TWI674101B - 檸檬發酵產物之製備方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明所揭一種檸檬發酵產物之製備方法，其係將一檸檬汁液以至少一乳酸菌進行發酵，其中：該檸檬汁液之酸鹼值係為3～4，糖度為15 o Brix；及該乳酸菌之菌種係為植物乳桿菌（
Lactobacillus plantarum），發酵乳桿菌（
Lactobacillus fermentum），嗜酸乳桿菌（
Lactobacillus acidophilus）、德氏乳桿菌亞種保加利亞（
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus）或上述乳酸菌之任意組合。藉由投予該檸檬發酵產物，係能夠有效達到於個體產生免疫調控、抗發炎、抗過敏等功效。
Description
本發明係有關於一種植物發酵產物之製備方法及其用途，特別係指一種檸檬發酵產物之製備方法及其用途。
按，檸檬係為一種具有高度營養價值之植物，因而許多食品業者係透過萃取法獲得檸檬內之活性成份，惟，基於檸檬中之活性成份係非大量存在，故以萃取法係無法大量獲得活性成份，不利於量產應用；再者，萃取法涉及乾燥、加熱、使用萃取溶劑等步驟，而檸檬中之活性成份係對於萃取條件十分敏感，亦即萃取條件會造成該些活性成份之變質或破壞其活性，並且，若所使用之萃取溶劑為有機溶劑，係會增加對於人體健康造成危害之風險。
先前研究指出，乳酸菌係被認為是一種對於人體健康有助益並且安全性高之微生物，例如抑制致病菌、緩和乳糖不耐症、預防和治療下痢、降低膽固醇含量、增加免疫力、抗代謝症候群等。目前乳酸菌已儼然成為大多數消費者能夠接受之食品，因此，乳酸菌目前已經成為許多食品業者會選擇使用之成份之一。
本發明之主要目的係在於提供一種檸檬發酵產物之製備方法及其用途，其係透過一預定產製條件，以達到有效地提高檸檬發酵產物之活性及其功能之功效。
本發明之另一目的係在於提供一種檸檬發酵產物之製備方法及其用途，藉由本發明所揭製備方法所得到之檸檬發酵產物，其係具有免疫調控、抗發炎、抗過敏等功效，而能作為醫藥組合物之有效成份。
緣是，為能達成上述目的，本發明所揭一種檸檬發酵產物之製備方法，其係將一檸檬汁液以至少一乳酸菌進行發酵，其中：
該檸檬汁液之酸鹼值係為3～4，糖度為15
oBrix；及
該乳酸菌之菌種係為植物乳桿菌（
Lactobacillus plantarum），發酵乳桿菌（
Lactobacillus fermentum），嗜酸乳桿菌（
Lactobacillus acidophilus）、德氏乳桿菌亞種保加利亞（
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus）或上述乳酸菌之任意組合。
舉例來說，該乳酸菌係得為寄存編號為BCRC 10069之菌株或寄存編號為BCRC 10696之菌株。
更進一步來說，本發明所揭一種檸檬發酵產物之製備方法，其包含有下列步驟：
步驟A：取一檸檬汁液；
步驟B：調整該檸檬汁液之酸鹼值為3～4；
步驟C：添加熊芶居菊苣纖維或葡萄糖，調整該檸檬汁液之糖度至15 o Brix；
步驟D：加入該乳酸菌於一預定發酵條件下進行發酵；
步驟E：獲得一檸檬發酵產物。
其中，該預定發酵條件係為發酵溫度約30℃、發酵時間約72小時。
其中，於加入乳酸菌前，將該檸檬汁液加熱。
其中，該乳酸菌係由植物乳桿菌，發酵乳桿菌，嗜酸乳桿菌及德氏乳桿菌亞種保加利亞所組成。
藉由本發明所揭檸檬發酵產物之製備方法得到之檸檬發酵產物係具有許多生理功效，因而能作為醫藥組合物之有效成份。
由於該檸檬發酵產物係能夠係能抑制IL-6、TNF-α或/及IFN-r之表現，故於本發明之一實施例中係揭露該檸檬發酵產物係能用於製備抗發炎之醫藥組合物之用途，其中，該檸檬發酵產物之濃度係為1wt％～2wt％。
再者，由於藉由本發明所揭製備方法製得之檸檬發酵產物係具有增加如IFN-r、IL-12等細胞激素之表現，因此，於另一實施例中係揭露該檸檬發酵產物係用於製備免疫細胞相關激素促進劑之用途，其中，該檸檬發酵產物之濃度係為1wt％～2wt％。
於本發明之又一實施例係揭露藉由本發明所揭製備方法製得之檸檬發酵產物係能用於製備IL-10抑制劑之用途，其中：該檸檬發酵產物之濃度為1wt％～2wt％。
於本發明之次一實施例係揭露藉由本發明所揭製備方法製得之檸檬發酵產物係能用於製備免疫調控之醫藥組合物之用途，其中：該檸檬發酵產物之濃度為1wt％～2wt％，並且能抑制IL-10之表現，及促進IFN-r及IL-12之表現。
以下，為能說明本發明之功效，將茲舉若干實例並搭配圖表作進一步說明如后。
以下實例所使用之檸檬係為購買自台中、南投及屏東之優利卡品種及無籽檸檬品種，其中，來自屏東之優利卡檸檬係簡稱為PE；來自台中之優利卡檸檬係簡稱為TE；來自南投之優利卡檸檬係簡稱為NE；來自屏東之無籽檸檬係簡稱為PL；來自台中之無籽檸檬係簡稱為TL；來自南投之無籽檸檬係簡稱為NL。
以下實例中所稱檸檬控制組係指檸檬經本發明所揭方法或實例一所揭方法進行前處理後，但未加入乳酸菌進行發酵之檸檬汁。
以下實例中所稱之共培養或共同培養係指將菌株PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696共同培養後作為發酵用之菌元，並簡稱為CO。
以下實例中之檸檬發酵產物前面的英文-英文或數字來表示檸檬產地與品種、以及用以發酵之菌元，舉例來說，NE- LF33檸檬發酵產物係由南投優利卡檸檬經菌株LF33發酵而得者；NE-Co檸檬發酵產物係由南投優利卡檸檬經共同培養菌株發酵而得者；PL-10069檸檬發酵產物係由屏東無籽檸檬經菌株BCRC 10069發酵而得者；PL-229檸檬發酵產物係由屏東無籽檸檬經菌株PM229發酵而得者。
實例一：製備檸檬發酵產物
自生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and ResearchCenter；BCRC）選購乳酸菌，其寄存號分別為BCRC 10069、BCRC 10696、BCRC 12256、BCRC14065、BCRC 14619。並取自行分離之乳酸菌菌株，其代號分別為PM2、PM68、PM78、PM201、PM206、PM229、PM301、RY2、LAP5、LF33。
依據下列程序進行檸檬發酵產物之製備：
首先，活化乳酸菌，再以8000 rpm離心10分鐘，以無菌水回溶，成為乳酸菌液。
將檸檬榨汁後，以過濾方式去除果皮渣，經8000 rpm離心10分鐘後，以碳酸氫鈉調整酸鹼值至pH 3.5，再添加熊芶居菊苣纖維或葡萄糖，以調整糖度至15o Brix，並於90℃下進行加熱處理5分鐘後冷卻，加入2％（8 Log/ CFU）乳酸菌液，於30℃下發酵72小時。
不同來源或品種之檸檬以不同乳酸菌以上述程序進行發酵後，計算乳酸菌之菌數，結果如下表一至表三所示，其中，表二中之菌數變化為發酵72小時之菌數減去未發酵之菌數。
由表一至表二之結果可知，僅由PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696之菌株經發酵後之菌數仍能夠維持7-8 log CFU/mL。由表三之結果可知，不同產地之檸檬分別以PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696之菌株進行發酵後，其菌數仍能維持在7.96-8.92 Log/ CFU。
由上述結果可知，乳酸菌PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696係為能夠用於發酵檸檬之菌株，並且能維持良好活性及生長能力。
表一：乳酸菌株活化20小時後之菌數（Log CFU/ mL）
| 乳酸菌菌株 | 活化20小時後之菌數（Log CFU/ mL） |
| PM2 | 8.47±0.05 |
| PM68 | 8.94±0.05 |
| PM78 | 8.91±0.07 |
| PM201 | 8.48±0.03 |
| PM206 | 8.41±0.01 |
| PM229 | 9.25±0.00 |
| PM301 | 9.49±0.09 |
| RY2 | 8.96±0.05 |
| LF33 | 9.09±0.03 |
| LAP5 | 8.81±0.05 |
| BCRC 10069 | 9.18±0.03 |
| BCRC 10696 | 9.14±0.05 |
| BCRC 12256 | 8.61±0.05 |
| BCRC 14065 | 8.88±0.03 |
| BCRC 14619 | 9.01±0.02 |
表二、優利卡檸檬汁添加葡萄糖或熊芶居菊苣纖維，經不同乳酸菌發酵不同時間之菌數（Log CFU/ mL）
| 乳酸菌菌株 | 發酵菌數（Log CFU/ mL） | |||||
| 葡萄糖 | 熊芶居菊苣纖維 | |||||
| 0小時 | 72小時 | 菌數變化 | 0小時 | 72小時 | 菌數變化 | |
| PM2 | 7.37±0.07 | 6.57±2.63 | -0.80 | 7.31±0.00 | 4.52±0.06 | -2.80 |
| PM68 | 7.65±001 | 1.45±0.20 | -6.20 | 7.66±0.05 | - | -7.66 |
| PM78 | 7.60±0.30 | 2.87±4.05 | -4.73 | 7.51±0.09 | - | -7.51 |
| PM201 | 7.20±0.01 | - | -7.20 | 7.16±0.02 | - | -7.16 |
| PM206 | 7.32±0.04 | 8.08±0.06 | 0.75 | 7.34±0.03 | 8.02±0.02 | 0.68 |
| PM229 | 6.87±0.01 | 8.06±0.39 | 1.19 | 6.86±0.03 | 8.30±0.08 | 1.44 |
| PM301 | 6.83±0.02 | - | -6.83 | 6.88±0.01 | - | -6.88 |
| RY2 | 7.60±0.01 | 2.72±3.85 | -4.88 | 7.48±0.02 | 6.49±0.06 | -0.99 |
| LF33 | 6.81±0.01 | 8.37±0.03 | 1.57 | 6.86±0.04 | 8.67±0.08 | 1.81 |
| LAP5 | 7.13±0.04cd | 4.26±6.02 | -2.87 | 7.13±0.00 | 8.64±0.06 | 1.51 |
| BCRC 10069 | 6.53±0.00g | 7.84±0.28 | 1.31 | 6.47±0.06 | 8.01±0.04 | 1.53 |
| BCRC 10696 | 6.53±0.07g | 7.96±0.33 | 1.43 | 6.71±0.05 | 8.12±0.08 | 1.41 |
| BCRC 12256 | 7.03±0.00de | 3.19±4.05 | -3.85 | 7.08±0.04 | - | -7.08 |
| BCRC 14065 | 7.28±0.09bc | 3.97±5.61 | -3.31 | 7.22±0.03d | - | -7.22 |
| BCRC 14619 | 6.60±0.12g | - | -6.60 | 6.41±0.07 | - | -6.41 |
表三：不同產地優利卡檸檬汁以不同乳酸菌進行發酵之菌數（Log CFU/ mL）
| 乳酸菌菌株 | 發酵時間(時) | |||||
| 屏東 | 台中 | 南投 | ||||
| 0 | 72 | 0 | 72 | 0 | 72 | |
| 控制組 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| PM229 | 6.97±0.02 | 8.16±0.01 | 6.96±0.02 | 8.18±0.10 | 6.93±0.00 | 7.99±0.01 |
| LF33 | 7.08±0.01 | 8.96±0.01 | 7.00±0.02 | 8.62±0.16 | 7.02±0.01 | 8.74±0.02 |
| LAP5 | 7.50±0.05 | 8.60±0.05 | 7.46±0.06 | 8.53±0.08 | 7.49±0.07 | 8.01±0.02 |
| BCRC10069 | 6.54±0.04 | 8.40±0.03 | 6.68±0.05 | 8.08±0.02 | 6.48±0.02 | 8.79±0.09 |
| BCRC10696 | 6.89±0.05 | 8.52±0.08 | 6.96±0.05 | 8.07±0.00 | 6.92±0.01 | 7.96±0.02 |
| 共同培養 | 7.09±0.01 | 8.66±0.05 | 6.97±0.02 | 8.77±0.09 | 7.06±0.04 | 8.92±0.02 |
實例二：乳酸菌鑑定結果
將乳酸菌PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696分別利用ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep System商業套組抽取其DNA，以API 50 CHL套組和16S rDNA PCR進行鑑定，可知乳酸菌PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696分別為
Lactobacillus plantarum 、 Lactobacillus fermentum 、 Lactobacillus acidophilus 、 Lactobacillus plantarum 和 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus。
實例三：檸檬發酵產物之酸鹼值測定
參考實例一之方法，以乳酸菌PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069及BCRC 10696分別與來自不同產地及品種之檸檬進行發酵，製備不同檸檬發酵產物，並檢測發酵前後之酸鹼值，結果如表四及表五所示。
表四：乳酸菌培養20小時之上清液及不同產品/品種之檸檬汁之酸鹼值
| 種類 | 上清液酸鹼值 |
| PM 229 | 3.83±0.02 |
| LF33 | 4.22±0.01 |
| LAP5 | 3.87±0.01 |
| BCRC 10069 | 3.84±0.01 |
| BCRC10696 | 3.78±0.01 |
| 屏東/優利卡 | 2.62±0.09 |
| 屏東/無籽檸檬 | 2.33±0.05 |
| 台中/優利卡 | 2.39±0.04 |
| 台中/無籽檸檬 | 2.35±0.04 |
| 南投/優利卡 | 2.65±0.00 |
| 南投/無籽檸檬 | 2.58±0.00 |
表五：不同產地之檸檬汁以不同乳酸菌發酵後之酸鹼值
| 乳酸菌 | 上清液酸鹼值 | |||||
| 屏東 | 台中 | 南投 | ||||
| 優利卡 | 無籽檸檬 | 優利卡 | 無籽檸檬 | 優利卡 | 無籽檸檬 | |
| 控制組 | 3.48±0.02 | 3.57±0.02 | 3.50±0.01 | 3.44±0.06 | 3.41±0.00 | 3.37±0.01 |
| PM229 | 3.43±0.04 | 3.48±0.00 | 3.45±0.05 | 3.49±0.01 | 3.40±0.01 | 3.35±0.00 |
| LF33 | 4.71±0.02 | 5.13±0.06 | 4.73±0.05 | 3.84±0.09 | 4.94±0.00 | 3.41±0.00 |
| LAP5 | 3.40±0.02 | 4.97±0.03 | 3.50±0.01 | 3.46±0.05 | 3.38±0.00 | 3.38±0.02 |
| BCRC 10069 | 4.77±0.01 | 4.05±0.01 | 3.69±0.02 | 3.47±0.04 | 4.35±0.00 | 3.35±0.01 |
| BCRC 10696 | 3.36±0.01 | 3.52±0.01 | 3.46±0.04 | 3.45±0.02 | 3.41±0.01 | 3.36±0.01 |
| 共同培養 | 4.65±0.01 | 4.35±0.04 | 3.98±0.03 | 3.70±0.12 | 4.69±0.05 | 3.40±0.06 |
實例四：細胞存活率分析
自食品工業研究所生物資源保存及研究中心細胞株人類單核球細胞為BCRC 60430（下稱THP-1細胞）。
將定量的THP-1細胞（1×106 cells/mL）置於孔盤中，於37°C、5% 二氧化碳之培養箱中培養隔夜，使細胞生長，以磷酸鹽緩衝液清洗後，分別加入不同濃度之檸檬發酵產物（5%、4%、3%、2%和1%），分別作為實驗組，並以添加培養基作為正控制組，其中，各實驗組之檸檬發酵產物係參照實例一所揭方法製成者。各組細胞培養24小時後，將孔盤內溶液吸出，以磷酸鹽緩衝液清洗後，加入300 μL MTT溶液，經培養後，去除上清液，再加入200 μL二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide），而後以酵素連結免疫分析測讀儀讀取波長570 nm之吸光值，再以下列公式計算出細胞存活率，結果如第一圖至第七圖所示。
細胞存活率（%）＝實驗組的細胞吸光值/ 控制組的細胞吸光值 × 100 %
由第一圖至第七圖之結果可知，當檸檬發酵產物之濃度為5％時，會降低THP-1細胞之存活率至50％以下；當檸檬發酵產物之濃度為1％時，THP-1細胞之存活率為60～80％；當檸檬發酵產物之濃度為2％時，THP-1細胞之存活率係能夠高於80％。
由此可知，藉由本發明所揭方法製備出之檸檬發酵產物係於濃度為1％及2％時，始能增加細胞之存活率。
實例五：免疫反應之細胞試驗
將THP-1細胞（1×10
6cells/mL）分別以不同條件進行處理：濃度為1％或2％之不同檸檬發酵產物、濃度為1％或2％之檸檬汁、乳酸菌上清液後，培養24小時，再分別取其上清液，以酵素連結免疫分析法檢測與抗過敏相關之細胞激素IFN-r、IL-12和IL-10之表現，並且以添加培養基作為正控制組，檢測結果如第八圖至第四十三圖所示。
由第八圖至第十九圖之結果顯示，添加濃度2％之NL-LF33檸檬發酵產物、NE-Co檸檬發酵產物及添加濃度1% PL-LAP5檸檬發酵產物係皆能提高細胞內之IFN-r分泌量，其分泌量分別為39.29±11.36、209.30±24.70和25.87±3.21 pg/mL。
由第二十圖至第三十一圖之結果可知，添加濃度2% 之PL-10069檸檬發酵產物、NL- 10069檸檬發酵產物、PE-10696檸檬發酵產物、TL-10696檸檬發酵產物係能夠增加THP-1細胞內之IL-12分泌量，而其表現量分別為43.53±1.33、42.63±5.30、55.18±5.62和24.88±0.00 pg/mL。
由第三十二圖至第四十三圖之結果可知，添加濃度2%之TE-229、TL-229檸檬發酵產物、NE-229檸檬發酵產物和TL-10696檸檬發酵產物係能夠降低細胞IL-10之分泌量，產量分別為0.78±0.37、0.37±0.00、0.69±0.12和0.41±0.05；而添加濃度1%之NL-PM229檸檬發酵產物、TE- 10069檸檬發酵產物、NE-10069檸檬發酵產物、NL-10069檸檬發酵產物和TL-10696檸檬發酵產物亦能降低細胞IL-10之分泌量，產量分別為1.62±0.08、0.56±0.06、1.32±0.52、2.34±0.09以及0.52±0.00 pg/mL。
由第九圖至第四十三圖之結果可知，藉由本發明所揭方法將檸檬以乳酸菌PM229、LF33、LAP5、BCRC 10069或BCRC 10696進行發酵後所得之檸檬發酵產物，於濃度1％或2％投予至一個體，係能夠有效地增加細胞IFN-r、IL-12之分泌量，並且降低細胞IL-10之分泌量，已達到減少個體過敏反應之發生。
實例六：抗發炎之細胞試驗
自食品工業研究所生物資源保存及研究中心購買細胞株：小鼠巨噬細胞為BCRC 60001（下稱RAW264.7細胞株）。
將RAW264.7細胞株經LPS誘導之同時加入濃度為1％或2％之不同檸檬發酵產物、濃度為1％或2％之檸檬汁或乳酸菌上清液，與RAW264.7細胞株共同反應24小時，另以未經LPS誘導之RAW264.7細胞株作為對照組，以及以未刺激之培養基作為空白組。反應完成後，分別取各組之上清液，以酵素連結免疫分析法TNF-α、IFN-r及IL-6之表現，結果如第四十四圖至第六十一圖所示。
由第四十四圖至第四十九圖之結果可知，RAW264.7細胞經LPS刺激後，TNF-α分泌量為2060.07±66.00 pg/mL，表示細胞呈現發炎反應狀態，而投予LPS之同時添加1% NE-10069檸檬發酵產物，係可顯著降低細胞分泌TNF-α（1712.66±76.80 pg/mL），使細胞對抗發炎反應之發生。
更進一步地，請參第五十圖至第五十五圖，添加LPS之同時分別添加2% PE- BCRC 10696檸檬發酵產物、TL-10696檸檬發酵產物及NL- 229檸檬發酵產物，係能降低RAW264.7細胞IFN-r分泌量，而產量分別為14.42±0.86、13.04±1.08和35.52±11.57 pg/mL；而添加LPS刺激之同時分別添加1% PE-10696檸檬發酵產物、PL-10069檸檬發酵產物、TE-229檸檬發酵產物、TE-10069檸檬發酵產物、TL-229檸檬發酵產物、TL-10696檸檬發酵產物及NE-CO檸檬發酵產物，係能夠使RAW264.7細胞降低IFN-r分泌量，而其分泌量分別為13.42±0.55、10.68±0.73、13.23±0.82、64.73±1.93、56.87±5.41、15.90±1.81和29.68±13.75 pg/mL。
請再參第五十六圖至第六十一圖，添加LPS之同時分別添加2% PE-10696檸檬發酵產物、TE-229檸檬發酵產物和TL-229檸檬發酵產物，係能夠使RAW264.7細胞顯著降低IL-6分泌量，其分別為31.46±13.63、300.11±27.98和618.92±57.05 pg/mL。
綜合第四十四圖至第六十一圖之結果顯示，由本發明所揭方法製備之檸檬發酵產物確實能夠增加個體抗發炎、活化補體系統及避免傷口感染之能力，其中，又以菌株BCRC 10069、PM229及BCRC 10696作為發酵菌元得到之檸檬發酵產物的抗發炎、活化補體系統、避免感染之效果較佳。
實例七：免疫反應之細胞實驗
取ICR雄鼠（樂斯科生物科技股份有限公司）之血液，離心去除血清層，取周邊血液單核球細胞，添加HBSS（Hank’s Buffered Salt Solution），緩慢混合均勻，以18℃、100 RCF離心10分鐘，去除上清液，加入RPMI 1640培養基（內含10% FBS及1% NEAA），利用血球計數器進行細胞計數，將細胞濃度調整至2×106 cell/ well，接種至孔盤後，在 37°C、5% 二氧化碳培養箱中培養24小時後，每孔分別以進行不同處理：加入不同濃度之檸檬發酵產物及刺激物質OVA後，分別以酵素連結免疫分析法檢測細胞激素IFN-r及IL-12之表現量，並且以添加培養基作為正控制組，OVA（200μg/ mL）為負控制組。結果係如第六十二圖至第七十三圖所示。
請參第六十二圖至第六十七圖，可知濃度2%之PL-10069、TL-229、NL-229、NL-10069和NL-LF33檸檬發酵液係能分別刺激PBMC分泌IFN-r，其分泌量分別為1069.57±15.26、1085.78±7.66、1308.26±56.36、1262.93±55.84和1130.15±116.14 pg/ mL檸檬發酵液係能分別刺激PBMC分泌IFN-r，並且，濃度1%之PL-10069、TL-229、TL-10696、NL-229和NL-10069，分泌量分別為1006.52±135.11、1058.90±45.67、1101.02±268.75、1069.91±76.32和1129.35±7.75 pg/ mL。
請再參第六十八圖至第七十三圖，可知濃度2%之TL-229和TL-10696檸檬發酵液係能分別刺激PBMC分泌IL-12，其分泌量為21.08±1.01和20.17±6.11 pg/ mL；1%之PE-10696和NE-229檸檬發酵液係能分別刺激PBMC分泌IL-12，其分泌量為23.80±3.71和64.69±14.81 pg/ mL。
由第六十二圖至第七十三圖之結果顯示，投予本發明所揭方法製得之檸檬發酵產物至一個體，係能夠促進IFN-r、IL-12之分泌，達到減少過敏症狀、調控免疫之功效，其中，又以菌株BCRC 10069、BCRC 10696、PM229作為進行發酵菌元得到之檸檬發酵產物具有較佳之免疫調節之功效。
綜合實例五至實例七之結果可知，本發明所揭方法所製備出檸檬發酵產物於濃度1%~2%時，確實具有良好之抗過敏、免疫調節、抗發炎之功效，並且，又以菌株PM229作為發酵菌元之效果最佳。
實例八：分析檸檬發酵產物之成份
以市售套組分析TL-229檸檬發酵產物之成份，結果如表六至表八所示。
表六：台中萊姆發酵液之酚酸化合物含量
| 種類 | 羥基苯甲酸（mg/ 100g） | 羥基肉桂酸（mg/ 100g） | ||||
| 沒食子酸 | 原兒茶酸 | 香草酸 | 綠原酸 | 對香豆酸 | 阿魏酸 | |
| TL | 0.9383±0.0011 | 0.015±0.0069 | 0.1446±0.0072 | 0.0258±0.0004 | 0.0047±0.0009 | 1.5518±0.0813 |
| TL-229 | 0.94±0.01 | 0.02±0.01 | 0.14±0.01 | 0.03±0.01 | 1.55±0.08 | ND |
表七：中萊姆發酵液之類黃酮含量
| 種類 | Glucosides（mg/ 100g） | Aglycone（mg/ 100g） | ||
| 柚皮甙 | 橙皮苷 | Diosmin | 橙皮素 | |
| TL | 1.4969±0.0001 | 2.1074±0.1067 | 0.0325±0.0419 | 0.3478±0.0411 |
| TL-229 | 1.8969±0.0001 | 1.9074±0.1067 | 0.1325±0.0419 | 0.4378±0.0311 |
表八：台中萊姆發酵液總酚酸、總類黃酮、辛內弗林素和抗氧化力之分析
| 種類 | 總酚 | 總類黃酮 | 辛內弗林素 | DPPH(%) | ABTS |
| TL | 2.68 | 3.98 | 0.193±0.0195 | 14.56±0.77 | 18.92±3.71 |
| TL-229 | 2.68 | 4.37 | 0.0941±0.0172 | 18.95±0.71 | 22.75±0.08 |
無
第一圖係為不同濃度之屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞存活率之影響。 第二圖係為不同濃度之屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞存活率之影響。 第三圖係為不同濃度之台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞存活率之影響。 第四圖係為不同濃度之台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞存活率之影響。 第五圖係為不同濃度之南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞存活率之影響。 第六圖係為不同濃度之南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞存活率之影響。 第七圖係為不同乳酸菌上清液對於THP-1細胞存活率之影響。 第八圖係顯示乳酸菌與2%屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第九圖係顯示乳酸菌與1%屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十圖係顯示乳酸菌與2%屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十一圖係顯示乳酸菌與1%屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十二圖係顯示乳酸菌與2%台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十三圖係顯示乳酸菌與1%台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十四圖係顯示乳酸菌與2%台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十五圖係顯示乳酸菌與1%台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十六圖係顯示乳酸菌與2%南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十七圖係顯示乳酸菌與1%南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十八圖係顯示乳酸菌與2%南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第十九圖係顯示乳酸菌與1%南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IFN-r之影響。 第二十圖係顯示乳酸菌與2%屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十一圖係顯示乳酸菌與1%屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十二圖係顯示乳酸菌與2%屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十三圖係顯示乳酸菌與1%屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十四圖係顯示乳酸菌與2%台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十五圖係顯示乳酸菌與1%台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十六圖係顯示乳酸菌與2%台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十七圖係顯示乳酸菌與1%台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十八圖係顯示乳酸菌與2%南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第二十九圖係顯示乳酸菌與1%南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第三十圖係顯示乳酸菌與2%南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第三十一圖係顯示乳酸菌與1%南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-12之影響。 第三十二圖係顯示乳酸菌與2%屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十三圖係顯示乳酸菌與1%屏東優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十四圖係顯示乳酸菌與2%屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十五圖係顯示乳酸菌與1%屏東無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十六圖係顯示乳酸菌與2%台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十七圖係顯示乳酸菌與1%台中優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十八圖係顯示乳酸菌與2%台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第三十九圖係顯示乳酸菌與1%台中無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第四十圖係顯示乳酸菌與2%南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第四十一圖係顯示乳酸菌與1%南投優利卡檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第四十二圖係顯示乳酸菌與2%南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第四十三圖係顯示乳酸菌與1%南投無籽檸檬發酵產物對於THP-1細胞分泌IL-10之影響。 第四十四圖係顯示乳酸菌與屏東優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌TNF-α之影響。 第四十五圖係顯示乳酸菌與屏東無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌TNF-α之影響。 第四十六圖係顯示乳酸菌與台中優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌TNF-α之影響。 第四十七圖係顯示乳酸菌與台中無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌TNF-α之影響。 第四十八圖係顯示乳酸菌與南投優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌TNF-α之影響。 第四十九圖係顯示乳酸菌與南投無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌TNF-α之影響。 第五十圖係顯示乳酸菌與屏東優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IFN-r之影響。 第五十一圖係顯示乳酸菌與屏東無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IFN-r之影響。 第五十二圖係顯示乳酸菌與台中優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IFN-r之影響。 第五十三圖係顯示乳酸菌與台中無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IFN-r之影響。 第五十四圖係顯示乳酸菌與南投優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IFN-r之影響。 第五十五圖係顯示乳酸菌與南投無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IFN-r之影響。 第五十六圖係顯示乳酸菌與屏東優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IL-6之影響。 第五十七圖係顯示乳酸菌與屏東無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IL-6之影響。 第五十八圖係顯示乳酸菌與台中優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IL-6之影響。 第五十九圖係顯示乳酸菌與台中無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IL-6之影響。 第六十圖係顯示乳酸菌與南投優利卡檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IL-6之影響。 第六十一圖係顯示乳酸菌與南投無籽檸檬發酵產物對於RAW264.7細胞分泌IL-6之影響。 第六十二圖係顯示乳酸菌與屏東優利卡檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IFN-r之影響。 第六十三圖係顯示乳酸菌與屏東無籽檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IFN-r之影響。 第六十四圖係顯示乳酸菌與台中優利卡檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IFN-r之影響。 第六十五圖係顯示乳酸菌與台中無籽檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IFN-r之影響。 第六十六圖係顯示乳酸菌與南投優利卡檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IFN-r之影響。 第六十七圖係顯示乳酸菌與南投無籽檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IFN-r之影響。 第六十八圖係顯示乳酸菌與屏東優利卡檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IL-12之影響。 第六十九圖係顯示乳酸菌與屏東無籽檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IL-12之影響。 第七十圖係顯示乳酸菌與台中優利卡檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IL-12之影響。 第七十一圖係顯示乳酸菌與台中無籽檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IL-12之影響。 第七十二圖係顯示乳酸菌與南投優利卡檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IL-12之影響。 第七十三圖係顯示乳酸菌與南投無籽檸檬發酵產物對於周邊血液單核球細胞分泌IL-12之影響。
Claims (7)
- 一種檸檬發酵產物之製備方法，其包含有下列步驟：步驟A：取一檸檬汁液，酸鹼值係為3~4，糖度為15° Brix；步驟B：調整該檸檬汁液之酸鹼值為3~4；步驟C：添加熊芶居菊苣纖維或葡萄糖，調整該檸檬汁液之糖度至15° Brix；步驟D：加入一乳酸菌於一預定發酵條件下進行發酵，其中：該乳酸菌之菌種係選自由植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)及德氏乳桿菌亞種保加利亞(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)所組成之群；該預定發酵條件係為發酵溫度約30℃、發酵時間約72小時；以及步驟E：獲得一檸檬發酵產物。
- 依據申請專利範圍第1項所述檸檬發酵產物之製備方法，其中，該乳酸菌係由植物乳桿菌，發酵乳桿菌，嗜酸乳桿菌及德氏乳桿菌亞種保加利亞所組成。
- 依據申請專利範圍第1項所述檸檬發酵產物之製備方法，其中，該乳酸菌係為寄存編號為BCRC 10069之菌株或寄存編號為BCRC 10696之菌株。
- 一種將由申請專利範圍第1項至第3項中之任一項所述製備方法製成檸檬發酵產物用於製備抗發炎之醫藥組合物之用途，其中：該檸檬發酵產物之濃度為1wt%~2wt%，並且，能抑制IL-6、TNF-α或/及IFN-r之表現。
- 一種將由申請專利範圍第1項至第3項中之任一項所述製備方法製成檸檬發酵產物用於製備免疫細胞相關激素促進劑之用途，其中： 該檸檬發酵產物之濃度為1wt%~2wt%，並且，能增加至少一細胞激素之表現，而該細胞激素係選自由IFN-r及IL-12所組成之群。
- 一種將由申請專利範圍第1項至第3項中之任一項所述製備方法製成檸檬發酵產物用於製備IL-10抑制劑之用途，其中：該檸檬發酵產物之濃度為1wt%~2wt%。
- 一種將由申請專利範圍第1項至第3項中之任一項所述製備方法製成檸檬發酵產物用於製備免疫調控之醫藥組合物之用途，其中：該檸檬發酵產物之濃度為1wt%~2wt%，並且能抑制IL-10之表現，及促進IFN-r及IL-12之表現。
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