CN109662100A - 一种多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物，其包括由多粘类芽孢杆菌和春雷霉素组成的有效成分，其中添加有适宜的农用助剂，制成常用农药剂型。本发明对水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病等多种作物病害有较好的防治效果，能协同作用提高防治效率，减少化学农药使用，有效降低生态破坏和环境污染，对人畜、有益生物、环境安全。
Description
技术领域
本发明属于农用杀菌剂领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物。
背景技术
多粘类芽孢杆菌是一类重要的根际有益细菌，兼具促进植物生长和生物防治的作用, 在生物医药、流程制造、生物修复等方面有重要利用。多粘类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质, 如酶、抗菌物质、植物生长调节剂等, 多是蛋白质、多糖、多肽。多粘类芽孢杆菌以芽孢形式存在，耐温性好，具有“以菌治菌”的作用，且药效持久，不仅是防治青枯病、枯萎病、根腐病、软腐病等土传病害最理想的药剂，而且具有明显的促进生长、提高产量、改善品质的作用；无任何药害和残留，是无公害、绿色、有机蔬菜生产的首选微生物制剂。由于生物制剂类农药产品普遍存在速效性不强、应用的菌株生物活性不高或贮存过程中菌株易于消解等因素，往往导致应用效果差。多粘类芽孢杆菌目前在我国应用并不多，已登记的制剂产品仅8个，其中与井岗霉素复配的产品1个。本发明人通过大量试验筛选出了多粘类芽孢杆菌DN-1，对多种病原物具有显著的拮抗作用，其中对油茶炭疽病防效可达77%；对水稻纹枯病防效可达75%；其发酵产物也具有显著的抑菌作用。
春雷霉素是由春日链霉菌所产生的氨基糖苷类抗生素，自研发以来，在亚洲和南美洲广泛应用于农业生产，对水稻稻瘟病防效较好，对马铃薯、黄瓜、芹菜、高粱、辣椒、菜豆等多种作物上病害都有较好的防治效果。目前在我国登记的产品已达100余种，用于水稻、烟草等及多种果树作物病害防治。
发明内容
本发明分别采用稀释平板法分离和平板对峙法筛选，获得一株对灰梨孢、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢等多种真菌具有显著抑制作用的多粘类芽孢杆菌DN-1，并在此基础上提供了一种该多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的新型杀菌组合物，对水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病具有较好的防治效果，利用多粘类芽孢杆菌DN-1芽孢、发酵产物中抗菌物质和春雷霉素协同作用，极大提高了防治效率。本发明提供的杀菌组合物其中有效成分均为生物或生物源农药，专利产品转化和推广后能大量减少化学农药的使用，同时两种有效成分的复配扩大了药剂防治谱，减少用药次数，从而实现经济、高效、环保的发明目的。
本发明的技术方案如下：
采用稀释平板法从土壤中分离多株细菌，利用平板对峙法，测定它们对灰梨孢、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢等真菌的抑制活性，获得具有显著抑菌效果的多粘类芽孢杆菌。通过形态学及种水平保守基因16SrDNA序列相似性进行鉴定，并命名为多粘类芽孢杆菌DN-1。序列如下：
TCTAACTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCCTGGTAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTTTGACCGGTCTAGAGATAGACCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTG
以筛选获得的多粘类芽孢杆菌DN-1与春雷霉素复配得到杀菌组合物，其中多粘类芽孢杆菌DN-1含量为（10～30）亿芽孢/g，春雷霉素的质量百分数为（1～10）%。
所述的杀菌组合物，优选的多粘类芽孢杆菌含量为（10～30）亿芽孢/g，春雷霉素的质量百分数为（2～4）%。
所述的杀菌组合物，其剂型加工为水悬浮剂、可湿性粉剂。采用的农用杀菌剂助剂包括表面活性剂、增稠剂、酸度调节剂、防冻剂、消泡剂、填料等各类助剂。采用的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钙、木质素磺酸钙、木质双酸钠、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐、蓖麻油与环氧乙烷缩合物、烷基酚聚氧乙烯基醚、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯中的一种或多种的混合；采用的增稠剂为黄原胶、硅酸镁铝中的一种或两种混合；所述的酸度调节剂为醋酸；采用的防冻剂为乙二醇、丙三醇中的一种或两种的组合；采用的消泡剂为磷酸三丁酯、有机硅油消泡剂中的一种或两种的组合，采用的填料为高岭土、凹凸棒土、白炭黑、玉米淀粉中的一种或几种的组合。
所述的杀菌组合物制备成水悬浮剂的方法是：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌DN-1活菌及发酵液，混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节pH值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。
所述的杀菌组合物制备成可湿性粉剂的方法是将春雷霉素、固态表面活性剂与填料混合均匀，气流粉碎，得半成品A，将多粘类芽孢杆菌发酵液及活菌用半成品A进行吸附，混合均匀，冷冻干燥，即得成品。
所述的杀菌组合物用于防治水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病等多种作物病害。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实质并不限于下述实施例。
实施例1
30亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 30亿芽孢/g；
春雷霉素 2%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
多粘类芽孢杆菌DN-1发酵液和水 余量。
制备方法：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌活菌及发酵液，混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节pH值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。
实施例2
30亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•3%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 30亿芽孢/g；
春雷霉素 3%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
多粘类芽孢杆菌DN-1发酵液和水 余量。
制备方法，同实施例1。
实施例3
30亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•4%春雷霉素水剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 30亿芽孢/g；
春雷霉素 4%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
多粘类芽孢杆菌DN-1发酵液和水 余量。
制备方法：同实施例1。
实施例4
10亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 10亿芽孢/g；
春雷霉素 2%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
多粘类芽孢杆菌DN-1发酵液和水 余量。
制备方法，同实施例1。
实施例5
20亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 20亿芽孢/g；
春雷霉素 2%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
多粘类芽孢杆菌DN-1发酵液和水 余量。
制备方法，同实施例1。
实施例6
20亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 30亿芽孢/g；
春雷霉素 2%；
2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐 2%
木质素磺酸钙 4%；
白炭黑 7%；
高岭土 余量/2 ；
凹凸棒土 余量/2。
制备方法：所述的杀菌组合物制备成可湿性粉剂的方法是将春雷霉素、固态表面活性剂与填料混合均匀，气流粉碎，得半成品A，将多粘类芽孢杆菌发酵液及活菌用半成品A进行吸附，混合均匀，冷冻干燥，即得成品。
实施例7
20亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•3%春雷霉素可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 20亿芽孢/g；
春雷霉素 3%；
2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐 2%
木质素磺酸钙 4%；
白炭黑 7%；
高岭土 余量/2 ；
凹凸棒土 余量/2。
制备方法，同实施例6。
实施例8
20亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•4%春雷霉素可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 20亿芽孢/g；
春雷霉素 4%；
2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐 2%
木质素磺酸钙 4%；
白炭黑 7%；
高岭土 余量/2 ；
凹凸棒土 余量/2。
制备方法，同实施例6。
对照例1
10亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 10亿芽孢/g；
2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐 2%
木质素磺酸钙 4%；
白炭黑 7%；
高岭土 余量/2 ；
凹凸棒土 余量/2。
制备方法，同实施例5。
对照例2
30亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水剂（不添加发酵液）的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌DN-1除外）。
多粘类芽孢杆菌DN-1 30亿芽孢/g；
春雷霉素 2%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
水 余量。
制备方法：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌活菌（不含发酵液），混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节pH值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。
对照例3
多粘类芽孢杆菌发酵液•2%春雷霉素水剂（不添加发酵液）的制备方法：按质量百分比。
春雷霉素 2%；
木质素磺酸钠 6%；
烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯 4%；
蓖麻油与环氧乙烷缩合物 5%
黄原胶 0.1%；
硅酸镁铝 3%；
磷酸三丁酯 0.3%；
多粘类芽孢杆菌发酵液 30%；
水 余量。
制备方法：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌发酵液（滤去芽孢及菌体），混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节pH值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。
在田间下测定制剂对水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病的防治效果：
实验方案如下：
各试验采用随机区组设计，小区面积40㎡，4次重复，随机排列，每个处理间设保护行。
供试药剂、对照药剂及用药量：
实施施例1至实施例8制剂用药量为60g/亩，对照药剂10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌(WH1G)WP（市购）制剂用药量为200g/亩，4%春雷霉素水剂制剂用药量为60g/亩，另设喷清水的空白对照。水稻稻瘟病的防治于水稻孕穗期进行第一次叶面喷雾处理，7天后进行第二次施药；棉花枯萎病的防治于棉花枯萎病初发时进行第一次灌根处理，7天和14天后分别进行第二次和第三次施药，每次每亩喷施药液量为50升，均匀喷雾；番茄灰霉病的防治于番茄灰霉病初发时进行第一次叶面喷雾处理，7天和14天后分别进行第二次和第三次施药，每次每亩喷施药液量为50升，均匀喷雾。施药器械为WS-16型背负式手动喷雾器。在药剂处理前进行病害基数调查，末次施药7天后调查病害发生情况。
调查方法、分级、药效计算均执行中华人民共和国国家标准，《农药田间药效试验准则》。
试验结果：
表1 多粘类芽孢杆菌•春雷霉素组合物末次施药后对水稻稻瘟病的田间防治效果
| 项目 | 制剂量（g/亩） | 防治效果（%） |
| 4%春雷霉素水剂 | 60 | 65.35 |
| 10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂 | 200 | 56.17 |
| 实施例1 | 60 | 75.16 |
| 实施例2 | 60 | 77.07 |
| 实施例3 | 60 | 76.53 |
| 实施例4 | 60 | 66.81 |
| 实施例5 | 60 | 71.43 |
| 实施例6 | 60 | 77.54 |
| 实施例7 | 60 | 72.19 |
| 实施例8 | 60 | 71.37 |
| 对照例1 | 200 | 60.24 |
| 对照例2 | 60 | 70.57 |
| 对照例3 | 60 | 59.64 |
表2 多粘类芽孢杆菌•春雷霉素组合物末次施药后对棉花枯萎病的田间防治效果
| 项目 | 制剂量（g/亩） | 防治效果（%） |
| 4%春雷霉素水剂 | 60 | 59.74 |
| 10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂 | 200 | 60.33 |
| 实施例1 | 60 | 73.15 |
| 实施例2 | 60 | 74.09 |
| 实施例3 | 60 | 72.18 |
| 实施例4 | 60 | 61.27 |
| 实施例5 | 60 | 66.94 |
| 实施例6 | 60 | 71.54 |
| 实施例7 | 60 | 69.75 |
| 实施例8 | 60 | 70.55 |
| 对照例1 | 200 | 63.87 |
| 对照例2 | 60 | 68.53 |
| 对照例3 | 60 | 51.44 |
表3 多粘类芽孢杆菌•春雷霉素组合物末次施药后对番茄灰霉病的田间防治效果
| 项目 | 制剂量（g/亩） | 防治效果（%） |
| 4%春雷霉素水剂 | 60 | 67.63 |
| 10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂 | 200 | 63.24 |
| 实施例1 | 60 | 77.25 |
| 实施例2 | 60 | 75.33 |
| 实施例3 | 60 | 78.12 |
| 实施例4 | 60 | 69.27 |
| 实施例5 | 60 | 71.64 |
| 实施例6 | 60 | 75.06 |
| 实施例7 | 60 | 74.24 |
| 实施例8 | 60 | 75.66 |
| 对照例1 | 200 | 67.57 |
| 对照例2 | 60 | 72.36 |
| 对照例3 | 60 | 60.04 |
水稻稻瘟病、棉花枯萎病和番茄灰霉病的田间防治试验结果如表1-表3所示。从表1和表3结果可以看出， 8个实施例除实施例4外，对水稻稻瘟病和番茄灰霉病的防效均在70%以上，从表2可以看出，8个实施例除实施例4、实施例5和实施例7外，对棉花枯萎病的防效也均在70%以上；8个实施例除实施例4外，对水稻稻瘟病、棉花枯萎病及番茄灰霉病的防效均明显高于对照例1、对照例3及对照药剂4%春雷霉素水剂和10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的防效。
从实施例1、实施例6与对照例2的防治效果比较可以看出，组合物中加入多粘芽孢杆菌DN-1发酵液能明显提升组合物的防治效果；从对照例1与对照药剂10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的防治效果可以看出，本发明组合物中的多粘芽孢杆菌DN-1对水稻稻瘟病、棉花枯萎病及番茄灰霉病均具有较高的生物活性，其防治效果高于对照药剂10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。
Claims (10)
1.一种含多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物，其特征在于：所述的杀菌组合物中，有效成分为春雷霉素、多粘类芽孢杆菌活菌及发酵液，其中春雷霉素的质量百分数为（1～10）%，多粘类芽孢杆菌活菌含量为（5～100）亿芽孢/g。
2.根据权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌为DN-1菌株，（Genbank登录号：KM891591），由本发明申请人安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所分离获得。
3.根据权利要求1-2所述的杀菌组合物，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌为活菌和发酵液混合物，所述的杀菌组合物中活菌的含量为（10～30）亿芽孢/g ，所述的春雷霉素为其盐酸盐。
4.根据权利要求1-3所述的杀菌组合物，其特征在于：所述的杀菌组合物剂型为水悬浮剂和可湿性粉剂。
5.根据权利要求1-4所述的杀菌组合物，其特征在于：所述的杀菌组合物制备成水悬浮剂时，所用的助剂为表面活性剂、增稠剂、酸度调节剂、防冻剂、消泡剂。
6.根据权利要求1-4所述的杀菌组合物，其特征在于：所述的杀菌组合物制备成可湿性粉剂时，所用的助剂为表面活性剂、填料。
7.根据权利要求5-6所述的杀菌组合物，其特征在于：所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钙、木质素磺酸钙、木质双酸钠、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐、蓖麻油与环氧乙烷缩合物、烷基酚聚氧乙烯基醚、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯中的一种或多种的混合；所述的增稠剂为黄原胶、硅酸镁铝中的一种或两种混合；所述的酸度调节剂为醋酸；所述的防冻剂为乙二醇、丙三醇中的一种或两种的组合；所述的消泡剂为磷酸三丁酯、有机硅油消泡剂中的一种或两种的组合，所述的填料为高岭土、凹凸棒土、白炭黑、玉米淀粉中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求5和7所述的杀菌组合物，其特征在于：一种含多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物制备成水悬浮剂的方法是将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌活菌及发酵液，混合均匀后加入酸度调节剂、增稠剂、防冻剂，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。
9.根据权利要求6和7所述的杀菌组合物，其特征在于：一种含多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物制备成可湿性粉剂的方法是将春雷霉素、固态表面活性剂与填料混合均匀，气流粉碎，得半成品A，将多粘类芽孢杆菌发酵液及活菌用半成品A进行吸附，混合均匀，冷冻干燥，即得成品。
10.根据权利要求1所述的杀菌组合物可用于防治水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病等多种作物真菌性病害。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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