と試験群のいずれも有意に肌色の明度(L*value)程度が増加した(p<0.05)。群間比較の際、頬の部位では製品服用4週後、8週後の時点で色素沈着部位では製品服用8週後の時点で対照群に比べて試験群で有意に肌色の明度(L*value)程度が増加した(p<0.05)(表11)。
2‐5.血液分析
分析の結果、製品の服用前と比較すると、製品服用8週後、T.Protein、Albumin、Creatinine項目は対照群で、T.Protein、Creatinine、Pulse項目は試験群で有意の差を示したが、パラメータの平均値はいずれも正常範囲内に存在した(p<0.05)。群間比較の際、製品服用8週後、すべてのパラメータで二つの群間に有意の差がなかった(表12)。
分析の結果、製品の服用前と比較すると、製品服用8週後、T.Protein、Albumin、Creatinine項目は対照群で、T.Protein、Creatinine、Pulse項目は試験群で有意の差を示したが、パラメータの平均値はいずれも正常範囲内に存在した(p<0.05)。群間比較の際、製品服用8週後、すべてのパラメータで二つの群間に有意の差がなかった(表12)。
2‐6.食餌調査および体重
分析の結果、製品の服用前と比較すると、製品服用8週後の時点の試験群で体重が有意に増加した以外は、食餌調査、体重、BMI指数のいずれも製品服用4週後、8週後の時点で有意の差がなかった(p<0.05)。群間比較の際、対照群と試験群のいずれも製品服用4週後、8週後の時点で食餌調査、体重、BMI指数の有意の差はなかった(p<0.05)(表13)。
分析の結果、製品の服用前と比較すると、製品服用8週後の時点の試験群で体重が有意に増加した以外は、食餌調査、体重、BMI指数のいずれも製品服用4週後、8週後の時点で有意の差がなかった(p<0.05)。群間比較の際、対照群と試験群のいずれも製品服用4週後、8週後の時点で食餌調査、体重、BMI指数の有意の差はなかった(p<0.05)(表13)。
3.アンケート評価の結果
3‐1.効能に関するアンケート分析の結果
「肌がしっとりとなった」、「滑らかになった」、「つっぱり減少」、「角質減少」、「肌が健康になった」項目は、製品服用4週後の時点と8週後の時点でそれぞれ被験者の60%、70%以上が対照製品、試験製品のすべてに対して肯定的に改善したと回答した。特に、「つっぱり減少」、「キメが整った」項目は、製品服用4週後の時点で対照製品に比べて試験製品で10%以上高く示された(表14)。
3‐1.効能に関するアンケート分析の結果
「肌がしっとりとなった」、「滑らかになった」、「つっぱり減少」、「角質減少」、「肌が健康になった」項目は、製品服用4週後の時点と8週後の時点でそれぞれ被験者の60%、70%以上が対照製品、試験製品のすべてに対して肯定的に改善したと回答した。特に、「つっぱり減少」、「キメが整った」項目は、製品服用4週後の時点で対照製品に比べて試験製品で10%以上高く示された(表14)。
3‐2.製品使用性に関するアンケート分析の結果
「咀嚼感」以外のすべての項目で被験者の70%以上が対照製品、試験製品のすべてに対して肯定的に回答した。特に、「製品の味」、「全体的な製品満足度」項目は、試験群で被験者の100%が満足すると回答した(表15)。
「咀嚼感」以外のすべての項目で被験者の70%以上が対照製品、試験製品のすべてに対して肯定的に回答した。特に、「製品の味」、「全体的な製品満足度」項目は、試験群で被験者の100%が満足すると回答した(表15)。
4.安全性評価の結果
本試験期間の間にすべての被験者からは、肌、全身的症状に何らの異常反応が観察されなかった。
本試験期間の間にすべての被験者からは、肌、全身的症状に何らの異常反応が観察されなかった。
以上の結果から、本試験製品は、肌水分、肌角質量、経皮水分蒸散量(TEWL)、肌色改善に役立つと判断される。
実施例9:ラクトバチルスプランタルムK8破砕物(Lactobacillus plantarum K8‐LTA)を含有する化粧品の製造および人体適用実験
臨床試験の結果
Lactobacillus plantarum K8‐LTAを含む化粧品3種を製造して人体の肌保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度改善効能を評価するための実験を行った。
臨床試験の結果
Lactobacillus plantarum K8‐LTAを含む化粧品3種を製造して人体の肌保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度改善効能を評価するための実験を行った。
シワおよび色素沈着が既に生成された35〜50歳の女性被験者32名を対象として試験を行った。試験製品(表16)を試験期間8週間連続使用するようにして、製品の使用前、4週後、8週後の時点で目視評価(目元シワ、肌色)と機器測定(肌の保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度)を行った。左側/右側の測定部位は、Block randomizationで決めており(A:左側頬の保湿、真皮緻密度、右側頬の色測定、弾力、目元シワ測定/B:右側頬の保湿、真皮緻密度、左側頬の色測定、弾力、目元シワ測定)、安全性およびアンケート評価は、製品使用4週後、8週後の時点で行った。
被験者は、洗顔後、空気の移動と直射光線がなく、恒温・恒湿条件(22±2℃、50±5%)が維持される空間で少なくとも20分以上休んでから機器測定に参加した。
1.目視評価
1‐1.時点別の目元シワの目視評価の分析
試験製品の使用前と比較すると、製品使用4週後、8週後の時点で有意にシワが改善することが認められ(P<0.05)、シワ改善最大増減率は5.50%の減少(改善)率を示した(表17)。
1‐1.時点別の目元シワの目視評価の分析
試験製品の使用前と比較すると、製品使用4週後、8週後の時点で有意にシワが改善することが認められ(P<0.05)、シワ改善最大増減率は5.50%の減少(改善)率を示した(表17)。
1‐2.時点別の肌色の目視評価の分析
試験製品の使用前と比較すると、製品使用4週後、8週後の時点で有意に肌色が改善したことが認められ(P<0.05)、肌色改善最大増減率は9.04%の減少(改善)率を示した(表18)。
試験製品の使用前と比較すると、製品使用4週後、8週後の時点で有意に肌色が改善したことが認められ(P<0.05)、肌色改善最大増減率は9.04%の減少(改善)率を示した(表18)。
2.機器測定
2‐1.水分量の測定
試験製品の使用前と比較すると、製品使用4週後、8週後の時点で水分量が統計的に有意に増加(改善)し(P<0.05)、水分量改善最大増減率は、42.97%の増加(改善)率を示した(表19)。
2‐1.水分量の測定
試験製品の使用前と比較すると、製品使用4週後、8週後の時点で水分量が統計的に有意に増加(改善)し(P<0.05)、水分量改善最大増減率は、42.97%の増加(改善)率を示した(表19)。
2‐2.肌色の明度(L*value)の測定
試験製品の使用前と比較すると、頬部位の肌色の明度程度は、製品使用4週後、8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)し、色素沈着部位の明度程度は、製品使用8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)した(P<0.05)。色明度改善最大増減率は頬部位が1.59%、色素沈着部位が1.25%の増加(改善)率を示した(表20)。
試験製品の使用前と比較すると、頬部位の肌色の明度程度は、製品使用4週後、8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)し、色素沈着部位の明度程度は、製品使用8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)した(P<0.05)。色明度改善最大増減率は頬部位が1.59%、色素沈着部位が1.25%の増加(改善)率を示した(表20)。
2‐3.肌弾力の測定(Moire topography system)
製品の使用前と比較すると、製品使用後4週後、8週後の時点で等高線の全距離(Distance)と平均角度(Angle)が統計的に有意に減少(改善)した(P<0.05)。等高線全長の最大減少率は9.64%であり、角度の最大減少率は14.70%であった(表21)。
製品の使用前と比較すると、製品使用後4週後、8週後の時点で等高線の全距離(Distance)と平均角度(Angle)が統計的に有意に減少(改善)した(P<0.05)。等高線全長の最大減少率は9.64%であり、角度の最大減少率は14.70%であった(表21)。
2‐4.目元シワの測定
製品の使用前と比較すると、製品使用後4週の時点でシワの平均深さ(Mean depth)と最大深さ(Max wrinkle depth)が統計的に有意に減少(改善)し、使用後8週の時点でシワの最大深さ(Max wrinkle depth)が統計的に有意に減少(改善)した(p<0.05)。
製品の使用前と比較すると、製品使用後4週の時点でシワの平均深さ(Mean depth)と最大深さ(Max wrinkle depth)が統計的に有意に減少(改善)し、使用後8週の時点でシワの最大深さ(Max wrinkle depth)が統計的に有意に減少(改善)した(p<0.05)。
「シワの平均深さ」の最大減少率は8.36%であり、「シワの最大深さ」の最大減少率は26.17%であった(表22)。
2‐5.肌真皮緻密度の測定
製品の使用前と比較すると、真皮の厚さ(distance)は、製品使用8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)し、真皮の密度(intensity)は、製品使用4週後、8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)した(p<0.05)。
製品の使用前と比較すると、真皮の厚さ(distance)は、製品使用8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)し、真皮の密度(intensity)は、製品使用4週後、8週後の時点で統計的に有意に増加(改善)した(p<0.05)。
真皮厚さの最大増加率は10.16%であり、真皮密度の最大増加率は13.55%であった(表23)。
3.アンケート評価
3‐1.効能に関するアンケート評価
製品使用4週後、8週後の時点で被験者らがアンケートを通じて回答した製品の効能に関する評価の結果は、以下のとおりである(表24)。
3‐1.効能に関するアンケート評価
製品使用4週後、8週後の時点で被験者らがアンケートを通じて回答した製品の効能に関する評価の結果は、以下のとおりである(表24)。
3‐2.製品使用性のアンケート評価
製品使用8週後の時点で被験者らがアンケートを通じて回答した製品の最終使用性に関する評価の結果は、以下のとおりである(表25)。
製品使用8週後の時点で被験者らがアンケートを通じて回答した製品の最終使用性に関する評価の結果は、以下のとおりである(表25)。
4.安全性の評価
製品使用後、4週、8週の時点で試験者が被験者の肌状態を観察および質疑応答により主観的、客観的刺激に関する評価を行った。
製品使用後、4週、8週の時点で試験者が被験者の肌状態を観察および質疑応答により主観的、客観的刺激に関する評価を行った。
本試験期間の間にすべての被験者から何らの肌異常反応が観察されなかった。(表26)
本試験製品(化粧品3種)は、肌保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度の改善に役立つと判断される。
[製造例]
製造例1:ラクトバチルスプランタルムK8破砕物(Lactobacillus plantarum K8‐LTA)を含有する飴の製造
植物性乳酸菌ラクトバチルスプランタルムK8破砕物を含有する飴を製造した。飴の作製に使用された原料は、精製ブドウ糖、ラクトバチルスプランタルムK8破砕物2.1%、キシリトール2%、ビタミンC、ブルーベリーエキス粉末、無水クエン酸、DL‐リンゴ酸、合成着香料(ブルーベリー香、ラズベリー香、)、酵素処理ステビア、ステアリン酸マグネシウムを含み、表7に表示した。次に、製造された飴が非配糖体イソフラボンを含有するか否かを調べるための実験を行った。互いに異なるロット番号を有している実験群用飴と対照群用飴(表27に成分表示)を3個ずつ選択し、乳鉢を用いて磨砕した後、滅菌蒸留水に懸濁(suspension)した。懸濁した飴サンプルをsonicatorを使用して破砕した後、エタノールを用いて抽出した。エタノール層をメタノールと混合した後、LC/MS‐MS分析を行った。その結果、非配糖体イソフラボンのdaidzeinとgenisteinが、実験群用飴から検出された一方、対照群用飴では検出されなかった(表28)。
製造例1:ラクトバチルスプランタルムK8破砕物(Lactobacillus plantarum K8‐LTA)を含有する飴の製造
植物性乳酸菌ラクトバチルスプランタルムK8破砕物を含有する飴を製造した。飴の作製に使用された原料は、精製ブドウ糖、ラクトバチルスプランタルムK8破砕物2.1%、キシリトール2%、ビタミンC、ブルーベリーエキス粉末、無水クエン酸、DL‐リンゴ酸、合成着香料(ブルーベリー香、ラズベリー香、)、酵素処理ステビア、ステアリン酸マグネシウムを含み、表7に表示した。次に、製造された飴が非配糖体イソフラボンを含有するか否かを調べるための実験を行った。互いに異なるロット番号を有している実験群用飴と対照群用飴(表27に成分表示)を3個ずつ選択し、乳鉢を用いて磨砕した後、滅菌蒸留水に懸濁(suspension)した。懸濁した飴サンプルをsonicatorを使用して破砕した後、エタノールを用いて抽出した。エタノール層をメタノールと混合した後、LC/MS‐MS分析を行った。その結果、非配糖体イソフラボンのdaidzeinとgenisteinが、実験群用飴から検出された一方、対照群用飴では検出されなかった(表28)。
製造例2:非配糖体含有乳酸菌整腸剤の製造
ラクトバチルスプランタルムK8を当業界において公知の方法によりサポニンまたはイソフラボン配糖体のような様々な配糖体を添加したMRS培地で大量培養し、乳酸菌原末を製造した。製造されたラクトバチルスプランタルムK8原末に少量のカルシウムおよびビタミンDを混合し整腸製品を製造した。具体的な組成は、下記の表29に記載した。整腸効果を高めるために整腸効果のある他の乳酸菌原末、例えば、大腸に存在すると知られているビフィダス菌原末を少量添加することができる。
ラクトバチルスプランタルムK8を当業界において公知の方法によりサポニンまたはイソフラボン配糖体のような様々な配糖体を添加したMRS培地で大量培養し、乳酸菌原末を製造した。製造されたラクトバチルスプランタルムK8原末に少量のカルシウムおよびビタミンDを混合し整腸製品を製造した。具体的な組成は、下記の表29に記載した。整腸効果を高めるために整腸効果のある他の乳酸菌原末、例えば、大腸に存在すると知られているビフィダス菌原末を少量添加することができる。
製造例3:非配糖体含有乳酸菌を含有する生食の製造
大豆胚芽発酵粉末に、各種の穀類粉末、海藻類粉末、果菜類粉末、キノコ類粉末および本発明における非配糖体乳酸菌原末を混合し生食製品を製造した。具体的な組成は、下記の表30に記載した。
大豆胚芽発酵粉末に、各種の穀類粉末、海藻類粉末、果菜類粉末、キノコ類粉末および本発明における非配糖体乳酸菌原末を混合し生食製品を製造した。具体的な組成は、下記の表30に記載した。
製造例4:非配糖体乳酸菌を含有する発酵乳の製造
脱脂乳または原乳に本発明におけるラクトバチルスプランタルムK8を前培養した培養液1%を混合し、40℃で6〜8時間発酵して発酵乳を製造した。具体的な組成は、下記の表31に記載した。前記脱脂乳または原乳を発酵するにあたり、発酵時間の短縮および発酵乳の風味を向上させるために、商業用に販売されているストレブトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスアシドフィルスをともに用いても良い。
脱脂乳または原乳に本発明におけるラクトバチルスプランタルムK8を前培養した培養液1%を混合し、40℃で6〜8時間発酵して発酵乳を製造した。具体的な組成は、下記の表31に記載した。前記脱脂乳または原乳を発酵するにあたり、発酵時間の短縮および発酵乳の風味を向上させるために、商業用に販売されているストレブトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスアシドフィルスをともに用いても良い。
製造例6:ラクトバチルスプランタルムK8を用いた発酵大豆液の製造
大豆液に本発明におけるラクトバチルスプランタルムK8を前培養した培養液1%を混合し、40℃で6〜8時間発酵して発酵大豆液を製造した。具体的な組成は、下記の表32に記載した。前記大豆液を発酵するにあたり、発酵時間の短縮および発酵乳の風味を向上させるために、商業用に販売されているストレブトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスアシドフィルスをともに用いても良い。
大豆液に本発明におけるラクトバチルスプランタルムK8を前培養した培養液1%を混合し、40℃で6〜8時間発酵して発酵大豆液を製造した。具体的な組成は、下記の表32に記載した。前記大豆液を発酵するにあたり、発酵時間の短縮および発酵乳の風味を向上させるために、商業用に販売されているストレブトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスアシドフィルスをともに用いても良い。
製造例7:紅参乳酸菌の製造
本発明におけるラクトバチルスプランタルムK8を紅参抽出物0.1%が含まれた最小培地100Lで12時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を水で洗浄してから凍結乾燥し、マイクロカプセルに入れて紅参乳酸菌を製造した。マイクロカプセルは、Wall materialと凝固液によるmatriXの形成時に可塑剤の添加条件と可塑剤の種類およびカプセルの表面張力等を考慮して粘着力と凝集力を向上できるようにし、カプセルの外部だけでなく内部までも強固にゲル化することから、胃酸で乳酸菌の生存率を高め、腸で高い活性を示す乳酸菌カプセルを作製できるようにした。1次coating solutionとしてNa alginate 1.8%、Glycerol 10%、Xanthan gum 0.32%、Tween 20 0.05%、MRS5%を使用し、hardening solutionとしてCaCl2 0.5M、Tween80 0.5%を使用し、2次coating solutionでChitosan 1.5%、Lactic acid 1.5%を使用した。かかる条件で生産された紅参乳酸菌カプセルは、pH7.4の人工腸液で溶けることを実験により確認した。また、耐酸性試験のために、pH1.4の人工胃液で時間の間隔を置いて180分まで反応させた後、それぞれを人工腸液に放出し生菌数を測定した結果、人工胃液での生存率は約95%であった。
本発明におけるラクトバチルスプランタルムK8を紅参抽出物0.1%が含まれた最小培地100Lで12時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を水で洗浄してから凍結乾燥し、マイクロカプセルに入れて紅参乳酸菌を製造した。マイクロカプセルは、Wall materialと凝固液によるmatriXの形成時に可塑剤の添加条件と可塑剤の種類およびカプセルの表面張力等を考慮して粘着力と凝集力を向上できるようにし、カプセルの外部だけでなく内部までも強固にゲル化することから、胃酸で乳酸菌の生存率を高め、腸で高い活性を示す乳酸菌カプセルを作製できるようにした。1次coating solutionとしてNa alginate 1.8%、Glycerol 10%、Xanthan gum 0.32%、Tween 20 0.05%、MRS5%を使用し、hardening solutionとしてCaCl2 0.5M、Tween80 0.5%を使用し、2次coating solutionでChitosan 1.5%、Lactic acid 1.5%を使用した。かかる条件で生産された紅参乳酸菌カプセルは、pH7.4の人工腸液で溶けることを実験により確認した。また、耐酸性試験のために、pH1.4の人工胃液で時間の間隔を置いて180分まで反応させた後、それぞれを人工腸液に放出し生菌数を測定した結果、人工胃液での生存率は約95%であった。
以上、本発明の内容の特定の部分について詳細に記述しているが、当業界において通常の知識を有する者にとって、かかる具体的技術は単に好ましい実施様態であって、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
本発明の製造方法によれば、配糖体を非配糖体に転換する能力とともに、転換された非配糖体を細胞内に蓄積する能力を有する微生物により、非配糖体を高濃度に製造することができる微生物を提供することができる。また、本発明の製造方法により製造された非配糖体を含む微生物の生菌またはその破砕物形態に作製することにより、抗酸化用組成物、整腸剤、生菌用組成物、飼料添加剤、食品添加剤、化粧品原料およびその他の発酵製品の製造に多様に用いられ得る。
ラクトバチルスプランタルムK8は、オタネニンジンサポニンを配糖体の形態で吸収した後、β‐glucosidaseを用いて加水分解サポニンに分解する。糖は、乳酸菌の代謝過程で使用される一方、加水分解サポニンの場合、乳酸菌の新陳代謝に不要な物質であるため、加水分解サポニンは、体内に蓄積した後、時間が経つにつれて細胞外に排出させると思われる。加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8を動物を用いた実験で変形させていないオタネニンジンサポニン(サポニン抽出物)を摂取した場合に比べて1,300倍以上高い体内吸収率を示した(実施例7)。かかる高い吸収率は、乳酸菌がカプセルの働きをすることで、胃でサポニンの破壊を防止し安全に腸内に伝達することができることが一つの理由である。また、加水分解サポニン含有乳酸菌は、腸細胞内に存在する大食細胞(Tissue Resident Macrophage)により選択的にup takeされた後、lamina propriaまたはlymph nodeに移動されて加水分解サポニンを血管に排出すると予想される(図5)。
非配糖体イソフラボンまたは加水分解サポニン含有乳酸菌を作製するために、Lactobacillus plantarum K8を大豆抽出物または配糖体サポニンを添加した培地に培養し、microfluidizerを用いて破砕した後、破砕された乳酸菌を溶媒系統分画により分画した。イソフラボンまたは加水分解サポニンが存在するEtOAc分画に対して2,000ppm濃度で調剤した後、LC‐MS/MSを使用して分析を行った。破砕後、非配糖体イソフラボンであるdaidzeinとgenisteinの含有量と加水分解サポニンであるRg3の含有量が増加することを確認することができた。
前記配糖体は、イソフラボン配糖体、サポニン配糖体、フェノール配糖体(フェノール)、青酸配糖体(ニトリル配糖体)、アントラキノン配糖体、強心配糖体、苦味配糖体(苦味物質)、クマリン配糖体(クマリン)、硫黄配糖体(チオグリコシド、硫黄)またはフラボノイド配糖体(フラボノイド)であってもよく、例えば、本発明に係る方法は、ダイジン(daidzin)、ゲニスチン(genistin)、グリシテイン(glycitin)、サポニン(saponin)、procyanidin、naringenin、quercetin、rutinose、hesparidin、baicalin、wogonoside、Mogroside V、amygdalinおよび3‐Phenyl coumarinから構成される群から選択された一つ以上の配糖体をゲニステイン(genistein)、ダイゼイン(daidzein)、グリシテイン(glycitein)、加水分解サポニン、3,4‐Hydroxyphenylactic acid、4‐HPA、m‐coumaric acid、p‐coumaric acid、O‐beta‐D‐glucuroniodes、stilbenoids、rutin、quercetin、hesparetin、baicalein、wogonin、Mogroside IIIE、mendelonitrile、benzaldehyde、およびcoumarin‐derivated compoundsから構成される群から選択された一つ以上の非配糖体に転換するものであってもよい。
実施例5:乳酸菌によるサポニンのサポゲニンへの転換
オタネニンジンサポニンの加水分解サポニンへの転換および細胞内蓄積を確認するために、ラクトバチルスプランタラムK8を人参抽出物が添加された培養液で培養した後、microfluidizerを使用して乳酸菌を破砕した。破砕後、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。その結果、イソフラボンでの結果と同じ脈絡でラクトバチルスプランタルムK8がジンセノサイドをuptakeしたことを確認した(washingと破砕物のarea値比較)。すなわち、洗浄液および人参抽出物では認められなかったピークが乳酸菌破砕物で認められたが、これは、乳酸菌の酵素によってtransfomationされたことが分かる(点線で表されたボックスで表示)。人参ジンセノサイド転換の核心は、量が多く活性が良好でないジンセノサイド、すなわち、rg1とrb1などで量は少ないが活性には優れたrg3、rc、f2などのジンセノサイドへの転換である。本実験結果でもラクトバチルスプランタルムK8によって高級サポニンの一種であるrg3に転換されたことを確認することができる。
オタネニンジンサポニンの加水分解サポニンへの転換および細胞内蓄積を確認するために、ラクトバチルスプランタラムK8を人参抽出物が添加された培養液で培養した後、microfluidizerを使用して乳酸菌を破砕した。破砕後、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。その結果、イソフラボンでの結果と同じ脈絡でラクトバチルスプランタルムK8がジンセノサイドをuptakeしたことを確認した(washingと破砕物のarea値比較)。すなわち、洗浄液および人参抽出物では認められなかったピークが乳酸菌破砕物で認められたが、これは、乳酸菌の酵素によってtransfomationされたことが分かる(点線で表されたボックスで表示)。人参ジンセノサイド転換の核心は、量が多く活性が良好でないジンセノサイド、すなわち、rg1とrb1などで量は少ないが活性には優れたrg3、rc、f2などのジンセノサイドへの転換である。本実験結果でもラクトバチルスプランタルムK8によって高級サポニンの一種であるrg3に転換されたことを確認することができる。
実施例6:最小培地を用いた加水分解サポニンの細胞内蓄積の増大
ラクトバチルスプランタルムK8をMRS培地5mLに接種した後、37℃で24時間静置培養してからMRS培地50mLに移して12時間さらに培養した。培養された細胞を1LのMRS培地に移した後、15時間培養してからPBSで3回洗浄をした。洗浄した細胞は、配糖体サポニンが含まれたM9 Minimal medium(最小培地)1L、配糖体サポニンとlysozyme(0.5g/L)が含まれたMRS培地に同数を接種した後、6時間静置培養をした。他の実験では、配糖体サポニンが含まれたMRS培地に細胞を移した後、42℃で6時間を培養した。対照群としては同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたMRS培地で6時間培養した。培養された細胞は、洗浄後、microfluidizerを使用して細胞を破砕し、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。M9最小培地を使用した細胞の場合、対照群に比べて3.84倍以上加水分解サポニン化合物が増加すると示された(表6)。
ラクトバチルスプランタルムK8をMRS培地5mLに接種した後、37℃で24時間静置培養してからMRS培地50mLに移して12時間さらに培養した。培養された細胞を1LのMRS培地に移した後、15時間培養してからPBSで3回洗浄をした。洗浄した細胞は、配糖体サポニンが含まれたM9 Minimal medium(最小培地)1L、配糖体サポニンとlysozyme(0.5g/L)が含まれたMRS培地に同数を接種した後、6時間静置培養をした。他の実験では、配糖体サポニンが含まれたMRS培地に細胞を移した後、42℃で6時間を培養した。対照群としては同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたMRS培地で6時間培養した。培養された細胞は、洗浄後、microfluidizerを使用して細胞を破砕し、LC/MS‐MSによりジンセノサイド化合物を分析した。M9最小培地を使用した細胞の場合、対照群に比べて3.84倍以上加水分解サポニン化合物が増加すると示された(表6)。
実施例7:マウスの血液からの人参ジンセノサイド検出
3日間、オタネニンジン抽出物と機能性加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8を摂取したマウスから分離した血液でオタネニンジンサポニンの含有量を測定した。オタネニンジン抽出物の場合、全摂取量1,085,630ngのうち約150ngのオタネニンジンサポニンが吸収されていることが認められた。一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8によって摂取されたオタネニンジン抽出物の量は11,653ngであり、このうち、血液から検出されたオタネニンジンサポニンの全含有量は約2160ngである(図6)。これを割合で換算すると、オタネニンジン抽出物の場合には0.014%の吸収率を示した一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8によるオタネニンジンサポニンの吸収率は約20%に達する(図7)。
3日間、オタネニンジン抽出物と機能性加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8を摂取したマウスから分離した血液でオタネニンジンサポニンの含有量を測定した。オタネニンジン抽出物の場合、全摂取量1,085,630ngのうち約150ngのオタネニンジンサポニンが吸収されていることが認められた。一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8によって摂取されたオタネニンジン抽出物の量は11,653ngであり、このうち、血液から検出されたオタネニンジンサポニンの全含有量は約2160ngである(図6)。これを割合で換算すると、オタネニンジン抽出物の場合には0.014%の吸収率を示した一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8によるオタネニンジンサポニンの吸収率は約20%に達する(図7)。
特に、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8を摂取したマウスではF2とRg3オタネニンジンサポニンが多量吸収されると示されたが、F2とRg3はオタネニンジンサポニンの中でも最大の機能性を有していると知られている。
オタネニンジン抽出物は、多量摂取しても吸収率が低いため、摂取量の面であまり意味がない。一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8の場合、抽出物を直接摂取することに比べて約1300倍以上高い吸収率を示す。すなわち、同一の100gのオタネニンジン抽出物を摂取する場合、直接摂取する場合には摂取した量の99%以上が吸収されず捨てられる一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8は20gを吸収することができる。かかる結果は、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムK8内に存在する低分子オタネニンジンサポニンがマウスの消化過程を経る間に乳酸菌によって自然に保護されたことを意味する。
実施例8:Yeastを用いた加水分解サポニンの細胞内蓄積
saccharomyces cerevisiaeを5mlのYPD培地に接種し、37℃で24時間振盪培養した後、オタネニンジン抽出物(1g/L)が添加された500mlのYPD培地に移した後、12時間さらに培養した。遠心分離後、上澄み液は別に冷蔵保管、pelletは滅菌蒸留水を用いて3回洗浄した。洗浄した酵母はmicrofluidizerを用いて3回破砕し、LC/MS‐MSにより加水分解サポニン化合物を分析した。本実験において分析のために準備した試料は、培養後上澄み液(1)、洗浄1回(2)、洗浄2回(3)、洗浄3回(4)、破砕前(5)、破砕後(6)の総6群のsampleを準備した。その結果を以下の表7に示す。
saccharomyces cerevisiaeを5mlのYPD培地に接種し、37℃で24時間振盪培養した後、オタネニンジン抽出物(1g/L)が添加された500mlのYPD培地に移した後、12時間さらに培養した。遠心分離後、上澄み液は別に冷蔵保管、pelletは滅菌蒸留水を用いて3回洗浄した。洗浄した酵母はmicrofluidizerを用いて3回破砕し、LC/MS‐MSにより加水分解サポニン化合物を分析した。本実験において分析のために準備した試料は、培養後上澄み液(1)、洗浄1回(2)、洗浄2回(3)、洗浄3回(4)、破砕前(5)、破砕後(6)の総6群のsampleを準備した。その結果を以下の表7に示す。
Claims (23)
- β−グルコシダーゼを発現する微生物を配糖体含有培地で培養するか、配糖体含有反応物と反応させて、前記微生物内に配糖体から転換された非配糖体(aglycone)を蓄積させる段階を含む、非配糖体が細胞内に蓄積された微生物を製造する方法。
- 前記配糖体は、人参、山参、豆、ツルニンジン、ソバ、桔梗、セリ、インゲン、ニンニク、タマネギ、銀杏、葛で構成された群から選択される1つまたはこれらの混合物由来であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記配糖体は、イソフラボン配糖体、サポニン配糖体、フェノール配糖体、青酸配糖体、アントラキノン配糖体、強心配糖体、苦味配糖体、クマリン配糖体、硫黄グリコシドまたはフラボノイド配糖体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ダイジン(daidzin)、ジェニスチン(genistin)、グリシチン(glycitin)、サポニン(saponin)、プロシアニジン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルチノース、ヘスパリジン、バイカリン、ウォゴノシド、モグロサイドV、アミグダリン及び3−フェニルクマリンで構成された群で選択された一つ以上の配糖体をゲニステイン(genistein)、ダイゼイン(daidzein)、グリシテイン(glycitein)、サポゲニン(sapogenin)、3,4−Hydroxyphenylactic酸、4−HPA、m−クマル酸、p−クマル酸、O−β−D−グルクロン酸、スチルベノイド、ルチン、ケルセチン、ヘスパレチン(hesparetin)、バイカレイン、ウォゴニン、モグロシドIIIE、マンデロニトリル(mandelonitrile)、ベンズアルデヒド、およびクマリン誘導化合物で構成された群から選択された一つ以上の非配糖体に転換することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記β−グルコシダーゼを発現する微生物は、乳酸菌、ビフィズス菌、酵母、コリネバクテリウム、アスペルギルスおよびクロストリジウムで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタロム(L.plantarum)、ラクトバチルス・サケイ(L.sakei)、ラクトバチルス・ラムノサスGG(L.rhamnosus GG)、ラクトバチルス・デルブリューキー(L.delbrueckii)、ラクトバチルス・アシドフィルス(L.acidophilus)、ラクトバチルス・ジョンソ二(L.johnsonii)、ラクトバチルス・カゼイ(L.casei)、およびラクトバチルス・ガセリ(L.gasseri)からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 上記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラムK8(L.plantarum K8)(寄託番号:KCTC10887BP)であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記β−グルコシダーゼを生産する微生物は、GRAS(Generally recognized as safe)微生物、ビフィズス菌、酵母、Bacillus licheniformis ZSP01、S.thermophilus、L.casei、Streptomyces sp.、Bifidobacteria、Lactobacillus delbrueckii Rh2、Sporosarcina sp.、Saccharomyces cerevisiae、Pyrococcus furiosus、Lactobacillus plantarum、Aspergillus ochraceus、Lactobacillus delbrueckii Rh2、Pseudomonas sp.Strain、Aspergillus niger、Pseudomonas fluorescens、Bifidobacterium adolescentis、Aspergillus sojae、Cunninghamella blakesleeana、Bifidobacteria and Lactobacillus、lactic acid bacteria、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Penicillium melinii、Eubacterium ramulus、Clostridium orbiscindens、Aspergillus awamori、Lactobacillus brevis、Aspergillus parasiticus Speare BGB、Aspergillus aculeatus及びAspergillus nigerで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記培養は、微生物活性化のための微生物を靜置培養する段階、振とう培養する段階、およびフィーディング培養する段階を順番に含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記靜置培養は、37℃で12時間行われることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記振とう培養は、37℃で12時間6rpmの条件で行われることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記培養は、培地に微生物接種後、培養した後、配糖体が含有された最小培地に移し1〜36時間の間追加培養することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- タンパク質分解酵素で配糖体含有植物体を前処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素は、プロモード(promod)、アルカラーゼ(alkalase)、ニュートラーゼ(neutrase)及びパパイン(papain)で構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞内に蓄積された非配糖体の濃度は、微生物培養培地中の非配糖体の濃度よりも1.5倍以上高いことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法によって製造され、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物またはその破砕物。
- 前記細胞内に蓄積された非配糖体の濃度は、微生物培養培地中の非配糖体の濃度よりも2倍以上高いことを特徴とする、請求項16に記載の微生物またはその破砕物。
- 前記破砕物は、ビーズミル(bead mills)、プレス(Presses)、ソニケータ(Sonicator)またはマイクロフルイダイザー(Microfluidizer)で処理して得られることを特徴とする、請求項16に記載の微生物またはその破砕物。
- 乾燥された粉末の形態であることを特徴とする、請求項16に記載の微生物またはその破砕物。
- 請求項16に記載の微生物またはその破砕物を含有する組成物。
- 請求項16に記載の微生物またはその破砕物を含有する食品。
- 請求項16に記載の微生物またはその破砕物を含有する皮膚機能改善用組成物。
- 肌の保湿、肌の色、肌の弾力性、しわまたは真皮緻密度を改善させることを特徴とする、請求項22に記載の組成物。
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