KR20020034261A - 락토바실러스 람노수스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

락토바실러스 람노수스 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종의 공개된 균주와 계통 발생학적으로 구별되고 우수한 원생물(probiotic) 특성을 보이는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)의 신규한 균주에 관한 것이다. 또한, 이러한 세균 균주의 의료적 및 영양학적 용도에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 람노수스 균주 및 이의 용도{LACTOBACILLUS RHAMNOSUS STRAIN AND USES THEREOF}
본 발명은 우수한 원생물(probiotic) 특성을 보이는 신규한 락트산-형성 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식품, 음료, 동물 사료 및/또는 식이성 보충 조성물에서 원생물로서의 및 포유동물 소화관내에서 바람직하지 않은 장 미생물의 집락화를 조절하는 약제로서의 상기 신규한 미생물의 용도에 관한 것이다.
다수의 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus(이하, "L."로 약칭함) rhamnosus), 예컨대 락토바실러스 (카세이 아종) GG(ATCC 53103)를 포유동물에 경구 투여하면 포유동물의 건강 상태를 유지시키거나 심지어는 증진시키는데 도움이 되는 것으로 알려졌다. 락토바실러스 람노수스는 소화되면 장관점막에서 일시적으로 집락을 형성하여 병원성 세균 및 로타바이러스와 같은 바이러스의 성장을 억제하고, 내장 투과성을 안정화시키고, 식품의 과민성 알러지 반응을 억제하는 것으로 생각되었다. 세균은 설사와 같은 위장 질병의 증상을 완화하고, 숙주의 비특이적 체액성 면역 반응을 유도하는데 특히 효과적이다.
1989년에 락토바실러스 카세이로부터 유도된 신규한 종으로 발표된 락토바실러스 람노수스는 락토바실러스 속에 속하는 2개의 다른 종, 즉 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)와 유사한 표현형을 공유한다. 3가지 종은 리보솜 RNA를 암호화하는 유전자 차이에 의해 또한 구별될 수 있다. 이 발견에 기초해 연구가 수행되어 왔다. 예를 들면,로드통 에스.(Rodtong S.) 등은 16S rDNA의 종-특이성을 인식하고, 리보타이핑(ribotyping) 방법을 개발하여 락토바실러스 균주를 차별화하였다(로드통 에스. 및 탄녹 지. 더블유.(Tannock, G. W.)의 문헌[Applied and Environmental Microbiology (1993) 59: 3480-3484]). 다른 한편으로, 와드 등 및 알란더 등은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR; polymerase chain reaction)의 간편함과 효율성의 이점을 취해서, 상이한 세트의 프라이머(primer)를 사용하여 16S rDNA의 서열 다형성(polymorphism)에 근거하여 락토바실러스 람노수스를 확인하였다(와드 엘. 제이. 에이치. 및 팀민스 엠. 제이. 등의 문헌[Letters in Applied Microbiology (1999) 29: 90-92]; 및 알란더 엠. 등의 문헌[Applied and Environmental Microbiology 65: 351-354]).
본 발명에 따르면, 본 발명자는 종의 공개된 균주와 계통 발생학적으로 구별되고 우수한 원생물 특성을 보이는 신규한 균주의 락토바실러스 람노수스(이후로, T세포-1 균주로 지칭한다)를 확인하였다.
본 발명의 제 1 목적은 신규한 락토바실러스 람노수스 균주를 제공하는 것이다. 본 발명에서 수행된 실험에서, 본 발명자는 세균 균주의 계통 발생학적 구별을 특성화하고 그 바람직한 원생물 특성을 입증하였다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 세균 균주 및 음료, 식품, 동물 사료 및 식이성 보충물과 같은 식료물의 제조용으로 적합한 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것 뿐만 아니라, 상기 조성물을 대상물에 투여하여 대상물 내의 위장 질병을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 지원자의 상부 공장(jejunum) 및 직장 조직으로부터 장내 시료를 채취하는 것을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 세균 균주의 발효 프로파일이다.
도 3a는 본 발명에 따른 세균 균주의 염색체 DNA의 제한 지도이고, 도 3b는 프로브로서 이. 콜라이(E. coli; 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 약칭임) MRE600 16S+23S rDNA를 사용하여 도 3a를 써던 분석(Southern analysis)한 결과를 나타낸다.
도 4는 와드(Ward L. J. H.) 및 팀민스(Timmins M. J.)에 의해 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 분석한 결과를 나타내는데, PCR에 적용된 본 발명에 따른 세균 균주로부터 추출된 DNA는 레인 2로 표시되어 있고 음성 대조군인 물은 레인 3으로 표시되어 있다.
도 5는 알란더(Alander M.) 등에 의해 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 분석한 결과를 나타내는데, PCR에 사용된 두 세트의 종-특이적 프라이머인 람(rham)-람2 및 람-카세이(casei)는 각각 레인 2-3 및 레인 4-5로 표시되어 있다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조로 한, 하기 발명의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다.
본 발명에 따라서, 락토바실러스 람노수스 균주는 내국의 지원자에 의해서 기증된 장내 시료로부터 단리되었다. 예비 공정에서는, 시료의 미생물이 일련의 선택 배지에 의해 선별되었는데, 그 중에서 MRS 한천 배지 및 로고사(Rogosa) SL 한천 배지는 락토바실러스가 독점적으로 증식하도록 하였다. 이 방법에 따라 선택된 세균은 락토바실러스 람노수스를 확인하기 위해서 하기 4 단계 선별 방법에 적용하였다:
단계 1: API 50CHL 키트(프랑스 리옹 소재의 바이오엠에리우스(BioM' erieux)제)를 사용한 발효 패턴화;
단계 2: 상기 로드통 등의 문헌에 기술된 방법에 따른 리보타이핑. 여기서, 미생물로부터 추출된 전체 DNA를 제한 효소EcoRI,BclI,BglII 또는HindIII로 처리한 후, 이. 콜라이의 rDNA 프로브를 사용하여 써던 블롯팅으로 검출함으로써, 추측되는 미생물의 제한 단편 지문(fingerprint)을 수득하여 락토바실러스 람노수스 DNA로부터 유도된 것들과 비교할 수 있다;
단계 3: 상기 와드 등의 문헌에 기술된 방법에 따른 PCR 분석. 여기서, 보편적인 프라이머 Y2(5'-CCCAC TGCTG CCTCC CGTAG GAGT-3') 및 종-특이적 프라이머 람(5'-TGCAT CTTGA TTTAA TTTTG-3')을 반응에 사용하여 락토바실러스 람노수스의 염색체 DNA가 반응 혼합물 내에 존재할 때 290bp의 주요 생성물이 생성되도록 한다;
단계 4: 상기 알란더 등의 문헌에 기술된 방법에 따른 PCR 분석. 여기서, 한쌍의 종-특이적 프라이머, 람(단계 3에 지시된 바와 같다) 및 람2(5'-CCGTC AATTC CTTTG AGTTT-3')은 락토바실러스 람노수스 DNA가 존재하는 경우에 863bp의 특정 생성물을 증폭시킨다.
따라서, 본 발명에 따른 세균 균주는 락토바실러스 람노수스 종에 속하는 것으로 확인되었다. 그러나, 단계 4에서 수득된 863bp의 서열분석에 의해, 놀랍게도 본 발명에 따른 세균 균주가 락토바실러스 람노수스 종의 공개된 모든 균주와는 계통 발생학적으로 구별된다는 사실이 밝혀졌다.
이와 같이 확인된 세균 균주는 "락토바실러스 람노수스 T세포-1"로 명명되었고, 대만 신츄 소재의 푸드 인더스트리 리서치 앤드 디벨럽먼트 인스티튜트(FIRDI; Food Industry Research and Development Institute)의 컬쳐 콜렉션 앤드 리서치 센터(CCRC; Culture Collection and Research Center)에 수탁 번호 CCRC 910145 (2000년 4월 14일자)로 기탁되었다. 또한, 상기 세균은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; American Type Culture Center)에 수탁 번호 PTA-2406(2000년 8월 22일자)으로 기탁되었다.
또한, T세포-1 균주의 원생물 특성에 관한 추가적인 연구가 수행되었다. 그 결과, 본 발명에 따른 세균 균주가 극도의 산성 pH 및 높은 수치의 담즙을 포함하여, 섭취된 박테리한천 위장관내에서 당면하는 핍박한 환경에서조차 살아남고 잘 성장할 수 있음이 밝혀졌다. 락토바실러스 람노수스 T세포-1이 특정 항생제에 저항하는 능력은 항생제 흡수가 필요한 대상물에 세균을 투여하는데 명백히 유익하다. 세균 균주의 우수성은 또한 다양한 장내세균의 성장을 억제하는 능력을 강화하는 것이다.
상기 언급된 이점의 관점에서, 본 발명에 따른 세균 균주는 원생물로 작용하는데 적합하다. 본 발명에 따라서, T세포-1 균주는 유체 우유, 발효된 우유, 요거트, 과일 주스 및 스포츠 음료와 같은 음료; 아이스크림, 치즈 및 스낵과 같은 식품; 동물 사료; 식이성 보충물; 및 유아 제제를 포함한, 광범위하게 다양한 식용 물질로 제형화될 수 있다. 명백하게는, 당분야의 숙련가는 본 발명의 세균 균주가 인간 또는 비인간 동물의 식이를 위한 통상적인 방법에 의해서 임의의 적합한 형태로 제형화될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 세균 균주는 다른 원생물 유기체, 예를 들면 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus),락토바실러스 브레비스(L. brevis),락토바실러스 카세이(L. casei),락토바실러스 플란타룸(L. plantarum),락토바실러스 살리바리우스(L.salivarius),락토바실러스 비피더스(L. bifidus),락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus),락토바실러스 카우사시쿠스(L. causasicus),스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis) 및 락토바실러스 람노수스의 기타 균주 또는 이의 조합물과의 조합으로 식용 물질로 제형화된다. 또한, 락토바실러스 람노수스 T세포-1은 바람직하게는 락토수크로스, 키틴, 키토산, 마니톨, 요거트 분말 또는 이의 조합물과 함께 제형화된다.
또한, 락토바실러스 람노수스 T세포-1은 포유동물의 소화관내에서 바람직하지 않은 장내 미생물의 집락화를 조절하는 약제로서 단독으로 또는 다른 활성 성분과 함께 사용되어 상기 집락화에 의해 유발된 증상을 완화시킬 수 있다. 조성물은 용액, 유화액, 분말, 정제, 캡슐 또는 경구 투여를 위해 적당한 다른 형태로 제형화될 수 있다.
하기 실시예는 예시의 목적으로 주어질 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
본 발명의 바람직한 양태
실시예 1: 락토바실러스 람노수스 T세포-1의 단리
24 내지 45세, 알콜 또는 흡연 중독이 없고 약물을 만성적으로 사용하지 않는 6명의 건강한 성인이 본 실험에 자발적으로 참여하였다. 이들 중 채식주의자는 없었으며 비정상적인 식이적 습관을 가지고 있지도 않았다. 자원한 기증자는 장내 시료 채취 전 12시간동안 금식하였다. 각각이 약 2㎟ 크기인 3개의 생체검사 시료를 각각의 기증자의 상부 공장 및 직장의 상이한 부위에서 채취하였다(도 1a 내지도 1c). 이어서, 조직 시료를 생리 식염수(증류수 중 0.9% NaCl)로 세척하고 추가적인 분석을 위해서 빙냉 저장액(0.9% NaCl, 0.1% 펩톤, 0.1% 트윈-80 및 0.02% 시스테인)에 저장하였다. 시료는 초음파욕에서 5분간 처리하고 추가적으로 2분동안 격렬하게 교반하였다. 수득된 현탁액은 희석하지 않거나 또는 5배 또는 10배로 희석하였고, 제제를 나누어 하기 고형 배지에 도포하여 이에 함유된 장내세균의 프로파일을 수득하였다(또한, 요한슨(Johansson) 등의 문헌[Applied and Environmental Microbiology 59(1): 15-20]을 참조할 수 있다).
1. 37℃에서 3일간 장내세균의 전체 개체군을 호기적 또는 혐기적으로 배양하기 위한 강화 배지인 뇌 심장 주입(Brain heart infusion)("BHIA"로 표시) 한천(디프코(Difco)에서 구입);
2. 37℃에서 5일간 락토바실러스를 혐기적으로 배양하기 위한 MRS 한천("MRS"로 표시)(디프코에서 구입);
3. 37℃에서 3일간 그람(+) 세균을 호기적 또는 혐기적으로 배양하기 위한 페놀 에탄올 한천("PEA"로 표시)(디프코에서 구입);
4. 37℃에서 2일간 스트렙토코쿠스를 호기적으로 배양하기 위한 아지드 혈액 한천("ABA"로 표시)(옥소이드(Oxoid)에서 구입);
5. 37℃에서 2일간 엔테로코쿠스를 혐기적으로 배양하기 위한 슬라네쯔-바틀레이(Slanetz-Bartley) 한천("SBA"로 표시)(옥소이드에서 구입);
6. 37℃에서 2일간 엔테로박테리아세아를 배양하기 위한 적자색 담즙 글루코스 한천("VRBGA"로 표시)(옥소이드에서 구입);
7. 37℃에서 5일간 락토바실러스를 혐기적으로 배양하기 위한 로고사 SL 한천("RA"로 표시)(디프코에서 구입);
8. 37℃에서 5일간 락토바실러스 비피더스를 혐기적으로 배양하기 위한 클로스트리디알 보강 한천("RCA"로 표시)(디프코에서 구입).
결과가 하기 표 1에 제시된다:
표 1에 제시된 바대로, 상부 공장 및 직장 시료의 장내세균의 프로파일은 매우 상이하였다.
실시예 2: 락토바실러스의 단리
실시예 1의 MRS 및 로고사 SL 한천 배지로부터, 200개의 집락을 무작위로 채취하여 각각 1% CaCO3를 함유하는 신선한 MRS 한천 배지로 옮겼다. 항온배양 후, 투명대에 의해서 둘러싸인 집락을 채취하고, 이들 각각을 1% 람노스 및 0.05% 클로로페놀 레드가 보충된 기본적인 MRS 한천 배지로 옮겼다. 최종적으로, 락토바실러스에 의해서 구성된 것으로 예상되는 황색의 집락을 채취하고, 또한 신선한 MRS 배지액으로 옮겨 추가적인 분석을 위해서 37℃에서 2일간 혐기적으로 배양하였다.
실시예 3: 락토바실러스 람노수스 T세포-1의 신규한 균주로서의 확인
(a) 발효 패턴
실시예 2에서 제조된 락토바실러스 배지액을 침전시키고, 증류수로 세척하고 소정량의 증류수로 재현탁하였다. 이런 방식으로 수득된 세균현탁액을 제조자에 의해서 제공된 방법에 따른 API 50CHL 키트를 사용하여 관찰하였다. 이 방법에서, 락토바실러스 람노수스 균주는 종에 특이적인 발효 패턴(도 2)에 근거하여 확인되었고, 락토바실러스 람노수스 T세포-1로 명명되었다.
T세포-1 균주의 전체 DNA를 삼브룩 제이.(Sambrook, J.) 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 기술된 통상적인 방법에 따라 중간기(mid-log phase)에서 성장하는 배양물 3㎖로부터 제조하고, 50㎕의 TE 완충용액(1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH 8.0)에 재현탁하였다. 이런 방식으로 수득된 DNA 용액을 T세포-1 균주의 추가적인 관찰을 위해서 하기 분석에서 사용하였다.
(b) 리보타이핑 분석
DNA의 10㎕ 분량을 제한 엔도누클레아제,EcoRI,BclI,BglII 및HindIII 각각으로 3시간동안 잘랐다. 잘려진 생성물을 0.8% 아가로즈 겔의 웰(well)에 놓고, 5V/㎝에서 2시간동안 전기영동하였다. 이어서, 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고, 겔의 이미지를 도 3a에 도시된 바와 같이 수득하였다. 겔상의 DNA를 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 바대로 변성시키고 나일론-기재막(아머샴(Amersham)제인 하이본드(Hybond)-N+)에 이전시켰다. 써던 분석용 프로브를 제조하기 위해서, 1㎕의 이. 콜라이 MRE600 16S+23S rRNA(뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)에서 구입)를 주형으로 사용하였는데, 이는 AMV 역전사효소(베테스다 리서치 라보레토리즈(Bethesda Research Laboratories) 및 무작위 프라이머에 의해서 [α-32P]dCTP가 혼입되면서 증폭되었다. 블롯을 5배 SSC, 1배 덴하르쯔 용액(Denhardt's solution), 1% SDS 및 100㎎/㎖의 하핀 스펌(Harpin sperm) DNA를 함유하는 혼성화(hybridization) 용액 중 68℃에서 16 내지 24시간동안 혼성화하고, 적절하게 세척하여 잡음에 대한 신호(signal-to-noise)의 비율을 높이고, 방사선사진술에 적용시켰다. 도 3b에 제시된 바대로, T세포-1 균주의 리보타입은 상기 로드통 등의 문헌에 기술된 바와 같은 락토바실러스 람노수스의 전형적인 패턴과 완벽하게 일치하였다.
(c) 와드 및 팀민스 프라이머를 사용한 PCR 분석
1㎖ 에펜도르프에 실시예 3(a)에서 수확된 1㎕의 T세포-1 DNA, 1㎕의 프라이머 Y2, 1㎕의 프라이머 람, 0.5㎕의 다이나자임(Dynazyme) II(핀자임스 오와이(Finnzymes Oy)) 및 각각의 dNTP(dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP) 100μM씩을 첨가하였다. 반응 혼합물을 증류수와 함께 최종 부피가 50㎕이 되도록 첨가하고 또한 미네랄 오일로 씌웠다. 반응 혼합물을 진앰프(GeneAmp; 등록상표) PCR 시스템 2400 열순환기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)제) 안에 위치시키고, 하기의 조건하에서 열순환시켰다:
초기 조건: 94℃에서 3분간.
45℃에서 45초간.
72℃에서 1분간.
열순환: 94℃에서 45초간.
45℃에서 45초간.
72℃에서 1분간.
열순환 주기의 수: 30
쇄 연장: 94℃에서 45초간.
45℃에서 45초간.
72℃에서 5분간.
열순환에 이어서, 증폭된 생성물을 0.2% 아가로즈 겔상에서 단리하였다. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고, 290bp의 주요 증폭물을 자외선 광원으로 겔상에서 관찰하였다(도 4).
(d) 알란더의 프라이머를 사용한 PCR 분석
와드 및 팀민스 프라이머를 상기의 알란더 등에 의해 고안된 람 및 람2 프라이머로 치환한 것을 제외하고는, 실시예 3(c)에서의 PCR을 반복하였다. 0.2% 아가로즈 겔상의 전기영동 분석에 의해, 증폭된 생성물이 863bp의 주요 밴드를 함유하는 것으로 밝혀졌고(도 5), 이는 상기한 바와 같이 락토바실러스 람노수스를 확인하기 위한 결정적인 지시자로 보고되어 있다.
실시예 3(a) 내지 (d)에서 수행된 실험은 T세포-1 균주의 생화학적 및 유전적 특징이 락토바실러스 람노수스 종에 속하는 것으로 고려되는 것들과 일치하는 것으로 결론지었다.
(e) T세포-1 균주와 다른 락토바실러스 람노수스 균주와의 차이점
토포(TOPO) TA 클로닝(상표) 키트(인비트로젠(Invitrogen)제)를 사용하여, 실시예 3(d)에서 수득된 863bp 생성물을 제조자에 의해서 제공된 방법에 따라서 pCR-토포(상표) 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 생성된 플라스미드를 전기영동으로 탑 10 원 샷(상표, TOP 10 One Shot) 엘렉트로컴피턴트 세포(인비트로젠제)내로 도입하였다. 선택 배지내에서 형질전환체를 증식시킨 후, 플라스미드를 수확하고, 863bp의 삽입물을 서열분석하였다.
서열은 의문 서열(query sequence)로 사용되었고, 유전자은행(GenBank)의 뉴클레오타이드 서열 자료에 대해 탐색되었다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov: 80/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide 참조). 하기 표 2에 제시된 서열배열은 T세포-1 균주가 유전자은행에서 얻을 수 있는 6개의 락토바실러스 람노수스 균주 모두와 16S rDNA 서열에 근거하여 계통 발생학적으로 구별됨을 제시한다. 표 2에 제시된 776bp 크기인 T세포-1 DNA 서열은 서열 식별 번호 1로 명명되었다.
실시예 4: 락토바실러스 람노수스 T세포-1의 특성화
(a) 산의 내성
MRS 액체 배지를 pH 2, 3, 4, 5 및 6 각각에서 제조하고, 0.3%의 담즙 염으로 보충하였다. 1.5㎖의 각각의 배지에, 106T세포-1 세포를 접종하고 37℃에서 혐기적으로 항온배양하였다. 시료를 접종후 0 및 4시간에서 수집하고, 각각의 배양의 미생물 개체군을 620nm에서의 광학 밀도를 참조로 하여 분석하였다.
결과가 하기 표 3에 제시된다:
표 3에 제시된 바대로, 섭취된 물질이 동물 위에서 당면하는 pH, 즉 3 이하의 pH까지 산성화되는 경우, 락토바실러스 람노수스 T세포-1의 성장 속도가 현저하게 감소였다. 놀랍게도, 상기 산성 환경에 4시간동안 배양된 세포는 pH 6.0인 신선한 MRS 배지로 이전되는 경우에도 이들의 통상적인 성장을 여전히 유지할 수 있었다(자료는 제시되지 않았다). 이것은, 락토바실러스 람노수스 T세포-1이 위산의 공격을 견딜 수 있음을 시사한다.
(b) 담즙 염의 내성
MRS 액체가 담즙 염을 각각 0.1, 0.2, 0.3 및 0.4%의 농도로 함유하면서, 배지의 pH는 일정하게 2.5로 고정된 것을 제외하고는, 실시예 4(b)를 반복하였다. 결과는 하기 표 4에 제시된다:
표 4로부터, 락토바실러스 람노수스 T세포-1의 성장이 높은 수치의 담즙에서도 유지됨이 입증되었다.
(c) 항생제 내성
락토바실러스 람노수스 T세포-1을 밤새 배양한 세균현탁액 2 내지 3㎖의 분량을 10㎍/㎖의 카나마이신, 반코마이신, 클로람페니콜 또는 앰피실린이 첨가된 MRS 한천 배지상에 도포하였다. 항온배양 후, 락토바실러스 람노수스 T세포-1은클로람페니콜 또는 앰피실린을 함유하는 배지에서는 성장이 감소되는 반면, 카나마이신 및 반코마이신에는 내성을 갖는 것이 발견되었다.
(d) 다른 세균의 집락화의 억제
락토바실러스 람노수스 T세포-1을 밤새 배양한 세균현탁액 2 내지 3㎖의 앨리쿼트를 MRS 한천 배지상에 도포하였다. 하기 표 5에 나열된 9종의 장내세균 균주 중 하나의 100㎕의 현탁액과 혼합한 7㎖의 연질 한천을 부은 각각의 플레이트를 30℃에서 22시간동안 항온배양하였다:
세균 배지
엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes) 디프코 0001
클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens) 뇌 심장 주입(혐기적으로 배양)
크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) 디프코 0001
에르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolotica) 뇌 심장 주입
리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes) 뇌 심장 주입
스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans) 뇌 심장 주입
시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) 디프코 0001
쉬겔라 디스엔테리에 (Shigella dysenteriae) 디프코 0001
에르시니아 루케리 (Yersinia ruckeri) 디프코 0001
수득된 배양물을 37℃에서 추가적으로 48시간동안 항온배양하고, 육안으로 관찰하였다. 락토바실러스 람노수스 T세포-1의 집락 주위에 억제환이 존재하는데 근거하여, 본 발명자는 T세포-1이 엔테로박터 에어로게네스, 클로스트리듐 퍼프린겐스, 리스테리아 모노사이토게네스, 스트렙토코쿠스 무탄스 및 시트로박터 프레운디의 의 성장을 상당히 억제할 수 있음을 발견하였다. 결과는 락토바실러스 람노수스 T세포-1이 장내에서 바람직하지 않은 세균의 집락화를 조절하거나 또는 억제하기 위한 향상된 원생물 특성을 보임을 강력하게 제시한다.
실시예 5: L. 람노수스 T세포-1을 함유하는 원생물 제제
L. 람노수스T세포-1은 식료품의 다양한 형태로 사용될 수 있는데, 이들 중 두가지 예를 하기에 기술한다:
제제 1:
10종의 락트산 형성 세균 균주: 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 비피더스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카오사시쿠스, 스트렙토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 람노수스 T세포-1;
부형제: 락토수크로스 올리고, 마니톨, 키틴 및 키토산, 요거트 분말;
천연 농축물: 알팔파, 보리 및 밀 초목즙 분말, 순수한 대두 레시틴, 당근즙 분말, 포스파티딜 콜린, 하와이안 스피루리나 파시피카(Spirulina pacifica), 사과 펙틴 분말, 포스파티딜 이노시톨 CGF 콜레라, 비-우유 원생물 배양물: 람노수스, FOS의 염기 중의 아시도필러스, 피스 리버 비 폴렌(peace river bee pollen) 분말, 스테비아, 냉동건조된 망고, 까막까지밥나무, 민들레 뿌리 추출액 4:1, 비트 뿌리 추출액, 시베리안 인삼 추출액 0.4%, 퍼시픽 켈프 4:1 추출액, 양엉겅퀴 4:1 추출액 2%, 대두 추출액, 월귤나무 추출액 5:1, 파인애플 추출액, 크랜베리즙 추출액18:1, 로즈힙 추출액 4:1, 라코펜, 밀크 티슬 피토솜(상표, Milk Thistle Phytosome), 징코 빌로바 피토솜(상표, Ginkgo Biloba Phytosome) 및 그레이프 시드 피토솜(상표, Grape Seed Phytosome);
기타 성분들: 비타민 C, 칼슘, 마그네슘, 아연.
제제 2:
9종의 락트산 형성 세균: 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 비피더스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카오사시쿠스, 및 락토바실러스 람노수스 T세포-1;
칼슘 락테이트, 락토수크로스 올리고, 락토스, 덱스트로즈, 분말 우유, 식물성 오일 및 소량의 유화제 및 천연 조미료를 땅콩 및 건포도 입자상에 피복하여 원생물적인 건강 디저트를 제조한다.
지금까지 설명된 본 발명에 의해, 본 발명의 범위 및 범주에서 벗어나지 않는 한 다수의 변형 및 개질을 할 수 있음이 명백하다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서 지시된 바대로만 제한된다.
본 발명에 따라서, 신규하며 원생물 특성이 우수한 락토바실러스 람노수스 균주가 제공된다.

Claims (8)

  1. 푸드 인더스트리 리서치 앤드 디벨럽먼트 인스티튜트(FIRDI; Food Industry Research and Development Institute)에 수탁 번호 CCRC 910145 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; American Type Culture Center)에 수탁 번호 PTA-2406으로 기탁된 락토바실러스 람노수스의 세균 단리물.
  2. 제 1 항의 세균 단리물 및 허용가능한 부형제를 함유하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    음료, 식품, 동물 사료 및 식이성 보충물로 구성된 군에서 선택된 형태인 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    부형제가 락토수크로스, 키틴, 키토산, 마니톨, 요거트 분말 또는 이의 조합물인 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    세균 단리물이 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus),락토바실러스 브레비스(L. brevis),락토바실러스 카세이(L. casei),락토바실러스 플란타룸(L. plantarum),락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius),락토바실러스비피더스(L. bifidus),락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus),락토바실러스 카우사시쿠스(L. causasicus),스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis) 및 락토바실러스 람노수스의 기타 균주 또는 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 원생물(probiotic) 유기체와 함께 부형제로 제형화된 조성물.
  6. 제 1 항의 세균 단리물의 원생물 양을 포함하는 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    위장 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
  8. 제 1 항의 세균 단리물을 원생물 양으로 함유하는 조성물을 위장 질병의 치료 또는 예방이 필요한 대상물에 투여함을 포함하는, 이러한 대상물의 위장 질병의 치료 또는 예방을 위한 방법.
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