KR101409763B1 - 락토바실러스 헬베티쿠스 ｈｙ７８０１로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents

락토바실러스 헬베티쿠스 ｈｙ７８０１로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 기능성 칡즙 발효물은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801에 의해 발효되어 마우스의 대식세포에서 면역지표인 TNF-α의 생산을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지고, NO(Nitric oxide) 생성을 억제하는 면역조절 활성을 가지며, 항산화 활성 및 동맥경화 활성을 가져 이를 유효성분으로 함유하는 약학조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품, 발효제품 등 다양하게 이용될 수 있다.

Description

락토바실러스 헬베티쿠스 ＨＹ７８０１로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품{Functional fermented Pueraria Radix juice using the Lactobacillus helveticus HY7801 and products containing thereof as effective factor}
본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마우스의 대식세포에서 면역지표인 TNF-α의 생성을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지며, 산화질소 생성을 억제하는 면역조절 활성을 가지고, 항산화 활성 및 동맥경화예방 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품에 관한 것이다.
칡은 혈액순환에 도움을 주어 고혈압, 동맥경화, 고지혈증 등에 좋으며, 칡 중 식물성 여성호르몬(이소플라본)은 주로 가수분해 되어 비배당체 형태로 흡수되어 호르몬 의존성 질환인 유방암, 난소암 및 골다공증의 예방 및 치료에 도움이 된다. 이는 구조가 β-에스트라디올과 유사하여 에스트로겐 수용체에 작용하는 식물성 에스트로겐으로 위와 같은 질병의 예방에 유용한 물질로 알려져 있다(Robbert P et al., Roles of vitamin D, n-3 polyunsaturated fatty acid, and soy ifoflavones in bone health. J American Dietetic Association 105(11): 1700-1702 (2005)).
칡의 약리작용을 나타내는 주된 성분인 이소플라본은 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin) 및 푸에라린(puerarin) 등이 있다(Jason Liggins et al., Daidzein and genistein content of fruits and nuts, J. Nutr. Biochem., 11(6):326-331, 2000). 칡 발효 시 대부분의 배당체가 가수분해 되어 비배당체(aglycone) 형태로 변환되게 된다. 칡의 이소플라본 배당체는 당과 결합한 상태로 존재하다가 장내 미생물에 의해 당이 떨어져 나간 뒤 장내로 흡수되게 되는데, 칡 발효 시 이소플라본 배당체는 다이드제인(daidzein), 제니스테인(Genistein) 등의 비배당체로 변환된다. 장내 미생물에 의해 전환된 비배당체는 식물성 여성호르몬(Phytoestrogen)으로 여성호르몬인 에스트로겐(estrogen)과 비슷한 구조로 대체요법으로 많이 활용된다.
이소플라본 배당체를 비배당체로 전환시키는 방법은 유산균 발효 시 유산균의 β-글루코시다제에 의해 활성형인 비배당체로 전환시킬 수 있다. 락토바실러스 헬베티쿠스는 β-글루코시다제를 생산하는 균으로, 이소플라본을 락토바실러스 헬베티쿠스로 발효 시, 배당체인 제니스틴과 다이드진은 β-글루코시다제에 의해 가수분해 되어 비배당체 형태인 제니스테인과 다이드제인으로 존재한다.
유산균은 장내에 서식하는 균으로 내산성과 내담즙성이 강하며, 병원성 균에 대한 항균활성을 가지고 있어 장내에서 유해 세균을 억제시키고, 살균능력을 강화시키는 효과가 있다. 유산균은 대식세포의 증식을 촉진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gabriela peridgon et al. J of food Protection 53: 404-411, 1990: Katsumasa sato et al., Microbiol Immunol., 32(7): 689-698, 1998).
또한, 유산균은 아토피 및 알러지 관련 질환에 관여하는 면역 반응을 조절하는 효과가 있어, 유아에게 유산균 투여 시 아토피 발생 및 습진 부위를 감소시키는 효과를 보이고 있다(Kalliomki et al., Lancet 357:1076-1079, 2001), (Rsenfeldt et al., Dermatologic and ocular diseases 111: 389-395, 2003).
한편, 대한민국 특허공개 제2004-0085807호(발명의 명칭: 식물성 여성 호르몬 물질인 이소플라본을 강화한 칡유산균 발효물 및 그의 제조 방법)에서는 유산균 발효로 이소플라본을 강화한 발효물이 공개되어 있으나, 이는 유방암 억제 및 간독성에 관한 활성으로 본 발명과 같은 유산균을 이용하는 것과는 균주의 차이가 있으며, 이들의 발명은 생리활성적인 측면에서 본 발명의 면역증강, 면역조절, 항산화 활성 및 동맥경화예방 활성과는 다르다.
또한, 대한민국 특허등록 제891165호(발명의 명칭: 이소플라본 강화 칡청국장 및 이를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방용 건강보조식품 조성물)에서는 대두 및 칡을 바실러스(Bacillus)를 이용하여 골다공증 예방, 골밀도 및 골함량 증가에 관한 발명으로 본 발명과 같은 유산균을 이용하는 것과는 균주의 차이가 있으며, 이들의 발명은 칡청국장을 활용한 생리활성을 본 것으로 본 발명의 칡 발효물의 생리활성과는 다르다.
이에 본 발명자들은 높은 역가로 β-글루코시다제를 생성하는 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 칡즙을 발효하여 칡의 배당체 형태로 존재하는 이소플라본을 비배당체 형태로 변환시킨 칡즙 발효물이 마우스의 대식세포에서 면역증강 및 면역조절 활성을 가질 뿐만 아니라 항산화 활성과 동맥경화예방 활성을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 특허공개 제2004-0085807호(발명의 명칭: 식물성 여성 호르몬 물질인 이소플라본을 강화한 칡유산균 발효물 및 그의 제조방법, 2004.10.08.공개) 대한민국 특허등록 제891165호(발명의 명칭: 이소플라본 강화 칡청국장 및 이를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방용 건강보조식품 조성물, 2009.03.24. 공고)
본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 면역증강, 면역조절, 항산화 및 동맥경화예방 활성을 가지는 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마우스의 대식세포에서 면역지표인 TNF(Tumor necrosis factor)-α의 생성을 유도함으로써 면역증강 활성을 가짐은 물론 산화질소(Nitrix oxide) 생성을 억제함으로써 면역조절 활성을 가지며, 항산화 활성 및 동맥경화예방 활성을 가지는 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 기능성 칡즙 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 건강한 성인 분변을 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양한 후, 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천평판배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 형성된 단일 콜로니를 각각 분리하여 사용하였다. 이렇게 분리한 균주의 관찰은 MRS 한천평판배지에서 37℃로 48시간 배양한 후, 그람염색(Cowan, 1974)을 통하여 분리 균주의 크기와 형태를 광학현미경으로 관찰하였으며, 분리한 균주의 생화학적 특성은 Cowan과 Steel(1984) 그리고 Macfaddin(1984)의 방법에 따라 균주의 특성을 조사한 후 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology와 Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology 및 16S rDNA 유전자 분석을 통하여 분류 및 동정하였다.
이와 같은 방법으로 분리된 본 발명에 따른 유산균의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
① 세포의 형태: 간균
② 운동성: 없음
③ 포자형성능: 없음
④ 그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
① 형상: 원형
② 융기: 볼록
③ 표면: 매끄러움(Smooth)
3)생리적 성질
① 최적 생육온도: 36~38℃
② 최적 생육 pH: 6.0~6.5
③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10) 16S rDNA 분석
16S rDNA 분석을 통한 분자유전학적인 방법을 실시하여 본 발명의 균주를 동정하였다. 즉, MRS 배지에 배양된 본 발명의 균주로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3') 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 반응[(95℃, 3분), 30cycles(95℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 90초), 72℃, 10분]을 수행하여 1.45kbp의 증폭산물을 얻은 후 정제하여 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 염기서열을 분석한 결과를 토대로 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), 하기 표 1에서와 같이 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주임을 동정할 수 있었다.
Figure 112012065609621-pat00001
위와 같은 유산균의 유전적, 형태학적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 유산균을 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 명명하고, 생명공학연구원 유전자은행에 2011년 7월 4일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11959BP).
한편, TNF(Tumor necrosis factor)-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 담당하는 사이토카인(cytokine)으로서 세균의 세포막에 있는 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 림프구에 의해 만들어지는데, 많은 종류의 사이토카인 분비를 조절하는 면역반응에 있어서 가장 초기에 일차적인 매개체로 작용한다. 또한 T 세포와 B 세포의 활성화에 공동자극제(co-stimulator)로 작용하기도 한다. 따라서 TNF-α는 염증반응에서 백혈구들이 혈관 내피세포에 부착하는 것을 촉진하며 염증세포들의 미생물 살해능력을 증가시키며, 단핵 식균세포(mononuclear phagocytes)에 작용하여 여러 가지 염증반응에 관여하는 사이토카인을 생산하게 만들어 염증반응을 촉진한다. TNF-α는 또한 종양세포에 작용하여 세포자연사를 유도하기도 한다.
대식세포는 면역반응에 관계하는 주 세포로서 면역세포의 작용을 조절하는 사이토카인을 분비하여 면역반응 조절, 자연면역에서 미생물, 항원, 죽은 조직 등을 식균 작용으로 파괴, 체액성 면역 반응에서 작용세포(effector cell)로서의 활동, 지연성 과민 반응(delayed type hypersensivity)에서 항원 제거, TNF-α 분비를 통한 종양세포의 파괴, 획득면역반응에서 항원의 조작과 제시(antigen processing and presentation), 염증반응에 관여하는 물질이나 사이토카인을 분비하여 염증반응을 조절, 섬유아세포와 혈관내피세포의 성장인자를 생산하여 손상된 조직의 치유 등 다양한 기능을 한다.
한편, LPS에 의한 염증반응이 유발될 때, iNOS(Nitric oxide synthases)에 의해 염증반응에 동반하는 산화질소(NO)를 생성하게 된다. 즉, iNOS가 발현되어 NO을 생성하게 되며, 생성된 NO는 염증반응에 의해 생산되는 물질로서 대식세포에서 병원체(pathogens)에 의한 염증반응의 중요한 과정이다. NO 생성에 중요한 역할을 하는 iNOS는 IRF-1(Interferon regulatory factor 1)에 의해서 조절된다. LPS에 의해서 면역반응이 유도되는 과정에서 유전자 전사에 의하여 iNOS를 만들어 내기 위해서는 반드시 IRF-1의 발현이 필요하다. 이를 위한 발현 조절영역에는 NF-κB의 발현이 중요한 역할을 한다. LPS에 의한 TLR(Toll-like receptor) 신호전달에 의하여 NF-κB의 활성화에 따라 iNOS의 발현이 유도된다. 즉, 면역반응에서 NO 생성은 LPS에 의하여 유도되어 NF-κB 활성화와 IRF-1 발현에 의해 iNOS발현으로 조절되게 된다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 발효시킨 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 면역조절용 약학적 조성물은 약제학적으로 통상적으로 이용되는 것으로 부형제들과 함께 이용될 수 있으며, 감미제, 향미제, 보존제 등을 활용하여 사용될 수 있다. 또한, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 단일 또는 다른 미생물과 복합으로 혼합하여 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 발효시킨 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 발효유는 유산균 배양액, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 발효시킨 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조한다. 특히, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 칡즙을 발효시켜 풍미와 영양성분이 증진됨은 물론, 항산화 효과와 면역증강 및 면역조절 효과를 가지는 칡즙 음료를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 발효시킨 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 상기 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 기능성 칡즙 발효물은 마우스의 대식세포에서 면역지표인 TNF(Tumor necrosis factor)-α의 생성을 유도함으로써 면역증강 활성을 가짐은 물론 산화질소(Nitrix oxide) 생성을 억제함으로써 면역조절 활성을 가지며, 항산화 활성 및 동맥경화예방 활성을 가지므로 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 건강기능식품, 기능성음료, 발효제품 등으로 이용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 칡즙 발효 시 마우스의 대식세포에서 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 칡즙 발효 시 마우스의 대식세포에서 면역지표인 TNF-α의 생산유도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 칡즙 발효 시 마우스의 대식세포에서 LPS로 면역반응 유도 후 면역지표인 NO생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 칡즙 발효 시 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 칡즙 발효 시 활성산소 흡수력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 칡즙 발효 시 사람의 거품세포에서 지질축적을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물 제조
칡 줄기와 뿌리 등 전체를 이용하여 잘게 썰은 후 압력을 가해 즙을 뽑아 칡즙을 제조하였다. 상기 칡즙에 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 1.0 × 106 cfu/㎖로 접종하고 30℃ 배양기에서 36시간 동안 정치배양하여 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물을 제조하였다.
상기의 칡즙 발효물을 동결건조하여 분말로 제조하였다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙은 상기와 같이 동결건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.
<실시예 2>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
액제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 동결건조분말 100㎎, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 동결건조분말 100㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효시킨 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5%정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 × 109 cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효시킨 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 β-글루코시다제(β-glucosidase) 활성 조사
칡즙을 유산균으로 발효 시 칡즙의 이소플라본 배당체는 유산균의 β-글루코시다제에 의해 활성형인 비배당체로 전환된다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 β-글루코시다제 활성을 조사하였다.
β-글루코시다제 활성은 p-Nitrophenyl β-D-glucoside와 효소를 반응시킨 후 유리되는 p-nitrophenol을 400nm에서 흡광도를 결정하는 방법을 사용하였다.
먼저, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 14,000rpm에서 5분간 원심분리하여 PBS로 3회 세척하였다. 균체액 20㎕를 각 well에 분주하고 40㎕의 0.2M Mailvane buffer(0.1M citric acid, 0.2M K2HPO4, pH5.0)를 첨가하였다. 최종 농도가 10mM이 되도록 p-Nitrophenyl β-D-glucoside 용액 20㎕를 첨가하였다. 96well mixer를 10초간 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 각각의 well에 160㎕의 0.5M Na2CO3를 첨가하여 반응을 종료하고 96well을 원심분리 하였다. 상등액 200㎕를 새로운 well에 옮기고 400nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 류코노스톡 락티스 KY16-1 및 락토바실러스 파라카제이 KM2-5에 대하여도 상기 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801에 대한 측정방법과 동일하게 하였다.
Blank는 균체가 없는 반응액을 사용한 것을 제외하고 상기 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801에 대한 측정방법과 동일하게 하였다. 모든 반응은 세 번 반복으로 실시하였다.
그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
균주 β-glucosidase 활성
Blank 0
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801 +++
류코노스톡 락티스 KY16-1 +
락토바실러스 파라카제이 KM2-5 +
상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 β-글루코시다제 활성이 다른 균주에 비하여 우수한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 칡즙 발효 시 칡즙의 이소플라본 비배당체 생성은 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 우수한 β-글루코시다제에 의한 것임을 알 수 있었다.
<시험예 2>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 칡즙 발효 및 비배당체 측정
2-1. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 pH 및 균수 측정
칡즙 원액 10㎖에 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 1% 접종하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하여 발효시킨 후, 발효한 칡즙의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 균수와 pH를 측정하였다. pH는 상기 발효한 칡즙에 대하여 pH meter를 이용하여 측정 하였으며, 균수는 상기 발효한 칡즙 1㎖를 채취한 후 십진희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하여 콜로니 수를 측정하였다.
그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
구 분 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801
pH 4.70
균수 5 X 108 CFU/㎖
상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 pH는 4.70을 나타내었고, 이때의 콜로니 수는 5 X 108 CFU/㎖로 측정되었다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801은 칡즙에서 잘 자라는 것을 알 수 있었다.
2-2. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 비배당체 측정
칡즙 원액에 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 1% 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양시켜 발효시킨 후, 이소플라본을 추출하기 위하여 칡즙을 동결건조 하였다. 상기 칡즙 동결건조분말 0.5g을 25mL의 메탄올(methanol)에 녹여서 1시간 동안 배양한 후, 이 혼합액을 Whatman no. 1 filter paper로 거른 후, HPLC 분석을 하였다. 컬럼(Column)은 C18(250 X 4.6mm, 5㎛)을 이용하였고, 40℃로 히팅(heating)하였으며, 1.0㎖/min flow rate로 흘려주었고, 사용되는 용매 A (solvent A)는 Water:MeOH:Acetic acid 비율을 88:10:2로, 용매 B(solvent B)는 MeOH:Acetic acid 비율을 98:2로 하여 분석을 시작하고 A:B의 비율을 0분에서 90:10, 21분에서 60:40, 32분에서 60:40, 35분에서 40:60, 36분에서 90:10, 50분에서 90:10으로 변화도를 주어 260nm의 흡광도에서 비배당체를 분석하였다.
그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
Daidzein Genistein
Normal 41.72㎛ 0.92㎛
24H incubation 64.92㎛ 2.82㎛
상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효 시키지 않은 칡즙 원액의 다이드제인(daidzein) 함량은 41.72㎛, 제니스테인(Genistein)함량은 0.92㎛이였으나, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효 시 다이드제인 함량은 64.92㎛로, 제니스테인 함량은 2.82㎛로 증가하였다. 이러한 사실로부터 칡즙 이소플라본 비배당체가 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801의 발효에 의해 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 3>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 TNF-α생산에 대한 영향 조사
TNF-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 담당하는 사이토카인이므로 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 발효물이 TNF-α의 생산에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.
3-1. 대식세포의 배양
본 시험에 사용된 동물 세포주로는 마우스 유래 대식세포(macrophage) 세포주인 Raw264.7 세포주를 한국세포주은행(cellbank.snu.ac.kr)에서 분양받아 사용하였다. 일반적인 세포의 유지를 위해서 DMEM 배지(Gibco#11995)와 10%의 FBS(Gibco#16000)가 함유된 배지에서 세포를 배양하였으며, 1:4의 비율로 주 1회 계대 배양을 수행하였다.
3-2. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 시료의 제조
칡즙 원액에 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 1% 접종하여 37℃에서 24 시간동안 배양하여 발효시킨 후, 0.2㎛ 쉬린지 필터(syringe filter)로 필터레이션(filtration)하여, 100℃에서 15분간 중탕으로 끓임으로서 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 사멸시킨 후 실험에 이용하였다.
3-3. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙에 의한 Raw264.7 세포에서의 TNF-α 발현량 측정
세포독성 확인
Raw264.7 세포를 1:4의 비율로 96 well plate에 계대배양 한 후 48시간 동안 배양하였다. 각 well당 50㎕, 5㎕, 0.5㎕의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙을 처리한 후 18시간 동안 추가 배양하였다. 각 well에서 MTT formazan(sigma#M2203)을 PBS에 녹여서 20㎕를 넣고, 37℃, CO2 incubator에서 4시간 반응시켰다. 각 well에서 media를 제거하고, DMSO 200㎕를 넣고 반응시켜 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3반복을 수행하여 각 시료 당 평균과 표준 편차를 계산하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 50㎕, 5㎕, 0.5㎕ 칡즙 발효물은 Raw264.7 세포에서 세포독성이 없음을 확인 할 수 있었다.
TNF-α 발현량 측정
Raw264.7 세포를 1:4의 비율로 96 well plate에 계대배양 한 후 48시간 동안 배양한 후, Con군(무처리군)은 세포에 아무 처리도 하지 않은 상태에서의 TNF-α의 양을 측정하였고, LPS 처리군은 세포에 LPS를 1㎍/mL 농도로 처리한 상태에서의 TNF-α의 양을 측정하였고, LPS+Normal 처리군은 세포에 LPS를 1㎍/mL 농도로 처리한 상태에서 발효하지 않은 칡즙 5㎕을 24시간 동안 처리하여 TNF-α의 양을 측정하였고, LPS+7801 처리군은 세포에 LPS를 1㎍/mL 농도로 처리한 상태에서 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 5㎕를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양한 후 TNF-α의 양을 측정하였다. 각 well에서 조심스럽게 배지를 수거 후 원심분리하여 상등액을 취하고 TNF-α ELISA kit(BD#550610)을 사용하여 배지에 존재하는 TNF-α의 양을 정량하였다.
간단하게 실험방법을 기술하면, ELISA plate의 각 well 당 50㎕의 ELISA diluent를 첨가하여 코팅(coating)된 항체(antibody)를 활성화 시킨 후, 여기에 샘플 또는 standard 100㎕를 첨가하고 플레이트(plate)를 sealing한 후 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 300㎕의 Wash buffer로 5회 세척 후, anti-TNF-α 항체 희석액을 100㎕ 첨가 한 후 플레이트를 sealing한 후 1시간 동안 반응시켰다. 300㎕의 Wash buffer로 7회 세척 후, TMB 발색 시약을 100㎕ 첨가하여 상온에서 30분간 발색 반응을 유도한 후 50㎕의 Stop solution을 첨가하고 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
모든 실험은 3반복을 수행하여 각 시료 당 평균과 표준 편차를 계산하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙(LPS+7801 처리군)은 TNF-α의 발현 유도를 LPS 처리군과 유사하게 일으키며, 발효하지 않은 칡즙(LPS+Normal 처리군)보다 TNF-α의 발현 유도가 증가하여 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙에서 높은 수준으로 TNF-α를 유도하여 Raw264.7 세포에서 면역반응을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
<시험예 4>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801 로 발효한 칡즙에 의한 Raw264 .7 세포에서의 산화질소( NO ) 생성량 측정
위의 방법과 마찬가지로 Raw264.7 세포에 LPS로 24시간 동안 면역반응을 유도한 후, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 처리하여 산화질소(NO) 생성량을 비교하였다.
Con군(무처리군)은 세포에 아무 처리도 하지 않은 상태에서의 산화질소의 양을 측정하였고, LPS 처리군은 세포에 LPS를 1㎍/mL 농도로 처리한 상태에서의 산화질소의 양을 측정하였고, LPS+Normal 처리군은 세포에 LPS를 1㎍/mL 농도로 처리한 상태에서 발효하지 않은 칡즙 5㎕을 24시간 동안 처리하여 산화질소의 양을 측정하였고, LPS+7801 처리군은 세포에 LPS를 1㎍/mL 농도로 처리한 상태에서 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 5㎕을 24시간 동안 처리하여 산화질소의 양을 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙(LPS+7801 처리군)은 LPS로 면역반응을 유도하였을 때 산화질소의 생성을 줄어들게 하였는데, LPS 처리군과 비교하여 산화질소 생성량이 50% 넘게 감소하였으며, 발효하지 않은 칡즙(LPS+Normal 처리군)보다 산화질소 생성량이 감소하였다. 이러한 사실로부터 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙은 Raw264.7 세포에서 면역반응 유도 시 면역반응 조절 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<시험예 5>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙에 의한 항산화 활성에 대한 조사
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙이 다른 활성을 갖는지 알아보기 위하여 항산화 활성을 조사하였다.
5-1. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 DPPH 라디칼 소거활성 측정
칡즙 원액에 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 1% 접종하여 37℃에서 24 시간동안 배양하여 발효시킨 후, 0.2㎛ 쉬린지 필터(syringe filter)로 필터레이션(filtration)하여, 100℃에서 15분간 중탕으로 끓임으로서 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 사멸시킨 후 실험에 이용하였다.
DPPH 라디칼 소거능(%)은 Lin과 Chang의 방법(Lin M-Y와 Chang F-J. 2000. Antioxidative Effect of Intestinal Bacteria Bifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Dig. Dis. Sci. 45:1617-1622)을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
상기 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 800㎕과 DPPH 용액(0.2mM) 1㎖을 혼합하여 30분간 반응시킨 다음 5,000rpm에서 원심분리한 후 상등액의 흡광도를 517nm에서 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능(%)은 아래와 같은 식으로 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거능(%) = 100 X (1-발효 칡즙의 흡광도/blank의 흡광도)
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 가로축에는 trolox 양성대조군과 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙으로 표시하였다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 DPPH 라디칼 소거능이 양성대조군과 비교하여 약 60% 이상으로서 항산화 활성이 높음을 알 수 있었다.
5-2. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 활성산소흡수력(ORAC) 측정
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 활성산소흡수력을 Huang 등[Huang D, Ou B, Hampsch-Woodill M, Flanagan J, 그리고 Prior R. 2002. High-throughput Assay of Oxygen Radical Absorbance Capacity(ORAC) Using a Multichannel Liquid Handling System Coupled with a Microplate Fluorescence Reader in 96-Well Format. J. Agric. Food Chem. 50:4437-4444]이 제시한 ORAC assay법에 따라 다음과 같이 측정하였다.
칡즙 원액에 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 1% 접종하여 37℃에서 24 시간동안 배양하여 발효시킨 후, 0.2㎛ 쉬린지 필터(syringe filter)로 필터레이션(filtration)하여, 100℃에서 15분간 중탕으로 끓임으로서 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801을 사멸시킨 후 실험에 이용하였다. 상기 발효한 칡즙을 ORAC 분석에 사용하였다. Fluorescein stock solution은 Sodium fluorescein을 4μM의 농도로 assay buffer에 녹여 차광한 후 5℃에 보관하였다.
양성대조군으로는 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 6.25, 12.5, 25, 50, 100μM의 농도로 assay buffer에 녹여 준비하였다. 96 well, black-sided, special optics clear bottom plate의 맨 가장자리 well에 물을 300㎕씩 채워 온도 변화에 의한 실험적 오차를 줄였다. Plate의 안쪽 well에 fluorescein stock solution을 phosphate buffer로 100배 희석하여 150㎕씩 넣은 후, 시험군, 양성대조군 및 blank(phosphate buffer)를 25㎕씩 넣었다. plate를 Synergy HT Multi-Detection Microplate reader로 37℃에서 30분간 평형에 도달하게 하였다. AAPH{2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride solution}을 153mM의 농도로 assay buffer에 녹여, well당 25㎕씩 넣고, 60분간 31회 형광을 측정하였다(Excitation: 485nm, Emission: 528 nm, sensitivity: 60).
실험 결과를 KC4TM data reduction software를 이용하여, 다음과 같은 수식에 의해 Kinetic curve의 AUC(Area Under the Curve)를 구하고 양성대조군의 AUC와 비교하여 TE(Trolox equivalents)를 산출하였다[Saide JA와 Gilliland SE. 2005. Antioxidative activity of lactobacilli measured by oxygen radical absorbance capacity. J. Dairy Sci. 88(4):1352-1357].
AUC는 아래와 같이 계산하였다.
AUC = 0.5+(R2/R1)+(R3/R1)+(R4/R1)+……+ 0.5(Rn/R1)
R1은 반응 초기의 형광 측정값이고, Rn은 맨 마지막 형광 측정값이다.
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 활성산소흡수력(ORAC)은 아래와 같이 TE(Trolox equivalents)로 나타내었다.
Trolox eq =
Figure 112012065609621-pat00002

그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 가로축에는 발효하지 않은 칡즙인 normal군과 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙으로 표시하였다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 활성산소흡수력(ORAC)은 발효하지 않은 칡즙과 비교하여 높게 나타나 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 항산화 활성이 높음을 알 수 있었다.
<시험예 6>
락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙의 동맥경화 예방 효과
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙이 다른 활성을 갖는지 알아보기 위하여 동맥경화 예방 효과를 조사하였다.
6-1. 대식세포의 배양
본 시험에 사용된 동물 세포주로는 인간유래 단핵백혈구(monocyte) 세포주인 THP-1 세포주를 한국세포주은행(cellbank.snu.ac.kr)에서 분양받아 사용하였다. 일반적인 세포의 유지를 위해서 85% RPMI 1640 배지(Gibco#22400)와 15%의 FBS(Gibco#16000)가 함유된 배지에서 세포를 배양하였으며, 1:4의 비율로 주 1회 계대 배양을 수행하였다.
6-2. 대식세포의 분화
THP-1 세포를 1×106 cells/well로 6 well plate에 계대배양 후 100ng/㎖ phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA, sigma#p1585)로 72시간 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다.
6-3. 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 처리에 의한 THP-1 세포에서의 지질축적량 측정
배양한 세포에 1% oxidized LDL cholesterol(oxLDL)을 24시간 동안 처리하여 세포가 oxLDL을 흡수하도록 하였다. 그 후, Con군(무처리군)은 세포에 아무 처리도 하지 않은 상태에서 24시간 동안 배양하였고, Normal 처리군은 발효하지 않은 칡즙 5㎕을 24시간 동안 처리하였고, 7801 처리군은 각 well당 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙 5㎕을 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다.
각 well에서 조심스럽게 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 후, 3.8% 1㎖ formaldehyde로 1시간 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포에 PBS-T에 녹인 oil-red O staining solution(sigma#O0625) 1㎖로 1시간 동안 염색시켰다. 염색약을 제거하고 PBS로 3회 세척한 후, 현미경으로 염색된 세포를 관찰하고, 1㎖ isopropyl alcohol을 30분간 처리하였다. 탈색된 isopropyl alcohol을 모아서 594nm에서에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙은 지질축적이 아무것도 처리하지 않은 대조군(무처리군) 보다 감소하였고, 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효시키지 않은 칡즙을 처리한 군(Nomal 처리군)과 비교하여 지질축적이 약 15% 이상 감소하였다. 이러한 사실로부터 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 HY7801로 발효한 칡즙은 지질축적 감소로 인한 거품세포 형성을 억제시킴으로서 동맥경화 예방 효과가 있음을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11959BP 20110610

Claims (13)

  1. 마우스(mouse)의 대식세포(macrophagy)에서 TNF(Tumor necrosis factor)-α의 생성을 유도함으로써 면역증강 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)로 발효시킨 칡즙 발효물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서,
    상기 기능성 음료는 칡즙 음료인 것을 특징으로 하는 기능성 음료.
  9. 삭제
  10. 제1항의 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
  11. 삭제
  12. 제1항의 칡즙 발효물을 유효성분으로 함유하는 발효유.
  13. 삭제
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