JPH0889259A - 自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用 - Google Patents
自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用Info
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- JPH0889259A JPH0889259A JP6301140A JP30114094A JPH0889259A JP H0889259 A JPH0889259 A JP H0889259A JP 6301140 A JP6301140 A JP 6301140A JP 30114094 A JP30114094 A JP 30114094A JP H0889259 A JPH0889259 A JP H0889259A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３由来の自立複製配列を有するＤＮ
Ａ断片及びその利用。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片を用いて造成される環状
ＤＮＡベクターは、コリネ型細菌内で低コピー数で存在
し、自律複製可能であり、該環状ＤＮＡベクターを用い
ることにより、高コピー数存在すると宿主コリネ型細菌
に悪影響を与える遺伝子等のクローニングが可能とな
る。
フラバムＭＪ−２３３由来の自立複製配列を有するＤＮ
Ａ断片及びその利用。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片を用いて造成される環状
ＤＮＡベクターは、コリネ型細菌内で低コピー数で存在
し、自律複製可能であり、該環状ＤＮＡベクターを用い
ることにより、高コピー数存在すると宿主コリネ型細菌
に悪影響を与える遺伝子等のクローニングが可能とな
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌染色体に
由来する自律複製配列を有するＤＮＡ断片及びそれが導
入された環状ＤＮＡに関する。染色体に由来する自律複
製配列を有するＤＮＡ領域（以下これを「ａｒｓ（Auto
monous Replication Sequence）領域」ということがあ
る）とは、染色体の複製開始に必要とされるＤＮＡ領域
又はその一部のＤＮＡ領域を意味するものである。コリ
ネ型細菌染色体に由来するａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片
を適当な薬剤耐性マーカーとなりうるベクターと連結す
ることにより、コリネ型細菌内で１〜２コピーの低コピ
ー数で存在し、自律複製可能な環状ＤＮＡを造成するこ
とができる。この低コピー数ベクターは、高発現化によ
り細胞に悪影響を与える遺伝子のクローニング等に有効
である。
由来する自律複製配列を有するＤＮＡ断片及びそれが導
入された環状ＤＮＡに関する。染色体に由来する自律複
製配列を有するＤＮＡ領域（以下これを「ａｒｓ（Auto
monous Replication Sequence）領域」ということがあ
る）とは、染色体の複製開始に必要とされるＤＮＡ領域
又はその一部のＤＮＡ領域を意味するものである。コリ
ネ型細菌染色体に由来するａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片
を適当な薬剤耐性マーカーとなりうるベクターと連結す
ることにより、コリネ型細菌内で１〜２コピーの低コピ
ー数で存在し、自律複製可能な環状ＤＮＡを造成するこ
とができる。この低コピー数ベクターは、高発現化によ
り細胞に悪影響を与える遺伝子のクローニング等に有効
である。
【０００２】
【従来の技術】微生物由来の自律複製配列を有する配列
を含む領域であるａｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli ）由来のもの〔プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA）、7
4、5458 〜 5462 （1977）参照〕、シュードモナス・プ
チダ （Pseudomonas putida）由来のもの〔モレキュラ
ー・ジェネラル・ジェネティックス（Mol. Gen. Gene
t.）、215、381 〜 387 （1979）参照〕、バチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis ）由来のもの〔エンボ・ジ
ャーナル（EMBO J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参
照〕、マイクロコッカッス・ルテウス（Micrococcus lu
teus）由来のもの〔ジーン（Gene）、93、73〜78 (199
0) 参照〕、ストレプトミセス・リビダンス（Storeptom
yces lividans）由来のもの〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Journal of Bacteriology ）、174 、26
88〜2693 (1992) 参照〕等がよく研究されている。
を含む領域であるａｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli ）由来のもの〔プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA）、7
4、5458 〜 5462 （1977）参照〕、シュードモナス・プ
チダ （Pseudomonas putida）由来のもの〔モレキュラ
ー・ジェネラル・ジェネティックス（Mol. Gen. Gene
t.）、215、381 〜 387 （1979）参照〕、バチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis ）由来のもの〔エンボ・ジ
ャーナル（EMBO J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参
照〕、マイクロコッカッス・ルテウス（Micrococcus lu
teus）由来のもの〔ジーン（Gene）、93、73〜78 (199
0) 参照〕、ストレプトミセス・リビダンス（Storeptom
yces lividans）由来のもの〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Journal of Bacteriology ）、174 、26
88〜2693 (1992) 参照〕等がよく研究されている。
【０００３】しかしながら、産業上重要なコリネ型細菌
由来のａｒｓ領域については本発明者らの知る限り、従
来の報告例はない。
由来のａｒｓ領域については本発明者らの知る限り、従
来の報告例はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌内に低コピー数で存在し自律複製するベクターの造成
に利用可能な、コリネ型細菌染色体由来のａｒｓ領域を
含むＤＮＡ断片を提供するためになされたものである。
菌内に低コピー数で存在し自律複製するベクターの造成
に利用可能な、コリネ型細菌染色体由来のａｒｓ領域を
含むＤＮＡ断片を提供するためになされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、コリ
ネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有する領域
（ａｒｓ領域）を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が導入
されたコリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ及び
該環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌を
提供するものである。
ネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有する領域
（ａｒｓ領域）を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が導入
されたコリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ及び
該環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌を
提供するものである。
【０００６】本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断片を用いるこ
とにより、コリネ型細菌内で自律複製し、低コピー数、
すなわち１〜２コピー数で存在しうる環状ＤＮＡを造成
することができる。この環状ＤＮＡベクターは、プラス
ミドベクター、ファージベクターと同様に遺伝子のクロ
ーニング等に有効である。また、特に宿主細胞に悪影響
を与える遺伝子のクローニング等に利用可能であると考
えられる。
とにより、コリネ型細菌内で自律複製し、低コピー数、
すなわち１〜２コピー数で存在しうる環状ＤＮＡを造成
することができる。この環状ＤＮＡベクターは、プラス
ミドベクター、ファージベクターと同様に遺伝子のクロ
ーニング等に有効である。また、特に宿主細胞に悪影響
を与える遺伝子のクローニング等に利用可能であると考
えられる。
【０００７】以下に、本発明の断片について詳細に説明
する。本発明のａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片（以下これ
を「ａｒｓ領域ＤＮＡ断片」ということがある）は、そ
の塩基配列が決定された後においては合成することも可
能であるが、通常はコリネ型細菌染色体からクローニン
グされる。
する。本発明のａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片（以下これ
を「ａｒｓ領域ＤＮＡ断片」ということがある）は、そ
の塩基配列が決定された後においては合成することも可
能であるが、通常はコリネ型細菌染色体からクローニン
グされる。
【０００８】ここで、「コリネ型細菌（Coryneform bac
teria ）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー〔（Bargeys Manual o
f Determinative Bacteriology) 、8 、599 （1974) 〕
に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム
陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、
その具体例として、例えばブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 687
1、ブレビバクテリウム・デイバリカタム (Brevibacter
ium divaricatum) ATCC 14020、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム (Brevibacterium lactofermentu
m) ATCC 13869 、ブレビバクテリウム・リネンス (Brev
ibacterium linens) ATCC 9174、ブレビバクテリウム・
フラバム (Brevibacterium flavum) ATCC 13826 、ブレ
ビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum) M
J-233 （FERM BP-1497) 、コリネバクテリウム・グルタ
ミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032、同
ATCC 13060、コリネバクテリウム・リリウム (Coryneba
cterium lilium) ATCC 15990、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ (Corynebacterium melassecola) ATCC 17965
等を挙げることができる。
teria ）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー〔（Bargeys Manual o
f Determinative Bacteriology) 、8 、599 （1974) 〕
に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム
陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、
その具体例として、例えばブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 687
1、ブレビバクテリウム・デイバリカタム (Brevibacter
ium divaricatum) ATCC 14020、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム (Brevibacterium lactofermentu
m) ATCC 13869 、ブレビバクテリウム・リネンス (Brev
ibacterium linens) ATCC 9174、ブレビバクテリウム・
フラバム (Brevibacterium flavum) ATCC 13826 、ブレ
ビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum) M
J-233 （FERM BP-1497) 、コリネバクテリウム・グルタ
ミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032、同
ATCC 13060、コリネバクテリウム・リリウム (Coryneba
cterium lilium) ATCC 15990、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ (Corynebacterium melassecola) ATCC 17965
等を挙げることができる。
【０００９】これらコリネ型細菌に属する微生物の中
で、ａｒｓ領域ＤＮＡ断片の供給源としては、殊にブレ
ビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)Ｍ
Ｊ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由
来株が有利に利用される。本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断
片は、上記コリネ型細菌染色体上に存在し、コリネ型細
菌から抽出した染色体ＤＮＡ（特開平４−２７８０８
８、実施例２参照）を鋳型として適当なプライマーを選
択して、ＰＣＲ反応により増幅させることにより、取得
することができる。
で、ａｒｓ領域ＤＮＡ断片の供給源としては、殊にブレ
ビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)Ｍ
Ｊ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由
来株が有利に利用される。本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断
片は、上記コリネ型細菌染色体上に存在し、コリネ型細
菌から抽出した染色体ＤＮＡ（特開平４−２７８０８
８、実施例２参照）を鋳型として適当なプライマーを選
択して、ＰＣＲ反応により増幅させることにより、取得
することができる。
【００１０】微生物染色体の自律複製配列を有するＤＮ
Ａ領域であるａｒｓ領域は、微生物染色体の複製開始点
（ｏｒｉＣ）を含み、エシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、74、5458 〜546
2 （1977）参照〕、シュードモナス・プチダ （Pseudom
onas putida）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル
・ジェネティックス（Mol. Gen. Genet.）、215、381
〜 387 （1979）参照〕、バチルス・サチルス（Bacillu
s subtilis ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（EMBO
J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参照〕、マイクロコッ
カッス・ルテウス（Micrococcus luteus）由来のもの
〔ジーン（Gene）、93、73〜78 (1990) 参照〕等がよく
研究されており、塩基配列が決定されている。これら４
種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩基配列の解析の結
果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒｐｍＨ遺伝子とｄ
ｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在するｄｎａＡ遺伝
子の近傍に存在することが示されている。そこで、これ
ら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａ
Ａ、ＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間
で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても
特に保存されている領域を検討し、適当なプライマーを
設計し、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣ
Ｒ法により、ａｒｓ領域を増幅し、取得することができ
る。
Ａ領域であるａｒｓ領域は、微生物染色体の複製開始点
（ｏｒｉＣ）を含み、エシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、74、5458 〜546
2 （1977）参照〕、シュードモナス・プチダ （Pseudom
onas putida）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル
・ジェネティックス（Mol. Gen. Genet.）、215、381
〜 387 （1979）参照〕、バチルス・サチルス（Bacillu
s subtilis ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（EMBO
J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参照〕、マイクロコッ
カッス・ルテウス（Micrococcus luteus）由来のもの
〔ジーン（Gene）、93、73〜78 (1990) 参照〕等がよく
研究されており、塩基配列が決定されている。これら４
種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩基配列の解析の結
果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒｐｍＨ遺伝子とｄ
ｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在するｄｎａＡ遺伝
子の近傍に存在することが示されている。そこで、これ
ら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａ
Ａ、ＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間
で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても
特に保存されている領域を検討し、適当なプライマーを
設計し、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣ
Ｒ法により、ａｒｓ領域を増幅し、取得することができ
る。
【００１１】このようにして得られるａｒｓ領域ＤＮＡ
断片の１つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｒｐｍＨ遺伝子
のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマー、例
えば下記ＲＰＭＨ−１及びｄｎａＮ遺伝子のＤＮＡ塩基
配列に基づいて設計されたプライマー、例えば下記ＤＮ
ＡＮ−１の２種のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によ
り増幅させることによって得られる大きさが約３．５ｋ
ｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ｃ断片」ということがあ
る）をあげることができる。
断片の１つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｒｐｍＨ遺伝子
のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマー、例
えば下記ＲＰＭＨ−１及びｄｎａＮ遺伝子のＤＮＡ塩基
配列に基づいて設計されたプライマー、例えば下記ＤＮ
ＡＮ−１の２種のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によ
り増幅させることによって得られる大きさが約３．５ｋ
ｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ｃ断片」ということがあ
る）をあげることができる。
【００１２】 （ＲＰＭＨ−１）ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＴＴ ＲＴＴＮＧ ＧＹＴＧＲ ＡＡＮＧＴ ＮＣＫＹＴ Ｔ （３１ｍｅｒ） （ＤＮＡＮ−１）ＧＧＧＴＣ ＧＡＣＧＣ ＭＡＧＶＣ ＧＧＴＲＲ ＣＢＲＴＣ ＳＧＴＫＧ Ｃ （３１ｍｅｒ） （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＫはＴ又は
Ｇ、ＳはＧ又はＣ、ＭはＣ又はＡ、ＶはＡ、Ｇ、又は
Ｃ、ＢはＧ、Ｃ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。
ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシン、
Ｔはチミンを示す。） このａｒｓ領域ＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断し
た時の認識部位数及び切断断片の大きさを第１表に、そ
の制限酵素切断点地図を図１に示す。
Ｇ、ＳはＧ又はＣ、ＭはＣ又はＡ、ＶはＡ、Ｇ、又は
Ｃ、ＢはＧ、Ｃ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。
ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシン、
Ｔはチミンを示す。） このａｒｓ領域ＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断し
た時の認識部位数及び切断断片の大きさを第１表に、そ
の制限酵素切断点地図を図１に示す。
【００１３】
【表１】 第１表 大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＥｃｏＲＩ ３ １．１、１．０、０．９、０．５ ＨｉｎｄＩＩＩ ４ １．８、１．４、０．１６、０．０７、０ ．０７ ＳａｌＩ １ ２．３、１．２
【００１４】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。
【００１５】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片の各ＤＮＡ断片の大きさを算出す
る。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片の各ＤＮＡ断片の大きさを算出す
る。
【００１６】上記した大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮ
Ａ断片は、そのままａｒｓ領域ＤＮＡ断片として利用す
ることができるが、更に次に述べる方法により複製に必
要なＤＮＡ領域に縮小化後に利用することもできる。す
なわち、前記したとおり、ａｒｓ領域は、ｄｎａＡ遺伝
子の上流及び下流にそれぞれｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ
遺伝子に挟まれる形で存在しており、ｄｎａＡ遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマー
と、前記したｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づい
て設計された適当なプライマー及びｄｎａＮ遺伝子のＤ
ＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーを
それぞれ用いて、前記ＭＪ−２３３株染色体ＤＮＡまた
は大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし
て、ＰＣＲ法により、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に
存在するｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を増幅することに
より、縮小化されたｏｒｉＣ領域を取得することができ
る。
Ａ断片は、そのままａｒｓ領域ＤＮＡ断片として利用す
ることができるが、更に次に述べる方法により複製に必
要なＤＮＡ領域に縮小化後に利用することもできる。す
なわち、前記したとおり、ａｒｓ領域は、ｄｎａＡ遺伝
子の上流及び下流にそれぞれｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ
遺伝子に挟まれる形で存在しており、ｄｎａＡ遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマー
と、前記したｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づい
て設計された適当なプライマー及びｄｎａＮ遺伝子のＤ
ＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーを
それぞれ用いて、前記ＭＪ−２３３株染色体ＤＮＡまた
は大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし
て、ＰＣＲ法により、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に
存在するｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を増幅することに
より、縮小化されたｏｒｉＣ領域を取得することができ
る。
【００１７】上記で用いるｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基
配列に基づいて設計された適当なプライマーとしては、
例えば、下記ＤＮＡＡ−３及びＤＮＡＡ−４の２種のプ
ライマーを挙げることができる。 （ＤＮＡＡ−３）ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＧＴ ＴＧＡＡＧ ＧＴＡＴＧ ＧＡＡＧＡ Ａ （３１ｍｅｒ） （ＤＮＡＡ−４）ＧＧＧＴＣ ＧＡＣＴＧ ＣＣＡＧＣ ＣＧＣＴＴ ＴＧＡＡＴ Ｃ （３１ｍｅｒ） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
配列に基づいて設計された適当なプライマーとしては、
例えば、下記ＤＮＡＡ−３及びＤＮＡＡ−４の２種のプ
ライマーを挙げることができる。 （ＤＮＡＡ−３）ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＧＴ ＴＧＡＡＧ ＧＴＡＴＧ ＧＡＡＧＡ Ａ （３１ｍｅｒ） （ＤＮＡＡ−４）ＧＧＧＴＣ ＧＡＣＴＧ ＣＣＡＧＣ ＣＧＣＴＴ ＴＧＡＡＴ Ｃ （３１ｍｅｒ） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）
【００１８】かくして得られる縮小化されたｏｒｉＣ領
域の部分ＤＮＡ断片としては、例えば、上記ＲＰＭＨ−
１とＤＮＡＡ−３の２種のプライマーを用いて増幅され
る大きさ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ａ断
片」ということがある）、このＤＮＡ断片を制限酵素Ｓ
ａｌＩで分解して得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片（以下これを「Ｄ断片」ということがある）、上
記ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−２の２種のプライマーを用
いて増幅される大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。
域の部分ＤＮＡ断片としては、例えば、上記ＲＰＭＨ−
１とＤＮＡＡ−３の２種のプライマーを用いて増幅され
る大きさ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ａ断
片」ということがある）、このＤＮＡ断片を制限酵素Ｓ
ａｌＩで分解して得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片（以下これを「Ｄ断片」ということがある）、上
記ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−２の２種のプライマーを用
いて増幅される大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。
【００１９】これら大きさが約１．７ｋｂ、約１．２ｋ
ｂ及び約１．５ｋｂのｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を各
種の制限酵素で切断した時の認識部位数及び切断断片の
大きさを第２表〜第４表及び図２〜図３にそれぞれ示
す。
ｂ及び約１．５ｋｂのｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を各
種の制限酵素で切断した時の認識部位数及び切断断片の
大きさを第２表〜第４表及び図２〜図３にそれぞれ示
す。
【００２０】
【表２】第２表 大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＢａｍＨＩ ０ １．７ ＥｃｏＲＩ ２ １．０、１．５、０．２ ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．４、０．２、０．１ ＳａｌＩ １ １．２、０．５
【００２１】
【表３】第３表 大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＢａｍＨＩ ０ １．２ ＥｃｏＲＩ １ ０．７、０．５ ＨｉｎｄＩＩＩ ０ １．２ ＳａｌＩ ０ １．２
【００２２】
【表４】第４表 大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＢａｍＨＩ １ １．２、０．３ ＥｃｏＲＩ １ ０．９、０．６ ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．２、０．２、０．１ ＰｖｕＩＩ ２ ０．７ ０．５ ０．３ ＳａｌＩ ０ １．５ ＸｈｏＩ １ ０．９、０．６
【００２３】上記ＤＮＡ断片は、その塩基配列をジデオ
キシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination
法）〔Sanger F. et al.、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー
・エス・エー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA）、74、546
3、(1977)〕等により決定することができる。このよう
にして決定した上記大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｃ断片）の配列を後記配列表の配列番号１に示す。こ
の配列中に存在するオープンリーディングフレームか
ら、ｄｎａＡ遺伝子は、配列中のアミノ酸番号１からア
ミノ酸番号４６３までのアミノ酸配列をコードするもの
であることが明らかとなった。上記の複製開始領域を含
むＤＮＡ断片は、天然の細菌染色体ＤＮＡ、例えばコリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製
システム−１プラス（System-1 Plus）を用いて合成さ
れたものであってもよい。また、前記の如くブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３等の細菌染色体から取
得される本発明のＤＮＡ断片は、コリネ型細菌等の細胞
内での複製開始能実質的に損なうことがない限り、塩基
配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていても、削除
されていてもよく、新たに塩基が挿入されていてもよ
く、あるいは塩基配列の一部が転移されているものであ
ってもよく、さらにそれらの塩基配列にハイブリダイズ
する塩基配列であってもよく、これらの誘導体のいずれ
もが、本発明の染色体複製開始領域を含むＤＮＡ断片に
包含されるものである。
キシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination
法）〔Sanger F. et al.、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー
・エス・エー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA）、74、546
3、(1977)〕等により決定することができる。このよう
にして決定した上記大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｃ断片）の配列を後記配列表の配列番号１に示す。こ
の配列中に存在するオープンリーディングフレームか
ら、ｄｎａＡ遺伝子は、配列中のアミノ酸番号１からア
ミノ酸番号４６３までのアミノ酸配列をコードするもの
であることが明らかとなった。上記の複製開始領域を含
むＤＮＡ断片は、天然の細菌染色体ＤＮＡ、例えばコリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製
システム−１プラス（System-1 Plus）を用いて合成さ
れたものであってもよい。また、前記の如くブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３等の細菌染色体から取
得される本発明のＤＮＡ断片は、コリネ型細菌等の細胞
内での複製開始能実質的に損なうことがない限り、塩基
配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていても、削除
されていてもよく、新たに塩基が挿入されていてもよ
く、あるいは塩基配列の一部が転移されているものであ
ってもよく、さらにそれらの塩基配列にハイブリダイズ
する塩基配列であってもよく、これらの誘導体のいずれ
もが、本発明の染色体複製開始領域を含むＤＮＡ断片に
包含されるものである。
【００２４】上記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片を用いて環状Ｄ
ＮＡベクターの構築に用いる場合、ｄｎａＡ遺伝子の上
流及び下流に由来する２種のＤＮＡ断片、すなわち上記
大きさが約１．７ｋｂ又は１．２ｋｂのＤＮＡ断片及び
大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を用いることも可能
である。
ＮＡベクターの構築に用いる場合、ｄｎａＡ遺伝子の上
流及び下流に由来する２種のＤＮＡ断片、すなわち上記
大きさが約１．７ｋｂ又は１．２ｋｂのＤＮＡ断片及び
大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を用いることも可能
である。
【００２５】環状ＤＮＡベクターの構築に用いられる前
記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片に導入されるマーカーＤＮＡ断
片としては、コリネ型細菌内でマーカーとして働く遺伝
子を含有しているものであれば特に制限はなく、カナマ
イシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ２９
８、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）、クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ３９８、ｐ
ＨＳＧ３９９（宝酒造製）等が好適に使用される。
記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片に導入されるマーカーＤＮＡ断
片としては、コリネ型細菌内でマーカーとして働く遺伝
子を含有しているものであれば特に制限はなく、カナマ
イシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ２９
８、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）、クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ３９８、ｐ
ＨＳＧ３９９（宝酒造製）等が好適に使用される。
【００２６】上記マーカーＤＮＡ断片の前記ａｒｓ領域
ＤＮＡ断片への導入は、例えば、まずプラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８を適当な制限酵素により解裂させ、それに前記
したａｒｓ領域ＤＮＡ断片を連結酵素処理により結合さ
せることにより行なう。ａｒｓ領域ＤＮＡ断片が部分Ｄ
ＮＡ断片である場合は、前記したｄｎａＡ遺伝子の上流
及び下流に存在するａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片が導入さ
れた各プラスミドからａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片を切り
出すか又はプラスミドを解裂し、連結酵素処理により結
合させることにより行なう。
ＤＮＡ断片への導入は、例えば、まずプラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８を適当な制限酵素により解裂させ、それに前記
したａｒｓ領域ＤＮＡ断片を連結酵素処理により結合さ
せることにより行なう。ａｒｓ領域ＤＮＡ断片が部分Ｄ
ＮＡ断片である場合は、前記したｄｎａＡ遺伝子の上流
及び下流に存在するａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片が導入さ
れた各プラスミドからａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片を切り
出すか又はプラスミドを解裂し、連結酵素処理により結
合させることにより行なう。
【００２７】このようにして構築される環状ＤＮＡベク
ターとしては、例えば、大きさが２．７ｋｂのプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片にｄｎａＡ遺伝子の上流に
存在する大きさが１．２ｋｂのＤＮＡ断片および、ｄｎ
ａＡ遺伝子の下流に存在する大きさが１．５ｋｂのＤＮ
Ａ断片が挿入された環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８
−ｏｒｉＣを挙げることができる。この環状ＤＮＡベク
ターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの構築方法の詳細は後記
実施例２で述べる。
ターとしては、例えば、大きさが２．７ｋｂのプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片にｄｎａＡ遺伝子の上流に
存在する大きさが１．２ｋｂのＤＮＡ断片および、ｄｎ
ａＡ遺伝子の下流に存在する大きさが１．５ｋｂのＤＮ
Ａ断片が挿入された環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８
−ｏｒｉＣを挙げることができる。この環状ＤＮＡベク
ターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの構築方法の詳細は後記
実施例２で述べる。
【００２８】本発明による環状ＤＮＡベクターで形質転
換し得る微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９９）等が挙げられる。
換し得る微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９９）等が挙げられる。
【００２９】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)
ATCC 6871、同 ATCC 13745 、同 ATCC 13746 、ブレビ
バクテリウム・デイバリカタム (Brevibacterium divar
icatum) ATCC 14020、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム (Brevibacterium lactofermentum) ATCC138
69 、コリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacte
rium glutamicum) ATCC 31831等を宿主微生物として用
いることもできる。
ム・アンモニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)
ATCC 6871、同 ATCC 13745 、同 ATCC 13746 、ブレビ
バクテリウム・デイバリカタム (Brevibacterium divar
icatum) ATCC 14020、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム (Brevibacterium lactofermentum) ATCC138
69 、コリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacte
rium glutamicum) ATCC 31831等を宿主微生物として用
いることもできる。
【００３０】尚、宿主としてブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３株由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３ー３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔バクテリオロジカル・レビュー（Bact. Rev.) 、36、
361 〜405 （1972）参照〕。
バムＭＪ−２３３株由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３ー３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔バクテリオロジカル・レビュー（Bact. Rev.) 、36、
361 〜405 （1972）参照〕。
【００３１】上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３への前記プラスミドの形
質転換（前記プラスミドの導入）は、ＤＮＡ受容菌にパ
ルス波を通電することにより〔Satoh Y. et al. 、ジャ
ーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジ
ー（Journal of Industrial Microbiology) 、5 、159
(1990) 参照〕行なうことができる。
リウム・フラバムＭＪ−２３３への前記プラスミドの形
質転換（前記プラスミドの導入）は、ＤＮＡ受容菌にパ
ルス波を通電することにより〔Satoh Y. et al. 、ジャ
ーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジ
ー（Journal of Industrial Microbiology) 、5 、159
(1990) 参照〕行なうことができる。
【００３２】かくして得られる形質転換株を選択圧下で
培養し、生成するコロニーを取得することにより、本発
明の環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌
を得ることができる。上記の方法で形質転換して得られ
る環状ＤＮＡベクターを保有するコリネ型細菌として
は、例えば、前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ
を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ｏｒｉＣ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）を挙げることが
できる。
培養し、生成するコロニーを取得することにより、本発
明の環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌
を得ることができる。上記の方法で形質転換して得られ
る環状ＤＮＡベクターを保有するコリネ型細菌として
は、例えば、前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ
を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ｏｒｉＣ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）を挙げることが
できる。
【００３３】本発明の上記コリネ型細菌、例えばブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在
する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）
の確認は、例えば、該形質転換株及び比較として親株、
例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤ
ＮＡ抽出液を、常法〔モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning ) 、Cold Spring Harbor Laboratory
Press （1989）〕に従いゲノミックスサザンハイブリダ
イゼーションに供し、ａｒｓ領域の検出を行うことによ
り可能である。この時プローブとしては、前期のＰＣＲ
法により増幅したＤＮＡ断片を、ランダムラベルキット
（宝酒造より市販）等によりラベルしたものを用いるこ
とができる。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出液、およ
び、比較例として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３のＤＮＡ抽出液を鋳型とし、前期４種の微生物
のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡ、ＲｐｍＨお
よびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されてい
る領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されて
いる領域をもとに設計したプライマーを用い、前述の方
法に従ってＰＣＲ反応を行い、得られた反応液をアガロ
ースゲル電気泳動により解析することによりブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する
環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）を確
認することができる。
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在
する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）
の確認は、例えば、該形質転換株及び比較として親株、
例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤ
ＮＡ抽出液を、常法〔モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning ) 、Cold Spring Harbor Laboratory
Press （1989）〕に従いゲノミックスサザンハイブリダ
イゼーションに供し、ａｒｓ領域の検出を行うことによ
り可能である。この時プローブとしては、前期のＰＣＲ
法により増幅したＤＮＡ断片を、ランダムラベルキット
（宝酒造より市販）等によりラベルしたものを用いるこ
とができる。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出液、およ
び、比較例として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３のＤＮＡ抽出液を鋳型とし、前期４種の微生物
のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡ、ＲｐｍＨお
よびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されてい
る領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されて
いる領域をもとに設計したプライマーを用い、前述の方
法に従ってＰＣＲ反応を行い、得られた反応液をアガロ
ースゲル電気泳動により解析することによりブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する
環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）を確
認することができる。
【００３４】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。 参考例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来のｄｎａＡ遺伝子断片の一部（ｄｎａＡ断片）のク
ローン化
例によりさらに具体的に説明する。 参考例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来のｄｎａＡ遺伝子断片の一部（ｄｎａＡ断片）のク
ローン化
【００３５】（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4
７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、
カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２
００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１１〕１ｌに、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチ
ームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍ
ｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１０
０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温
した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．
５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌
した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム
溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、
全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１
２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３
Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮ
Ａをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌ
を加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ
に使用した。
−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4
７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、
カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２
００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１１〕１ｌに、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチ
ームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍ
ｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１０
０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温
した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．
５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌
した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム
溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、
全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１
２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３
Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮ
Ａをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌ
を加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ
に使用した。
【００３６】（Ｂ）ＰＣＲプライマーの設計 ｄｎａＡ遺伝子は原核生物では、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli ）由来のもの〔プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、7
4、5458 〜 5462（1977）参照〕、シュードモナス・プ
チダ （Pseudomonas putida）由来のもの〔モレキュラ
ー・ジェネラル・ジェネティックス（Mol. Gen. Gene
t.）、215、381 〜 387 （1979）参照〕、バチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis ）由来のもの〔エンボ・ジ
ャーナル（EMBO J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参
照〕、マイクロコッカス・ルテウス由来のもの〔ジーン
（Gene）、93、73〜78 (1990) 参照〕がよく研究されて
おり、塩基配列が決定されている。これら５種の微生物
のｄｎａＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡタンパク質
アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基
配列においても特に保存されている領域を検討し、下記
の２つのプライマーを設計し、アプライド・バイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製
３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
（Escherichia coli ）由来のもの〔プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、7
4、5458 〜 5462（1977）参照〕、シュードモナス・プ
チダ （Pseudomonas putida）由来のもの〔モレキュラ
ー・ジェネラル・ジェネティックス（Mol. Gen. Gene
t.）、215、381 〜 387 （1979）参照〕、バチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis ）由来のもの〔エンボ・ジ
ャーナル（EMBO J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参
照〕、マイクロコッカス・ルテウス由来のもの〔ジーン
（Gene）、93、73〜78 (1990) 参照〕がよく研究されて
おり、塩基配列が決定されている。これら５種の微生物
のｄｎａＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡタンパク質
アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基
配列においても特に保存されている領域を検討し、下記
の２つのプライマーを設計し、アプライド・バイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製
３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００３７】 （ＤＮＡＡ−１）ＧＧＹＹＴ ＲＧＧＭＡ ＡＲＡＣＭ ＣＡＣＹＴ （２０ ｍｅｒ） （ＤＮＡＡ−２）ＲＡＹＧＣ ＭＣＣＹＴ ＣＭＡＧＹ ＴＭＡＣＧ （２０ ｍｅｒ） （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＭはＡ、Ｇ、
Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、
Ｃ はシトシン、Ｔはチミンを示す。）
Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、
Ｃ はシトシン、Ｔはチミンを示す。）
【００３８】これら２つのプライマーを用いて上記
（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体上
のｄｎａＡ遺伝子部分の増幅により、約５００ｂｐのＰ
ＣＲ反応産物が得られると期待される。
（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体上
のｄｎａＡ遺伝子部分の増幅により、約５００ｂｐのＰ
ＣＲ反応産物が得られると期待される。
【００３９】（Ｃ）ＰＣＲ反応 実際のＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤ
ＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。 反応液： ５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 鋳型ＤＮＡ ５μｌ 上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔ
ｓ 以上を混合し、１００μｌとした。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：３７℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
ＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。 反応液： ５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 鋳型ＤＮＡ ５μｌ 上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔ
ｓ 以上を混合し、１００μｌとした。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：３７℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【００４０】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行ったところ約５００ｂｐの断片
が検出された。
ゲルにより電気泳動を行ったところ約５００ｂｐの断片
が検出された。
【００４１】（Ｅ）増幅断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌとＰＣＲ産物クローニ
ングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）
１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ 2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
ングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）
１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ 2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００４２】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）、53、159 （19
70）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗
抹した。
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）、53、159 （19
70）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗
抹した。
【００４３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ約５００ｂｐの挿入断片が認められ
た。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ約５００ｂｐの挿入断片が認められ
た。
【００４４】（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定 参考例１の（Ｅ）項で得られた長さが約５００ｂｐの増
幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチ
ド酵素法（dideozychain termination法）〔Sanger F.
et al.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Pr
oc．Nat ．Acad．Sci ．USA ）、74、5463（1977）〕に
より決定した。
幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチ
ド酵素法（dideozychain termination法）〔Sanger F.
et al.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Pr
oc．Nat ．Acad．Sci ．USA ）、74、5463（1977）〕に
より決定した。
【００４５】塩基配列決定の結果、該挿入断片はマイク
ロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ断片の一部（ＰＣ
Ｒに使用したプライマーによって挟まれる領域）と高い
ホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部をクローニングした
ことを確認した。
ロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ断片の一部（ＰＣ
Ｒに使用したプライマーによって挟まれる領域）と高い
ホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部をクローニングした
ことを確認した。
【００４６】実施例１ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来のａｒｓ領域ＤＮＡ断片のクローン化 （Ａ）ＰＣＲプライマーの設計 微生物染色体の複製に必要とされるＤＮＡ領域であるａ
ｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli
）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、74、5458 〜 5462
（1977）参照〕、シュードモナス・プチダ （Pseudomon
as putida）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・
ジェネティックス（Mol. Gen. Genet.）、215、381 〜
387 （1979）参照〕、バチルス・サチルス（Bacillus s
ubtilis ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（EMBO
J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参照〕、マイクロコッカ
ス・ルテウス由来のもの〔ジーン（Gene）、93、73〜78
(1990) 参照〕がよく研究されており塩基配列が決定さ
れている。これら４種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩
基配列の解析の結果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒ
ｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在
するｄｎａＡ遺伝子の近傍に存在することが示されてい
る。そこで、これら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より
推定されるＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸
配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列にお
いても特に保存されている領域を検討し、ｒｐｍＨ遺伝
子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した下記プライマー
ＲＰＭＨ−１及びｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基
づいて設計した下記プライマーＤＮＡＮ−１の２つのプ
ライマーを設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ｒ）を用いて合成した。
ＭＪ−２３３由来のａｒｓ領域ＤＮＡ断片のクローン化 （Ａ）ＰＣＲプライマーの設計 微生物染色体の複製に必要とされるＤＮＡ領域であるａ
ｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli
）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、74、5458 〜 5462
（1977）参照〕、シュードモナス・プチダ （Pseudomon
as putida）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・
ジェネティックス（Mol. Gen. Genet.）、215、381 〜
387 （1979）参照〕、バチルス・サチルス（Bacillus s
ubtilis ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（EMBO
J.）、 4、3345〜3350 (1985) 参照〕、マイクロコッカ
ス・ルテウス由来のもの〔ジーン（Gene）、93、73〜78
(1990) 参照〕がよく研究されており塩基配列が決定さ
れている。これら４種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩
基配列の解析の結果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒ
ｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在
するｄｎａＡ遺伝子の近傍に存在することが示されてい
る。そこで、これら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より
推定されるＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸
配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列にお
いても特に保存されている領域を検討し、ｒｐｍＨ遺伝
子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した下記プライマー
ＲＰＭＨ−１及びｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基
づいて設計した下記プライマーＤＮＡＮ−１の２つのプ
ライマーを設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ｒ）を用いて合成した。
【００４７】 （ＲＰＭＨ−１）ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＴＴ ＲＴＴＮＧ ＧＹＴＧＲ ＡＡＮＧＴ ＮＣＫＹＴ Ｔ （３１ｍｅｒ） （ＤＮＡＮ−１）ＧＧＧＴＣ ＧＡＣＧＣ ＭＡＧＶＣ ＧＧＴＲＲ ＣＢＲＴＣ ＳＧＴＫＧ Ｃ （３１ｍｅｒ） （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＫはＴ又は
Ｇ、ＳはＧ又はＣ、ＭはＣ又はＡ、ＶはＡ、Ｇ、又は
Ｃ、ＢはＧ、Ｃ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。
Ｇ、ＳはＧ又はＣ、ＭはＣ又はＡ、ＶはＡ、Ｇ、又は
Ｃ、ＢはＧ、Ｃ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。
【００４８】ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃは
シトシン、Ｔはチミンを示す。） なお、ＲＰＭＨ−１の５’末端にはクローニングサイト
として制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＮ−１の
５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素Ｓａｌ
Ｉ認識部位をを付加した。
シトシン、Ｔはチミンを示す。） なお、ＲＰＭＨ−１の５’末端にはクローニングサイト
として制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＮ−１の
５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素Ｓａｌ
Ｉ認識部位をを付加した。
【００４９】また、参考例１の（Ｆ）で明らかになった
ｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもとに、下記の２つ
のプライマーを設計し、上記と同様に合成した。 （ＤＮＡＡ−３）ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＧＴ ＴＧＡＡＧ ＧＴＡＴＧ ＧＡＡＧＡ Ａ （３１ｍｅｒ） （ＤＮＡＡ−４）ＧＧＧＴＣ ＧＡＣＴＧ ＣＣＡＧＣ ＣＧＣＴＴ ＴＧＡＡＴ Ｃ （３１ｍｅｒ） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。） なお、ＤＮＡＡ−３の５’末端にはクローニングサイト
として制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＡ−４の
５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素Ｓａｌ
Ｉ認識部位を付加した。
ｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもとに、下記の２つ
のプライマーを設計し、上記と同様に合成した。 （ＤＮＡＡ−３）ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＧＴ ＴＧＡＡＧ ＧＴＡＴＧ ＧＡＡＧＡ Ａ （３１ｍｅｒ） （ＤＮＡＡ−４）ＧＧＧＴＣ ＧＡＣＴＧ ＣＣＡＧＣ ＣＧＣＴＴ ＴＧＡＡＴ Ｃ （３１ｍｅｒ） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。） なお、ＤＮＡＡ−３の５’末端にはクローニングサイト
として制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＡ−４の
５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素Ｓａｌ
Ｉ認識部位を付加した。
【００５０】これら４つのプライマーを用いて参考例１
の（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行っ
た。プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により全ｄ
ｎａＡ遺伝子を含むｏｒｉＣ領域全体が、ＲＰＭＨ−１
とＤＮＡＡ−３によりｄｎａＡ遺伝子上流領域が、ＤＮ
ＡＡ−４とＤＮＡＮ−１によりｄｎａＡ遺伝子下流領域
がＰＣＲ反応産物として得られると期待される。
の（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行っ
た。プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により全ｄ
ｎａＡ遺伝子を含むｏｒｉＣ領域全体が、ＲＰＭＨ−１
とＤＮＡＡ−３によりｄｎａＡ遺伝子上流領域が、ＤＮ
ＡＡ−４とＤＮＡＮ−１によりｄｎａＡ遺伝子下流領域
がＰＣＲ反応産物として得られると期待される。
【００５１】（Ｂ）ＰＣＲ反応 参考例の（Ｃ）の方法に従いＰＣＲ反応を行った。 （Ｃ）反応物の検出 上記（Ｂ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行ったところ、プライマーＲＰＭ
Ｈ−１とＤＮＡＮ−１により約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｃ断片）の増幅が、ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３によ
り約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）の増幅が、ＤＮ
ＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５ｋｂのＤＮＡ断
片（Ｂ断片）の増幅が検出された。また、プライマーＲ
ＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により増幅した約３．５ｋｂ
のＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲをおこなった場合、染
色体を鋳型として用いた場合と同じように、プライマー
ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により約１．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５
ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。
ゲルにより電気泳動を行ったところ、プライマーＲＰＭ
Ｈ−１とＤＮＡＮ−１により約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｃ断片）の増幅が、ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３によ
り約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）の増幅が、ＤＮ
ＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５ｋｂのＤＮＡ断
片（Ｂ断片）の増幅が検出された。また、プライマーＲ
ＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により増幅した約３．５ｋｂ
のＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲをおこなった場合、染
色体を鋳型として用いた場合と同じように、プライマー
ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により約１．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５
ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。
【００５２】プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１に
より増幅された大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ
断片）、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により
増幅された大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断
片）、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩにより切断し
て得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断
片）、プライマーＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により増
幅された大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）
のそれぞれを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果は、前記第１表〜第３表に示し
た通りであった。これらＤＮＡ断片の制限酵素切断点地
図及び各ＤＮＡ断片の相互関連を図１〜図３に示す。
より増幅された大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ
断片）、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により
増幅された大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断
片）、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩにより切断し
て得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断
片）、プライマーＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により増
幅された大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）
のそれぞれを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果は、前記第１表〜第３表に示し
た通りであった。これらＤＮＡ断片の制限酵素切断点地
図及び各ＤＮＡ断片の相互関連を図１〜図３に示す。
【００５３】（Ｄ）増幅ＤＮＡ断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得られたＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで
切断したものに、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したカナマ
イシン耐性プラスミドｐＨＳＧ２９８を混合し、５０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイ
トール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 及びＴ
4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分
の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、
結合させた。
切断したものに、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したカナマ
イシン耐性プラスミドｐＨＳＧ２９８を混合し、５０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイ
トール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 及びＴ
4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分
の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、
結合させた。
【００５４】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）、53、159 （19
70）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗
抹した。
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）、53、159 （19
70）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗
抹した。
【００５５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８
のＤＮＡ断片に加え、大きさ約１．７ｋｂの挿入ＤＮＡ
断片（Ａ断片）が認められた。このプラスミドをｐＨＳ
Ｇ２９８−Ａ１と命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８
のＤＮＡ断片に加え、大きさ約１．７ｋｂの挿入ＤＮＡ
断片（Ａ断片）が認められた。このプラスミドをｐＨＳ
Ｇ２９８−Ａ１と命名した。
【００５６】また、上記（Ｃ）項で得られたＢ断片を、
前記の方法に従いｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市
販）にクローニングした。得られたプラスミドを制限酵
素ＳａｌＩにより切断し、挿入断片を確認した。この結
果、大きさが約３．０ｋｂのプラスミドｐＧＥＭ−ＴＤ
ＮＡ断片に加え、大きさが約１．５ｋｂの挿入断片（Ｂ
断片）が認められた。このプラスミドをｐＧＥＭ−Ｂ１
と命名した。
前記の方法に従いｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市
販）にクローニングした。得られたプラスミドを制限酵
素ＳａｌＩにより切断し、挿入断片を確認した。この結
果、大きさが約３．０ｋｂのプラスミドｐＧＥＭ−ＴＤ
ＮＡ断片に加え、大きさが約１．５ｋｂの挿入断片（Ｂ
断片）が認められた。このプラスミドをｐＧＥＭ−Ｂ１
と命名した。
【００５７】（Ｅ）増幅ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 上記（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−Ａ
１及びｐＧＥＭ−Ｂ１に含まれるＡ断片およびＢ断片に
ついて、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法
（dideozychain termination法）〔Sanger F. et al.、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Proc．Nat
．Acad．Sci ．USA ）、74、5463（1977）〕により決
定した。
１及びｐＧＥＭ−Ｂ１に含まれるＡ断片およびＢ断片に
ついて、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法
（dideozychain termination法）〔Sanger F. et al.、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Proc．Nat
．Acad．Sci ．USA ）、74、5463（1977）〕により決
定した。
【００５８】塩基配列決定の結果、Ａ断片は一方にｒｐ
ｍＨ遺伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ル
テウス由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを
示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のｄｎａＡ断片の一部及びその上流領域をクローニング
したことを確認した。また、Ｂ断片は一方にｄｎａＮ遺
伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ルテウス
由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを示し、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎ
ａＡ断片の一部及びその下流領域をクローニングしたこ
とを確認した。
ｍＨ遺伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ル
テウス由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを
示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のｄｎａＡ断片の一部及びその上流領域をクローニング
したことを確認した。また、Ｂ断片は一方にｄｎａＮ遺
伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ルテウス
由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを示し、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎ
ａＡ断片の一部及びその下流領域をクローニングしたこ
とを確認した。
【００５９】実施例２ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３染色体由来の環状ＤＮＡベクターの作成 実施例１の（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９
８−Ａ１をＳａｌＩにより切断すると、ｐＨＳＧ２９８
とＡ断片の一部（大きさが約１．２ｋｂのＤ断片）を含
む４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、Ａ断片の残りの一部分の
約０．５ｋｂのＤＮＡ断片とに別れる（図１参照）。こ
の、ｐＨＳＧ２９８とＡ断片の一部（Ｄ断片）を含む
４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＧＥＭ−Ｂ１をＢａｍＨ
Ｉにより切断することにより得られる１．５ｋｂのＢ断
片を上記の方法によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
した。
ＭＪ−２３３染色体由来の環状ＤＮＡベクターの作成 実施例１の（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９
８−Ａ１をＳａｌＩにより切断すると、ｐＨＳＧ２９８
とＡ断片の一部（大きさが約１．２ｋｂのＤ断片）を含
む４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、Ａ断片の残りの一部分の
約０．５ｋｂのＤＮＡ断片とに別れる（図１参照）。こ
の、ｐＨＳＧ２９８とＡ断片の一部（Ｄ断片）を含む
４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＧＥＭ−Ｂ１をＢａｍＨ
Ｉにより切断することにより得られる１．５ｋｂのＢ断
片を上記の方法によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
した。
【００６０】上記の如く調製されたＤＮＡ混液を用い、
電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢ
Ｙ５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／
ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃
で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、常法によりベクターＤＮＡを抽出し、該ベクターを
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、大きさが
２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片に加
え、大きさが約１．２ｋｂのＤ断片および、大きさが約
１．５ｋｂのＢ断片が認められた。
電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢ
Ｙ５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／
ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃
で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株よ
り、常法によりベクターＤＮＡを抽出し、該ベクターを
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、大きさが
２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片に加
え、大きさが約１．２ｋｂのＤ断片および、大きさが約
１．５ｋｂのＢ断片が認められた。
【００６１】本環状ＤＮＡベクターをｐＨＳＧ２９８−
ｏｒｉＣと命名した。得られた環状ＤＮＡベクターを各
種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。
その結果を下記の第５表に示す。また環状ＤＮＡベクタ
ーｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの制限酵素切断点地図を図
４に示す。
ｏｒｉＣと命名した。得られた環状ＤＮＡベクターを各
種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。
その結果を下記の第５表に示す。また環状ＤＮＡベクタ
ーｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの制限酵素切断点地図を図
４に示す。
【００６２】
【表５】 第５表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ２ ３．９、１．５ ＥｃｏＲＩ ３ ３．６、１．３、０．５ ＨｉｎｄＩＩＩ ４ ３．６、１．２、０．５、０．１ ＳａｌＩ ２ ３．９、１．５ ＸｈｏＩ １ ５．４
【００６３】得られた環状ＤＮＡベクターを用いて、電
気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ
５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍ
ｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃で
２〜３日間培養したところ、多数の形質転換株が得ら
れ、得られた環状ＤＮＡベクターはコリネ型細菌内でａ
ｒｓ領域ＤＮＡ断片として複製していることが確認され
た。
気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ
５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍ
ｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃で
２〜３日間培養したところ、多数の形質転換株が得ら
れ、得られた環状ＤＮＡベクターはコリネ型細菌内でａ
ｒｓ領域ＤＮＡ断片として複製していることが確認され
た。
【００６４】なお、環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８
−ｏｒｉＣにより形質転換されたブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣは、茨城県つくば市東１
丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、
平成４年１１月２４日付で：微工研菌寄第１３３０３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）として寄託されている。
−ｏｒｉＣにより形質転換されたブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣは、茨城県つくば市東１
丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、
平成４年１１月２４日付で：微工研菌寄第１３３０３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）として寄託されている。
【００６５】実施例３ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター
（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）の確認およびコピー数の
測定 上記参考例１（Ａ）項の方法に従い、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより全ＤＮＡを抽出
した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｏｒ
ｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、および、比較例とし
て、参考例１（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を、常法に従い
〔モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning
）、 ColdSpng Harbor Laboratory Press（1989）〕ゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーションに供し、ａｒｓ
領域の検出を行った。この時プローブとしては、実施例
１の（Ｃ）で得られたＡ断片を、ランダムラベルキット
（宝酒造より市販）によりラベルしたものを用いた。
ＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター
（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）の確認およびコピー数の
測定 上記参考例１（Ａ）項の方法に従い、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより全ＤＮＡを抽出
した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｏｒ
ｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、および、比較例とし
て、参考例１（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を、常法に従い
〔モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning
）、 ColdSpng Harbor Laboratory Press（1989）〕ゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーションに供し、ａｒｓ
領域の検出を行った。この時プローブとしては、実施例
１の（Ｃ）で得られたＡ断片を、ランダムラベルキット
（宝酒造より市販）によりラベルしたものを用いた。
【００６６】この結果、染色体由来と考えられるバンド
の他に環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
Ｃ）由来と考えられるバンドが検出された。両者のバン
ドの濃さの比較より１細胞当たりの環状ＤＮＡベクター
のコピー数は、１〜２と考えられた。
の他に環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
Ｃ）由来と考えられるバンドが検出された。両者のバン
ドの濃さの比較より１細胞当たりの環状ＤＮＡベクター
のコピー数は、１〜２と考えられた。
【００６７】また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、およ
び、比較例として、実施例１（Ａ）項で得られたブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液
を鋳型とし、実施例１の（Ａ）項で用いたＲＰＭＨ−１
およびＤＮＡＮ−１をプライマーとして用い、前述の方
法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた反応液をアガ
ロース電気泳動により解析したところ、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を鋳型と
したＰＣＲ反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の
みが検出されるのに対し、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ＯｒｉＣのＤＮＡ抽出溶液を鋳型とした
反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の他に、約
２．７ｋｂの環状ＤＮＡベクター由来と考えられるＤＮ
Ａ断片が検出された。
２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、およ
び、比較例として、実施例１（Ａ）項で得られたブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液
を鋳型とし、実施例１の（Ａ）項で用いたＲＰＭＨ−１
およびＤＮＡＮ−１をプライマーとして用い、前述の方
法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた反応液をアガ
ロース電気泳動により解析したところ、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を鋳型と
したＰＣＲ反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の
みが検出されるのに対し、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ＯｒｉＣのＤＮＡ抽出溶液を鋳型とした
反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の他に、約
２．７ｋｂの環状ＤＮＡベクター由来と考えられるＤＮ
Ａ断片が検出された。
【００６８】実施例４ ａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片の
塩基配列の決定 上記実施例１の（Ｃ）項で得られたａｒｓ領域を含む大
きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を下記の操作
により決定し、また、このＤＮＡ断片上に存在するｄｎ
ａＡ遺伝子の存在部位を特定した。まず、大きさ約３．
５ｋｂのＤＮＡ断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｓａｕ３
Ａ〓を用いて３７℃で１〜５分間処理してＤＮＡ断片を
部分分解した。次に、クローニングベクターｐＵＣ１１
８（宝酒造製）を制限酵素ＢａｍＨ〓で切断した。得ら
れたベクター断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、こ
の混合液にそれぞれ最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ジオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、およびＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔとなるように各成分を添加し、ベクター
断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結合させた。
塩基配列の決定 上記実施例１の（Ｃ）項で得られたａｒｓ領域を含む大
きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を下記の操作
により決定し、また、このＤＮＡ断片上に存在するｄｎ
ａＡ遺伝子の存在部位を特定した。まず、大きさ約３．
５ｋｂのＤＮＡ断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｓａｕ３
Ａ〓を用いて３７℃で１〜５分間処理してＤＮＡ断片を
部分分解した。次に、クローニングベクターｐＵＣ１１
８（宝酒造製）を制限酵素ＢａｍＨ〓で切断した。得ら
れたベクター断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、こ
の混合液にそれぞれ最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ジオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、およびＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔとなるように各成分を添加し、ベクター
断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結合させた。
【００６９】上記と同様に大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ
断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｔａｑ〓 ５０ｕｎｉｔと
５〜８分間反応させて部分分解ＤＮＡ断片を調製した。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を制限酵素Ａｃｃ〓
で切断した後、これを上記と同様にして部分分解ＤＮＡ
と結合させた。
断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｔａｑ〓 ５０ｕｎｉｔと
５〜８分間反応させて部分分解ＤＮＡ断片を調製した。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を制限酵素Ａｃｃ〓
で切断した後、これを上記と同様にして部分分解ＤＮＡ
と結合させた。
【００７０】得られたプラスミド混液を用い、常法［J.
Mol. Biol., 53, 159(1970)参照］によりエシエリヒア
・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換し、アンピ
シリンを５０μｇ含む前記のＬ培地に塗抹した。上記培
地に生育した菌株を常法に従い液体培養し、得られた培
養物よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラス
ミドＤＮＡを用いて、ベクターｐＵＣ１１８に挿入され
た部分分解ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド酵素法［dideoxy chain termination method, Sang
er, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 546
3(1977)参照］により決定した。
Mol. Biol., 53, 159(1970)参照］によりエシエリヒア
・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換し、アンピ
シリンを５０μｇ含む前記のＬ培地に塗抹した。上記培
地に生育した菌株を常法に従い液体培養し、得られた培
養物よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラス
ミドＤＮＡを用いて、ベクターｐＵＣ１１８に挿入され
た部分分解ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド酵素法［dideoxy chain termination method, Sang
er, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 546
3(1977)参照］により決定した。
【００７１】具体的には、上記培養物より抽出したプラ
スミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタリスト８０
０モレキュラー・バイオロジー・ラボステーション(CAT
ALYST 800 Moleculer Biology Labostation ; Prkin-El
mer)を用いてプロトコールに従い反応させた後、パーキ
ン・エルマー社製 ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーによ
り各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定
した。そして、これらの個々の配列の連結は、パーキン
・エルマー社製のシークエンス解析ソフト インヘリッ
ト(INHERIT)を用いて行い、大きさ約３．５ｋｂのＤＮ
Ａ断片の全塩基配列を決定した。その配列を後記配列表
の配列番号：１に示す。決定した塩基配列中にはオープ
ンリーディングフレームの存在が認められ（塩基番号８
８０〜２４５１；５２４アミノ酸）、既知のマイクロコ
ッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子〔ジーン（Gen
e）、93、73〜78 (1990) 参照〕との相同性の比較によ
り、それがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
のｄｎａＡ遺伝子であることが判明した。さらに、ｄｎ
ａＡ遺伝子の上流にｒｐｍＨ遺伝子の一部が（塩基番号
３２〜９）存在し、ｄｎａＡ遺伝子の下流にはｄｎａＮ
遺伝子の一部分（塩基番号２９７８〜３５１４）が存在
していることが確認された。このことより、ａｒｓ領域
は、ｄｎａＡ遺伝子およびｒｐｍＨ遺伝子の間、およ
び、ｄｎａＡ遺伝子およびｄｎａＮ遺伝子の間の領域に
存在することが確認された。
スミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタリスト８０
０モレキュラー・バイオロジー・ラボステーション(CAT
ALYST 800 Moleculer Biology Labostation ; Prkin-El
mer)を用いてプロトコールに従い反応させた後、パーキ
ン・エルマー社製 ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーによ
り各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定
した。そして、これらの個々の配列の連結は、パーキン
・エルマー社製のシークエンス解析ソフト インヘリッ
ト(INHERIT)を用いて行い、大きさ約３．５ｋｂのＤＮ
Ａ断片の全塩基配列を決定した。その配列を後記配列表
の配列番号：１に示す。決定した塩基配列中にはオープ
ンリーディングフレームの存在が認められ（塩基番号８
８０〜２４５１；５２４アミノ酸）、既知のマイクロコ
ッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子〔ジーン（Gen
e）、93、73〜78 (1990) 参照〕との相同性の比較によ
り、それがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
のｄｎａＡ遺伝子であることが判明した。さらに、ｄｎ
ａＡ遺伝子の上流にｒｐｍＨ遺伝子の一部が（塩基番号
３２〜９）存在し、ｄｎａＡ遺伝子の下流にはｄｎａＮ
遺伝子の一部分（塩基番号２９７８〜３５１４）が存在
していることが確認された。このことより、ａｒｓ領域
は、ｄｎａＡ遺伝子およびｒｐｍＨ遺伝子の間、およ
び、ｄｎａＡ遺伝子およびｄｎａＮ遺伝子の間の領域に
存在することが確認された。
【発明の効果】本発明により、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３染色体に由来するａｒｓ領域を含む
ＤＮＡ断片が提供される。本発明のＤＮＡ断片を用いて
造成される環状ＤＮＡベクターは、コリネ型細菌内で低
コピー数で存在し、自律複製可能であり、該環状ＤＮＡ
ベクターを用いることにより、高コピー数存在すると宿
主コリネ型細菌に悪影響を与える遺伝子等のクローニン
グが可能となる。
ラバムＭＪ−２３３染色体に由来するａｒｓ領域を含む
ＤＮＡ断片が提供される。本発明のＤＮＡ断片を用いて
造成される環状ＤＮＡベクターは、コリネ型細菌内で低
コピー数で存在し、自律複製可能であり、該環状ＤＮＡ
ベクターを用いることにより、高コピー数存在すると宿
主コリネ型細菌に悪影響を与える遺伝子等のクローニン
グが可能となる。
【００７２】
配列番号：１ 配列の長さ：３５２１ 鎖の数：二本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＲＥＰ 存在位置：１〜３５２１ 特徴を決定した方法：Ｅ
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＲＥＰ 存在位置：１〜３５２１ 特徴を決定した方法：Ｅ
【００７３】 配列 GGATCCTT GTT TGG CTG AAA GGT CTT TGC CAT GTGAAACACT CCTAAATATT 52 CCTAGGAA CAA ACC GAC TTT CCA GAA ACG GTA CACTTTGTGA GGATTTATAA BamHI nsA orP nlG ehP rhT syL alA teM 8 5 1 rpmH <- TTGTTGACGG ATCACCGGAC ACACCGGTTC TAGTGGACAA AGTGCGCGAA GATTTCCGCG 112 CTACCCTATA CCGGGGGAAC GGATCACCCA ACGTTGGATG ATTTTTTTAA GATTGCAGAT 172 TCGTGGATGA AACCGCAGCA ACGCTTTATG GAAAGTGTTG CTCTCAAGCA CATTCGTTGC 232 GCCTGGAAAC TTGACCAAGA GGTTTGGACA AAGATCCGAG AGTCACACGA TGTGACAGAC 292 TGGTTTAGCT TACGGGAAAA CGACCTGCGA AAACAAATCT GTCCTTTGGC AATTCGGCGG 352 GGGCACCCAT AATTACAAAG CTGGCATTAA ACACTGGTGA GAGGGCATAT CGCCCGTCCA 412 AACGCTTTTC GACGCCACCC TCCGGCAAAC TCCAGTCGGT AAAGAATTCA CAGGGGTTGG 472 ACATGTGGAT TGAACTGCGG GTAACAATGA AAATTGCACA CAGCATCAAC AGCCTGTGAA 532 AACTTCAACC TGTGGATAAC AGGTAATGTT CACCTTGAGA TCAAGGGAAA CATTCAAATA 592 ACTGCAGGTG AGAGCGAATT TGAGGTTGAT GCACGTTTTC CACAGGTAGT GCGCTATCCT 652 GTGGATAAAC GTTTTTTGGG AAATGTTATC CACAGCTGTG GACAACATTG CGGAAACAAT 712 GGTTATGGGC GTTTTTCGAT GTGAATGGAG CTGTAGAAAC ATCGAGAACG CCCACGTGGA 772 TAACAAAGCG GAATTTTGCC CTGCTTTTTA GCTTCTCCGC CACCCTTCAT CCACGGCTGA 832 ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTCGCCAAA AGGAGATACC TAACATA GTG AGC CAG 888 Val Ser Gln 1 -> dnaA AAC TCA TCT TCT TTG CTC GAA ACC TGG CGC CAA GTT GTT GCC GAT CTC 936 Asn Ser Ser Ser Leu Leu Glu Thr Trp Arg Gln Val Val Ala Asp Leu 5 10 15 ACA ACT TTG AGC CAG CAA GCG GAC AGT GGA TTC GAC CCA TTG ACG CCA 984 Thr Thr Leu Ser Gln Gln Ala Asp Ser Gly Phe Asp Pro Leu Thr Pro 20 25 30 35 ACT CAA CGT GCA TAT TTG AAC CTG ACG AAG CCG ATT GCC ATC GTC GAT 1032 Thr Gln Arg Ala Tyr Leu Asn Leu Thr Lys Pro Ile Ala Ile Val Asp 40 45 50 GGC TAC GCA GTG CTG TCC ACA CCC AAC GCA ATG GCA AAA AAT GTC ATT 1080 Gly Tyr Ala Val Leu Ser Thr Pro Asn Ala Met Ala Lys Asn Val Ile 55 60 65 GAA AAC GAT TTG GGC GAT GCT TTG ACC CGT GTG TTG TCG CTG CGC ATG 1128 Glu Asn Asp Leu Gly Asp Ala Leu Thr Arg Val Leu Ser Leu Arg Met 70 75 80 GGC CGA TCA TTC AGC TTG GCC GTC AGT GTG GAG CCT GAG CAG GAA ATT 1176 Gly Arg Ser Phe Ser Leu Ala Val Ser Val Glu Pro Glu Gln Glu Ile 85 90 95 CCA GAA ACC CCA GCT CAG CAG GAG TTT AAG TAT CAA CCT GAC GCA CCT 1224 Pro Glu Thr Pro Ala Gln Gln Glu Phe Lys Tyr Gln Pro Asp Ala Pro 100 105 110 115 GTG ATC TCT TCC AAC AAG GCG CCA AAG CAG TAT GAA GTT GGT GGT CGG 1278 Val Ile Ser Ser Asn Lys Ala Pro Lys Gln Tyr Glu Val Gly Gly Arg 120 125 130 GGA GGG GCG TCG ACA AGC GAC GGC TGG GAA CGC ACC CAC TCT GCA CCG 1320 Gly Gly Ala Ser Thr Ser Asp Gly Trp Glu Arg Thr His Ser Ala Pro 135 140 145 GCT CCC GAG CCG CAC CCA GCA CCT ATC GCC GAT CCT GAG CCA GAG CTG 1368 Ala Pro Glu Pro His Pro Ala Pro Ile Ala Asp Pro Glu Pro Glu Leu 150 155 160 GCC ACC CCG CAG CGC ATT CCG CGT GAA ACC CCA GCT CAC AAC CCT AAT 1416 Ala Thr Pro Gln Arg Ile Pro Arg Glu Thr Pro Ala His Asn Pro Asn 165 170 175 CGG GAA GTG TCC CTC AAC CCG AAA TAC ACT TTT GAA AGC TTC GTG ATC 1464 Arg Glu Val Ser Leu Asn Pro Lys Tyr Thr Phe Glu Ser Phe Val Ile 180 185 190 195 GGA CCG TTC AAC CGT TTC GCC AAC GCA GCC GCA GTT GCT GTG GCG GAA 1512 Gly Pro Phe Asn Arg Phe Ala Asn Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Glu 200 205 210 AGC CCA GCG AAA GCT TTC AAC CCG TTG TTT ATT TCC GGC GGT TCC GGC 1560 Ser Pro Ala Lys Ala Phe Asn Pro Leu Phe Ile Ser Gly Gly Ser Gly 215 220 225 TTG GGC AAA ACT CAC CTG CTG CAC GCA GTA GGA AAT TAC GCT CAA GAA 1608 Leu Gly Lys Thr His Leu Leu His Ala Val Gly Asn Tyr Ala Gln Glu 230 235 240 TTG CAG CCT GGC CTG CGG ATT AAG TAC GTC TCA AGT GAG GAA TTC ACC 1656 Leu Gln Pro Gly Leu Arg Ile Lys Tyr Val Ser Ser Glu Glu Phe Thr 245 250 255 AAC GAC TAC ATC AAC TCC GTG CGA GAT GAC CGC CAG GAA ACC TTC AAG 1704 Asn Asp Tyr Ile Asn Ser Val Arg Asp Asp Arg Gln Glu Thr Phe Lys 260 265 270 275 CGC CGC TAC CGC AAC CTG GAT ATC CTC ATG GTC GAT GAC ATC CAG TTC 1752 Arg Arg Tyr Arg Asn Leu Asp Ile Leu Met Val Asp Asp Ile Gln Phe 280 285 290 CTG GCT GGC AAA GAA GGC ACC CAG GAA GAG TTC TTC CAT ACC TTC AAC 1800 Leu Ala Gly Lys Glu Gly Thr Gln Glu Glu Phe Phe His Thr Phe Asn 295 300 305 GCA TTG CAC CAG GCA GAT AAG CAA ATT ATT TTA TCC TCG GAC CGC CCA 1848 Ala Leu His Gln Ala Asp Lys Gln Ile Ile Leu Ser Ser Asp Arg Pro 310 315 320 CCC AAG CAG CTG ACC ACG CTG GAA GAT CGC CTG CGC ACC CGC TTC GAA 1896 Pro Lys Gln Leu Thr Thr Leu Glu Asp Arg Leu Arg Thr Arg Phe Glu 325 330 335 GGT GGC CTG ATT ACT GAT ATT CAG CCA CCT GAC CTG GAA ACT CGC ATC 1944 Gly Gly Leu Ile Thr Asp Ile Gln Pro Pro Asp Leu Glu Thr Arg Ile 340 345 350 355 GCG ATT TTG ATG AAG AAG GCC CAA ACC GAT GGC ACG CAC GTG GAT AGG 1992 Ala Ile Leu Met Lys Lys Ala Gln Thr Asp Gly Thr His Val Asp Arg 360 365 370 GAA GTC CTC GAG CTC ATT GCC AGC CGC TTT GAA TCT TCG ATC CGT GAA 2040 Glu Val Leu Glu Leu Ile Ala Ser Arg Phe Glu Ser Ser Ile Arg Glu 375 380 385 TTG GAA GGC GCA CTG ATT CGT GTG TCT GCC TAT TCT TCG TTG ATT AAT 2088 Leu Glu Gly Ala Leu Ile Arg Val Ser Ala Tyr Ser Ser Leu Ile Asn 390 395 400 CAG CCG ATC GAT AAA GAA ATG GCC ATC GTG GCG CTG CGC GAT ATC CTC 2136 Gln Pro Ile Asp Lys Glu Met Ala Ile Val Ala Leu Arg Asp Ile Leu 405 410 415 CCA GAA CCT GAG GAT ATG GAA ATC ACC GCA CCG GTG ATC ATG GAG GTC 2184 Pro Glu Pro Glu Asp Met Glu Ile Thr Ala Pro Val Ile Met Glu Val 420 425 430 435 ACT GCG GAA TAT TTT GAA ATT TCC GTG GAT ACA CTC CGT GGA GCA GGC 2232 Thr Ala Glu Tyr Phe Glu Ile Ser Val Asp Thr Leu Arg Gly Ala Gly 440 445 450 AAA ACT CGT GCG GTC GCG CAT GCA CGC CAA CTG GCG ATG TAC CTG TGC 2280 Lys Thr Arg Ala Val Ala His Ala Arg Gln Leu Ala Met Tyr Leu Cys 455 460 465 CGC GAG CTC ACC GAT ATG TCA TTG CCC AAG ATC GGT GAT GTG TTT GGC 2328 Arg Glu Leu Thr Asp Met Ser Leu Pro Lys Ile Gly Asp Val Phe Gly 470 475 480 GGA AAA GAC CAC ACA ACT GTC ATG TAC GCG GAT CGG AAG ATT CGC CAA 2376 Gly Lys Asp His Thr Thr Val Met Tyr Ala Asp Arg Lys Ile Arg Gln 485 490 495 GAA ATG ACA GAA AAG CGC GAT ACC TAC GAT GAA ATC CAG CAA CTT ACC 2424 Glu Met Thr Glu Lys Arg Asp Thr Tyr Asp Glu Ile Gln Gln Leu Thr 500 505 510 515 CAG CTG ATT AAG TCG CGC GGA CGT AAC TAAGACCTGT TTAGCGTGGT 2471 Gln Leu Ile Lys Ser Arg Gly Arg Asn 520 524 GCTAAATTAC AAAATTTAGC TCTGCTGCTC TTGAAGACCC ATCTTCGGAT GGGTCTTTTT 2531 GTAATTTAGC GGTTGTGCAG GGATTTTGCG GACAACTTCC GATAAAACCC CAGCTCACAA 2591 AGTTATCCAC AATCAATCAC AACCCAGTTC ACACGCCAGA TTTCCGCGAC TACCTTGTAA 2651 AACAATGGTC TATCCACAGT TTCAACAGGA CTTACTGTTA TTACCGATTT TTTACCTAGA 2711 AATTAACTAA AAGAAAGAGG GGGTGGGGAG AAACCTTCGT GGGTGAGCCC AATGCTCACG 2771 AAACTTCAGC GAAAGCCTCG AGGAAATTGA AATTACAAAT TCCAGATCCG CGAGGAACAC 2831 AGGTAGGTTG GGCTTGTGTA ATTCGGACTG AAGCCACCTG GAGGGTGAAC CTTCTTCCAA 2891 GAAGTTTTCC CTATCGGTAA ACGTCCGAGT TTAGTTAAAC GATGAACTAT ATTTGATCTA 2951 TATTTCCCAA GGAGCTTTAA AACAGC ATG GAG TCA CAA AAC GTG TCC TTC CGT 3004 Met Glu Ser Gln Asn Val Ser Phe Arg 1 5 -> dnaN GTG GCC AGG GAA GAC CTG GTT ACC GCG GTA GCC TGG GTC GCT CGC AAC 3052 Val Ala Arg Glu Asp Leu Val Thr Ala Val Ala Trp Val Ala Arg Asn 10 15 20 25 CTG CCC ACC AAA CCG ACT CAG CCG GTA CTT CGA GCC ATG CTG ATC ACT 3100 Leu Pro Thr Lys Pro Thr Gln Pro Val Leu Arg Ala Met Leu Ile Thr 30 35 40 GCC GAT GAT GAG GGT CTT GAA CTC GCC GGT TAC GAC TAC GAC GTA TCC 3148 Ala Asp Asp Glu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Ser 45 50 55 ACC CGA GTT CGC CTT TCA GCT GAG GTT TCT CAG CCA GGT CGC ATC GCA 3196 Thr Arg Val Arg Leu Ser Ala Glu Val Ser Gln Pro Gly Arg Ile Ala 60 65 70 GTA GCC GGC AAG CTG CTG TCT GAA ATC ACA GGA TCT TTG CCC AAC AAG 3244 Val Ala Gly Lys Leu Leu Ser Glu Ile Thr Gly Ser Leu Pro Asn Lys 75 80 85 CCC GTT GAT TTC CGC ATC GAC GGA TCC AAA GCT TTT GTC ACT TGT GGT 3292 Pro Val Asp Phe Arg Ile Asp Gly Ser Lys Ala Phe Val Thr Cys Gly 90 95 100 105 TCT TCC CGC TTC GAG CTG CCA CTG ATC CCG CTT GAT GAT TAC CCA ATG 3340 Ser Ser Arg Phe Glu Leu Pro Leu Ile Pro Leu Asp Asp Tyr Pro Met 110 115 120 CTG CCC AAG CTT CCT GCA GGT ACC GGT TCC ATC AAC GCC AAA CTG TTC 3388 Leu Pro Lys Leu Pro Ala Gly Thr Gly Ser Ile Asn Ala Lys Leu Phe 125 130 135 ACC GAA GCA GTC TCC CAG GTG GCA TCC GCT GCA GGT AAA GAT GAT TCT 3436 Thr Glu Ala Val Ser Gln Val Ala Ser Ala Ala Gly Lys Asp Asp Ser 140 145 150 TTG CCG ATG CTC ACC GGT GTC AGC ATG GAA ATC GTG GGC AAC CAG ATC 3484 Leu Pro Met Leu Thr Gly Val Ser Met Glu Ile Val Gly Asn Gln Ile 155 160 165 AAC TTG GCT GCA ACC GAC CGC CAC GCC TTG CGTCGAC 3521 Asn Leu Ala Ala Thr Asp Arg His Ala Leu SalI 170 175 179
【図１】本発明の大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｃ断片）の制限酵素切断点地図並びに該ＤＮＡ断片と
大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）、大きさ
が約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）及び大きさが約
１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）との相互関係を示す
図。
（Ｃ断片）の制限酵素切断点地図並びに該ＤＮＡ断片と
大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）、大きさ
が約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）及び大きさが約
１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）との相互関係を示す
図。
【図２】本発明の大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片
（Ａ断片）および大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｄ断片）の制限酵素切断片地図
（Ａ断片）および大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｄ断片）の制限酵素切断片地図
【図３】本発明の大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｂ断片）の制限酵素切断片地図
（Ｂ断片）の制限酵素切断片地図
【図４】本発明のプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ
の制限酵素切断片地図
の制限酵素切断片地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (12)
- 【請求項１】 コリネ型細菌染色体に由来する自律複製
配列を有するＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 前記コリネ型細菌がブレビバクテリウム
・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖ
ｕｍ）ＭＪ−２３３である請求項１記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 大きさが約３．５ｋｂであり、下記表に
記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認
識部位数と切断断片の大きさを示す請求項２記載のＤＮ
Ａ断片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＥｃｏＲＩ ３ １．１、１．０、０．９、０．５ ＨｉｎｄＩＩＩ ４ １．８、１．４、０．１６、０．０７、０ ．０７ ＳａｌＩ １ ２．３、１．２ - 【請求項４】 大きさが約１．７ｋｂであり、下記表に
記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認
識部位数と切断断片の大きさを示す請求項２記載のＤＮ
Ａ断片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＢａｍＨＩ ０ １．７ ＥｃｏＲＩ ２ １．０、０．５、０．２ ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．４、０．２、０．１ ＳａｌＩ １ １．２、０．５ - 【請求項５】 大きさが約１．２ｋｂであり、下記表に
記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認
識部位数と切断断片の大きさを示す請求項２記載のＤＮ
Ａ断片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＢａｍＨＩ ０ １．２ ＥｃｏＲＩ １ ０．７、０．５ ＨｉｎｄＩＩＩ ０ １．２ ＳａｌＩ ０ １．２ - 【請求項６】 大きさが約１．５ｋｂであり、下記表に
記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認
識部位数と切断断片の大きさを示す請求項２記載のＤＮ
Ａ断片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＢａｍＨＩ １ １．２、０．３ ＥｃｏＲＩ １ ０．９、０．６ ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．２、０．２、０．１ ＰｖｕＩＩ ２ ０．７ ０．５ ０．３ ＳａｌＩ ０ １．５ ＸｈｏＩ １ ０．９、０．６ - 【請求項７】 少なくとも請求項１〜３のいずれにかに
記載のＤＮＡ断片を保有するコリネ型細菌内で自律複製
可能な環状ＤＮＡ。 - 【請求項８】 少なくとも請求項４又は５のいずれかに
記載のＤＮＡ断片及び請求項６に記載のＤＮＡ断片を保
有するコリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ。 - 【請求項９】 請求項７又は８のいずれかに記載の環状
ＤＮＡにより形質転換されたコリネ型細菌。 - 【請求項１０】 配列表に示される、コリネ型細菌の染
色体由来自律複製配列を有するＤＮＡ断片。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載のＤＮＡ断片の全部
あるいは一部を保有するコリネ型細菌内で自律複製可能
な環状ＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の環状ＤＮＡにより
形質転換されたコリネ型細菌。
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|---|---|---|---|
| JP30114094A JP3550766B2 (ja) | 1994-07-26 | 1994-12-05 | 自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-174316 | 1994-07-26 | ||
| JP17431694 | 1994-07-26 | ||
| JP30114094A JP3550766B2 (ja) | 1994-07-26 | 1994-12-05 | 自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889259A true JPH0889259A (ja) | 1996-04-09 |
| JP3550766B2 JP3550766B2 (ja) | 2004-08-04 |
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|---|---|---|---|
| JP30114094A Expired - Fee Related JP3550766B2 (ja) | 1994-07-26 | 1994-12-05 | 自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用 |
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| JP (1) | JP3550766B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6677146B1 (en) | 2000-03-28 | 2004-01-13 | Replidyne, Inc. | Thermophilic polymerase III holoenzyme |
-
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- 1994-12-05 JP JP30114094A patent/JP3550766B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| US6677146B1 (en) | 2000-03-28 | 2004-01-13 | Replidyne, Inc. | Thermophilic polymerase III holoenzyme |
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