DE3127361A1 - Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin - Google Patents

Description

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Herstellung und Anwendung von Plasmiden mit Genen für die Biosynthese von L-Prolin

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellrag το a Flaisfflidoa die Gene für die Biosynthese von L-Prolin tragen, wobei ©ia©s dieser Gene so mutiert ist, daß die normalerweise vorhanden© allosterische Hemmung der Biosynthese dieser Amiaos&wr© entfällt

Die Erfindung betrifft ferner die Anwendung dieser Plaseaid© Entwicklung von Bakterienstämmen der Art Ksehsriehia coil, die L-Prolin in die Kulturflüssigkeit ausscheiden und daher für die fermentative Herstellung dieser Aminosäure b@©©sd®r© geeignet · sind. Dabei können die Plasmide in d®n Zellen di© Fähigkeit sur Überproduktion von L-Prolin. sntHodsr überhaupt espst oder eine bereits vorhandene, ehroaosoBal bedingt© tionsfähigkeit erheblich steigern»

Außerdem ist noch die Herstellung von geei ten, die in Verbindung mit diesen Piasmiden ©in© Konzentration von L-Prolin in des· Kmlturflüssigkoit Gegenstand der vorliegenden Erfindung«

Die Biosynthese von L-Prolia aus L-SlutaainsfiwE'© wird l richia coli sowie in versohle denen and®s"©n Äteoörgaaisaea die Enzyme y-Glutamyl-Kinas© (©©b pr©B), y-ßliataEylph©@piiat= Eeductase (Gen proA) und l-Pyrrolia-^^carboxylat^Bedmetas® (@©a proC) katalysiert /D.J. Haya@r und Th. Leisiager, J.GensHicrobiole 118, 287-293 (1980)7. Ub®nsehüs0ig©8 L-Prolim bewirkt sowohl ©ia© allosterische Hemmung des ersten Enzyme als auch ©ins Repression der Biosynthese der beiden ©s»®tea lasyae dies®^ leaktioasf©lg©, wodurch eine Oberproduktion der Aminosäure in Wildtypzellea ^arhindert wird /Ή.Ε. Umbarger, Ann.» H©v« Biocheso k2_, 533-δ©6 (1978)7.

Es sind Mutanten versehiademsr Eseh®rishia eoli-Stfimme bekannt, die gegen mehrere Prolin-Antimetaboliten, z.B_o 3,^-P©ßydr©-- D/L= Prolin oder Azetidin-2-carbonsäur®, reisiatent siad und -Sie ge Mengen L-Prolin in die Kulturfliassigkeit ausscheiden.

A. Baich und D.J. Pierson, Biochem. BiophyB. Acta JLOft, (1965), beschreiben z.B. eine Mutante des Stammes E.coli W, die ca. 25O-35O mg/l L-Prolin in einem Medium mit 0,5 % Glucose und 0,1 % Glutaminsäure produziert. Diese Stämme sind offenbar in dem Gen proB so mutiert, daß die entsprechende y-Glutamyl-Kinase durch L-Prolin nicht mehr allosterisch gehemmt wird Jk. Condamine, Ann. Inst. Pasteur 120, 126-1^3 (1971}/.

Es wurde nun gefunden, daß durch Klonierung von chromosomalen DNS-Fragmenten, die aus antimetabolitresistenten Mutanten der oben beschriebenen Art isoliert wurden und die die dicht benachbarten Gene proA und proB tragen, neukombinierte Plasmide erhalten werden können, welche die Fähigkeit zur Ausscheidung von L-Prolin auf zahlreiche E.coli-Stämme, die von sich aus keine Überproduktion von L-Prolin aufweisen, übertragen können. Auf diesen Plasmiden liegt das Gen proB in der mutierten Form vor, was den Verlust der allosterischen Hemmung zur Folge hat (hier ale Gen proB(mut.) bezeichnet).Plasmide dieser Art sind die in Beispiel 1 beschriebenen pSB121, pSB12*f und pSB125. Ihre Eignung zur Steigerung der Ausscheidung von L-Prolin in Stämmen, die diese Aminosäure auch ohne Plasmid (chromosomal bedingt) ausscheiden, wird anhand der Tabelle 1 in Beispiel 3 belegt (pSB125 ergab die gleichen Werte wie pSB124).

Gegenstand der Erfindung ist zunächst die Verwendung der Mutante E.coli SBl zur Herstellung des Plasmids pSB121 sowie die Verwendung des Plasmids pSB121 zur Herstellung der Plasmide pSB122, 123, 12^₁ 125 und 126.

Die Erfindung betrifft ferner Plasmide, die eine DNS-Sequenz mit den Genen proA und proB enthalten, wobei proB in einer mutierten Form vorliegt, die eine antimetabolitresistente y-Glutamyl-Kinase codiert.

Die Fähigkeit zur Überproduktion von L-Prolin kann weiter gesteigert werden, wenn man mit Hilfe der Methoden zur in-vitro-Neu-

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kombination von DNS Plasmide herstellt, die außer proA und proB (mut.) auch das Gen proC tragen» pSB122, pSB123 und pS»B126, deren Herstellung in Beispiel 2 beschrieben wird, repräsentieren diesen Plasmidtyp. Ihre vorteilhaften Eigenschaften kommen vor allem in Stämmen zur Geltung, die wie Socoli SB^ (sieh© weiter unten) aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften eine hohe Produktion von L-Prolin ermöglichen. So unterscheiden sich die maxi·= malen Prolinkonzentrationen und di© Produktivitäten bei dem Stamm E.coli SB2, der nur ®in© mittlere Überproduktion ermöglicht, für die Plasmide pSB122, pSB12^ und pSB126 nur geringfügig voneinander (Tabelle l). In Socoli SBJ dagegen ergeben pSB 122 und pSB126 erheblich bsssor® Wert© als pgB12*f (vgl_o z.B. Tabelle 2 in Beispiel ^? für pBB125 wurden die gleichen Werte wie für pSB122 gefunden). Offenbar produziert das konstitutive chromosomale Gen proG in Eosoli SB3 nieht mehr genügend l-Pyrrolin-^carboxylat-Hedactas©, um di© von den im Überschuß vorhandenen ersten beiden Enzymen di©s©a Stoffweehselweges gebildete Zwischenstufe (l-Pyrrolin~5-carboxylat) rasch genug in L-Prolin umzuwandeln.

Die Erfindung umfaßt somit auch Plaeaid®, di© &eb®n d@n Genen proA und proB (mutiert) auch noch da© Q®n pr©C auf ihrer DNS-i Sequenz enthalten.

Die Methoden zur in vitro Neukombination und sur Ilonisrung voa DNS sind in verschiedenen Publikationen ausamaenfassend beschrieben worden, z.B. in Methods in BSnzymol. , Vol. 68, Say Wu (Ed.), Academic Press, New York 1979° Sine Zusasmenet©llung der im Rahmen dieser Erfindung in dan Beispielen 1 und 2 hergestelltes neukombinierten Plasmide enthält di© Abb. 1, in d©2* die riagför·= migen Strukturen in einer linearisierten Form dargestellt Die Wellenlinie kennzeichnet d@a übergang von' chromosoaaler zu Vektor-DNS aus pWB2. Dieser ist weniger als 14-00 Bp von d®r rechts daneben gelegenen Sall-Bequeas entfernt, aber nieht'genau definiert.

Die Sequenz mnmsnn ist durch kovalente Verknüpfung eines BamHI-Einzelstrangendes mit einem Bglll-Einzelstrangende entstanden und iat durch keine der beiden genannten Restriktionsendonucleasen spaltbar.

Die Erfindung beinhaltet auch die Verfahren zur Herstellung der genannten Plasmide. Diese Verfahren bestehen darin, daß man ehre— mosomale DNS-Fragmente mit den Genen proA und proB aus einer antimetabolitresistenten E.coli-Mutante cloniert, oder daß man durch in-vitro Neukombination ein Fragment mit den Genen proA und proB mit einem Fragment mit dem Gen proC auf einem Plasmid vereinigt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung von antimetabolitresietenten E.coli-Hutanten durch Einführung weiterer chromosomaler Mutationen, die unabhängig vom Vorhandensein neukombinierter Plasmide der oben erwähnten Art eine Steigerung der L-Prolin-Ausscheidung bewirken. So wurde in den Stamm E.coli SBl (Herstellung im Beispiel la beschrieben), aus dem auch die chromosomale DNS für die Herstellung des neukombinierten Plasmids pSB121 isoliert wurde, eine Mutation eingeführt , die das Wachstum mit L-Prolin als einziger Kohlenstoffoder Stickstoffquelle verhindert. Wie aus Abb. 3 zu ersehen ist, liefert die so erhaltene Mutante E.coli SB2 ca. dreimal soviel L-Prolin wie E.coli SBl.

Die Ausbeute an L-Prolin ließ sich durch Einführung eines Stoffwechseldefektes, der das Zellwachstum begrenzt, noch weiter steigern. So ergaben einige Mutanten von E.coli SB2 mit Bedürftigkeiten für andere Aminosäuren und für Vorstufen der Nuleinsäureeynthese höhere Konzentrationen an L-Prolin. Als besonders geeignet erwies sich der Stamm E.coli SB3, der aus E.coli SB2 durch Einführung einer Bedürftigkeit für L-Leucin erhalten wurde, unter den in Beispiel k beschriebenen Bedingungen mit 60-100, insbesondere mit 75-85, vorzugsweise mit 80mg/l L-Leucin. Die Konzentration an L-Prolin nahm gegenüber E.coli SB2 um den

Faktor 1,5-2 zu.

Die für das Wachstum einer Mangelrautante wie E.coli SB3 benötigte Aminosäure kann auch vorteilhaft in Form einer Aminosäuremischung zugesetzt werden. So ließ sich die maximale Prolinkonzentration und die Produktivität von E.coli SB3 mit pSB122 dadurch auf 13,8 g/l bzw. auf 0,21 g/l/h steigern, daß L-Leucin durch eine äquivalente Menge z.B. Casamino Acids ersetzt wurde.

Die Erfindung besteht damit auch in der Verwendung von E.coli= Mutanten, insbesondere den Mutanten E.coli $B2 und SB3 sur fermeatativen Herstellung von L-Prolin. Damit sind gleichzeitig Verfahren zur Herstellung neuer Bakterienstämm® und Verfahren w&v Herstellung von L-Prolin mit Hilf© dieser StätHU© gemeiat (Anspruch© 17-22).

Es iet bekannt, daß Bakterien solche Plasmide besonders leicht verlieren, die in hohem Maße eine unnatürliche Stoffwechselleistung induzieren, z.B. die Überproduktion eines Enzyme ©der einer Aminosäure /vgl. z.B. T, Imanaka et al., Je Gen Mier©bi©lo 118, 253-261 (I98O)/. Dies trifft insbesondere auch für die Plasmide pSB122 und pSB123 au. So siad am End® der Fermentationen von E.coli SB2 (pSB122) und B.coli SB3 (pBB122) unter dsn ia Beispiel 3 und h beschriebenen Bedingungen 20-25 % bsw. mehr als 90 % der Zellen plasmidfrei (vgl» in den Tabellen 1 und 2 die Werte für den Anteil an ampieillinreeistenten, doh. plasmidhaltigen Zellen an der Gesamtpopulation).

Eine wesentliche Verbesserung der Stabilität vob pHB122 ließ sich durch Verkleinerung des Moleküls um ca. 2580 BP erreich©», wobei das Plasmid pSB126 resultierte (Beispiel 2)» pSB126 ist auch in E.©oli SB3 unter den in Beispiel h beschriebenen Bedingungen stabil und ergibt entsprechend ©ine höher© Prolinkonzentration sowie eine bessere Produktivität als pSB122 in dem gleichen Stamm (Tabelle 2), während umgekehrt in

E.coli SB2 pSB122 die besseren Resultate lieferte (Tabelle 1).

Eine Plasmidstabilisierung wird auch erreicht, wenn man Bedingungen schafft, unter denen nur die plasmidhaltigen Zellen wachsen können. Dies war bei den hier beschriebenen Plasmiden durch Zusatz des Antibiotikums Ampicillin zum Medium möglich, da sie in ihren Wirtszellen Resistenz gegen Ampicillin bewirkten. So ließen sich die maximalen Prolinkonzentrationen der Stämme E.coli SB2 (pSB122) und E.coli SBJ (pSB122) von 6,0 g/l auf 6,8 g/l bzw. von 12,5 g/l auf 16,1 g/l durch Zusatz von 100 mg/l Ampicillin zum Fermentationsmedium steigern (Vergleich der Ergebnisse in Beispiel 5 mit den entsprechenden Werten in den Tabellen 1 und 2).

Alle bekannten Verfahrensschritte wurden nicht"im einzelnen auegeführt, da sie bereits ausführlich in der Europäischen Patentanmeldung 0023882 genannt worden sind.

Am 8. Juli I98I wurden bei der "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM)" in Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, folgende Mikroorganismen hinterlegt (Hinterlegungsnumaer):

Escherichia coli SBl (DSM 2120} Escherichia coli SB2 (DSM 2121) EBcherichia coli SB3 (DSM 2122) E.coli SB2 mit pSB121 (DSM 2123) E.coli SB3 mit pSBl22 (DSM 2124)

Für folgende in dieser Anmeldung genannten Mikroorganismen und Plasmide liegen bereits Hinterlegungen vor:

E.coli SBMf (DSM I6O6, 16.7-79)

E.coli HB 101 (DSM I6O7, 16.7.79)

Plasmid pWB2 (ATCC 40013, 16.7.79)

Plasmid pBB322 (ATCC 40015, 16.7.79)

Plasmid pSB53 (ATCC 40020, 16.7.79)

Der Stamm E.coli X^7^ wurde von P.Broda (England) bezogen, der Stamm E.coli LEPl von E. Yagil (Tel Aviv) uad von CGSG (YaIe Univ., New Haven, USA).

Beispiel 1:

Herstellung von Plasmiden mit den Genen pro A und pro B (mut)

a) Isolierung der antimetabolitresistenten Mutante E.coli SBl

Je 0,1 ml einer Übernachtkultur von E.coli K12 Wildtyp in Ε-Medium /K.J. Vogel und D.M. Bonner, J.Biol. Chem. 218, 97-106 (1956)7 wurden auf Agarplatten (1,5* Agarose in Ε-Medium) ausplattiert, welche 15(ig/ml D/L-Dehydroprolin (bezogen von der Fa. Calbiochem GmbH, 63OO Giessen, FRG) enthielten. Nach 2(tstündiger Inkubation waren durch Spontanmutation entstandene, gegen Dehydroprolin resistente Einzelkolonien in einer Häufigkeit von ca. 1 Kolonie pro 3 χ 10 Wildtypzellen gewachsen. Diese wurden mit Hilfe von sterilen Zahnstochern auf Agarplatten mit Minimalmedium (M9-Medium mit 2 g/l Glucose, 20 mg/1 L-Tryptophan und 40 mg/1 Adenin;vgl. R.W. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York I98O, S. 203) überführt, auf welche als Indikatorstamm zuvor 1 χ 10 Zellen pro Platte der prölinbedürftigen Mutante E.coli LEPl /proC, purE, trpE; vgl. M. Bracha und E. Yagil, Molec. gen. Genet. 122, 53-6O (197317 ausplattiert worden waren. Nach 2*tstündiger Inkubation bei 37 C Hessen sich L-Prolin ausscheidende Kolonien durch einen Hof von Mikrokolonien des Indikatofcstammes identifizieren. Eine dieser L-Prolin produzierenden Kolonien wurde für die weiteren Versuche abgeimpft und erhielt die Bezeichnung E.coli SBl. Der Stamm erwies sich auch als resistent gegen den Antimetabouten Acetidin-2-carbonsäure.

b) Herstellung des Plasmide pSB121

Als Vektor wurde das Plasraid pWB2 verwendet, welches eine Schnittstelle für die ttestriktionsendonuklease Hind III besitzt und Resistenz gegen Ampicillin und Colicin

El vermittelt /V. Bo id öl et al., Bfiolec. gex&. ©eiset. 231-237 (1977)7. Alle Plasmid-DNS wurde nach 'einem Verfahren von 6.0. Humphreys et al«, Biochera. Bioptsye. Acta 3B3, Λ57-463 (1975) isoliert und gegen DNS-Puffsr (45 mM TriaHCl, 0,1 raM EDTA, pH 7,9) dialysiert. Hochmolekulare ehromosomale DNS aus l.coli .SBl wurde Bach dem Phenolextraktionsverfahren von H.Saito und K. Miisra, Biochem. Biophys. Acta JJ-Li 619-629 (1963)» j©d@eh Auslassung der RNAse-Verdauung iseliert gegen DNS-Puffer dialysiart»

pVB2 und Chromosom»le DNS rub E_o<g©li SBl imrcleM mit Restriktionsendonuklease Hindi!X rarag®s@t§Et« tionsmischung enthielt 8θμ1

20 μΐ pWB2 (3OO μg/ml) , 75 μΐ Reaktionspt&ffer TrisHCl, 20 mM Mereapteäifoaraol, 20 mM NaCl, pH 7,4) und 50 μ,Ι ©ister

mit einer zur quantitativen

zymkonzentration, welche in Vor^ersmehera ermittelt worden war. Die Mischung wiard© 75 Misi. bei 37 ^ %u^^ ^asa" schliessend zur Inaktivierung d©a Eiasysas 10 Min. bei 65 C gehalten. Zu I80 μΐ der Hindlll-Umsetsiaisg wurdesL 25 ^l Ligase-Puffer (66Ο mM TrisHCl, 66ebM MgCIg, 100 asM Dithi®·= threitol, pH 7,6), 25 μΐ Äff (k mM), 15 μΐ Mg© und 5 μΐ ΤΊ-Ligase (100 Einheiten/ml; Biolabs, Beverly, Md. USA) gegeben. Die Mischung wurde 17 Stdc bei 13 C irakubiert, zweimal mit je 250 μΐ Phenol, walefei©8 zwi?®t sit TES-Fuaffer (50 mM TrisHCl, 50 HiM NaCl, 5 ωΜ EDTA, pE 8,0) ge» sättigt worden war und dreimal mit je §5© |il Äther ©xtra« hiert. Die DNS wurd® aHischli©0sead in der föfeliehosa Waise mit 'Äthanol gefällt und ±n BMg-Pnaffey

Als Empfänger stamm für die Klomiormtg disi&t© dar transformierbare, prolinbedürftigö Stöiasi E_oe@Ii (proA, leuB, thi, hsdR, fesdM, r®eÄ| vgl. R.W al., Advanced Bacterial Gesaaticc,
Laboratory, New York I980, S.7)·

einem Verfahren von M. Dagert und S.D. Ehrlich, Gene £, 23-28 (1979) mit der DNS aus der Ligase-Umsetzung transformiert. Nach der Transformation wurde die Zellsuspension (0,6 ml) mit 8 ml L-Medium /E.S.Lennox, Virology 1_, I90 - 2O6 (1955)7 verdünnt und 1 Std. bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe weiterer XOO ml L-Medium und 50 (ig/ml Ampicillin wurde über Nacht bei 37 C inkubiert. Die Zellsuspension wurde auf M9-Agar mit 2 g/l Glucose, 20 mg/1 L-Leucin und 1 mg/1 Vitamin Bl ausplattiert. Nach kS Std. bei 37 C waren einzelne, prolinprototrophe Kolonien gewachsen.

Aus einigen dieser Kolonien, für welche sich in einem Fütterungsversuch mit den prolinbedürftigen Indikatorstaram E.coli LEPl wie in Beispiel la eine Ausscheidung von L-Prolin nachweisen Hess, wurde Plasmid-DNS isoliert. Bei der Analyse durch Agarose-Gelelektrophorese erwiesen sich diese Isolate als uneinheitlich, was auf: eine Instabilität des klonierten DNS-Fragments hinwies. Durch erneute Transformation und Selektion von anpicillinresistenten und prolinprototrophen Zellen wurde schliesslich ein Klon erhalten, aus dem sich ein einheitliches, stabiles Plasmid isolieren Hess, welches als pSB121 bezeichnet wurde.

Eine Restriktionskarte von pSB121 ist in Abb. 1 dargestellt. Sie weist nur eine Hindlll-Sequenz auf und ent hält nicht mehr den gesamten Vektor. Dies weist darauf hin, dass aus der primär gebildeten neukombinierten DNS ein Teilbereich abgespalten wurde, der sowohl Sequenzen des Vektors als auch des klonierten chromosouaalen Fragments und die zwischen beiden liegende HindllI-Sequenz umfasst.

Durch Transformation mit pSB121 wurde die proB-Mutante E.coli Xk7± /P- Broda, J. Bacteriol. 117, 7^1 -(197^)-/ prolinprototroph, woraus hervorgeht, dass

pSB121 neben proA auch das dicht benachbarte Gen proB trägt. Ein Fütterungsversueh wie oben beschrieb*»« zeigt, dass der Stamm E.coli HBlOl (pSB12l) L-Prolin produziert, währen E.coli HBlOl ohne Plasnsid kein L-Prolin ausscheidet.

c) Herstellung der Plasmide pSB12% und pSBlS5 _

pSB121 wurde durch Umsetzung mit dass Eestrikt!©Bseradonukleasen BamHI und BgIII in sswei Fragmente sait den Molekulargewichten 5860 Bp und II050 Bp zerlegt, das kiel= nere Fragment wurde durch präparative 6el©lektroph@res© in 0,7 % Agar öse und Elektroeluiion (B.©«> Smith, In. Methods in Enzymology, Vol. 6
I98O, S. 371) aus der

plasmid pBR322 /F. Bolivar ©t al., Gera© JS, 95 - 3-13 (1977)-7 wurde durch Umsetziarag rait BeEtHI lisa©avisiert

2,5 (ig lineares pBR322 und 6 p,g des BaniHI/BgllI von 5860 Bp aus pSB121 wurd©ii wi© im Beispiel Ib dtireh Umsetzung mit T4-Ligase k®iral©mt v©rksüpfto ©ies ist möglich, da durch BamHI und BgIII ©raewgt© EiHselstrajagenden die gleiche' Sequens iaab©n_o Dörels Tv&mm£®rm&t±Qn von E.coli RBlOl mit der MfS aus der Ligas©»1Dtasetzraäg und Selektion von arapicilliraresist©Eat©ra η&ά pr®liraprot©tr©=> phen Zellen wie in Beispiel Ib ward©m iae!ir©re Z©llkl©n® erhalten, aus denen sich sewei als pSB12% vrnd pSS125 bezeichnete Plasmid© isolieren liössera. Beide Qsathaltea je ein Molekül des FragEaeiits ©ms pSB121 w&d des mit BamHI linearisierten pEB.J22 wad w®.t®i?&che±a®n sieb raar durch die Orientierung ά@τ b©idesa fragmeat© sueinasid©r. Restriktionskarten von pSB12% ηηά pSB125 sind in ABB. 1 dargestellt. Sie weisen nur ©isa© BsbüHI- «ad" keine Bglll» Sequenz auf, da sich die durch ¥erkmiip£laiag ©in©s BanaHI-nait einem BglII-Eiazel®trang®ssd© esatstasidosa® SGqia©ns durch keines der beiden Snzyrae wi©d©5T spalten lässt»

Die Stämme E.coli HBlOl (pSB124) und E.coil HBlOl (pSB125) eind beide in der Lage, L-Prolin auszuscheiden, wie sich durch einen Fütterungeversuch in Beispiel la zeigen liess. Dies beweist, dass die Gene proA und proB(mut) auf dem BamHI/Bglll-Fragment von 586O Bp in pSB121 lokalisiert sind.

Beispiel 2:

Herstellung von Plasmiden mit den Genen proA, proB(mut) und proC

a) Herstellung der Plasmide pSB122 und pSB123

pSB53, welches die Gene phoA und proC auf einem chromosomalen Hindlll/BamHI-Fragment aus E.coli K12 von 4600 Bp trägt, ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. OO23882 beschrieben worden. Eine Restriktionskarte des Plasmids ist in Abb. 2 dargestellt. Das Gen proC befindet sich zwischen der Xholl- und der BamHI-Sequenz auf einem Fragment von 2020 Bp.

i pSB122 und pSB123 wurden durch Insertion des gleichen BaraHI/BglII-Fragments von 586O Bp, welches in Beispiel Ic zur Herstellung von pSB124 und pSB125 verwendet wurde und welches die Gene proA und proB(mut) trägt, in die BamHI-Sequenz von pSB53 in den beiden möglichen Orientierungen erhalten.

Zu einer Lösung von 12 μg pSB53» welches mit BamHI linearisiert worden war, und 9 Pg pSB121, welches mit BamHI und BgIII gespalten worden war, in 50 μΐ DNS-Puffer wurden 10 μΐ Ligase-Puffer (vgl. Beispiel Ib), 10 μΐ ATP (k raM), 25 μΐ Wasser und 5 μΐ T^-Ligase gegeben. Die Mischung wurde wie in Beispiel Ib inkubiert und aufgearbeitet. Als Wirt für die Transformation diente der Stamm E.coli SB4*t, eine phosphat as ennegative (phoA)-Mut ante von E.coli HBlOl. Dieser Stamm sowie ein Verfahren zur Selektion von phosphatasepositiven Zellen sind ebenfalls in

der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0023882 beschrieb©» < >

Nach der Transformation von E.coli SB hk wurden anapicil= linresistente, prolinprototrophe und phosphatasepositiv© Zellen selektioniert. Aus diesen Hessen sich die Plasmide pSB122 und pSB123 Isolieren, deren Restriktionskar·= te in Abb. 1 dargestellt ist.

i
Durch Transformation der proB und proC~Mutant©n E.coli Xkyk und E.coli LEPl Hess sich zeigen, dass pSB122 und pSB123 neben proA auch die Gene proB und proC tragen. Al-Ie Stämme mit pSB122 oder pSB123 ergaben eint positives Ergebnis in dem in Beispiel la beschriebenen Fütterung®= test und sind daher in der lag©, L-Prolim auszuscheiden.

b) Herstellung von ρSBl26

pSB126 ist aus pSB122 durch Eliminierung des E-IiEdIII/ Xhol-Fragments von 2580 Bp, welches das Gen phoA trägt, entstanden. pS3122 wurde durch Umsetzung mit Hindlll und Xhol in zwei Fragmente von 258Ο und 11900 Bp zerlegt₉ das grössere Fragment wurde durch preparative Galelek= trophorese und Elektroeluiion wie in Beispiel Ic trennt und isoliert.

Die Einzelstrangenden dieses Fragments wurden Starch Setzung mit T4-Polymerase (11000 Eißheiten/nä^. P„L.

Biochemicals Inc., Milwaukee, ffis., USA) zu Dop enden aufgefüllt. Die Reaktionaraischung enthielt 50 fil einer Lösung von 8 μg des Xhol/Siindlll-Fragifflaiats von II900 Bp, 10 μΐ Ligase-Puffar (vgl. Beispiel Ib), j© 5 μΐ von 1 mM Lösungen der k IDesoxywukleosid-tyiphogpliate dATP, dGTP, dTTP und dCTP, 10 μ1 Wasser und 10 μ1 eimer Verdünnung von T4-Polym©ra®@ mit 2,2 Einheiten. Die Mi-

o schung von insgesamt 100 fil wurde 30 Min. bei 37 C und zur Inaktivierung der Polymeres© 10 Min. bei 65 C gehalten. Danach wurden 5 μΐ Ligas©-Pu£fer, 15 μΐ ATP 10 μΐ Wasser und 20 μ1 T^-Ligas© zugefügt. Die

wurde wie in Beispiel Ib inkubiert und aufgearbeitet. Mit der DNS wurde E.coli S&kk trdssformiert, aus dem Transformationsansatz wurden ampicillinresistente, prolinprototrophe, phosphatasenegative Zellen selektioniert. Aus diesen Hess sich das Plasmid pSB126 isolieren, dessen Restriktionskarte in Abb. 1 dargestellt ist.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2a beschrieben, wurde für pSB126 bewiesen, dass es ausser proA auch proB und proC besitzt und eine Überproduktion von L-Prolin bewirkt .

Beispiel 3 J

Isolierung der Mutante E.coli SB2 und ihre Verwendung zur Produktion von L-Prolin in Verbindung mit Plasmiden aus Beispiel 1 und 2

a) Isolierung von E.coli SB2

E.coli SB2 wurde aus der antintetabolitresistenten Mutante E.coli SBl (Beispiel 1) durch Mutagenese mit 1-Nitroso-3-nitro-l-methyl-guanidin (NNMG) und Selektion von Zellen, die L-Prolin weder als Kohlenstoff-noch als Stickstoffquelle verwerten können, erhalten. Dazu wurde in bekannter Weise /E.A. Adelberg et al., Biochem. Biophys.Res. Comra. IjEJ₁ 788 - 795 (1965)./ eine Suspension von ίο" Zellen/ml E.coli SBl in einer Lösung von 9g/l NaCl durch lOminütige Einwirkung von 10 μg/ml NNMG mutagenisiert. Danach wurde überschüssiges Mutagen durch Waschen mit steriler NaCl-Lösung entfernt, die Zellen wurden in einer geeigneten Verdünnung auf M9-Agar mit 2 g/l Glucose als C-Quelle ausplattiert und bei 37 C bis zur Bildung von Einzelkolonien inkubiert. Mit Hilfe der Stempeltechnik wurden die Kolonien sowohl auf M9-Agar mit 2,5 g/l L-Prolin anstelle von Glucose (L-Prolin als einzige C-Quelle) als auch auf M9-Agar mit 2 g/l Glucose und 2,5 g/l L-Prolin anstelle von NH.C1 (L-Prolin als einzige N-Quelle) überführt. Es liessen sich mehrere Kolonien identifizie-

ren, die auf beiden prolinhaltigen Mediesa nietet Eine von diesen wurde unter der Bezeichnung E_oe®li für die weiteren Versuche eingesetzt.

b) Fermentative Herstellung von L-Prolin

Durch Transformation von E.coli SB2 mit, den pSB121, pSB122, pSB12^ und pSB126 uad Selektion ψ®ά ampicillinresistenten Kolonien wurden die effitsps^a©eh©md©a plasmidhaltigen E.coli-Stämme erhalten»

Ausgehend von einer frischen Eirazelkolomi© Stammes auf L-Agar mit 100 mg/1 Ampicillin wordora 2© sal L-Medium, welchem 100 mg/1 Ampicillin zugefügt sirad, too= impft. Die Kultur (1, Vorzueht) wird über Mast 37 ^c geschüttelt und dann zur Beimpfung von |?©( Medium mit 5 g/l Glucose, 1 g/l Casamino Acids und 100 mg/1 Ampicillin eingesetzt, welches 6 » ? Si bei 37°C geschüttelt wird (2.Vorssucht)f.

In einem 20 1-Glasfermenter, welcher eine steril© von 70 g Na₂HPOj₁^H₂O, 30 g KHgPO^, 10 g NH^CI raad 5 g NaCl in 8 1 Wasser enthält, werden 1 Liter Lösung von 500 g/l Glucose sowie 1 Liter e±m©2r stosrilaia Lösung, welche 200 g/l Mosaoraatiriraj-L-glutasaat ₀ 2,5 g/l MgSO. · 7H₃O und 10 mg/1 Vitamin Bl enthält, Fermenter wird mit der 2. Vorzieht beimpft uasndl tool 37°G, 0,7 atü Druck und einer BelüiTt'tang von 10 l/mlno mit 220 u/min, bis zum Erreichen dar maximalen trat ion (100 - 200 Std.) gerührt. Der pH-Wesrt laufende Zugabe einer 129^ig©m MH„-Lösumg mit SSilf© automatischen pH-Steuerung auf δ„5 gehalten»

In regelmässigen Abständen von 3 Proben entnommen, in denen dar Gehalt an L°Pr@lia siaeb einer Methode von F. P„Chisiard, J. Biol, Cheina»!^?¹.» (1952) bestimmt wird, welche &nt der Realstiom von L-

rait Ninhydrin in essigsaurer Lösung beruht (vgl. R.H. Abeles, in Methode in Enzymol. Vol. XVII B, Academic Press, New York 1971). Zur Bestätigung wird in einem kleinen Teil der Proben der ProlingfeÄalt durch einen quantitativen mikrobiologischen Test mit Hilfe der proC-Mutante E.coli LEPl gemessen. In einigen Proben aus der Schlussphase der Fermentation wird ausserdem das Verhältnis von ampicillinresistenten Zellen zur Gesamtkeimzahl als Mass für den Plasmidverlust ermittelt. Die plasmidfreien Stämme E.'coli SB2 werden in der gleichen Weise fermentiert mit dem einzigen Unterschied, dass die Vorzuchtmedien ampicillinfrei sind.

Die Ergebnisse dieser Fermentationen sind in Abb. 3 (plasmidfreie Stämme) tfnd in Tabelle 1 zusammengefasst.

TABELLE 1

Ergebnisse der fermentativen Herstellung von L-Prolin mit E.coli SB2 und plasmidhaltigen Abkömmlingen dieses Stammes in M9-Medium mit 50 g/l Glucose und. 20 g/l Mononatrium-L-glutamat, pH 6,5 *— ~~ - -·-

Stamm (Plasmid)	Maximale Konzentra tion von L-Prolin We/1*	Fermentations zeit t90(h) ♦	Produktivität c9o/t9O (g/l/h> *	ampicillin- resistente Zellen bei Fenaenta- tionsende
SB2	3,2	51	0,056	-
SB2 (pSB121)	4,1	46	0,080	>90 %
SB2 (pSB122)	6,0	49	0,110	75 - 80 * ·
SB2 (pSB124)	5,6	56	0,090	100 %
SB2 (pSB126)	5,3	51	0,094	100 %

gg gQ: Prolinkonzentration und Fennentationszeit bei Erreichen von 90 % der maximalen Prolinkonzentration

^cmax"

vr-Zi-

Beispiel k:

Isolierung der Mutante E.coli SB3 und ihre Verwendung zur Herstellung von L-Prdlin nach Transformation mit den Plasmiden pSB122, pSB124 und pSB126

a) Isolierung von E.coli SB3

Als Ausgangsstamm diente der Stamm E.coli SB2, welcher der in Beispiel 3a beschriebenen Weise mit NNMG mutagenisiert und gewaschen wurde. Danach wurden die Zellen einer geeigneten Verdünnung auf M9-Agar mit 2,0 coie un(t^20ii»Bg/l.JL»Leuci»^ffiusplattiert und bei y, zur Bildung von Einzelkolonien inkubiert. Durch auf M9-Agar mit 2,0 g/l Glucose ohne Aminosäiareausats konnten einige Kolonien mit einer Bedürftigkeit für L-Leucin identifiziert werden. Eine von diesen wurde water der Bezeichnung E.coli SB3 für die folgenden Versuche eingesetzt. Durch Überführung auf Agarmedien mit L-Proliira als einziger C- oder N-Quelle wie in Beispiel 3& liess sich zeigen, dass E.coli SB3 wie E.coli SB2 L-Prolin nicht als Kohlenstoff- oder Stickst off quelle verwerten kann«.

b) Fermentative Herstellung von L-Prolin

Durch Transformation mit den Plasmiden pSB122, pSB12% und pSB126, wie in Beispiel 3b, wurden die entsprechenden, von E.coli SB3 abgeleiteten plasmidhaltigen Stärane hergestellt. Die Fermentationen wurden unter den gleichen Bedingungen ausgeführt wie in Beispiel 3b mit dem einzigen Unterschied, dass den Medien für die Hauptfermentation 80 mg/1 L-Leucin zugesetzt wurde. Die Vorzuchten von plasmidfreiem E.coli SB3 erfolgten wiederum in Mediera ohne Ampicillin. Die Ergebnisse dieser Versuche sind isa Tabelle 2 zusammengefasst.

TABELLE 2

Ergebnisse der Fermentation von E.coil SB3 und plasmidhaltigen Abkömmlingen dieses Stammes in M9-Medium mit 50 g/l Glucose, 20 g/l Mononatrium-L-glutamat und 80 mg/1 L-Leucin, pH 6,5

Stamm (Plasmid)	Maximale Konzentra tion von L-Prolin	Fermentations zeit t90(h)	Produktivität Ο9ο/*90 (g/l/h)	ampicillin- resistente Zellen bei Feraenta- tionsende
SB3	5,5	77	0,064	-
SB3 (pSB122)	12,5	74	0,152	<10 %
SB3 (pSB124)	12,1	67	0,163	75*
SB3 (pSB126)	14,0	66	0,191	>8O#

Beispiel 5-

Ftrmentative Herstellung von L-Prolin unter Zusatz von Ampicillin

Die Stämme E.coli SB2 (pSB122) und E.coli SB3 (pSB122) wurden wie in Beispiel 3 b) bzw. 4 b) fermentiert mit dem einzigen Unterschied, dass auch dem Medium der Hauptfermentation 1OO mg/1 Ampicillin zugesetzt wurde.

Es ergaben sich die folgenden Werte für die maximale Konzentration an L-Prolin (c ) , die Fermentationszeit bis

max

zum Erreichen von 90% der maximalen Konzentration (t ) und für die aus den beiden Werten berechnete Produktivität

^Cmax⁽«^/:L)

90

E.coli SB2 (pSB122) E.coli SB3 (pSB122

6,8

51 93

0,120 0.156

Beispiel 6:

Fermentation von E.coli SB3 (pSB122) in Medium mit Casamino Acids anstelle von L-Leucin

Der Stamm wurde wie in Beispiel k b) fermentiert mit dem einzigen Unterschied, dass das Medium der Hauptfermente= tion 3» 5 g/l Casamino Acids anstelle von 80 mg/1 L-Leraeisa enthielt.

Die folgenden Werte für di© maximale Prolinkonzentratiosa. c , die Fermentationszeit t_Q_ und die Frodulstivität
__ wurden ermittelt;

t_9Q: 59 h

0,211 g/l/h

Leerseite

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1) Plasmide, die eine DNS-Sequenz mit den Genen proA

   und proB enthalten, wobei proB in einer mutierten Form vorliegt , die eine antimetabolitresietente y-Glutamyl-Kinas© codiert.

   2) Plasmid pSB 121

   3) Plasmid pSB 12*t k) Plasmid pSB 125

   5) Verfahren zur Herstellung von Plasmiden entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man chromosomal© DNS-Fragmente mit den Genen proA und proB für die Biosynthese von L-Prolin aus einer antimetabolitresistenten 23. eoli-Mutant© cloniert.

   6) Plasmid·, die eine DNS-Sequens mit den ß©n®n proA,

   proB (mutiert) und proC enthalten, mit proB in einer mutierten Form entsprechend Anspruch.

   7) Plasmid pSB 122"

   8) Plasmid pSB 123

   9) Plasmid pSB 126

   10) Verfahren zur Herstellung von Plaemiden entsprechend Aaspruola 6, dadurch gekennzeichnet, daß Ban durch in-vltsO-Neukombination ein Fragment mit den G^nen proA und JproB ©ntsprechead Anspruch 1 mit einem Fragsaeat Hit dem G©n p5?©G. auf eiaeia Plasmid vereinigt.

   U) Mutante E.coli SB

   12) Verwendung der Mutant® E.coli ^B 1 zur Herstellung d©a Plaa= mids pSB 121

   13) Mutante E.coli SB

   Verwendung der Mutante E.coli SB 2, die Plasmide nach Anspruch 1-4 oder 6-9 enthält, zur fermentativen Herstellung von L-Prolin.

   15) Mutante E.coli SB 3

   16) Verwendung der Mutante E.coli SB 3» die Plasmide nach Anspruch 1-4 oder 6-9 enthält, zur fermentativen Herstellung von L-Prolin.

   17) Verfahren zur Herstellung neuer Bakterienstämme, die Plasmide mit den Genen proA und proB (mutiert) enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man kompetente Zellen des betreffenden Stammes mit der Plasmid-DNS unter Transformationsbedingungen inkubiert und aus der Zellpopulation Antibiotika-resistente Zellen isoliert.

   18) Verfahren zur Herstellung neuer Bakterienstämme, die Plasmide mit den Genen proA; proB (mutiert) und proC enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man kompetente Zellen des betreffenden Stammes mit der Plasmid-DNS unter Transformationebedingungen inkubiert und aus der ZellpDpulation Antibiotika-resistente Zellen isoliert.

   19) Verfahren zur Herstellung Plasmid-haltiger E.coli SB 2-Stamme nach Anspruch 17·

   20) Verfahren zur Herstellung Plasmid-haltiger E.coli SB 3-Stamme nach Anspruch 18.

   21) Verfahren zur Herstellung von L-Prolin mit Hilfe von E.coli-Mutanten wie E.coli SB2 enthaltend Plasmide wie pSB121, pSB122, pSB124 oder pSB126, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme in einem Glutaminsäure-haltigen Mineralsalzmedium fermentiert und das gebildete L-Prolin nach bekannten Verfahren isoliert.

   22) Verfahren zur Herstellung von L-Prolin mit Hilfe von E.coli-Mutanten wie E.coli SB5 enthaltend Plasmide wie pSB122, TpSBlZk oder pSB126, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme in einem Glutaminsäure-haltigen Mineralsalsmedium unter Zusatz von L-Leucin fermentiert und das gebildet© L-Prolin nach bekannten Verfahren isoliert«.