JP2023161983A - サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物 - Google Patents
サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】サポニンの新たな有効利用をすることである。【課題手段】サポニンの各菌株の増殖能及び該菌株の有用成分の産出能に対する効果を検討した。サポニンは、酪酸産生菌増殖能向上効果、腸内常在菌増殖能向上効果、乳酸菌増殖能向上効果及びビフィズス菌増殖能向上効果を有することを確認して、本発明を完成した。【選択図】なし
Description
本発明は、サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物に関する。
（サポニン）
食品中の機能性成分は、老化防止や癌の発生抑制、高血圧予防、免疫力の向上などの保健効果が期待されている。
機能性成分の一種であるサポニンは、サポゲニンと糖から構成される配糖体の総称である。サポニンは、大豆やオリーブなどの植物中に含まれ、経口摂取によりマウスの血液中のコレステロールを減少させる、また、経口摂取によるマウスのIL-1β、TNF-α、PGE2といった炎症性因子の減少などの機能が報告されている。
食品中の機能性成分は、老化防止や癌の発生抑制、高血圧予防、免疫力の向上などの保健効果が期待されている。
機能性成分の一種であるサポニンは、サポゲニンと糖から構成される配糖体の総称である。サポニンは、大豆やオリーブなどの植物中に含まれ、経口摂取によりマウスの血液中のコレステロールを減少させる、また、経口摂取によるマウスのIL-1β、TNF-α、PGE2といった炎症性因子の減少などの機能が報告されている。
（腸内細菌叢）
ヒトは腸管内に自らの10倍の細胞数、150菌種以上の細菌からなる複雑な腸内細菌叢を保持しており、アレルギーの発症と腸内細菌叢の組成が関連していることがこれまでに報告されている。例えば、無菌マウスに牛乳アレルギーではない健康な乳児の糞便を定着させたところ牛乳のアレルゲンへのアナフィラキシー反応を抑制され、また、乳幼児期のマウスに対して特定の微生物に曝露することで、アレルギーの感受性を制御できる腸内細菌叢を構築することで、アトピーや喘息といった炎症を抑制できたことが報告されている。 制御性T細胞（Treg）は、自己に対する免疫応答の抑制を司っている細胞で、健康人のCD4+T細胞の約5%を占めている。腸内細菌の一種である酪酸産生菌によって腸内に産生された酪酸が、Treg産生に関わる遺伝子が格納されているヒストンのアセチル化を通じて組織中のTreg数を増加させ、アレルギーの原因となる過度な免疫反応を抑制することが知られている。
ヒトは腸管内に自らの10倍の細胞数、150菌種以上の細菌からなる複雑な腸内細菌叢を保持しており、アレルギーの発症と腸内細菌叢の組成が関連していることがこれまでに報告されている。例えば、無菌マウスに牛乳アレルギーではない健康な乳児の糞便を定着させたところ牛乳のアレルゲンへのアナフィラキシー反応を抑制され、また、乳幼児期のマウスに対して特定の微生物に曝露することで、アレルギーの感受性を制御できる腸内細菌叢を構築することで、アトピーや喘息といった炎症を抑制できたことが報告されている。 制御性T細胞（Treg）は、自己に対する免疫応答の抑制を司っている細胞で、健康人のCD4+T細胞の約5%を占めている。腸内細菌の一種である酪酸産生菌によって腸内に産生された酪酸が、Treg産生に関わる遺伝子が格納されているヒストンのアセチル化を通じて組織中のTreg数を増加させ、アレルギーの原因となる過度な免疫反応を抑制することが知られている。
本発明者らは、特許文献１により、「大豆サポニンを含む、アレルギー性接触皮膚炎を抑制する食品添加用組成物、皮膚への外用や経口摂取することでアレルギー性接触皮膚炎を抑制する製剤、食品、飲料並びに皮膚外用剤」を開示している。
しかし、特許文献１は、本発明の「サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物」を開示又は示唆をしていない。
しかし、特許文献１は、本発明の「サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物」を開示又は示唆をしていない。
本発明者らは、サポニンの新たな有効利用を課題とした。
本発明者らは、サポニンの新たな有効利用を検討するために、サポニンの各菌株の増殖能及び該菌株の有用成分の産出能に対する効果を検討した。
サポニンは、酪酸産生菌増殖能向上効果、腸内常在菌増殖能向上効果、乳酸菌増殖能向上効果及びビフィズス菌増殖能向上効果を有することを確認して、本発明を完成した。
サポニンは、酪酸産生菌増殖能向上効果、腸内常在菌増殖能向上効果、乳酸菌増殖能向上効果及びビフィズス菌増殖能向上効果を有することを確認して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
１．サポニンを含む、Rosebria intestinaliの増殖能及び酪酸産生能向上組成物。
２．サポニンを含む、Eubacteriumventriosumの増殖能、酢酸産生能及び酪酸産生能向上組成物。
３．サポニンを含む、酪酸産生菌増殖能向上組成物。
４．前記酪酸産生菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある前項３に記載の組成物。
１）Clostridium ramosum
２）Clostridium indolis
３）Clostridium bolteae
５．サポニンを含む、腸内常在菌増殖能向上組成物。
６．前記腸内常在菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある前項５に記載の組成物。
１）Eubacterium ventriosum
２）Clostridium asparagiforme
３）Bacteroides uniformis
４）Bacteroides dorei
５）Bacteroides fragilis
６）Ruminococcus torques
７）Ruminococcus gnavus
８）Eubacterium siraeum
９）Clostridium nexile
１０）Rosebria intestinalis
１１）Anaerotruncus colihominis
７．前記腸内常在菌の菌株は、Anaerotruncus colihominisである前項６に記載の組成物。
８．サポニンを含む、乳酸菌増殖能向上組成物。
９．前記乳酸菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある前項８に記載の組成物。
１）Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
２）Lactobacillus gasseri
３）Lactobacillus johnsonii
４）Lactobacillus plantarum
５）Lactobacillus curvatus
１０．サポニンを含む、ビフィズス菌増殖能向上組成物。
１１．前記ビフィズス菌は、以下のいずれか１以上ある前項１０に記載の組成物。
１）Bifidobacterium adolescentis
２）Bifidobacterium animalis subsp. lactis
３）Bifidobacterium bifidum
４）Bifidobacterium breve
５）Bifidobacterium longum
６）Bifidobacterium pseudolongum
１２．サポニンを含む培地を使用して、酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌の増殖方法。
１３．前記サポニンは、培地中に0.02～0.7重量％含有する、前項１２に記載の増殖方法。
１．サポニンを含む、Rosebria intestinaliの増殖能及び酪酸産生能向上組成物。
２．サポニンを含む、Eubacteriumventriosumの増殖能、酢酸産生能及び酪酸産生能向上組成物。
３．サポニンを含む、酪酸産生菌増殖能向上組成物。
４．前記酪酸産生菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある前項３に記載の組成物。
１）Clostridium ramosum
２）Clostridium indolis
３）Clostridium bolteae
５．サポニンを含む、腸内常在菌増殖能向上組成物。
６．前記腸内常在菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある前項５に記載の組成物。
１）Eubacterium ventriosum
２）Clostridium asparagiforme
３）Bacteroides uniformis
４）Bacteroides dorei
５）Bacteroides fragilis
６）Ruminococcus torques
７）Ruminococcus gnavus
８）Eubacterium siraeum
９）Clostridium nexile
１０）Rosebria intestinalis
１１）Anaerotruncus colihominis
７．前記腸内常在菌の菌株は、Anaerotruncus colihominisである前項６に記載の組成物。
８．サポニンを含む、乳酸菌増殖能向上組成物。
９．前記乳酸菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある前項８に記載の組成物。
１）Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
２）Lactobacillus gasseri
３）Lactobacillus johnsonii
４）Lactobacillus plantarum
５）Lactobacillus curvatus
１０．サポニンを含む、ビフィズス菌増殖能向上組成物。
１１．前記ビフィズス菌は、以下のいずれか１以上ある前項１０に記載の組成物。
１）Bifidobacterium adolescentis
２）Bifidobacterium animalis subsp. lactis
３）Bifidobacterium bifidum
４）Bifidobacterium breve
５）Bifidobacterium longum
６）Bifidobacterium pseudolongum
１２．サポニンを含む培地を使用して、酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌の増殖方法。
１３．前記サポニンは、培地中に0.02～0.7重量％含有する、前項１２に記載の増殖方法。
本発明は、サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物を提供する。
（本発明の対象）
本発明は、サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物に関する。さらに、サポニンを含む、Rosebria intestinaliの増殖能及び酪酸産生能向上組成物、並びに、サポニンを含む、Eubacterium ventriosumの増殖能、酢酸産生能及び酪酸産生能向上組成物に関する。
本発明は、サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物に関する。さらに、サポニンを含む、Rosebria intestinaliの増殖能及び酪酸産生能向上組成物、並びに、サポニンを含む、Eubacterium ventriosumの増殖能、酢酸産生能及び酪酸産生能向上組成物に関する。
（サポニン）
本発明の「サポニン」は、公知のサポニン含有植物由来であれば特に限定されないが、大豆、エンドウ、テンサイ等を例示することができ、大豆サポニンが好ましい。
大豆サポニンの製造例として、以下を例示することができるが、特に限定されない。
大豆生胚軸１ｋｇに７５容量％の含水エタノール４Ｌを加え、抽出を行う。抽出液をろ過により分離した後、該抽出液を減圧下、濃縮を行う。このようにして得られた抽出物を水に溶解し、吸着樹脂ダイアイオンHP-20（三菱化学(株)製）を充填したカラム（２００ mL）にSV1にて負荷する。
次に、水（２００ mL）、および２５容量％の含水エタノール（２００ mL）で洗浄後、６０容量％の含水エタノール（４００ mL）で溶出させた画分を減圧下で濃縮し、乾燥粉末化して大豆サポニン抽出素材を得る。素材中の重量あたりの総サポニン含量は約５５％になる。またサポニン総量に対して、グループＡサポニンが６４重量％、グループＢサポニンが３６重量％になる。
また、市販の大豆サポニン（例：ソイヘルスSA（不二製油））等を使用することもできる。
本発明の「サポニン」は、公知のサポニン含有植物由来であれば特に限定されないが、大豆、エンドウ、テンサイ等を例示することができ、大豆サポニンが好ましい。
大豆サポニンの製造例として、以下を例示することができるが、特に限定されない。
大豆生胚軸１ｋｇに７５容量％の含水エタノール４Ｌを加え、抽出を行う。抽出液をろ過により分離した後、該抽出液を減圧下、濃縮を行う。このようにして得られた抽出物を水に溶解し、吸着樹脂ダイアイオンHP-20（三菱化学(株)製）を充填したカラム（２００ mL）にSV1にて負荷する。
次に、水（２００ mL）、および２５容量％の含水エタノール（２００ mL）で洗浄後、６０容量％の含水エタノール（４００ mL）で溶出させた画分を減圧下で濃縮し、乾燥粉末化して大豆サポニン抽出素材を得る。素材中の重量あたりの総サポニン含量は約５５％になる。またサポニン総量に対して、グループＡサポニンが６４重量％、グループＢサポニンが３６重量％になる。
また、市販の大豆サポニン（例：ソイヘルスSA（不二製油））等を使用することもできる。
（Rosebria intestinaliの増殖能及び酪酸産生能向上組成物）
本実施例では、サポニンはヒト腸内常在菌叢最優勢種であるRosebriaintestinaliの増殖能だけでなく酪酸産生能も向上させることを確認している。
増殖能は3.3倍であり、酪酸産生能は4.4倍であった。
本実施例では、サポニンはヒト腸内常在菌叢最優勢種であるRosebriaintestinaliの増殖能だけでなく酪酸産生能も向上させることを確認している。
増殖能は3.3倍であり、酪酸産生能は4.4倍であった。
（Eubacteriumventriosumの増殖能、酢酸産生能及び酪酸産生能向上組成物）
本実施例では、サポニンはヒト腸内常在菌叢最優勢種であるEubacterium ventriosumの増殖能だけでなく酢酸産生能及び酪酸産生能も向上させることを確認している。
本実施例では、サポニンはヒト腸内常在菌叢最優勢種であるEubacterium ventriosumの増殖能だけでなく酢酸産生能及び酪酸産生能も向上させることを確認している。
（酪酸産生菌増殖能向上組成物）
本実施例では、サポニンは酪酸産生菌（特に、Clostridiumramosum、Clostridium indolis、Clostridium bolteae）の増殖能を向上させることを確認している。
本実施例では、サポニンは酪酸産生菌（特に、Clostridiumramosum、Clostridium indolis、Clostridium bolteae）の増殖能を向上させることを確認している。
（腸内常在菌増殖能向上組成物）
本実施例では、サポニンは腸内常在菌（特に、ヒト腸内常在菌叢最優勢種のEubacteriumventriosum、Clostridium asparagiforme、Bacteroides uniformis、Bacteroidesdorei、Bacteroides fragilis、Ruminococcus torques、Ruminococcus gnavus、Eubacterium siraeum、Clostridium nexile、Rosebria intestinalis、Anaerotruncus colihominis）の増殖能を向上させることを確認している。
特に、Anaerotruncus colihominisの増殖能は15倍であった。
本実施例では、サポニンは腸内常在菌（特に、ヒト腸内常在菌叢最優勢種のEubacteriumventriosum、Clostridium asparagiforme、Bacteroides uniformis、Bacteroidesdorei、Bacteroides fragilis、Ruminococcus torques、Ruminococcus gnavus、Eubacterium siraeum、Clostridium nexile、Rosebria intestinalis、Anaerotruncus colihominis）の増殖能を向上させることを確認している。
特に、Anaerotruncus colihominisの増殖能は15倍であった。
（乳酸菌増殖能向上組成物）
本実施例では、サポニンは乳酸菌（特に、Lactobacillus caseisubsp. rhamnosus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus curvatus、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）の増殖能を向上させることを確認している。
特に、Lactobacillus gasseriの増殖能は約4.5倍であった。
本実施例では、サポニンは乳酸菌（特に、Lactobacillus caseisubsp. rhamnosus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus curvatus、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）の増殖能を向上させることを確認している。
特に、Lactobacillus gasseriの増殖能は約4.5倍であった。
（ビフィズス菌増殖能向上組成物）
本実施例では、サポニンはビフィズス菌（特に、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium animalis subsp.lactis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium pseudolongum）の増殖能を向上させることを確認している。
本実施例では、サポニンはビフィズス菌（特に、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium animalis subsp.lactis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium pseudolongum）の増殖能を向上させることを確認している。
（組成物の使用例・使用態様）
上記述べた各組成物は、組成物としてそのまま使用しても良いが、食品、飲料、健康食品、医薬品及び医薬部外品等として使用又は該品の有効成分として使用することもできる。
例えば、上記組成物を以下のように使用することができる。本発明の各組成物は、以下の態様も含む。
酪酸産生菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
腸内常在菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
乳酸菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
ビフィズス菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
上記述べた各組成物は、組成物としてそのまま使用しても良いが、食品、飲料、健康食品、医薬品及び医薬部外品等として使用又は該品の有効成分として使用することもできる。
例えば、上記組成物を以下のように使用することができる。本発明の各組成物は、以下の態様も含む。
酪酸産生菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
腸内常在菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
乳酸菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
ビフィズス菌増殖能向上食品、飲料、健康食品、医薬品又は医薬部外品
（組成物の摂取・投与例）
本発明の組成物の摂取・投与例は、各効果（増殖能向上）を得ることができれば得に限定されないが、大豆サポニン素材の乾燥物重量として、被投与個体の体重1ｋｇあたり0.001 g／日以上が好ましく、0.05 g/日以上がより好ましい。
本発明の組成物の摂取・投与例は、各効果（増殖能向上）を得ることができれば得に限定されないが、大豆サポニン素材の乾燥物重量として、被投与個体の体重1ｋｇあたり0.001 g／日以上が好ましく、0.05 g/日以上がより好ましい。
（酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌の増殖方法）
本発明の酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌の増殖方法では、自体公知の酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌で使用する培地に、サポニン、好ましくは0.02～0.7％のサポニンを含有することにより、各菌の増殖能、さらには、酢酸産生能及び酪酸産生能を向上させることができる。
培地は、特に限定されないが、GAM培地が好ましい。
本発明の酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌の増殖方法では、自体公知の酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌で使用する培地に、サポニン、好ましくは0.02～0.7％のサポニンを含有することにより、各菌の増殖能、さらには、酢酸産生能及び酪酸産生能を向上させることができる。
培地は、特に限定されないが、GAM培地が好ましい。
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
実施例で使用した材料、菌株及び該菌株の培養方法は以下の通りである。
（大豆サポニン）
市販のソイヘルスSA（不二製油）を使用した。
市販のソイヘルスSA（不二製油）を使用した。
（使用菌株）
本実施例では、デンマークとスペインの健常成人と肥満成人からなる124人の糞便中の細菌における培養を介さない方法で解析した結果から推測されたヒト腸内常在菌叢最優勢種における上位56種のうち入手可能な45種から、GAM培地で生育可能な32 種腸内細菌（表１）を用いて実験を行った。
また菌株収集にあたっては、それぞれの菌種の基準種（タイプストレイン）を選定し、菌株保存・分譲機関（ATCC（American Type Culture Collection）、JCM（Japan Collection of Microorganisms）、DSMZ（Deutsche SammLung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH））から購入した。また、本研究で使用したGAM培地で生育可能な重要腸内細菌24種（乳酸菌とビフィズス菌、酪酸産生菌）を表２に示した。
本実施例では、デンマークとスペインの健常成人と肥満成人からなる124人の糞便中の細菌における培養を介さない方法で解析した結果から推測されたヒト腸内常在菌叢最優勢種における上位56種のうち入手可能な45種から、GAM培地で生育可能な32 種腸内細菌（表１）を用いて実験を行った。
また菌株収集にあたっては、それぞれの菌種の基準種（タイプストレイン）を選定し、菌株保存・分譲機関（ATCC（American Type Culture Collection）、JCM（Japan Collection of Microorganisms）、DSMZ（Deutsche SammLung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH））から購入した。また、本研究で使用したGAM培地で生育可能な重要腸内細菌24種（乳酸菌とビフィズス菌、酪酸産生菌）を表２に示した。
（培養方法）
〇GAM培地
200 mL容ビーカーにスターラーバーと約130 mLのElix水を入れ、GAMブイヨン（日水製薬株式会社; 製品番号, 65422）8.49 gを加え、攪拌して完全に溶解させた。溶解させたものを200 mL容メスシリンダーに移し、Elix水で144 mLにメスアップした後に、200 mL容耐熱性瓶に入れた。オートクレーブ（TOMY; 製品番号, LSX-500）（115℃, 15 min）し、オートクレーブ内の温度が97℃まで下がったら直ちに、アネロパック（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-03）と共に密封容器（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-110）に入れ、常温で保存した。一晩以上脱気処理した後、試験に使用した。
〇GAM+0.5％（w/v）サポニン培地
200 mL容ビーカーにスターラーバーと約130 mLのElix水を入れ、GAMブイヨン8.49 gとサポニン0.72 g を加え、攪拌して完全に溶解させた。溶解させたものを200 mL容メスシリンダーに移し、Elix水で144 mLにメスアップした後に、200 mL容耐熱性瓶に入れた。オートクレーブ（115℃, 15 min）し、オートクレーブ内の温度が97℃まで下がったら直ちに、アネロパックと共に密封容器に入れ、常温で保存した。一晩以上脱気処理した後、試験に使用した。なお、0.5% サポニンはGAM培地中で完全に溶解した。
〇GAM培地
200 mL容ビーカーにスターラーバーと約130 mLのElix水を入れ、GAMブイヨン（日水製薬株式会社; 製品番号, 65422）8.49 gを加え、攪拌して完全に溶解させた。溶解させたものを200 mL容メスシリンダーに移し、Elix水で144 mLにメスアップした後に、200 mL容耐熱性瓶に入れた。オートクレーブ（TOMY; 製品番号, LSX-500）（115℃, 15 min）し、オートクレーブ内の温度が97℃まで下がったら直ちに、アネロパック（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-03）と共に密封容器（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-110）に入れ、常温で保存した。一晩以上脱気処理した後、試験に使用した。
〇GAM+0.5％（w/v）サポニン培地
200 mL容ビーカーにスターラーバーと約130 mLのElix水を入れ、GAMブイヨン8.49 gとサポニン0.72 g を加え、攪拌して完全に溶解させた。溶解させたものを200 mL容メスシリンダーに移し、Elix水で144 mLにメスアップした後に、200 mL容耐熱性瓶に入れた。オートクレーブ（115℃, 15 min）し、オートクレーブ内の温度が97℃まで下がったら直ちに、アネロパックと共に密封容器に入れ、常温で保存した。一晩以上脱気処理した後、試験に使用した。なお、0.5% サポニンはGAM培地中で完全に溶解した。
（サポニンの乳酸菌、ビフィズス菌、ヒト腸内常在菌叢最優勢種、酪酸産出菌及び悪玉菌の増殖に与える影響の解析）
本実施例では、サポニンの乳酸菌、ビフィズス菌、ヒト腸内常在菌叢最優勢種、酪酸産出菌及び悪玉菌の増殖に与える影響を解析した。
本実施例では、サポニンの乳酸菌、ビフィズス菌、ヒト腸内常在菌叢最優勢種、酪酸産出菌及び悪玉菌の増殖に与える影響を解析した。
（培養）
１．3 mLのGAM液体培地をバイアル瓶9本にそれぞれ分注した。
２．前培養に48時間が必要な細菌（Roseburia intestinalis, Coprococcus comes, Ruminococcus obeum, Pseudoflavonifractor capillosus, Anaerotruncus colihominis, Bacteroidesintestinalis, Clostridium scindens, Bifidobacterium infantis, Leuconostocmesenteroides subsp. mesenteroides）について、1の培地に滅菌済み爪楊枝を用いて植菌した。
３．アネロパック（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-03）と共に密封容器（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-110）に入れ、嫌気チャンバー内で37℃嫌気条件下で48時間培養した。
４．GAM液体培地を96穴ディープウェルプレート（丸穴丸底; WATSON; 製品番号, 376-96R-10, 1.0 mL）にそれぞれ500 μL分注した。
５．前培養に24時間が必要な細菌の、96穴プレート上の凍結グリセロールストック菌体液（50 μL）を、嫌気チャンバー内に10分間静置し、溶解させた。
６．20 μLに調節した8連ピペットマン（GILSON; 製品番号, FA10009, 最大容量20 μL）で10回ピペッティングし、懸濁した。
７．8連ピペットマン（GILSON;製品番号, FA10009, 最大容量20 μL）を用いて5 μLの融解済みグリセロールストック菌体液を4の培地に植菌した。
８．200 μLに合わせた8連のピペットマン（GILSON; 製品番号, FA10011, 最大容量200 μL）で20回ピペッティングし、懸濁した。
９．ガス透過性のシール（4titude; 製品番号, 4ti-0516/96）を貼り、アネロパックと共に密封容器に入れ、嫌気チャンバー内で37℃嫌気条件下で24時間培養した。
１０．前培養に48時間が必要な菌について、48時間の培養後にボルッテクスミキサーで攪拌後、4の96穴ディープウェルプレートの植菌予定のウェルに500 μLずつ分注した。
１１．前培養培地を200 μLに合わせた8連ピペットマンで20回ピペッティングし、懸濁した。
１２．96穴ディープウェルプレートにGAM+0.5％（w/v）サポニン培を500 μLずつ分注した。
１３．乾熱滅菌したコピープレート96（株式会社 トッケン; 製品番号, TK-CP96）を用いて前培養培地からそれぞれ本培養培地に植菌した。この操作により、およそ2 μLの前培養液が接種された。
１４．ガス透過性のシールを貼り、アネロパックと共に密封容器に入れ、嫌気チャンバー内で37℃嫌気条件下で24時間培養した
１．3 mLのGAM液体培地をバイアル瓶9本にそれぞれ分注した。
２．前培養に48時間が必要な細菌（Roseburia intestinalis, Coprococcus comes, Ruminococcus obeum, Pseudoflavonifractor capillosus, Anaerotruncus colihominis, Bacteroidesintestinalis, Clostridium scindens, Bifidobacterium infantis, Leuconostocmesenteroides subsp. mesenteroides）について、1の培地に滅菌済み爪楊枝を用いて植菌した。
３．アネロパック（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-03）と共に密封容器（三菱ガス化学株式会社; 製品番号, A-110）に入れ、嫌気チャンバー内で37℃嫌気条件下で48時間培養した。
４．GAM液体培地を96穴ディープウェルプレート（丸穴丸底; WATSON; 製品番号, 376-96R-10, 1.0 mL）にそれぞれ500 μL分注した。
５．前培養に24時間が必要な細菌の、96穴プレート上の凍結グリセロールストック菌体液（50 μL）を、嫌気チャンバー内に10分間静置し、溶解させた。
６．20 μLに調節した8連ピペットマン（GILSON; 製品番号, FA10009, 最大容量20 μL）で10回ピペッティングし、懸濁した。
７．8連ピペットマン（GILSON;製品番号, FA10009, 最大容量20 μL）を用いて5 μLの融解済みグリセロールストック菌体液を4の培地に植菌した。
８．200 μLに合わせた8連のピペットマン（GILSON; 製品番号, FA10011, 最大容量200 μL）で20回ピペッティングし、懸濁した。
９．ガス透過性のシール（4titude; 製品番号, 4ti-0516/96）を貼り、アネロパックと共に密封容器に入れ、嫌気チャンバー内で37℃嫌気条件下で24時間培養した。
１０．前培養に48時間が必要な菌について、48時間の培養後にボルッテクスミキサーで攪拌後、4の96穴ディープウェルプレートの植菌予定のウェルに500 μLずつ分注した。
１１．前培養培地を200 μLに合わせた8連ピペットマンで20回ピペッティングし、懸濁した。
１２．96穴ディープウェルプレートにGAM+0.5％（w/v）サポニン培を500 μLずつ分注した。
１３．乾熱滅菌したコピープレート96（株式会社 トッケン; 製品番号, TK-CP96）を用いて前培養培地からそれぞれ本培養培地に植菌した。この操作により、およそ2 μLの前培養液が接種された。
１４．ガス透過性のシールを貼り、アネロパックと共に密封容器に入れ、嫌気チャンバー内で37℃嫌気条件下で24時間培養した
（生育度の測定）
１．96穴プレート（非滅菌）（WATSON;製品番号,4845-96F）に1×PBSをマルチチャンネルピペットマン（GILSON; 製品番号, F81020 最大容量 1200 μL）を用いて150 μLずつ入れた。
２．96穴電動ピペッター（VIAFLO96; INTEGRA; 製品番号, 6001）のステージの左側で専用チップ（1250 μL GRIPTIP; INTEGRA; 製品番号, 6443）をセットした。
３．96穴電動ピペッターのステージの左側に本培養液の入った96ディープウェルプレートを置き、ステージの右側に1×PBSを分注した96ウェルプレートを配置した。
４．96穴電動ピペッターのカスタムプログラムのA（参照：表３）を選択し、RUNで開始した。
５．プレートシェイカー（ThermoMixer; Eppendorf ; 製品番号, 5382000023）で振とうし（600 rpm、1分）、ピペッティングに伴って生じる気泡の一部を破壊した。
６．さらに、気泡をドライヤー（Panasonic; 製品番号, EH-NE4A）を冷風にセットして破壊した。
７．さらに、気泡をダイヤモンドチップ（Molecular BioProducts; 製品番号, 3510-05）でつぶした。
８．MultiskanTM GO マイクロプレートスペクトロフォトメータ（Thermo Fisher Scientific; 製品番号, 51119350）にマイクロプレートをセットし、GAM培地とサンプルの600 nmにおける吸光を測定した。
９．測定値からGAM培地の吸光の値を引いて、さらにその値を4倍することで、培養液の600 nmにおける吸光を測定した。
１．96穴プレート（非滅菌）（WATSON;製品番号,4845-96F）に1×PBSをマルチチャンネルピペットマン（GILSON; 製品番号, F81020 最大容量 1200 μL）を用いて150 μLずつ入れた。
２．96穴電動ピペッター（VIAFLO96; INTEGRA; 製品番号, 6001）のステージの左側で専用チップ（1250 μL GRIPTIP; INTEGRA; 製品番号, 6443）をセットした。
３．96穴電動ピペッターのステージの左側に本培養液の入った96ディープウェルプレートを置き、ステージの右側に1×PBSを分注した96ウェルプレートを配置した。
４．96穴電動ピペッターのカスタムプログラムのA（参照：表３）を選択し、RUNで開始した。
５．プレートシェイカー（ThermoMixer; Eppendorf ; 製品番号, 5382000023）で振とうし（600 rpm、1分）、ピペッティングに伴って生じる気泡の一部を破壊した。
６．さらに、気泡をドライヤー（Panasonic; 製品番号, EH-NE4A）を冷風にセットして破壊した。
７．さらに、気泡をダイヤモンドチップ（Molecular BioProducts; 製品番号, 3510-05）でつぶした。
８．MultiskanTM GO マイクロプレートスペクトロフォトメータ（Thermo Fisher Scientific; 製品番号, 51119350）にマイクロプレートをセットし、GAM培地とサンプルの600 nmにおける吸光を測定した。
９．測定値からGAM培地の吸光の値を引いて、さらにその値を4倍することで、培養液の600 nmにおける吸光を測定した。
（細菌の生育度の測定）
本実施例では、96穴マイクロタイタープレートを使用して培養液の600 nmにおける吸光の測定値を測定したが、この96穴マイクロタイタープレートの光路長は1 cmではない。光路長が1 cmのキュベットを用いて測定した600 nmにおける吸光の測定値が濁度（OD600）であるため、本実施例では、プレートでの測定結果をキュベットでの測定値に換算する操作を行った。換算方法は以下に示した。この重要腸内細菌のファクタ（表４）、ヒト腸内常在菌叢最優勢種のファクタ（表５）を用いて濁度を測定した。
培養液を光路長1 cmのキュベット（ザルスタッド株式会社; 製品番号, 67.742J）に入れて、吸光度を測定した。
↓
“光路長1 cmのキュベットにおける吸光度 （OD600）/ 96穴マイクロタイタープレートにおける吸光値”（「ファクタ」と呼ぶ。）を腸内細菌ごとに出した。
↓
培養液をプレートで測定した際に出た値をファクタとかけることで、プレートで測定した値をキュベットで測定した値に換算した。
本実施例では、96穴マイクロタイタープレートを使用して培養液の600 nmにおける吸光の測定値を測定したが、この96穴マイクロタイタープレートの光路長は1 cmではない。光路長が1 cmのキュベットを用いて測定した600 nmにおける吸光の測定値が濁度（OD600）であるため、本実施例では、プレートでの測定結果をキュベットでの測定値に換算する操作を行った。換算方法は以下に示した。この重要腸内細菌のファクタ（表４）、ヒト腸内常在菌叢最優勢種のファクタ（表５）を用いて濁度を測定した。
培養液を光路長1 cmのキュベット（ザルスタッド株式会社; 製品番号, 67.742J）に入れて、吸光度を測定した。
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“光路長1 cmのキュベットにおける吸光度 （OD600）/ 96穴マイクロタイタープレートにおける吸光値”（「ファクタ」と呼ぶ。）を腸内細菌ごとに出した。
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培養液をプレートで測定した際に出た値をファクタとかけることで、プレートで測定した値をキュベットで測定した値に換算した。
（サポニンの乳酸菌、ビフィズス菌、ヒト腸内常在菌叢最優勢種、酪酸産出菌及び悪玉菌の増殖に与える影響の結果）
サポニンを添加したGAM培地におけるヒト腸内常在菌叢最優勢32種および重要腸内細菌24種の生育度（OD600）を、サポニンを添加しないGAM培地における生育度（OD600）で除することにより、0.5％サポニンによる増殖促進効果を示した（図１）。
0.5%サポニンは、プロバイオティクス細菌である乳酸菌やビフィズス菌、酪酸産生菌の増殖を促進することが明らかとなった。また、GAMで培養可能なヒト腸内常在菌叢最優勢種のうち11種（Eubacterium ventriosum, Clostridium asparagiforme, Bacteroidesuniformis, Bacteroides dorei, Bacteroides fragilis, Ruminococcus torques,Ruminococcus gnavus, Eubacterium siraeum, Clostridium nexile, Rosebriaintestinalis, Anaerotruncuscolihominis）に対する増殖促進効果を確認した。
また、悪玉菌であるFusobacterium nucleatum subsp.nucleatumの増殖抑制効果を確認した。
特に、乳酸菌1菌種（Lactobacillusgasseri）では、0.5%サポニンを添加した際の生育度（OD600）が添加せずに培養した際と比較して4.5倍となり、高い増殖促進効果を有していた。
さらに、ヒト腸内常在菌叢最優勢種に含まれ酪酸産生菌でもあるRosebriaintestinalisおよびEubacterium ventriosum, Anaerotruncuscolihominisは、0.5%サポニンの培地への添加によりその増殖がそれぞれ3.3倍、1.7倍および15倍に促進されたことから、一部の有用菌に対する強い増殖促進効果を有していることが明らかとなった。
サポニンを添加したGAM培地におけるヒト腸内常在菌叢最優勢32種および重要腸内細菌24種の生育度（OD600）を、サポニンを添加しないGAM培地における生育度（OD600）で除することにより、0.5％サポニンによる増殖促進効果を示した（図１）。
0.5%サポニンは、プロバイオティクス細菌である乳酸菌やビフィズス菌、酪酸産生菌の増殖を促進することが明らかとなった。また、GAMで培養可能なヒト腸内常在菌叢最優勢種のうち11種（Eubacterium ventriosum, Clostridium asparagiforme, Bacteroidesuniformis, Bacteroides dorei, Bacteroides fragilis, Ruminococcus torques,Ruminococcus gnavus, Eubacterium siraeum, Clostridium nexile, Rosebriaintestinalis, Anaerotruncuscolihominis）に対する増殖促進効果を確認した。
また、悪玉菌であるFusobacterium nucleatum subsp.nucleatumの増殖抑制効果を確認した。
特に、乳酸菌1菌種（Lactobacillusgasseri）では、0.5%サポニンを添加した際の生育度（OD600）が添加せずに培養した際と比較して4.5倍となり、高い増殖促進効果を有していた。
さらに、ヒト腸内常在菌叢最優勢種に含まれ酪酸産生菌でもあるRosebriaintestinalisおよびEubacterium ventriosum, Anaerotruncuscolihominisは、0.5%サポニンの培地への添加によりその増殖がそれぞれ3.3倍、1.7倍および15倍に促進されたことから、一部の有用菌に対する強い増殖促進効果を有していることが明らかとなった。
（サポニンのヒト腸内常在菌叢最優勢種の酢酸及び酪酸産出能に与える影響の解析）
本実施例では、ヒト腸内常在菌叢最優勢種の酢酸及び酪酸産出能に与える影響を解析した。
本実施例では、ヒト腸内常在菌叢最優勢種の酢酸及び酪酸産出能に与える影響を解析した。
実施例２で使用したGAM+0.5％（w/v）サポニン培地で24時間培養した各菌株の酢酸産及び酪酸の産出量についてガスクロマトグラフィー質量分析計を用いて解析した。解析結果を以下表６に示す。
（サポニンのヒト腸内常在菌叢最優勢種の酢酸及びブチル酸産出能に与える影響の解析結果）
上記表６に示すように、サポニンは以下の効果を有することを確認した。
Eubacteriumventriosumの酢酸産出能及び酪酸産出能を向上させる。
Bacteroides uniformisの酢酸産出能を向上させる。
Ruminococcus torques の酢酸産出能を向上させる。
Eubacterium siraeumの酢酸産出能を向上させる。
Clostridium nexileの酢酸産出能を向上させる。
Roseburia intestinalisの酪酸産出能を向上させる。
Enterococcus faecalisの酢酸産出能を向上させる。
上記表６に示すように、サポニンは以下の効果を有することを確認した。
Eubacteriumventriosumの酢酸産出能及び酪酸産出能を向上させる。
Bacteroides uniformisの酢酸産出能を向上させる。
Ruminococcus torques の酢酸産出能を向上させる。
Eubacterium siraeumの酢酸産出能を向上させる。
Clostridium nexileの酢酸産出能を向上させる。
Roseburia intestinalisの酪酸産出能を向上させる。
Enterococcus faecalisの酢酸産出能を向上させる。
サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物を提供することができる。
Claims (13)
- サポニンを含む、Rosebria intestinaliの増殖能及び酪酸産生能向上組成物。
- サポニンを含む、Eubacteriumventriosumの増殖能、酢酸産生能及び酪酸産生能向上組成物。
- サポニンを含む、酪酸産生菌増殖能向上組成物。
- 前記酪酸産生菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある請求項３に記載の組成物。
１）Clostridium ramosum
２）Clostridium indolis
３）Clostridium bolteae
- サポニンを含む、腸内常在菌増殖能向上組成物。
- 前記腸内常在菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある請求項５に記載の組成物。
１）Eubacterium ventriosum
２）Clostridium asparagiforme
３）Bacteroides uniformis
４）Bacteroides dorei
５）Bacteroides fragilis
６）Ruminococcus torques
７）Ruminococcus gnavus
８）Eubacterium siraeum
９）Clostridium nexile
１０）Rosebria intestinalis
１１）Anaerotruncus colihominis
- 前記腸内常在菌の菌株は、Anaerotruncus colihominisである請求項６に記載の組成物。
- サポニンを含む、乳酸菌増殖能向上組成物。
- 前記乳酸菌の菌株は、以下のいずれか１以上ある請求項８に記載の組成物。
１）Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
２）Lactobacillus gasseri
３）Lactobacillus johnsonii
４）Lactobacillus plantarum
５）Lactobacillus curvatus
- サポニンを含む、ビフィズス菌増殖能向上組成物。
- 前記ビフィズス菌は、以下のいずれか１以上ある請求項１０に記載の組成物。
１）Bifidobacterium adolescentis
２）Bifidobacterium animalis subsp. lactis
３）Bifidobacterium bifidum
４）Bifidobacterium breve
５）Bifidobacterium longum
６）Bifidobacterium pseudolongum
- サポニンを含む培地を使用して、酪酸産生菌、腸内常在菌、乳酸菌、及び／又はビフィズス菌の増殖方法。
- 前記サポニンは、培地中に0.02～0.7重量％含有する、請求項１２に記載の増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022072662A JP2023161983A (ja) | 2022-04-26 | 2022-04-26 | サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2022072662A JP2023161983A (ja) | 2022-04-26 | 2022-04-26 | サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物 |
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| JP2023161983A true JP2023161983A (ja) | 2023-11-08 |
Family
ID=88650572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2022072662A Pending JP2023161983A (ja) | 2022-04-26 | 2022-04-26 | サポニンを含む酪酸産生菌増殖能向上組成物、腸内常在菌増殖能向上組成物、乳酸菌増殖能向上組成物及びビフィズス菌増殖能向上組成物 |
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2022
- 2022-04-26 JP JP2022072662A patent/JP2023161983A/ja active Pending
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