KR100745013B1 - 알러지 질환 예방 및 치료를 위한 유산균 - Google Patents

알러지 질환 예방 및 치료를 위한 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은, Th1 면역반응을 유도하는 김치유산균인 락토바실러스 플랜타럼 K8에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 Th1 싸이토카인 IL-12, IL-23 발현을 유도하고 Th2 싸이토카인 IL-4, IL-10을 억제하는 면역반응을 유도할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 균주 또는 파쇄물, 또는 균주를 배양한 배양물이나 발효식품을 섭취하였을 때, 아토피성 피부염, 과민증, 두드러기, 알레르기성 비염, 천식 등 Th1/Th2 싸이토카인의 평형이 깨져 발생하는 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있다.
김치유산균, 락토바실러스 플랜타럼 K8, 싸이토카인, 알레르기

Description

알러지 질환 예방 및 치료를 위한 유산균 {Lactic acid bacteria preventing and treating allergic diseases}
도1은 락토바실러스 속 특이 프라이머를 이용한 연쇄중합반응 결과를 보여주는 그림이다.
도2는 락토바실러스 플랜타럼 K8의 구성성분이 비장세포의 싸이토카인 발현에 미치는 영향을 보여주는 그림이다.
과민증 (anaphylaxis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma) 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 두드러기 (urticaria)와 같은 IgE 매개 알러지성 질환은 비만세포와 산성백혈구 (eosinophil)가 중요한 역할을 한다.
IgE을 생산하는 면역반응은 Th0 세포를 Th2 세포로 분화시키는 신호와 B 면역세포로 하여금 IgE를 생산하도록 하는 Th2 세포로부터 생산되는 싸이토카인 등이 매우 중요하다. IL-4. -5, -9, -10, -13과 같은 싸이토카인은 전술한 바와 같이 B 면역세포로 하여금 IgE를 생산하도록 하며 Th0 세포가 Th2 세포로 분화하는 것을 유도한다.
Th1과 Th2 면역반응의 평형을 통해 알레르기를 치료하는 시도가 있다. 첫째는 알러젠을 낮은 농도로부터 점차적으로 투여하는 감작 (hyposensitization)을 통해 알러젠에 의한 면역반응을 Th2에서 Th1으로 유도하여 IgE 대신 IgG를 생산하는 방법이다. 두 번째는 Th0 세포가 Th1 세포로 분화하도록 IFN-γ, IL-10, IL-12, TGF-β 등이나 Th1 자극 면역강화제 (adjuvant)를 투여하는 방법 등이 있다.
신생아 시기의 감염과 알레르기 질환과는 역비례 관계가 있다 (hygiene hypothesis, Strachan, D. P., 1989, Hay fever, hygiene and household size. BMJ 299:1259-1260). 신생아의 면역체계 완성에 중요한 병원성 미생물에 의한 감염 감소는 면역체계의 불균형을 해소하지 못 하는 것으로 알려져 있다. 실제로 태아 및 신생아 기간은 Th2 면역반응 쪽으로 편향되어 있는 것으로 알려져 있다.
유산균은 사람의 면역반응을 조절하고 장관의 항상성 (homeostasis)을 유지하는 데 도움을 주고 최근에는 항원제시세포의 일종인 수지상 세포 (dendritic cell)를 자극하여 Th1 면역반응을 유도하여 알레르기 질환의 예방 및 치료에 기여할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Mohamadzadeh, M. et al., 2005, Lactobacilli activate human dendritic cells that skew T cells toward T helper 1 polarization. PNAS. 102:2880-2885.). 실제로 임산부와 신생아의 Lactobacillus와 Bifidobacterium 속 균주의 섭취를 통해서 아토피 피부염이 완화되었다는 보고 등이 있다 (Rosenfeldt, V. et al., 2003. Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 111:389-395).
유산균의 건강증진 효과는 속 (genus)과 종 (species)의 일반적 특징이라기보다는 균주 (strain) 특이적이다 (Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London Ontario, Canada, 2002). 따라서 본 발명은 Th2 싸이토카인의 수치를 낮추고 Th1 싸이토카인의 수치를 높여 Th1/Th2 면역반응의 평형을 통해 아토피성 피부염 등의 IgE 매개 알레르기성 질환 예방 및 치료를 위한 락토바실러스 플랜타럼 K8 (Lactobacillus plantarum K8) 및 그 파쇄물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 락토바실러스 플랜타럼 K8을 함유하는 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 락토바실러스 플랜타럼 K8을 이용하여 발효한 식품을 제공하는 것이다.
각지에서 수집한 김치에서 배지의 pH를 낮추어 황색을 띠는 집락을 선발하여 속 특이 프라이머 (genus-specific primer)를 이용한 연쇄중합반응에서 중합산물을 형성하는 락토바실러스 속 김치유산균을 선발하였다.
선발한 김치유산균에서 Th2 면역반응으로 편향된 ovalbumin 면역제시 마우스의 비장세포에서 Th1 cytokine-12를 발현하고 Th1 cytokine-4를 억제하는 유산균을 선발하였다.
유산균의 구성성분을 각각 분리하여 상기와 같이 싸이토카인의 발현 양상을 조하여 유산균의 구성성분 중 하나인 lipoteichoic acid가 싸이토카인 평형을 이룰 수 있도록 Th1 면역반응을 유도하는 것을 확인하였다.
상기 김치유산균의 형태적, 생리적 특징을 조사하여 락토바실러스 플랜타럼 K8으로 명명하였으며 2006년 1월 20일부로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 본 발명을 완성하였다 (기탁번호 KCTC 10887BP).
본 발명에 따른 김치유산균의 특성은 다음과 같다.
1. 균의 형태
MRS 한천평판배지에서37℃에서 2일간 배양하였을 때,
① 균의 형태: 단간균
② 운동성: 없음
③ 포자형성능: 없음
④ Gram staining: 양성
2. 생리적 특징
① 15℃에서 생육: ＋
② 45℃에서 생육: ＋
③ 젖산 생산 및 형태: DL형 젖산
④ 당발효 시험
아미그달린:＋
아라비노스:＋
셀로바이오스:-
에스큘린: ＋
글루코네이트:
만니톨:＋
멜레지토스:＋
멜리바이오스:＋
라피노스:＋
리보스:＋
솔비톨:＋
설탕:＋
자일로스:-
이와 같은 균의 형태적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 균주는 락토바실러스 플랜타럼 K8로 명명하였다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
실시예 1
김치유산균 수집
각지에서 수집한 김치에서 찌꺼기를 거르고 멸균생리식염수에 적절히 희석하여 pH 지시약이 첨가된 평판측정용 한천배지 (효모 추출물 0.25중량%, 프로테오스 펩톤 No.3 0.5 중량%, 포도당 0.1중량%, 트윈 80 0.1중량%, L-씨스테인 0.01중량%, 아가 1.5 중량%, 브로모크레졸 퍼플 0.005%)에 집락을 배양하였다. 배지의 pH를 낮추어 황색을 띠는 집락을 선발하여 속 특이 프라이머 (genus-specific primer, Dubernet, et al., 2002. A PCR-based method for identification of lactobacillus at the genus level. FEMS Microbiol. Letts. 214:271-275) (표1)를 이용한 연쇄중합반응에서 중합산물 (250 base-pairs)을 형성하는 락토바실러스 속 김치유산균을 선발하였다 (도1).
락토바실러스 속 특이 프라이머
R16-1(16S) CTTGTACACACCGCCCGTCA
LbLMA1-rev (ITS) CTCAAAACTAAACAAAGTTTC
실시예 2
Th2 편향 비장세포의 싸이토카인에 미치는 김치유산균의 영향
Th1 cytokine IL-12 (p70)와 Th2 cytokine IL-4의 발현에 미치는 유산균의 영향을 조사하기 위하여 ovalbumin을 제시하여 (primed) Th2 면역으로 편향된 비장세포를 사용하였다. BALB/c mouse에 ovalbumin을 흡착한 Al(OH)3을 0일 및 6일에 복강 주사하였다. 13일 째에 비장을 제거하고 단일세포로 분리한 후, 적혈구를 용혈시켜 비장세포를 얻어 2×106 cell/ml의 수로 10% FBS 및 항생제가 첨가된 RPMI 배지 (HyClone)에 현탁하였다. well 당 2×105 cell을 심고 ovalbumin 1mg/ml, 유산균 108 cfu/well을 처리하여 3일간 배양하였다. 배양 상징액을 회수하여 IL-12, IL-4를 ELISA 방법으로 측정하였다.
Lactobacillus plantarum K8이 IL-12를 가장 강하게 유도하였다. 각 균주의 IL-12와 IL-4 유도능은 서로 달랐으며 IL-12 유도능이 큰 유산균은 IL-4 발현을 억제하는 경향을 나타내었다.
Strains IL-12 IL-4 Strains IL-12 IL-4
pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml
Lactobacillus K1 3027.4 136.8 K44 3698.2 106.5
K2 2657.3 156.8 K45 2698.1 163.4
K3 3452.3 126.5 K46 2468.2 156.3
K4 1369.4 236.4 K47 1468.7 221.3
K5 2523.6 163.4 K48 934.5 243.0
K6 986.5 226.3 K49 4013.5 93.2
K7 3658.5 116.9 K50 2578.3 156.3
K8 5032.3 43.8 K51 875.4 248.3
K9 2987.4 136.5 K52 965.4 236.9
K10 1539.8 216.5 K53 1236.5 216.3
K11 782.6 246.7 K54 2465.8 163.5
K12 678.2 253.6 K55 1689.4 196.5
K13 1368.5 213.6 K56 968.5 236.8
K14 2361.2 168.7 K57 3578.6 121.5
K15 1786.5 201.3 K58 1352.6 215.6
K16 569.4 263.5 K59 2598.7 163.5
K17 697.8 254.6 K60 1326.8 216.4
K18 2635.5 163.5 K61 4021.3 93.6
K19 1698.7 206.5 K62 2983.4 132.4
K20 3462.3 125.3 K63 3694.5 113.6
K21 2569.3 143.6 K64 3457.8 119.4
K23 1698.2 216.3 K65 2698.4 143.5
K24 697.3 254.6 K66 3126.4 124.6
K25 4593.5 75.6 K67 2569.4 146.9
K26 3421.8 113.2 K68 1249.4 206.4
K27 1536.2 214.5 K69 986.5 239.4
K28 1987.2 191.3 K70 1578.8 203.6
K29 2569.4 145.3 K71 1453.7 211.4
K30 2365.6 165.4 K72 2685.6 143.5
K31 1982.4 187.6 K73 3269.9 126.3
K32 698.4 263.4 K74 1635.8 223.4
K33 879.5 245.6 K75 987.5 239.4
K34 1265.5 213.6 K76 1638.9 210.3
K35 1985.6 236.5 K77 2635.4 156.1
K36 2687.4 145.3 K78 973.6 241.3
K37 2953.4 136.2 K79 876.9 256.3
K38 1326.8 215.6 K80 1368.5 216.3
K39 2789.6 156.3 K81 2698.5 136.4
K40 3658.4 112.4 control 25.6 276.4
K41 1693.4 209.7 Lb. gasseri ATCC33323 3698.7 115.3
K42 963.4 236.1 Lb. acidophilus VPI11088 2987.5 135.4
K43 1527.7 216.2 Lb. casei ATCC12452 3987.6 93.2
실시예 3
3-1) 유산균 구성성분 분리
Bacterial subcellular fractions는 Roman Dziarski (Methods in enzymology, Academic Press, San Diego, 1994, pp255-260) 등이 사용한 방법을 이용하였다. 요약을 하면, Lactobacillus plantarum K8을 optimal density (OD) 620nm에서 mid logarithmic phase 까지 배양한 후 세포를 ice ethanol bath에 넣어 4℃까지 cooling 시켰다. 원심분리기(6,000xg, 4℃)를 이용하여 세포를 harvest하고, saline으로 re-suspension 시킨 후 100℃에서 20분간 boiling 시켰다. heat-killed bacterial 세포를 다시 원심분리하여 모은 후 saline으로 두 번 distilled water (DW)로 한번 그리고 acetone으로 3번 세척하였다. 37℃에서 heat-killed 된 bacterial 세포를 건조시킨 후 'heat-killed bacterial cells'로 사용하였다.
건조된 heat-killed bacterial 세포를 ice cold water로 suspension 시킨 후 0.1mm glass beads를 사용하여 분쇄하였다. 파쇄되지 않은 세포는 원심분리 (1,500xg, 4℃, 10분)를 사용하여 제거시키고, 파쇄된 세포만을 'crude extract'로 사용하였다. 원심분리 (6,500xg, 4℃, 30분)를 통하여 crude extract를 침전 시킨 후 침전물을 DW로 3번 세척하였다. 이 후 ribonuclease (100ug/ml)과 deoxyribonuclease (50ug/ml)를 첨가하여 37℃에서 18시간동안 incubation 시켰다. 6,500xg에서 30분간 원심분리를 수행하고 침전물을 동결건조 시킴으로써 cell wall을 분리하였다.
1g의 cell wall을 5% trichloroacetic acid (TCA)를 사용하여 22℃에서 18시간동안 incubation 시킨 후 원심분리를 통하여 침전 시켰다. 침전물은 acetone을 이용하여 건조시킴으로써 'peptidoglycan'을 분리하였다. 반면, supernatant는 ethyl ether를 이용한 TCA extraction을 통하여 TCA를 제거시키고 3배의 acetone을 이용하여 침전시킴으로써 'teichoic acid(TA)'를 준비하였다.
Lactobacillus plantarum K8으로부터의 genomic DNA는 genomic DNA prep kit (Promega)을 사용하여 분리하였다. 또한 리포테익코익산 (lipoteichoic acid)는 Hartung (Schroder, et al., 2003. Lipoteichoic acid (LTA) of Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus activates immune cells via Toll-like receptor (TLR)-2, Lipopolysaccharide-binding protein (LBP), and CD14, whereas TLR4 and MD-2 are not involved. J. Biol. Chem. 278:15587-15594) 등이 사용한 butanol extraction 방법을 사용하여 분리하였다.
3-2) 유산균 구성성분의 싸이토카인에 미치는 영향
IL-23은 IL-12에 비해서 cytotoxic T 세포의 유지와 Th1 세포로의 분화에 있어서 IL-12에 비해서 더욱 효과가 뛰어나다는(8)것이 보고됨에 따라 Th1 cytokine으로서 발현을 조사하였으며 IL-4와 함께 중요한 Th2 cytokine IL-10의 발현량을 조사하였다. 실시예 2에서와 같이 비장세포를 분리하고 각각의 구성성분을 분리하여 처리(10ug/ml)했을 경우 생균을 처리하거나 heat-killed plantarum(108)을 처리했을 때 보다 더 높은 사이토카인의 발현을 유도하였다. 그 중에서도 순수 분리한 리포테익코익산과 테이코익산 (Teichoic acid)을 처리했을 경우 IL-23p19의 발현 양이 높게 나타났고, DNA와 crude extract를 처리할 경우에는 IL-23p19 및 TNF-a에 비해서 IL-10의 발현 level이 증가하였다 (도2).
본 발명의 균주 또는 균주를 배양한 배양물이나 발효식품, lipoteichoic aicd 또는 이를 함유하는 파쇄물을 섭취하였을 때, Th1 면역반응을 유도하여 아토피성 피부염, 천식, 두드러기, 과민증, 알레르기성 비염 등 알레르기성 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

Claims (4)

  1. 김치에서 분리되고, IL-12 및 IL-23의 발현을 유도하고, 동시에 IL-4 및 IL-10의 발현을 억제하며, IL-23의 발현 유도능이 있는 리포테이코익산(lipoteichoic acid) 또는 테이코익산(teichoic acid)을 생산하는 특징을 가지는 락토바실러스 플랜타럼 K8 KCTC 10887BP.
  2. 제1항의 균주를 이용하여 발효시킨 식품.
  3. 제1항의 균주 또는 그 파쇄물을 함유하는 식품.
  4. 삭제
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