CN114540211A - 一种春雷霉素发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种春雷霉素发酵方法。本发明提供的春雷霉素发酵方法，在发酵对数生长期，添加特殊的氮源，能够缩短发酵时间，并提高春雷霉素产量，提高单位时间产素量。为进一步提高春雷霉素产量并缩短发酵时间，在发酵对数生长期，添加特殊的生长因子，在发酵稳定期，添加春雷霉素合成前体，进一步地，对发酵对数期、稳定期和衰亡期进行变温控制，在发酵对数期，提高发酵温度至30～32℃；在稳定期，降低温度至26～28℃以延长产素时间，在衰亡期，提高发酵温度至32～34℃刺激放罐结束，为了进一步提高春雷霉素产量，将发酵培养基中的玉米油替换为经脂肪酶乳化的玉米油，以提高传质速率，且对合成春雷霉素有较明显的促进作用。

Description

一种春雷霉素发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，本发明涉及一种春雷霉素发酵方法。
背景技术
春雷霉素又名5-氨基-2-甲基-6-(2,3,4,5,6-羰基环己基氧代)吡喃-3-基氨基-α-亚氨醋酸，是1963年从日本良奈县春日神社境内的土壤中分离得到的一种放线菌(Sterptomyces Kasugaensis)所产生的氨基糖苷类抗生素，常用作农用杀菌剂，对水稻上的稻瘟病有优异防效和治疗作用。
目前春雷霉素主要是通过微生物发酵法而制得，国内春雷霉素的发酵生产多采用三级发酵，发酵周期在7-10天左右，春雷霉素的发酵水平在10-20g/L，因此，单罐产春雷霉素的产量低。如中国申请CN107828702A公开了一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法，该申请中的发酵周期为168～170h左右，发酵液中春雷霉素的平均效价在16g/L左右。目前，针对春雷霉素发酵水平低，主要从筛选高产菌株或菌株基因改造、发酵工艺优化等方面进行研究，如中国申请CN 109486881A，通过在培养基中添加春雷霉素发酵滤渣，能够使春雷霉素发酵滤渣得到循环利用(利用率可以达到80％以上)，减少春雷霉素发酵滤渣对环境污染，但该发酵液中春雷霉素的平均效价在8g/L左右，发酵水平较低。又如中国申请 CN106011201A，公开了一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养方法，采用传统的恒温发酵方法，虽然对发酵培养基进行了一定程度的改进，但春雷霉素的效价在15g/L左右。
因此，单批次产量较低带来的影响是生产相同量的春雷霉素需要较多的生产批次，废水废渣的量也较多，因此市场亟需开发一种提高单批次春雷霉素产量的生产方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供新的春雷霉素发酵方法，在发酵法生产春雷霉素过程中，在发酵对数生长期添加特殊的氮源，能够缩短发酵时间，并提高春雷霉素产量，提高单位时间产素量。为了进一步提高春雷霉素产量并缩短发酵时间，对发酵条件进行了进一步优化，在发酵对数生长期，添加特殊的生长因子，在稳定期添加春雷霉素合成前体。进一步地，对发酵对数期、稳定期和进行变温控制，在发酵对数期，提高发酵温度，在发酵稳定期，降低温度以延长产素时间，在衰亡期，提高发酵温度刺激放罐结束。为了进一步提高春雷霉素产量，将发酵培养基中的玉米油替换为经脂肪酶乳化的玉米油，以提高传质速率，且对合成春雷霉素有较明显的促进作用，提高了春雷霉素的的生产效率。
为此，本发明第一方面提供了一种春日链霉菌。根据本发明的实施例，所述春日链霉菌为春日链霉菌NK121-KN-01(Sterptomyces Kasugaensis NK121-KN-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020619。
发明人创造性的发现一种新型的春日链霉菌NK121-KN-01，利用该菌株作为发酵生产春雷霉素的发酵菌株，对春雷霉素合成有较明显的促进作用，能够提高春雷霉素的产量并缩短发酵时间，提高单批次春雷霉素产量，减少发酵产生的废水废渣量。
本发明第二方面提供一种春雷霉素的发酵方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：
将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，其中，在所述发酵培养的对数生长期额外添加氮源。
采用本发明特殊的发酵方法，在发酵对数生长期，额外添加氮源能够缩短发酵时间，并提高春雷霉素产量。
根据本发明的实施例，所述氮源为吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣。
采用本发明特殊的发酵方法，在发酵对数生长期，添加特殊的氮源能缩短发酵时间，能够进一步提高春雷霉素产量，缩短了2～20小时的培养时间。而不添加或添加其他的氮源，均无法达到添加吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣获得的发酵产量和发酵时间。
根据本发明的实施例，所述发酵方法还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣中总氮含量为 5～8wt％，氨基氮含量为1～3wt％。
所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣包含多种生物活性酶与活性成分，有利于菌体的快速生长繁殖与诱导合成代谢途径。
根据本发明的实施例，所述额外添加氮源的添加量为0.15～0.35wt％。
所述氮源的添加量需要进行精准控制，若添加量过多，会影响产物的合成代谢通路，形成抑制，导致春雷霉素的积累量减少。
根据本发明的实施例，所述发酵方法进一步包括在所述发酵培养的对数生长期额外添加生长因子，所述生长因子为发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液。
根据本发明的实施例，所述发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液中总糖含量为1～3wt％，还原糖含量为0.1～0.8wt％，溶磷含量为100～800ppm。
多粘芽孢杆菌的离心上清液包含多种多糖类物质，有利于菌体的快速生长繁殖。
根据本发明的实施例，以培养基的总重量计，所述额外添加生长因子的添加量为0.05～0.15wt％。
所述生长因子的添加量需要进行精准控制，若添加量过多，产量无明显提升，发酵时间也无明显缩短。
根据本发明的实施例，所述发酵方法进一步包括在所述发酵培养的稳定期添加合成春雷霉素的前体，所述合成春雷霉素的前体选自氨基葡萄糖、油酸、亚油酸。
添加春雷霉素的前体能进一步提高发酵产量。
根据本发明的实施例，以培养基的总重量计，所述合成春雷霉素的前体添加量为3～5 wt％。
根据本发明的实施例，所述合成春雷霉素的前体为油酸、亚油酸混合物，所述油酸和亚油酸的质量比为1:3～1:5。
春雷霉素在合成过程中，首先是将玉米油分解为油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸，发明人发现棕榈酸和硬脂酸不利于春雷霉素的合成，单独添加油酸和亚油酸的混合物对春雷霉素的发酵效果最好。
根据本发明的实施例，在所述发酵培养的对数生长期控制发酵温度在30～32℃，在所述发酵培养的稳定期控制发酵温度在26～28℃；在所述发酵培养的衰亡期控制发酵温度在 32～34℃。
采用本发明特殊的发酵方法，在发酵对数生长期，提高发酵温度至30～32℃；在发酵稳定期，降低温度至26～28℃能延长产素时间；在发酵衰亡期，提高发酵温度至32～34℃能刺激放罐结束。因此变温培养对春雷霉素整个发酵过程具有重要意义。
根据本发明的实施例，所述发酵培养基中含有经脂肪酶乳化的玉米油，含量为5～10 wt％。
本发明的发明人对春雷霉素发酵培养基进行了进一步的改进，利用含有经脂肪酶乳化的玉米油的培养基进行微生物发酵生产春雷霉素，能够提高传质速率，以促进春雷霉素的合成。发酵培养基添加经脂肪酶乳化的玉米油，能大大提高产春雷霉素产量。
根据本发明的实施例，所述经脂肪酶乳化的玉米油是通过将玉米油与脂肪酶进行乳化处理得到的。
根据本发明的实施例，进行乳化时，所述玉米油与脂肪酶的质量比1000:1～500:1。
根据本发明的实施例，所述脂肪酶酶活为10万U/g。
发酵培养基中添加的经脂肪酶乳化的玉米油的含量过高，延长发酵时间，降低了底物转化率；添加的经脂肪酶乳化的玉米油的含量过低，导致春雷霉素的积累量较低。
根据本发明的实施例，所述发酵培养基中还含有黄豆饼粉、玉米浆、谷氨酸钠、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。
根据本发明的实施例，所述发酵培养基中进一步含有黄豆饼粉3～8wt％、玉米浆0.15～0.5wt％、谷氨酸钠0.5～2wt％、KH2PO4 0.1～0.3wt％、MgSO4·7H2O 0.08～0.2wt％、 MnSO4·7H2O 0.0005～0.002wt％、FeSO4·7H2O 0.0005～0.002wt％。
采用本发明提供的特殊的发酵培养基，能够提高传质速率，以促进春雷霉素的合成。
根据本发明的实施例，所述种子液中的菌株为春日链霉菌NK121-KN-01(Sterptomyces Kasugaensis NK121-KN-01)，于2020年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020619。
在发明人对发酵条件进一步优化，获得一种缩短发酵时间，提高单批次春雷霉素产量的生产方法的基础上，本发明的发明人创造性的发现一种新的春日链霉菌，其用于发酵生产春雷霉素，能够进一步提高春雷霉素产率。
本发明提供的发酵方法，在发酵对数生长期，额外添加特殊的氮源，能够缩短发酵时间，并提高春雷霉素产量。为了进一步提高春雷霉素产量并缩短发酵时间，对发酵条件进行了进一步优化，在发酵对数生长期，额外添加特殊的生长因子，在发酵稳定期，添加春雷霉素合成前体，进一步的，对发酵对数期、稳定期和衰亡期进行变温控制，在发酵对数期，提高发酵温度至30～32℃；在发酵稳定期，降低温度至26～28℃以延长产素时间，在衰亡期，提高发酵温度至32～34℃刺激放罐结束。另外，为了进一步提高春雷霉素产量，将发酵培养基中的玉米油替换为经脂肪酶乳化的玉米油加入发酵培养基中，以提高传质速率，且对合成春雷霉素有较明显的促进作用，提高了春雷霉素的的生产效率。本方法应用于工业大规模生产春雷霉素具有重要的意义。本发明提供的发酵方法，发酵14天产量为30g/L 左右，相比发酵周期在7-10天春雷霉素的发酵水平在10-20g/L的技术而言，生产相同量的春雷霉素需要的发酵批次更少，从而产生的废水废渣量也相应更少，从节能减排方面，本发明具有重要意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
保藏信息：
菌株名称：春日链霉菌NK121-KN-01
Streptomyces Kasugaensis NK121-KN-01
保藏日期：2020年10月21日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
保藏编号：CCTCC NO：M 2020619
保藏地：中国.武汉.武汉大学
菌株名称：吸水链霉菌KN-055
Streptomyces hygroscopicus KN-055
保藏日期：2015年10月15日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
保藏编号：CCTCC NO:M 2015605
保藏地：中国.武汉.武汉大学
菌株名称：多粘芽孢杆菌KN-03
Bacillus polymyxa KN-03
保藏日期：2012年3月13日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
保藏编号：CCTCC NO:M 2012077
保藏地：中国.武汉.武汉大学
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。以下试验中使用的春日链霉菌为春日链霉菌Streptomyces Kasugaensis NK121-KN-01，吸水链霉菌发酵井冈霉素的发酵菌株为吸水链霉菌KN-055，多粘类芽孢杆菌发酵均为多粘芽孢杆菌KN-03，但本申请不局限于这些菌株，同种的菌株均可实现本发明。
根据本发明一个具体的实施例，吸水链霉菌为吸水链霉菌KN-055(Streptomyceshygroscopicus KN-055)，于2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2015605。
根据本发明一个具体的实施例，多粘芽孢杆菌为多粘芽孢杆菌KN-03(Bacilluspolymyxa KN-03)，于2012年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:M 2012077。本发明提供的春雷霉素的发酵方法，通过以下步骤实现：
1、种子液的获取
种子液中的菌株为春日链霉菌，于2020年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020619。
本发明中的种子液可按照本领域常规的春日链霉菌种子液的获取方式。
根据本发明一个具体的实施例，种子液通过一下一级和二级培养获取：
(a)一级种子培养：将活性春日链霉菌菌液按照体积比例0.8％至1.5％(优选1％)接种到一级种子培养基，控制培养温度25～27℃之间，优选26℃，通气量0.8VVM～1.2VVM，培养40～48h，获得一级种子液；所述一级种子培养基按照质量比例包括：葡萄糖0.5％～1％，优选0.8％，黄豆饼粉1％～1.5％，优选1.2％，蛋白胨0.5％～1％，优选0.8％，NaCl0.1％～0.3％，优选0.18％，(NH4)2SO4 0.2％～0.7％，优选0.5％，酵母粉1％～3％，优选1.5％，调pH在5.5～6.5 之间，0.11Mpa～0.12Mpa灭菌30分钟，使其处于无菌状态。
(b)二级种子培养：将一级种子液按照体积比例1％～3.5％(优选2％)接种到二级种子培养基，控制培养温度26～28℃(优选27℃)之间，通气量1VVM～1.5VVM，培养8～12h获得所述种子液；所述二级种子培养基按照质量比例包括：葡萄糖1％～1.5％，优选1.2％，黄豆饼粉1％～3％，优选1.5％，玉米油3％～5％，优选3.5％，(NH4)2SO4 0.5％～1.5％，优选 1％，谷氨酸钠0.8％～1.5％，优选1％，KH2PO4 0.1％～0.3％，优选0.15％，MgSO4·7H2O0.003％～0.015％，优选0.01％，MnSO4·7H2O 0.0005％～0.0025％，优选0.001％，FeSO4·7H2O 0.0005％～0.0025％，优选0.001％，调pH在6.0～6.5之间，0.11Mpa～0.12Mpa灭菌30分钟，使其处于无菌状态。
2、春日链霉菌发酵制备春雷霉素
在本发明的一些具体的实施方案中，本发明提供的春雷霉素的的发酵方法，包括以下步骤：
1)将种子液按照体积比例12％～18％接入装有培养基的发酵罐，优选15％，流加酸碱控制pH值在6.5～7.5之间，优选6.8；
所述培养基包括：玉米油8％，黄豆饼粉3～8wt％，优选5wt％，玉米浆0.15～0.5wt％，优选0.3wt％，谷氨酸钠0.5～2wt％，优选1wt％，KH2PO4 0.1～0.3wt％，优选0.15wt％， MgSO4·7H2O 0.08～0.2wt％，优选0.1wt％，MnSO4·7H2O 0.0005～0.002wt％，优选0.001wt％， FeSO4·7H2O 0.0005～0.002wt％，优选0.001wt％，消泡剂0.02～0.15wt％，优选0.1wt％，调节pH 6.5～7.5之间，0.11Mpa～0.12Mpa灭菌30分钟，使其处于无菌状态。
2)发酵对数生长期，维持发酵温度27～28℃；
分1～3批次额外添加氮源，优选地，分2次添加，
氮源每次添加量0.15～0.35wt％，优选氮源添加量为0.2wt％；
氮源为吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣。吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣包含多种生物活性酶与活性成分，有利于菌体的快速生长繁殖与诱导合成代谢途径。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣通过以下方式获取：
将吸水链霉菌发酵结束后的发酵液(活菌体含量为107～108cfu/ml)，经过振动筛过滤，然后板框压滤后得到的湿菌体，再烘干后得到，其中吸水链霉菌发酵菌株为吸水链霉菌 KN-055，保藏编号为CCTCC NO.2015605。
所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣中总氮含量为5～8wt％，氨基氮含量为1～3wt％。
3)发酵稳定期，维持发酵温度27-28℃；
在发酵稳定期分1～3批次添加合成春雷霉素的前体，优选地，分3次添加，
所述合成春雷霉素的前体选自氨基葡萄糖、油酸、亚油酸；
以培养基的总重量计，所述合成春雷霉素的前体添加量为3～5wt％，优选4wt％。
优选地，所述合成春雷霉素的前体优选为油酸和亚油酸的混合物；所述油酸和亚油酸的质量比为1:3～1:5，优选1:4。
4)发酵衰亡期，维持发酵温度27～28℃；
5)发酵结束后，从发酵液中获取春雷霉素。
在本发明的一些优选的实施方案中，在发酵对数生长期，额外添加特殊的生长因子，生长因子为发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液。多粘芽孢杆菌的离心上清液包含多种多糖类物质，有利于菌体的快速生长繁殖。
所述发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液通过以下方式获取：
将多粘芽孢杆菌发酵生产结束后的发酵液，经过振动筛过滤，然后再经离心机除去沉淀后获得的上清液，其中多粘芽孢杆菌发酵菌株为多粘芽孢杆菌KN-03，保藏编号为CCTCC NO.2012077。
所述发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液中总糖含量为1～3wt％，还原糖含量为0.1～0.8 wt％，溶磷含量为100～800ppm。
在本发明的一些优选的实施方案中，在所述发酵培养的对数生长期控制发酵温度在 30～32℃，在所述发酵培养的稳定期控制发酵温度在26～28℃；所述发酵衰亡期控制发酵温度在32～34℃。
在本发明的一些更为优选的实施方案中，在所述发酵培养的对数生长期控制发酵温度在31℃，在所述发酵培养的稳定期控制发酵温度在27℃；所述发酵衰亡期控制发酵温度在 33℃。
在本发明的另一些优选的实施方案中，在对发酵培养进行温度控制，进行变温发酵的基础上，在发酵培养基中将玉米油替换为经脂肪酶乳化的玉米油。
所述脂肪酶乳化的玉米油是通过将玉米油与脂肪酶进行乳化处理所得到的，
进行乳化时，所述玉米油与脂肪酶的质量比1000:1～500:1；
所述脂肪酶酶活为10万U/g(诺维信酶制剂公司)。
以培养基的总重量计，所述发酵培养基中含有的经脂肪酶乳化的玉米油的含量为5～10 wt％，优选8wt％。
发酵培养的对数生长期、稳定期、衰亡期阶段可根据发酵菌株的生长曲线进行确定，如采用春日链霉菌NK121-KN-01时，发酵过程大体可以分为三个阶段，第一阶段是发酵前期，即菌体的对数生长期，此时期主要目标是提高生产菌株的浓度，时间段为0至36小时；第二阶段是产素期，即发酵稳定期，此时期主要目标是积累春雷霉素产量，时间段为36小时至288小时；第三阶段是发酵末期，即发酵衰亡期，此时期菌体自溶并伴随大量代谢副产物及毒素的生成，时间段为288至336小时。本发明提供的发酵方法适当的延长稳定期并提高转化率，以积累更多的春雷霉素，发酵末期刺激放罐以减少非目的产物的积累。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、发酵培养的对数生长期添加氮源
一种高产春雷霉素的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将种子液按照体积比例15％接入装有培养基的发酵罐，流加酸碱控制pH值在6.8。
所述培养基按照质量比例包括：玉米油8％，黄豆饼粉5％，谷氨酸钠1％，玉米浆0.3％， KH2PO4 0.15％，MgSO4·7H2O 0.1％，MnSO4·7H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，消泡剂0.1％，调节pH 7，0.11Mpa灭菌30分钟，使其处于无菌状态。
所述种子液制备方法：
(a)一级种子培养：将活性春日链霉菌菌液按照体积比例1％接种到一级种子培养基，控制培养温度26摄氏度，通气量1.2VVM，培养40小时，获得一级种子液；所述一级种子培养基按照质量比例包括：葡萄糖0.8％，黄豆饼粉1.2％，蛋白胨0.8％，NaCl 0.18％， (NH4)2SO4 0.5％，酵母粉1.5％，调pH至6.5之间，0.11Mpa灭菌30分钟，使其处于无菌状态。
(b)二级种子培养：将一级种子液按照体积比例2％接种到二级种子培养基，控制培养温度27摄氏度，通气量1.5VVM，培养8小时获得所述种子液；所述二级种子培养基按照质量比例包括：葡萄糖1.2％，黄豆饼粉1.5％，玉米油3.5％，(NH4)2SO4 1％，谷氨酸钠 1％，KH2PO4 0.15％，MgSO4·7H2O 0.01％，MnSO4·7H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，调pH至6.5，0.11Mpa灭菌30分钟，使其处于无菌状态。
(2)发酵对数生长期，发酵温度27℃；
所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣通过以下方式获取：
将吸水链霉菌KN-055发酵结束后的发酵液(活菌体含量为107～108cfu/ml)，经过振动筛过滤，然后板框压滤后得到的湿菌体，再烘干后得到，其中吸水链霉菌发酵菌株为吸水链霉菌KN-055，保藏编号为CCTCC NO.2015605。
所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣中总氮含量为5～8wt％，氨基氮含量为1～3wt％。
(3)发酵稳定期，发酵温度27℃；
(4)发酵衰亡期，发酵温度27℃；
(5)发酵结束后，从发酵液中获取春雷霉素。
采用上述发酵方法，在发酵对数生长期，可选择春雷霉素发酵开始后第18h和第36h，分别向不同的平行试验样品中分2批次添加不同的氮源，氮源占培养基总重量的0.2％，氮源具体添加种类如表1所示，发酵结束统计春雷霉素产量，结果见表1。
下表1显示了在发酵培养的对数生长期，向培养基中添加不同的氮源，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表1
Figure RE-GDA0002938562800000091
表1数据显示，在上述发酵方法中，在发酵培养的对数生长期额外添加氮源要比未添加氮源，获得的春雷霉素产量更高，并且缩短了发酵时间。对数生长期加入本发明中的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣，要比其他常用的氮源，如酵母粉、生物肽素、蛋白胨更能够提高春雷霉素产量，并且进一步缩短了发酵时间。
实施例2、发酵培养的对数生长期添加的氮源用量的优化
本实施例提供的发酵方法与实施例1中样品3的发酵条件相同，不同之处仅在于在发酵培养的对数生长期对添加的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣设置不同的氮源用量，以探索出最有利于提高春雷霉素产量的氮源的用量，结果见表2。
表2显示了在发酵培养的对数生长期，向培养基中添加不同用量的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表2
样品序号 氮源占培养基总重量％ 春雷霉素产量 发酵时间
1 0.05 23.5g/L 358h
2 0.15 24.2g/L 352h
3 0.2 24.7g/L 350h
4 0.35 24.5g/L 352h
5 0.6 24.1g/L 352h
表2中结果显示，样品2～4中在发酵培养的对数生长期加入的氮源吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣的用量只有在本发明的保护范围内，即占培养基总重量0.15～0.35％时，才能获得较高的春雷霉素产量，而小于0.15％，则无明显提升效果，大于0.35％，则会影响合成代谢。
实施例3、发酵培养的对数生长期额外添加氮源和生长因子
本实施例提供的发酵方法与实施例2中样本3的发酵条件相同，不同之处仅在于向发酵培养的对数生长期额外再添加不同的生长因子，每种生长因子分2批次添加，分别是发酵的第18小时和第36小时。
表3显示了在发酵培养的对数生长期，向培养基中添加本发明中氮源和不同的生长因子，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表3
Figure RE-GDA0002938562800000101
Figure RE-GDA0002938562800000111
表3中结果显示，在发酵培养的对数生长期加入本发明提供的特殊的氮源和不同的生长因子，能够进一步提高春雷霉素产量。并且，在发酵培养的对数生长期加入氮源吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣以及生长因子发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液，获得的春雷霉素产量要高于其他的氮源和生长因子组合，同时也进一步缩短了发酵时间。
实施例4、发酵培养的对数生长期额外添加生长因子用量的优化
本实施例提供的发酵方法与实施例3中样品3的发酵条件相同，不同之处仅在于在发酵培养的对数生长期对添加的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液设置不同的用量，以探索出最有利于提高春雷霉素产量的生长因子的用量。
表4显示了在发酵培养的对数生长期，向培养基中添加吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣和不同用量的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表4
Figure RE-GDA0002938562800000112
Figure RE-GDA0002938562800000121
表4中结果显示，在发酵培养的对数生长期向培养基中加入吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣的基础上，进一步向培养基中额外加入的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液的用量只有在本发明的保护范围内，即占培养基总重量0.05～0.15％时，才能获得较高的春雷霉素产量，而小于0.05％，则无明显效果，大于0.15％，产量无明显提升，发酵时间也无明显缩短。
实施例5、发酵培养的稳定期添加合成春雷霉素的前体
本实施例提供的发酵方法与实施例4中的样本序号3的条件相同，即在发酵培养的对数生长期，向培养基中分2批次添加0.2％的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣和 0.1％的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液。在此基础上，在发酵稳定期，可选择春雷霉素发酵开始后96h、120h、144h，分别向不同的平行试验样品中分3批次添加不同的春雷霉素合成前体组合，春雷霉素合成前体添加量占培养基总重量的4％，未添加合成前体(对数生长期添加了氮源和生长因子)作为对照，统计发酵时间和春雷霉素产量。
下表5显示了在发酵培养的稳定期，向培养基中添加不同的春雷霉素合成前体组合，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表5
样品序号 合成前体 春雷霉素产量 发酵时间
1 油酸 26.2g/L 338h
2 亚油酸 26.3g/L 338h
3 油酸:亚油酸＝1:4 26.8g/L 335h
对照 — 26g/L 340h
表5数据显示，在上述发酵方法中，在发酵培养的稳定期添加春雷霉素合成前体，能够进一步提高春雷霉素产量，并且同时添加油酸和亚油酸混合物获得的春雷霉素产量要高于仅添加油酸或亚油酸合成前体的实验组。
实施例6、发酵培养的稳定期添加合成春雷霉素的前体的用量的优化
本实施例提供的发酵方法与实施例5中样品3的发酵条件相同，不同之处仅在于在发酵培养的稳定期对添加的春雷霉素合成前体油酸和亚油酸设置不同的合成前体用量以及油酸和亚油酸之间的不同比例，以探索出最有利于提高春雷霉素产量的春雷霉素合成前体的用量。
表6显示了在发酵培养的稳定期，向培养基中添加不同用量的春雷霉素合成前体和油酸和亚油酸的比例(重量比)，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表6
样品序号 合成前体占培养基总重量％ 春雷霉素产量 发酵时间
1 1(油酸:亚油酸＝1:4) 26.2g/L 340h
2 3(油酸:亚油酸＝1:4) 26.3g/L 337h
3 4(油酸:亚油酸＝1:4) 26.8g/L 335h
4 5(油酸:亚油酸＝1:4) 26.8g/L 336h
5 8(油酸:亚油酸＝1:4) 26.3g/L 340h
6 4(油酸:亚油酸＝1:1) 26.7g/L 335h
7 4(油酸:亚油酸＝1:3) 26.75g/L 335h
8 4(油酸:亚油酸＝1:5) 26.77g/L 335h
9 4(油酸:亚油酸＝1:8) 26.72g/L 335h
表6数据显示，在上述发酵方法中，在发酵培养的稳定期添加春雷霉素合成前体添加量只有在本发明的保护范围内，即占培养基总重量为3～5％时，才能获得较高的春雷霉素产量，并且只有当油酸和亚油酸的质量比为1:3～1:5时，才能够进一步提高春雷霉素产量。
实施例7、发酵培养过程中的温度控制
本实施例提供的发酵方法与实施例6中样本3的发酵条件相同，即在发酵培养的对数生长期，向培养基中分2批次添加0.2％的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣和0.1％的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液，在发酵培养的稳定期，分3批次添加的春雷霉素合成前体油酸和亚油酸的混合物，并且油酸:亚油酸＝1:4(重量比)，不同之处仅在于改变发酵对数生长期(开始发酵后5小时)，稳定期(开始发酵后36小时)和发酵衰亡期(开始发酵后288小时)的温度，以探索出最有利于菌株生长和提高春雷霉素产量的温度条件。
表7显示了发酵培养过程中的温度条件对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表7
Figure RE-GDA0002938562800000131
Figure RE-GDA0002938562800000141
表7中结果显示，发酵培养过程中，在对数生长期控制发酵温度在30～32℃，在发酵培养的稳定期控制发酵温度在26～28℃，发酵衰亡期控制发酵温度在32～34℃，相对于恒温发酵，能够提高春雷霉素的产量，同时减少发酵时间。
实施例8、发酵培养基的优化
本实施例提供的发酵方法与实施例7中的样品3的发酵条件相同，即在发酵培养的对数生长期，向培养基中分2批次添加0.2％的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣和 0.1％的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液，在发酵培养的稳定期，分3批次添加的春雷霉素合成前体油酸和亚油酸的混合物，并且油酸:亚油酸＝1:4(重量比)，控制发酵对数生长期温度31℃，稳定期温度27℃，发酵衰亡期温度33℃，不同之处仅在于在发酵开始前，将发酵培养基中的玉米油替换为经脂肪酶乳化的玉米油(占培养基总重量的8％)，添加等量玉米油的培养基作为对照。
制备经脂肪酶乳化的玉米油时，玉米油与脂肪酶的重量比500:1，脂肪酶的酶活为10 万U/g。
下表8显示了在发酵开始前，向发酵培养基中添加未经处理的玉米油和经脂肪酶乳化的玉米油，对发酵时间和春雷霉素产量的影响。
表8
样品序号 添加物 春雷霉素产量 发酵时间
1 经脂肪酶乳化的玉米油 29.8g/L 324h
对照 未经处理的玉米油 28.8g/L 330h
表8中结果显示，在发酵培养基中加入经脂肪酶乳化的玉米油，相比未经处理的玉米油，能够进一步提高春雷霉素的产量并缩短发酵时间。
实施例9发酵菌株的选择
本实施例提供的发酵方法与实施例8中的样品1的发酵条件相同，即在发酵培养的对数生长期，向培养基中分2批次添加0.2％的吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣和 0.1％的发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液，在发酵培养的稳定期，分3批次添加的春雷霉素合成前体油酸和亚油酸的混合物，并且油酸:亚油酸＝1:4(重量比)，控制发酵对数生长期温度31℃，稳定期温度27℃，发酵衰亡期温度33℃，将发酵培养基中的玉米油替换为经脂肪酶乳化的玉米油(占培养基总重量的8％)。利用本发明中春日链霉菌NK121-KN-01 和市售的小金色链霉菌分别进行发酵制备春雷霉素，获得的发酵时间和春雷霉素产量如下表9所示。样品3为对照，其与实施例1中发酵方法相同，不同之处仅在于未在发酵对数生长期额外添加氮源。
表9
样品序号 菌种名称 春雷霉素产量 发酵时间
1 春日链霉菌NK121-KN-01 30g/L 324h
2 小金色链霉菌 13g/L 150h
3 小金色链霉菌 11g/L 168h
表9中结果(样本2和样本3)显示，利用本发明优化后的发酵条件，同样能提高除了春雷霉素之外的其他的菌株(例如市售的小金色链霉菌)发酵生产春雷霉素的产量，缩短发酵时间(样本3为常规的小金色链霉菌发酵水平，其与实施例1中发酵方法相同，不同之处仅在于未在发酵对数生长期额外添加氮源，样本2为小金色链霉菌利用本发明的方法后的发酵水平)；但小金色链霉菌的发酵时间短、产量较低(通常时间为7天到10天，延长发酵时间菌体自溶，不能产生同等高的产量)，常规水平168h产11g/L，其效率为 0.065g/L/h，利用本发明后提升至150h产13g/L，其效率为0.087g/L，而本发明的春日链霉菌324h产30g/L的春雷霉素，其效率为0.093g/L/h；相对于本领域常规的恒温发酵方法，本发明中发酵方法能够显著提高单位时间产素量，减少发酵批次，减少废水废渣量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1.一种春日链霉菌，其特征在于，所述春日链霉菌为春日链霉菌NK121-KN-01(Sterptomyces Kasugaensis NK121-KN-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020619。
2.一种春雷霉素的发酵方法，其特征在于，包括：
将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，
其中，在所述发酵培养的对数生长期额外添加氮源。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述氮源为吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述吸水链霉菌发酵井冈霉素后的板框压滤废渣中总氮含量为5～8wt％，氨基氮含量为1～3wt％。
5.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，以培养基的总重量计，所述额外添加氮源的添加量为0.15～0.35wt％。
6.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法进一步包括在所述发酵培养的对数生长期额外添加生长因子，所述生长因子为发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵多粘芽孢杆菌后的离心上清液中总糖含量为1～3wt％，还原糖含量为0.1～0.8wt％，溶磷含量为100～800ppm。
8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，以培养基的总重量计，所述生长因子添加量为0.05～0.15wt％。
9.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法进一步包括在所述发酵培养的稳定期添加合成春雷霉素的前体，所述合成春雷霉素的前体选自氨基葡萄糖、油酸、亚油酸；
任选地，以培养基的总重量计，所述合成春雷霉素的前体添加量为3～5wt％；
任选地，所述合成春雷霉素的前体为油酸、亚油酸混合物，所述油酸和亚油酸的质量比为1:3～1:5。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，在所述发酵培养的对数生长期控制发酵温度在30～32℃，在所述发酵培养的稳定期控制发酵温度在26～28℃；在所述发酵培养的衰亡期控制发酵温度在32～34℃。
11.根据权利要求10所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有经脂肪酶乳化的玉米油，含量为5～10wt％。
12.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基中还含有黄豆饼粉、玉米浆、谷氨酸钠、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O；
任选地，以培养基的总重量计，所述发酵培养基中进一步含有黄豆饼粉3～8wt％、玉米浆0.15～0.5wt％、谷氨酸钠0.5～2wt％、KH2PO4 0.1～0.3wt％、MgSO4·7H2O 0.08～0.2wt％、MnSO4·7H2O 0.0005～0.002wt％、FeSO4·7H2O 0.0005～0.002wt％。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述种子液中的菌株为春日链霉菌NK121-KN-01(Sterptomyces Kasugaensis NK121-KN-01)，于2020年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020619。
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