CN107636145A - 制备其中苷元在细胞中积累的微生物制剂的方法和通过该方法生产的微生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备自糖苷转化的苷元的方法，具体涉及通过使用产生β‑糖苷酶的微生物使糖苷转化成苷元形式而自糖苷制备苷元，然后回收在微生物的细胞中积累的苷元的方法。

Description

制备其中苷元在细胞中积累的微生物制剂的方法和通过该方 法生产的微生物制剂
技术领域
本发明涉及一种在细胞中制备含有苷元(aglycone)的微生物制剂的方法，具体涉及一种制备微生物的方法，所述微生物通过使用产生β-糖苷酶的微生物将糖苷转化为苷元形式，并且具有在细胞中积累的苷元。
背景技术
乳酸菌是人类可获得的最有益的微生物之一，并且意指在发酵过程中分解碳水化合物如葡萄糖或乳糖以产生乳酸的细菌。1858年，法国微生物学家路易斯·巴斯德(LouisPasteur)发现了乳酸菌的存在，于1908年被授予诺贝尔生理学奖的俄国免疫学家伊拉·梅契尼科夫(Ilija Mecnikov)在其晚年宣称“通过发酵乳永葆青春假说(the eternal youthhypothesis by the fermented milk)”，然后声称保加利亚人长寿的原因是乳酸菌发酵乳，而自该声称，全面研究已经开始，迄今为止已经发现了300多种乳酸菌。乳酸菌生活在包括人类在内的大多数哺乳动物的肠道中，且具体而言，在人体肠道中存在超过100万亿个结合健康和有害细菌的100种细菌。由于乳酸菌产生乳酸作为酸化肠道的代谢物，乳酸菌被称为用于抑制有害细菌的增殖并通过异常发酵减少氨或致癌物的产生，即进行肠道调节的细菌。
已知乳酸菌的生理活性是它们主要产生有机酸以降低肠道的pH，其抑制肠道中有害细菌的增殖并维持正常的肠道微生物菌群。它们还用于将糖苷异黄酮转化成苷元，其通过产生β-葡糖苷酶容易在体内吸收。
具体而言，在异黄酮的情况下，存在四种形式：与糖偶联的糖苷、除去糖的苷元、乙酰葡糖苷和丙二酰葡糖苷，其中，苷元异黄酮通过在肠道中β-葡糖苷酶水解被转化为苷元，作为活性苷元并被吸收。然而，一般食品中包含的异黄酮作为糖偶联的糖苷形式存在，并且从饮食中摄取的异黄酮需要通过肠道微生物转化成苷元形式以被吸收。因此，具有β-糖苷酶活性的微生物可在异黄酮的生物利用中发挥非常重要的作用。
作为相关技术中提取异黄酮的方法，有一种方法是用水提取包含异黄酮的植物的粉末，酸化提取物，将提取物从沉渣(sludge)中分离出来以通过填充有吸收树脂的柱，使异黄酮吸收在树脂上的提取物中，使醇溶剂通过柱，并回收吸附在树脂上的异黄酮。作为另一种方法，有一种提取异黄酮的方法，其包括第一步骤：通过在环糊精、其衍生物或其聚合物中添加包含异黄酮的植物或植物加工产物，使异黄酮与环糊精、其衍生物或其聚合物结合并提取异黄酮，以及第二步骤：通过在第一步骤中形成的提取物中注入凝结剂并提取，从提取物中分离异黄酮和环糊精的结合物(binder)。具体而言，为了从天然豆类中提取苷元异黄酮，使用各种机械和化学方法，并且有使用超声波提取异黄酮，然后通过液相色谱纯化提取物的方法。然而，提取方法包括许多步骤，并且包括一些问题，如生产率降低、生产成本增加和纯化过程中污染的可能性。
已经研究了通过微生物将糖苷异黄酮生物转化成苷元异黄酮(Kuo等,ApplMicrobiol Biotechnol 2006.73:314-320；Lee等,J Agric Food Chem 2013.61:12101-12110)，并且最重要的是，通过乳酸菌将糖苷异黄酮生物转化成苷元异黄酮是可能的，并且为此已经积极地进行了研究(Cavallini等,Alim.Nutr.2010.21:175-182)。举例而言，Ali及其同事检查了通过乳酸菌及脂肪和胆固醇代谢转化成作为异黄酮糖苷代谢活性形式的苷元的效果。结果显示，乳酸菌不诱导异黄酮的功效的增强。原因是乳酸菌的生物转化效率低(Ali等,J Nutr Biochem.2004.15:583-90)。另据报道，当不添加豆浆时，通过乳酸菌双歧杆菌属转化为苷元(的转化率)为73-74％或以下。然而，在添加豆浆的情况下，转化率提高到84％至85％(2007 11.Newhope 360.com)。
同时，皂苷(saponin)是类固醇、类固醇生物碱或三萜烯的糖苷，以及溶解在水中并呈现与肥皂相似的起泡作用的物质的通用术语。皂苷是一种增强人体免疫力的成分，特别是人参中所含的皂苷是有名的。在人参中，包括多达32类各种皂苷。具体而言，已知当长时间施用时，仅在通过加工人参获得的红参中所含的皂苷对成人疾病的治疗具有显著的效果。人参皂苷(ginsenoside)可抑制各种癌细胞的生长。即使在与白内障相关的实验中，人参皂苷也展现出极好的效果。人参皂苷(人参皂苷(ginseng saponin))是在同一分子中具有碳水化合物(糖基(glycone))和非碳水化合物残基(苷元)的化合物。碳水化合物残基通过在1-碳位置的缩醛键与非碳水化合物残基结合。非糖组分称为苷元，而糖组分称为糖基。当碳水化合物位点是葡萄糖时，称为葡糖苷。因此，通过水解人参皂苷(其为人参中的糖苷)，人参皂苷被分解为糖基和作为苷元的皂苷元(sapogenin)。
水解异黄酮糖苷的微生物包括长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、黑曲霉(aspergilus niger)和sachcaroplysporaerythraea，并且这些微生物通常产生β-糖苷酶。此外，已继续研究用于开发产生能够使糖苷异黄酮高效转化成苷元异黄酮的高效力β-糖苷酶的微生物。
然而，相关领域的技术包括许多复杂的步骤并且因此存在一些问题，如生产率降低、生产成本增加以及纯化过程中污染的可能性。
在这些技术背景下，本申请的发明人已经证实可通过以下方式改善所述常规问题：使用产生β-糖苷酶的微生物使糖苷转化成苷元，然后使转化的苷元在微生物中积累并使用含有其苷元或裂解物的微生物作为原料，并完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供通过使用产生β-糖苷酶的微生物，能够能够以高浓度制备自糖苷转化的苷元的微生物的制备方法。
本发明的另一目的是提供含有其苷元的微生物及其用途，其中通过所述方法制备的苷元在细胞中积累。
根据本发明的一个方面，提供了一种制备其中苷元在细胞中积累的微生物的方法。所述方法包括通过使表达β-糖苷酶的微生物在含有糖苷的培养基中温育或与含有糖苷的反应物反应而使自糖苷转化的苷元在微生物中积累。
根据本发明的另一方面，提供了通过所述方法制备并且其中苷元在细胞中积累的微生物或其裂解物。
根据本发明的另一方面，提供了包含微生物或其裂解物的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了包含微生物或其裂解物的食物。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于改善皮肤功能的组合物，其包含微生物或其裂解物。
附图简述
图1示出了通过本发明的制备方法使用植物乳杆菌K8(Lactobacillus plantarumK8)转化成大豆苷元的结果。通过植物乳杆菌K8将糖苷异黄酮转化为苷元异黄酮。在图1中，原料表示含有大豆提取物的培养基，STD表示异黄酮标准品；并且植物乳杆菌K8-LTA提取物表示在将植物乳杆菌K8在含有大豆提取物的培养基中温育后通过使用微流化器裂解的裂解物。
图2示出了通过本发明的制备方法使用植物乳杆菌K8、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)和清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)转化成大豆苷元的结果。比较乳酸杆菌(包括植物乳杆菌K8)的苷元产生。在图2中，STD表示异黄酮标准品；delbrueckii表示德氏乳杆菌；GG表示鼠李糖乳杆菌GG；K8表示植物乳杆菌K8；且sakei表示清酒乳杆菌。
图3示出了通过本发明的制备方法在植物乳杆菌K8裂解物的制备方法中检测到的大豆苷元的测量的量。在图3中，gg表示鼠李糖乳杆菌GG，del表示德氏乳杆菌，k8表示植物乳杆菌K8。
图4是表示通过本发明的制备方法使用植物乳杆菌K8自人参皂苷转化的皂苷的图。在图4中，rg1、rg3(s)、rh2、rb1、rc、rd、rb2和f2是人参皂苷化合物。上述名称根据分子结构分为各类皂苷。在图4中，洗液表示在温育乳杆菌之后的洗涤溶液；人参ext表示人参提取物；且k8表示植物乳杆菌K8。
图5是示出通过植物乳杆菌K8苷元皂苷的吸收预测机理的图。
图6示出了测量低分子量人参皂苷的检测量的结果。摄入量表示饲喂给小鼠的人参提取物的量，且吸收量表示自小鼠血液中检测到的人参皂苷的量。
图7是示出低分子量人参皂苷的吸收速率的结果。吸收速率是将摄入量中的吸收量转化成百分数的结果。
在相关技术中，已经尝试使用微生物将糖苷转化成苷元，但尚未报道转化的苷元包括在微生物的细胞中。因此，通过本发明的微生物使苷元生物转化并在微生物的细胞积累的结果是新的结果。本申请的发明人证实，积累在微生物的细胞中的苷元的浓度为微生物培养基中苷元的浓度的超过1.5倍、超过2倍，从而以高浓度产生苷元。
作为益生菌的作用机制，重塑肠道环境、抑制病原体、抑制促炎因子、对上皮分化的作用、增强肠道屏障效应等是已知的。益生菌对抑制结肠直肠癌的作用具有各种生化途径，通过细胞周期、反应性性氧种类、细胞凋亡、特异性细菌酶的生成和宿主代谢抑制结肠直肠癌的发生。此外，乳酸菌通过激活免疫系统的免疫激活作用保护身体免受疾病的侵袭。在肠道表面的绒毛中，乳酸菌与免疫细胞如白细胞或淋巴细胞相互作用，并且促进免疫活性。乳酸菌诱导人结肠癌细胞中人β防御素(hBD2)的表达，以调节肠道免疫力。此外，通过在作为结肠癌细胞的Caco-2细胞中暴露于乳酸菌进行作为炎性细胞因子的IL-8的产生和Hsp70的表达的抑制。结果可以看出，乳酸菌通过调节细胞因子直接参与调节炎症应答。此外，肠道内的乳酸菌调节自身免疫应答和toll-样受体(TLR)。这意味着乳酸菌对调节肠道健康的作用与TLR信号传导有关。
植物乳杆菌K8以糖苷形式吸收人参皂苷，然后通过使用β-糖苷酶将糖苷形式分解成糖和苷元。这些糖被用于乳酸菌的代谢，而由于苷元对于乳酸菌代谢是不必要的物质，所以苷元被积累在体内，然后随时间被释放到细胞外。在使用动物(实施例7)的测试中，与获取未经修饰的人参皂苷(皂苷提取物)的情况相比，含有苷元的植物乳杆菌K8展现出1300倍或更高的体吸收率。高吸收率是因为植物乳杆菌K8作为胶囊，从而防止皂苷的破坏并将皂苷安全地转移到肠道。此外，预期含有苷元的植物乳杆菌K8通过肠道中的组织驻留(issueresident)巨噬细胞选择性摄取，然后移动到固有层(lamina propria)或淋巴结以将苷元释放到血液中(参见图5)。
基于此，本发明的一个方面涉及制备其中苷元在细胞中积累的微生物的方法。所述方法包括通过使表达β-糖苷酶的微生物在含有糖苷的培养基中温育或与含糖苷的反应物反应而使自糖苷转化的苷元在微生物中积累。
本发明中使用的微生物表示苷元的产生活性。具体而言，所述微生物具有通过β-糖苷酶的活性将糖苷转化成苷元形式的能力。在厌氧条件下，所述微生物具有将糖苷形式染料木苷(genistin)和大豆黄苷(diadzin)转化成苷元形式染料木素(genistein)和大豆黄素(diadzein)的能力。在裂解微生物的情况下，可检测积累在细胞中的苷元(参见图1)。
微生物没有特别限制，只要微生物是产生β-糖苷酶的微生物，但可为选自以下的一种或多种：乳酸菌(lactic acid bacteria)、乳球菌属(lactococcus)、棒状杆菌属(corynebacterium)、通常被认为是安全(GRAS)的微生物、双歧杆菌(bifidus)、酵母(yeast)、芽孢杆菌属(bacillus)、曲霉属(aspergillus)和梭菌属(clostridium)。乳酸菌可为选自以下的一种或多种：植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus GG)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、干酪乳杆菌(L.casei)、格氏乳杆菌(L.gasseri)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroid)。
本申请的发明人分离并鉴定了来自韩国传统发酵食品泡菜(Kimchi)的产生β-糖苷酶的植物乳杆菌K8。首先，通过使用无菌生理盐水将泡菜和泡菜液分阶段稀释10倍，然后将未稀释的溶液和经稀释的溶液铺展在乳杆菌属选择性琼脂(LBS琼脂,Difco)上。根据类型和颜色再次纯种分离在37℃温育2至3天后展现出的菌落。对分离的菌落进行革兰氏染色和显微镜观察，然后仅筛选革兰氏阳性和棒状菌落，并且将这些菌落在pH 6.8和37℃在乳杆菌MRS液体培养基(Difco)中温育24小时，重新筛选其中培养物溶液的pH降低至4.5或更低的菌落。此后，当菌落在pH 2.0的MRS培养基中温育2小时，然后在添加有0.3％oxgall的MRS培养基中温育9小时时，分离出存活的耐酸性和耐胆汁性乳杆菌菌株。通过使用API CHL50试剂盒和16SrRNA测序的生化测试鉴定分离的菌株。作为鉴定结果，证实菌株是属于植物乳杆菌种的菌株，并且菌株被称为“植物乳杆菌K8(Lactobacillus plantarum K8)”(登录号：KCTC 10887BP，国际保藏单位：韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection forType Cultures,KCTC)，保藏日期：2005年12月29日)。
在另一个实例中，产生β-糖苷酶的微生物可为选自以下的一种或多种：通常被认为是安全(GRAS)的微生物、双歧杆菌、酵母、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热链球菌(S.thermophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)双歧杆菌属(Bifidobacteria)、德氏乳杆菌Rh2(Lactobacillus delbrueckii Rh2)、芽孢八叠球菌属菌种(Sporosarcina sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、德氏乳杆菌Rh2(Lactobacillus delbrueckii Rh2)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)和乳杆菌属(Lactobacillus)、乳酸菌、假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、梅林青霉(Penicillium melinii)、细枝真杆菌(Eubacteriumramulus)、环切梭菌(Clostridium orbiscindens)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、寄生曲霉BGB(Aspergillus parasiticus speare BGB)、棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)和黑曲霉(aspergillus niger)。
为了制备包含苷元异黄酮或皂苷元的乳酸菌，将植物乳杆菌K8在添加大豆提取物或糖苷皂苷的培养基中温育并通过使用微流化器裂解，然后将裂解的植物乳杆菌K8通过溶剂体系级分进行分级。对于具有异黄酮或皂苷元的EtOAc级分，制备浓度为2,000ppm的植物乳杆菌K8，然后使用LC-MS/MS进行分析。可确认，裂解后，作为苷元异黄酮的大豆黄素(daidzein)和染料木素的含量和作为苷元皂苷元的Rg3的含量增加。
通过使用超声处理器或微流化器将植物乳杆菌K8裂解并冻干以制备“植物乳杆菌K8-LTA”裂解物。具体而言，步骤(a)可包括依次静态培养用于微生物活化、摇动培养和补料(feeding)培养的步骤。在这种情况下，微生物可在37℃静态培养12小时，并在37℃在6rpm条件下摇动培养12小时。由碳源、氮源、维生素和矿物质构成的培养基(例如，MRS培养基)可用于温育微生物。
在一些情况下，在步骤(a)之前，可进一步包括用蛋白酶预处理包含糖苷的植物的步骤。所述蛋白酶可为选自以下的一种或多种：例如Promod(百路达)、碱性蛋白酶(alkalase)、中性蛋白酶(neutrase)和木瓜蛋白酶(papain)。
详细言之，详细的制备工艺述于以下“制备工艺表”和表1中。
[制备工艺表]膜细胞再循环反应器(MCR)制备工艺
1)发酵生产线的灭菌：通过使用蒸汽对流入发酵管的管线(line)进行灭菌。
2)发酵罐和进料罐的共灭菌：将发酵罐和进料罐在以下条件下灭菌15至20分钟：121±1℃和1.2至1.5kgf/cm2，通过使用喷洒器将蒸汽注入罐，取样和较低的蒸汽。
3)原料的称量和培养基的灭菌：培养基的原料分别根据产品的标准品精确称量，然后注入发酵罐和进料罐，并在根据容量调整量后根据条件2)进行灭菌。
4)冷却：灭菌后进行冷却至37℃。
5)菌种活化：将冷冻的乳杆菌在37℃恒温槽中迅速解冻，然后接种在1.5L的无菌培养基中并静态培养12小时。
6)主要温育：将以1/100稀释的菌种在30L灭菌的培养基中温育。
7)补料温育：频繁检查温育条件以始终保持该条件。当光密度(OD)值达到预定值时，通过使膜循环而除去使用的介质，并且通过排出量将新介质注入进料罐。通过连续去除和注入约200L的培养基来温育菌细胞。
8)浓度调节：将排出管线用蒸汽灭菌30分钟，然后溶液流过排出管线并离心，并用适量的反渗透蒸馏水稀释以调节浓度。
9)活细胞的收集和细菌细胞的产物包装或裂解：通过微流化器裂解经浓度调节的细菌细胞。
10)灭菌：将裂解的细菌细胞在80℃保持30分钟，并将培养基溶液灭菌并再次冷却。根据目的，可不包括灭菌。
11)细菌细胞的收集和包装：通过使用罐排出管线将冷却的溶液包含并包装在聚乙烯(PE)瓶中。
[表1]制备工艺
在另一实例中，将微生物接种，然后在培养基中温育，并转移至包含糖苷的基本培养基中，并且可另外培养1至36小时，例如4至24小时。根据本发明的实施例6，当通过使用包含糖苷的基本培养基温育微生物时，证实与其中将相同量的细胞在含有糖苷皂苷的MRS培养基中温育的对照组相比，细胞中苷元的积累可增加。
在一个实例中，糖苷可源自选自以下的一种：人参(ginseng)、野山参(wildginseng)、大豆(soybean)、轮叶党参(codonopsis lanceolata)、荞麦(buckwheat)、风铃草(bellflower)、水欧芹(water parsley)、绿豆(mung beans)、蒜(garlic)、洋葱(onion)、银杏(ginkgo)和葛(kudzu)。
糖苷可为异黄酮糖苷、皂苷糖苷、苯酚糖苷(酚)、cynophore糖苷(腈糖苷)、蒽醌糖苷、强心苷、苦苷(Amara)、香豆素糖苷(香豆素)、硫糖苷(rioglycoside和硫)或类黄酮糖苷(类黄酮)。例如，本发明的方法可为将一种或多种选自以下的糖苷：大豆黄苷(daidzin)、染料木苷(genistin)、黄豆黄苷(glycitin)、皂苷(saponin)、原花青素(procyanidin)、柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、芦丁糖(rutinose)、橙皮苷(hesparidin)、黄芩苷(baicalin)、汉黄芩苷(wogonoside)、罗汉果苷(mogroside)V、苦杏仁苷(amygdalin)和3-苯基香豆素，转化成一种或多种选自以下的：染料木素(genistein)、大豆黄素(daidzein)、黄豆黄素(glycitein)、皂苷元、3,4-羟基苯基乳酸(phenylactic acid)、4-HPA、间香豆酸、对香豆酸、O-β-D-葡糖苷酸(O-β-D-glucuroniode)、芪类(stilbenoids)、芦丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、橙皮素(hesparetin)、黄芩黄素(baicalein)、汉黄芩黄素(wogonin)、罗汉果苷IIIE、扁桃腈(mendelonitrile)、苯甲醛和香豆素衍生的化合物。
通过制备方法产生的苷元可在细胞中积累。基于此，本发明的另一方面涉及其中通过制备方法产生的苷元在细胞中积累的微生物或其裂解物。证实细胞中积累的苷元的浓度为微生物培养基中苷元的浓度的2倍高。
裂解物可通过使用物理方法制备。举例而言，通过使用珠磨机、压力机(press)、超声处理器或微流化器将微生物裂解4至9次，然后冻干并粉碎。如果需要，将裂解的细菌细胞在80℃保持30分钟，并将培养基溶液灭菌并再次冷却。
本发明的另一方面涉及包含微生物或其裂解物的组合物。
微生物或其裂解物可用作抗氧化剂组合物、用于肠道调节的组合物、用于化妆品的原料组合物和益生菌组合物。具体而言，微生物或其裂解物可用作饲料组合物、用于食物添加的组合物和其它发酵产品。可包括本发明的微生物或其裂解物的裂解细胞壁级分、活的微生物、死的微生物、干燥的微生物或培养物作为活性成分，并且可另外包括赋形剂或载体。
培养物包括在液体培养基中温育的培养溶液本身，通过过滤或离心培养溶液以除去菌株获得的滤液(离心的上清液)和通过对培养溶液进行超声处理或溶胞获得的细胞裂解物。本发明的组合物中的微生物或其裂解物的含量可根据组合物的用途和制剂而变化。
本发明的组合物可通过各种制剂和方法制备和施用。举例而言，将微生物或其裂解物或培养物与通常用于药物领域的载体或调味剂组合，然后可以如片剂(tablet)、锭剂(troche)、胶囊、酏剂、糖浆剂、粉剂、悬浮液或颗粒的形式制备和施用。作为载体，可使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、混悬剂等。施用方法可使用口服、肠胃外或应用方法，并且可根据体内活性成分的吸收、不活动率(inactivity rate)和排泄率以及被施用人的年龄、性别、状态等适当选择剂量。优选地，组合物可以10mg/天的有效剂量施用，并且在益生菌组合物的情况下，组合物中的活细胞计数可为108至1010CFU/天。
抗氧化剂组合物可用于除去活性氧，并且肠道调节组合物或益生菌组合物促进异黄酮的内部吸收以预防或改善消化不良或腹泻。
此外，饲料组合物可以如发酵饲料、复合饲料(compound feed)、丸剂形式、青贮饲料(silage)等形式制备。发酵饲料可通过添加本发明的微生物或其裂解物和各种其它已知的微生物或酶使有机物质发酵来制备，而复合饲料可通过组合各种常规饲料和本发明的乳酸菌来制备。颗粒形式饲料可通过造粒机配制发酵饲料或复合饲料来制备，而青贮饲料可通过用本发明的乳酸菌发酵绿色饲料来制备。
此外，微生物或其裂解物或其培养物可用作用于食品如婴儿食品、泡菜、饮料、乳制品等的食品添加剂。
此外，本发明涉及包含微生物或其裂解物的食品。
本发明的微生物或其裂解物或其培养物可用作化妆品组合物，并且具体可用于各种用途，如基础化妆品、化妆品、美发化妆品、美白化妆品，抗皱化妆品和抗衰老化妆品。
此外，本发明提供了用于改善皮肤功能的组合物，其包含微生物或其裂解物。皮肤功能的改善可意味着改善皮肤保湿、肤色、皮肤弹性、皱纹或真皮密度。
此外，本发明的微生物或其裂解物可用作制备发酵产品的起子(starter)。发酵产品包括发酵肉制品如火腿和香肠、发酵生食品、发酵乳制品、发酵大豆液、泡菜等。发酵产品可根据本领域已知的一般方法制备。举例而言，发酵生食品可通过以下方式制备：组合微生物或其裂解物与谷物粉末如糙米和薏仁、植物粉末和蘑菇粉末，或者用微生物或其裂解物或者包含微生物或其裂解物的二至五种混合乳酸菌在适当温度发酵谷物粉末，然后适当地组合植物和蘑菇粉末以具有优异的营养平衡和适口性。此外，发酵乳制品可通过以下方式制备：用本发明的乳酸菌或包含它们的二至五种混合乳酸菌在适当温度发酵生奶或脱脂奶粉；且发酵大豆液可通过用以下方式制备：用本发明的乳酸菌或包含它们的二至五种混合乳酸菌在适当温度发酵大豆液。
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅举例说明本发明，而本发明的内容不限于以下实施例。
实施例
实施例1：植物乳杆菌K8的生化特征测试
为了评价从韩国传统发酵食品泡菜中分离和鉴定的植物乳杆菌K8的抗氧化活性，进行API测试(Biomerieux，法国)。乳酸菌的生化特性和糖可利用性(sugar availability)如下表2和3所示。
[表2]植物乳杆菌k8的特征
特征 结果
细菌类型 条形(bar type)
最适生长温度 37℃
活力(motility) 无
革兰氏染色 +
对过氧化氢酶的活性 -
氧气的影响 未察觉的厌氧(oblivious anaerobic)
[表3]植物乳杆菌k8的糖可利用性
*缩写：MDX，甲基-βD-吡喃木糖苷；MDM，甲基-αD-吡喃甘露糖苷；MDG，甲基-αD-吡喃葡萄糖苷；NAG，N-乙酰氨基葡糖胺；ESC，七叶苷(Esculin)柠檬酸铁；GNT，葡糖酸钾；2KG，2-酮葡糖酸钾；5KG，5-酮葡糖酸钾。
*在24小时测量中，显示为阴性，但是在48小时测量中，当颜色稍微改变时，其表示为‘？’。
实施例2：植物乳杆菌K8的苷元的产生
将植物乳杆菌k8在添加大豆提取物的培养基中温育并通过使用微流化器裂解，然后通过溶剂级分系统对裂解的植物乳杆菌K8进行分级。对于具有异黄酮的EtOAc级分，以2000ppm的浓度制备植物乳杆菌K8裂解物样品，然后使用LC-MS/MS进行分析。结果证实，在大豆原料的情况下，作为糖苷异黄酮的大豆黄苷和染料木苷的含量高，而与植物乳杆菌K8温育后，作为苷元异黄酮的大豆黄素和染料木素的含量增加。相反，在与植物乳杆菌K8温育后，培养基中糖苷异黄酮的含量降低(参见图1)。在接种本发明的植物乳杆菌K8之前，在包括通过添加1ml/L碱性蛋白酶、1ml/L的中性蛋白酶和0.2g/L木瓜蛋白酶在60℃搅拌8小时的预处理过程的情况下，转化成苷元后的细胞内积累率增加约10％(表4)。
[表4]通过酶预处理转化成苷元后的细胞内积累率
大豆黄素(ng/mL) 染料木素(ng/mL)
未处理的酶* 8,672.46 18,286.58
预处理的酶 9,539.24 20,115.24
*1ml/L碱性蛋白酶、1ml/L中性蛋白酶和0.2g/L木瓜蛋白酶
实施例3：苷元产生活性的评价
为了确定乳酸菌的苷元异黄酮的转化能力以及苷元异黄酮在细胞中的积累能力，将德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG、植物乳杆菌K8和清酒乳杆菌接种在包含大豆提取物的培养基中并在37℃温育12小时，然后使用微流化器裂解细胞。在裂解的细胞中，通过LC/MS-MS测量异黄酮的含量且如图2所示。结果是，在4种乳杆菌中检测到大豆黄素和染料木素的苷元(参见图2)。结果表明，通过各种分泌β-糖苷酶的乳杆菌或微生物，糖苷异黄酮可生物转化成苷元异黄酮，此外，结果表明转化的苷元异黄酮可在细胞中积累。
实施例4：乳酸菌的各工艺中苷元异黄酮的产生活性
在产生乳酸菌裂解物的过程中进行测量异黄酮含量的实验。将鼠李糖乳杆菌GG、德氏乳杆菌和植物乳杆菌K8在含有大豆提取物的培养基中在37℃温育12小时，然后用无菌水洗涤3次。分别使用LC/MS-MS测量洗液和乳杆菌裂解物中的异黄酮含量。结果是，从三次洗液和乳杆菌裂解物中未检测到糖苷异黄酮。同时，在苷元异黄酮的情况下，从洗液中检测到少量，并且从乳杆菌裂解物中以高浓度检测到苷元异黄酮(参见图3)。在另一实验中，在植物乳杆菌K8培养基、培养物上清液(sup.)、1次洗液、2次洗液和3次洗液、裂解物、裂解物上清液(sup.)和裂解物沉淀(ppt.)中测量糖苷和苷元异黄酮的含量。结果证实，在裂解物、裂解物上清液和裂解物沉淀中，异黄酮的含量，特别是苷元异黄酮的含量大大增加(参见表5)。结果是，苷元异黄酮可能不会在乳酸菌的表面被污染(smear)或由残留的培养溶液引起，因此，该结果意味着苷元异黄酮在乳酸菌中积累。
[表5]根据制备工艺比较苷元异黄酮量
*N.D.：未测定
实施例5：通过乳酸菌转化皂苷
为了确定人参皂苷转化为苷元皂苷元和细胞内积累，将植物乳杆菌K8在添加人参提取物的培养溶液中温育，然后使用微流化器裂解植物乳杆菌K8。裂解后，通过LC/MS-MS分析人参皂苷化合物。结果证实，植物乳杆菌K8以与异黄酮结果相同的情况摄取人参皂苷(参见图4，洗液和裂解物的面积值的比较)。也就是说，在乳酸菌裂解物中展现出在洗液和人参提取物中未展现的峰，并且可看出，通过乳酸菌的酶转化所述峰(参见图4，由虚线框表示)。人参皂苷转化的关键点是将量大且具有低活性的人参皂苷转化成Rg3、Rc和F2的人参皂苷，其量少，但具有优异活性。在实验结果中，可确认人参皂苷由植物乳杆菌K8转化为一种高级皂苷Rg3。
实施例6：使用基本培养基增加苷元的细胞内积累
将植物乳杆菌K8接种在5mL MRS培养基中，然后在37℃静态温育24小时，并转移至50mL MRS培养基中并另外温育12小时。将经温育的细胞转移至1L MRS培养基中并温育15小时，然后用PBS洗涤3次。将经洗涤的细胞以相同数量接种在1L含有皂苷糖苷的M9基本培养基和包含皂苷糖苷和溶菌酶(0.5g/L)的MRS培养基中，然后静置温育6小时。在另一实验中，将细胞转移至含有皂苷糖苷的MRS培养基中，并在42℃温育6小时。作为对照组，将相同量的细胞在含有皂苷糖苷的MRS培养基中温育6小时。将经温育的细胞洗涤，然后使用微流化器裂解，并通过LC/MS-MS分析人参皂苷化合物。在使用M9基本培养基的细胞的情况下，苷元皂苷元化合物为对照组的3.84倍或更多(参见表6)。
[表6]根据植物乳杆菌K8的培养条件比较苷元皂苷元的检测量
总面积 BuOH fr.(mg) 相对比率
MRS(溶菌酶) 7545 6.6 0.32
MRS(热休克) N.D. 5.6 -
基本培养基(M9) 40762 12.4mg 3.84
MRS 17779 7.4mg 1
实施例7：检测来自小鼠血液的人参皂苷
在从摄取人参提取物和含功能性苷元的植物乳杆菌K8持续3天的小鼠分离的血液中测量人参皂苷的含量。在人参提取物的情况下，占1,085,630ng总吸收量的约150ng的人参皂苷被吸收。同时，由含苷元的植物乳杆菌K8吸收的人参提取物的量为11,653ng，从血液中检测到的人参皂苷的总含量为约2160ng(参见图6)。当转化成百分数时，在人参提取物的情况下，展现出0.014％的吸收率，但是通过含苷元的植物乳杆菌K8的人参皂苷的吸收率达到约20％(参见图7)。
具体而言，在服用含苷元的植物乳杆菌K8的小鼠中，大量的F2和Rg3人参皂苷被吸收，已知即使在人参皂苷中，F2和Rg3也具有最优异的功能。
虽然服用大量的人参提取物，但是由于低吸收率，所以服用量没有大的意义。同时，在含苷元的植物乳杆菌K8的情况下，吸收率为直接服用人参提取物的情况中的约1300倍或更大。即，当直接服用100g人参提取物时，99％或更多服用量不被吸收而被丢弃，但是可吸收20g含苷元的植物乳杆菌K8。结果表明，含有苷元的植物乳杆菌K8中的低分子人参皂苷在小鼠的消化过程中天然地被乳酸菌保护。
实施例8：使用酵母细胞内积累苷元皂苷
将酿酒酵母接种在5ml YPD培养基中，并在37℃摇动温育24小时，然后转移至500ml添加人参提取物(1g/L)的YPD培养基中，然后另外温育12小时。离心后，分别冷冻上清液，用无菌蒸馏水将团块(pellet)洗涤3次。通过使用微流化器将经洗涤的酵母裂解三次，然后通过LC/MS-MS分析苷元人参皂苷化合物。在本实验中，将共6组经制备用于分析的样品分为温育后的上清液(1)、1次洗液(2)、2次洗液(3)、3次洗液(4)、裂解前的上清液(5)、裂解后的上清液(6)。结果列于下表7。
[表7]包含苷元的酿酒酵母的制备
样品 苷元人参皂苷(ng/mL)
培养基(1) 675
1次洗液(2) 175
2次洗液(3) 165
3次洗液(4) 245
裂解前(5) 45
裂解后(6) 1,222
实施例9：对包含植物乳杆菌K8裂解液的糖果 的临床试验结果
为了评价植物乳杆菌K8裂解物(植物乳杆菌K8-LTA)的人皮肤保湿和肤色改善的效力，进行临床试验。本研究根据客户的要求内容和人体应用测试指南(2011年12月由韩国食品药品监督管理局制定)、健康功能食品的人体应用测试(韩国食品药品监督管理局，2008年12月)和良好临床实践指南(GCP)进行，并获得庆熙大学临床研究审议委员会批准(研究编号KHUSBC2012-011)。
选择41位年龄为25至60岁的具有干性皮肤并且其肤色开始变暗或已经变暗的女性受试者，空腹时，在早晨服用2片产品并在晚上服用2片产品(表27)。将测试产品(包括2.1％植物乳杆菌K8-LTA的糖果)和对照产品(不含2.1％的植物乳杆菌K8-LTA的糖果)双盲随机分配给所选择的受试者并施用8周，其后在使用测试产品前的各个时间点、使用后4周、使用后8周，通过进行肤色视觉评价、皮肤水分、死皮量、TEWL、肤色(L*值)和问卷评价、安全评价、膳食调查和体重(包括BMI)调查来评价皮肤改善效果。此外，在施用产品之前和施用产品后8周，进行血液分析。通过LC/MS-MS的分析证实包含植物乳杆菌K8-LTA的糖果含有苷元异黄酮。
1.视觉评价结果
与施用产品前相比，在施用产品后4周和8周，对照组和测试组中肤色(亮度)在统计学上显著改善(降低)。组间比较，在施用产品后4周和8周，组间无统计学显著差异(p<0.05)。
2.设备评价
2-1.皮肤水分量
与施用产品相比，在施用产品后4周，两个测试组中面部和前臂的皮肤水分在统计学上均显著增加，在施用产品后8周，测试组和对照组中面部皮肤水分在统计学上显著增加，且测试组中前臂皮肤水分在统计学上显著增加。组间比较，与对照组相比，在面部施用产品后4周和8周以及在前臂施用产品后4周，测试组中皮肤水分统计学显著增加(p<0.05)(表8)。
[表8]各组之间水分量的变化
值：独立t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)
值^：Mann-Whitney检验
2-2.经皮水分流失(TEWL)
与施用产品前相比，在施用产品后8周，在面部和前臂，两个测试组中TEWL在统计学上均显著降低。组间比较，在施用产品后8周，与对照组相比，在前臂，测试组中TEWL在统计学上显著降低(p<0.05)(表9)。
[表9]各组之间经皮水分流失的比较(TEWL值)
值：配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)
值^：Wilcoxon单侧秩和检验。
°强化因数(IF)：(WX–W0)/W0×100，通过均值计算
2-3.死皮数量
与施用产品前相比，在施用产品后4周和8周，在面部，测试组中死皮数量在统计学上显著降低，且在前臂，对照组和测试组中死皮数量在统计学上均显著降低。组间比较，在面部和前臂，施用产品后4周和8周，与对照组相比，测试组中死皮数量在统计学上显著降低(p<0.05)(表10)。
[表10]各组之间死皮数量的变化
值：独立t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)
值^：Mann-Whitney检验
2-4.肤色亮度(L*值)
与施用产品相比，在脸颊部分，在施用产品后4周，测试组中肤色亮度显著增加，且施用产品后8周，对照组和测试组中肤色亮度均显著增加。在色素沉着部分，在施用产品后4周和8周，对照组和测试组中肤色亮度(L*值)均显著增加(p<0.05)。组间比较，在施用产品后4周和8周在脸颊部分以及在施用产品后8周在色素沉着部分，与对照组相比，测试组中肤色亮度(L*值)显著增加(p<0.05)(表11)。
[表11]肤色亮度(L*值)随时间的比较(n＝41)
值：独立t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001两组间的显著性差异)
值^：Mann-Whitney检验
2-5.血液分析
作为分析结果，与施用产品相比，在施用产品后8周，对照组中T.蛋白、白蛋白、肌酐项有显著差异，而测试组中T.蛋白、肌酐和脉搏(Pulse)项有显著差异，但参数的平均值在正常范围内(p<0.05)。组间比较，在使用产品后8周，两组之间在所有参数中没有显著差异(表12)。
[表12]根据项目类型的血液分析结果(n＝41)
值：独立t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001两组间的显著性差异)
值^：Mann-Whitney检验
2-6.膳食调查和体重
作为分析结果，与产品施用前相比，在产品施用后8周，测试组中重量显著增加，但在产品施用后4周和8周，膳食调查、体重和BMI指数没有显著差异(p<0.05)。组间比较，在施用产品后4周和8周，在对照组和测试组两者中膳食调查、体重和BMI指数没有显著差异(p<0.05)(表13)。
[表13]各组之间随时间的膳食调查和重量变化(n＝41)
值：独立t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001两组间的显著性差异)
值^：Mann-Whitney检验
3.问卷评价结果
3-1.对功效的问卷评价结果
在项目“滋润皮肤”、“柔滑”、“减少牵拉(reduced pulling)”、“减少死皮”和“健康皮肤”中，在施用产品后4周和8周，对照产品和测试产品中60％和70％或更多受试者回答说各项积极改善。具体而言，在施用产品后4周，与对照组相比，测试产品中“减少牵拉”和“有序的肌理”项改善了10％或更多(表14)。
[表14]对功效随时间的问卷评价结果(n＝41)
问卷标准0，没有变化/1，感觉小变化但不知道变化/2，感觉有所改善/3，感觉改善/4，大大改善。
-调查员肯定回答(％)：2～4
问卷标准1.一点也没有/2.没有/3.似乎没有/4.似乎可能/5.可能/6.很可能。
-调查员肯定回答(％)：4～6
3-2.对产品可用性的问卷评价结果
在除了关于“咀嚼感觉”所有项目中，对照产品和测试产品中70％或更多受试者持肯定回答。具体而言，在“产品的味道”和“总体产品满意度”项目中，测试组中100％受试者回答说对各项满意(表15)。
[表15]使用产品后对产品可用性的问卷(n＝41)
问卷标准1.一点也不好/2.不好/3.一般/4.似乎不错/5.很好。
-调查员肯定回答(％)：4～5
4.安全性评价结果
对于本测试期间，在所有受试者中观察到对皮肤和全身系统性症状无不良反应。
作为上述结果，确定的是，本测试产品有助于改善皮肤水分、死皮数量、经皮水分流失(TEWL)和肤色。
实施例9：包含植物乳杆菌K8裂解物(植物乳杆菌K8-LTA)的化妆品的制备和人体 应用测试
临床试验结果
制备三种类型包含植物乳杆菌K8-LTA的化妆品并进行用于评价改善皮肤保湿、肤色、皮肤弹性、眼部皱纹和真皮密度的功效的实验。
针对32位年龄为35至50岁的女性受试者进行皱纹和色素沉着的测试。当连续使用测试产品8周的测试周期时(表16)，在使用产品前的时间点、使用产品后4周、使用产品后8周，进行视觉评价(眼部皱纹、肤色)和设备测量(皮肤保湿、肤色、皮肤弹性、眼部皱纹和真皮密度)。通过区块随机化限定左/右测量部分(A：左脸颊的保湿和真皮密度、肤色的测量、弹性、右脸颊的眼部皱纹的测量/B：右脸颊的保湿和真皮密度、肤色的测量、弹性、左脸颊的眼部皱纹的测量)，以及在使用产品后4周和8周进行安全性和问卷评价。
[表16]关于化妆品的信息
在没有空气流动和阳光直射以及保持恒定的温度和湿度条件(22±2℃和50±5％)的空间在清洁后稳定化至少20分钟后，受试者参与设备测量。
1.视觉评价
1-1.各个时间眼部皱纹的视觉评价分析
与使用测试产品前相比，在使用产品后4周和8周，皱纹显著改善(P<0.05)，且皱纹改善的最大变化为5.50％的降低(改善)率(参见表17)。
[表17]使用测试产品之前和之后眼部皱纹随时间的变化(n＝32)
值：配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著的差异)
1降低或改善率：(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
1-2.各个时间肤色的视觉评价分析
与使用测试产品前相比，在使用产品后4周和8周，肤色显著改善(P<0.05)，且肤色改善的最大变化为9.04％的降低(改善)率(参见表18)。
[表18]使用测试产品之前和之后肤色随时间的变化(n＝32)
值：配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著的差异)
1降低或改善率：(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
2.设备测量
2-1.水分的测量
与使用测试产品前相比，在使用产品后4周和8周，水分在统计学上显著增加(改善)(P<0.05)，且水分改善的最大变化为42.97％的增加(改善)率(参见表19)。
[表19]使用测试产品之前和之后皮肤水分随时间的变化(n＝32)
值:配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著的差异)
1降低或改善率:(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
2-2.肤色亮度的测量值(L*值)
与使用测试产品前相比，在使用产品后4周和8周，脸颊部分的肤色亮度在统计学上显著增加(改善)(P<0.05)，并且在使用产品后8周，在色素沉着部分的亮度在统计学上显著增加(改善)(P<0.05)。脸颊部分和色素沉着部分肤色亮度改善的最大变化分别为1.59％和1.25％的增加(改善)率。
[表20]使用测试产品之前和之后肤色随时间的变化(n＝32)
值:配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著的差异)
1降低或改善率:(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
2-3.皮肤弹性的测量(莫尔(Moire)拓扑法系统)
与使用测试产品前相比，在使用产品后4周和8周，轮廓线的总距离和平均角度在统计学上显著降低(改善)(P<0.05)。
轮廓线的整个长度的最大下降率为9.64％，而角的最大下降率为14.70％(表21)。
[表21]使用测试产品之前和之后皮肤弹性随时间的分析结果(n＝32)
值:配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著的差异)
1降低或改善率:(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
2-4.眼部皱纹的测量
与使用产品前相比，在使用产品后4周，皱纹的平均深度和最大皱纹深度在统计学上显著降低(改善)，并且在使用产品后8周，最大皱纹深度在统计学上显著降低(改善)(p<0.05)。
“皱纹的平均深度”的最大下降率为8.36％，而“皱纹的最大深度”的最大下降率为26.17％(表22)。
[表22]使用测试产品之前和之后眼部皱纹随时间的分析结果(n＝32)
值:配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著
的差异)
1降低或改善率:(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
2-5.皮肤真皮密度的测量
与使用测试产品前相比，在使用产品后8周，真皮的厚度在统计学上显著增加(改善)，并且在使用产品后4周和8周，真皮的密度在统计学上显著增加(改善)(p<0.05)。
真皮厚度的的最大增加率为10.16％，而真皮密度的最大增加率为13.55％(表23)。
[表23]使用测试产品之前和之后皮肤真皮密度随时间的分析结果(n＝32)
值:配对t检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与使用产品前相比显著的差异)
1降低或改善率:(Wx-W0)/W0X100,通过均值计算
3.问卷评价
3-1.功效的问卷评价
在使用产品后4周和8周，通过问卷由受试者回答产品的功效的评价结果如下(表24)。
[表24]对效果的问卷评价的结果(n＝32)
问卷标准0，没有变化/1，感觉小变化但不知道变化/2，感觉有所改善/3，感觉改善/4，大大改善。
-调查员肯定回答(％)：3～4
问卷标准1.一点也没有/2.没有/3.似乎没有/4.似乎可能/5.可能/6.很可能。
-调查员肯定回答(％)：4～6
3-2.产品可用性的问卷评价
在使用产品后8周，通过问卷由受试者回答产品的最终可用性的评价结果如下(表25)。
[表25]对产品可用性的问卷(n＝32)
问卷标准：1.一点也不好/2.不好/3.一般/4.好/5.非常好。调查员肯定回答(％):4～5
4.安全性的评价
在使用产品后4周和8周，通过观察和提问受试者的皮肤状况由测试员(tester)进行主观和客观刺激的评价。
对于本测试期间，在所有受试者中未观察到对皮肤的不良反应(表26)。
[表26]安全性的评价：对皮肤的不良反应(n＝32)
确定的是，本测试产品(3种化妆品)有助于改善皮肤保湿、肤色、皮肤弹性、肤色、眼部皱纹和真皮密度。
[制备实施例]
制备实施例1：含有植物乳杆菌K8裂解物(植物乳杆菌K8-LTA)的糖果的制备
制备含有蔬菜植物乳杆菌K8裂解物的糖果。在糖果的制备中使用的原料包括经纯化的葡萄糖、植物乳杆菌K8裂解物2.1％、木糖醇2％、维生素C，蓝莓提取物粉末、无水柠檬酸、DL-苹果酸、合成矫味剂(蓝莓味和树莓味)、酶处理过的甜叶菊(stevia)和硬脂酸镁并且在列于表7。接着，进行用于确定苷元异黄酮是否包括在所制备的糖果中的实验。选择具有不同批号的三个测试糖果和三个对照糖果(在表27中示出成分)，通过使用研钵研磨，然后混悬在无菌蒸馏水中。通过使用超声处理器将混悬的糖果样品破碎，然后通过使用乙醇提取。乙醇层与甲醇混合，然后进行LC/MS-MS分析。结果是，从测试糖果检测到作为苷元异黄酮的大豆黄素和染料木素，但在对照糖果中则没有检测到(表28)。
[表27]糖果中成分的对比
[表28]测量糖果中苷元异黄酮的结果
糖果中苷元异黄酮的含量：均值±S.D.(ng/ml)
制备实施例2：包含含有苷元的乳酸菌的肠道调节剂的制备
根据本领域中已知的方法，在添加各种糖苷类如皂苷或异黄酮糖苷的MRS培养基中大量温育植物乳杆菌K8，以制备乳酸菌原料粉末。将少量钙和维生素D与所制备的植物乳杆菌K8原料粉末混合以制备肠道调节产品。详细的组成描述于下表29中。为了增强肠道调节作用，可添加具有肠道调节作用的少量其它乳酸菌原料粉末，例如，已知存在于大肠中的双歧杆菌原料粉末。
[表29]包含植物乳杆菌K8的肠道调节剂的组分
组分 1个包装(wt％)
植物乳杆菌K8 70
维生素D 15
钙 15
总计 100
制备实施例3：包含含有苷元的乳酸菌的生食的制备
将各种谷物粉、海藻粉、水果和蔬菜粉、蘑菇粉和本发明的乳酸菌原料粉末与大豆胚发酵粉末混合以制备原料食品。详细的组成描述于下表30中。
[表30]包含植物乳杆菌K8的生食(raw food)
组分 1个包装(wt％)
大豆胚发酵粉末 25
糙米粉 10
大麦粉 5
玉米粉 3
大豆粉 3
薏仁粉 3
芝麻粉 3
红豆粉 3
草粉(weed powder) 5
海藻粉 8
海带粉 12
芥兰粉 5
芦荟粉 3
胡萝卜粉 2
香菇(Shiitake mushroom)粉 4
灵芝(Ganoderma lucidum)粉 4
植物乳杆菌K8 2
总计 100
制备实施例4：包含含有苷元的乳酸菌的发酵乳的制备
将脱脂乳或粗乳与培养液1％混合，其中将本发明的植物乳杆菌K8在40℃预温育并发酵6至8小时，以制备发酵乳。详细的组成描述于下表31中。当发酵脱脂乳或粗乳时，为了缩短发酵时间并改善发酵乳的口味，可一起使用可商购获得的嗜热链球菌或嗜酸乳杆菌。
[表31]包含苷元乳杆菌的发酵乳的组分
组分 1个包装(wt％)
脱脂奶粉 95
寡糖 4
苷元乳杆菌 1
总计 100
制备实施例6：使用植物乳杆菌K8制备发酵大豆液
将大豆液与培养液1％混合，其中将本发明的植物乳杆菌K8在40℃预温育并发酵6至8小时，以制备发酵大豆液。详细的组成描述于下表32中。当发酵大豆液时，为了缩短发酵时间并改善提高发酵物的口味，可一起使用可商购获得的嗜热链球菌或嗜酸乳杆菌。
[表32]含有植物乳杆菌K8的发酵大豆液的组分
组分 1个包装(wt％)
大豆液 90
寡糖 9
植物乳杆菌K8 1
总计 100
制备实施例7：红参乳酸菌的制备
将本发明的植物乳杆菌K8在100L含有红参提取物0.1％的基本培养基中温育12小时，然后收集细胞。收集的细胞用水洗涤，然后冻干，并包括在微胶囊中以制备红参乳酸菌。当通过壁材料和凝结液形成基质时，通过考虑增塑剂的添加条件、增塑剂的类型和胶囊的表面张力，微胶囊可改善粘附力(adhesion)和内聚力(cohesion)。由于胶囊的外部和内部形成硬凝胶，因此胃酸中乳酸菌的存活率增加，并且得到在肠道中具有高活性的乳酸菌胶囊。使用海藻酸钠1.8％、甘油10％、黄原胶0.32％、吐温200.05％和MRS 5％作为主要涂布溶液，使用CaCl20.5M和吐温800.5％作为硬化溶液，使用壳聚糖1.5％和乳酸1.5％作为二次涂布溶液。通过实验证实，通过该条件制备的红参乳酸菌胶囊溶解在pH 7.4的人造肠液中。此外，对于抗酸测试，人参乳酸菌胶囊在pH 1.4人造胃液中以时间间隔反应直至180分钟，然后从人造肠液中释放出来，并测量活细胞计数，作为结果，人造胃液中的存活率为约95％。
根据本发明的制备方法，通过具有使糖苷转化为苷元的能力和在细胞中积累转化的苷元的能力的微生物，可提供能够以高浓度制备苷元的微生物。此外，制备含有通过本发明的制备方法产生的苷元的微生物活细胞或其裂解物，并且可广泛用于制备抗氧化剂组合物、肠道调节剂、益生菌组合物、饲料添加剂、食品添加剂、用于化妆品和其他发酵产品的原料。
尽管已经详细描述了本发明的具体部分，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这样的具体描述仅仅是优选的实施方案，并且本发明的范围不受限制。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。

Claims (23)

1.一种制备其中苷元在细胞中积累的微生物的方法，包括通过使表达β-糖苷酶的微生物在含有糖苷的培养基中温育或与含有糖苷的反应物反应而使自糖苷转化的苷元在所述微生物中积累。
2.权利要求1的方法，其中所述糖苷源自选自以下的一种或多种：人参、野山参、大豆、轮叶党参、荞麦、风铃草、水欧芹、绿豆、蒜、洋葱、银杏和葛(kudzu)。
3.权利要求1的方法，其中所述糖苷为异黄酮糖苷、皂苷糖苷、苯酚糖苷、cynophore糖苷、蒽醌糖苷、强心苷、苦苷、香豆素糖苷、硫糖苷或类黄酮糖苷。
4.权利要求1的方法，包括将一种或多种选自以下的糖苷：大豆黄苷、染料木苷、黄豆黄苷、皂苷、原花青素、柚皮素、槲皮素、芦丁糖、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、罗汉果苷V、苦杏仁苷和3-苯基香豆素，转化成一种或多种选自以下的苷元：染料木素、大豆黄素、黄豆黄素、皂苷元、3,4-羟基苯基乳酸、4-HPA、间香豆酸、对香豆酸、O-β-D-葡糖苷酸、芪类、芦丁、槲皮素、橙皮素、黄芩黄素、汉黄芩黄素、罗汉果苷IIIE、扁桃腈、苯甲醛和香豆素衍生的化合物。
5.权利要求1的方法，其中所述表达β-糖苷酶的微生物选自以下的一种或多种：乳酸菌、双歧杆菌、酵母、棒状杆菌属、曲霉属和梭菌属。
6.权利要求5的方法，其中所述乳酸菌为选自以下的一种或多种：植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus GG)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、干酪乳杆菌(L.casei)和格氏乳杆菌(L.gasseri)。
7.权利要求5的方法，其中所述乳酸菌为植物乳杆菌K8(登录号：KCTC 10887BP)。
8.权利要求1的方法，其中所述产生β-糖苷酶的微生物为选自以下的一种或多种：通常被认为是安全(GRAS)的微生物、双歧杆菌、酵母、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热链球菌(S.thermophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)双歧杆菌属(Bifidobacteria)、德氏乳杆菌Rh2(Lactobacillusdelbrueckii Rh2)、芽孢八叠球菌属菌种(Sporosarcina sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、德氏乳杆菌Rh2(Lactobacillusdelbrueckii Rh2)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana)、双歧杆菌属(Cifidobacteria)和乳杆菌属(Lactobacillus)、乳酸菌、假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、梅林青霉(Penicillium melinii)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)、环切梭菌(Clostridium orbiscindens)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、寄生曲霉BGB(Aspergillusparasiticus speare BGB)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)和黑曲霉(aspergillusniger)。
9.权利要求1的方法，其中温育微生物包括依次静态培养以进行微生物活化、摇动培养和补料培养的步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述静态培养在37℃进行12小时。
11.权利要求9的方法，其中所述摇动培养在6rpm在37℃条件下进行12小时。
12.权利要求1的方法，其中所述温育进一步包括接种，然后在培养基中温育所述微生物，接着转移至含糖苷的基本培养基中，然后将所述培养物再培养1至36小时。
13.权利要求1的方法，进一步包括用蛋白酶预处理包含糖苷的植物的步骤。
14.权利要求13的方法，其中所述蛋白酶为选自以下的一种或多种：例如Promod(百路达)、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。
15.权利要求1的方法，其中积累在微生物的细胞中的苷元的浓度为微生物培养基中苷元的浓度的超过1.5倍高。
16.一种根据权利要求1至15中任一项的方法制备并且其中苷元在细胞中积累的微生物或其裂解物。
17.权利要求16的微生物或其裂解物，积累在微生物的细胞中的苷元的浓度为微生物培养基中苷元的浓度的超过2倍高。
18.权利要求16的微生物或其裂解物，所述裂解物通过使用珠磨机、压力机、超声处理器或微流化器处理所述微生物而获得。
19.权利要求16的微生物或其裂解物，其通过干粉的形式制备。
20.一种组合物，其包含权利要求16的微生物或其裂解物。
21.一种食品，其包含权利要求16的微生物或其裂解物。
22.一种用于改善皮肤功能的组合物，其包含权利要求16的微生物或其裂解物。
23.权利要求22的组合物，其中改善皮肤保湿、肤色、皮肤弹性、皱纹或真皮密度的皮肤功能。
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