CN107099489B - 一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株及其应用 - Google Patents

一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株及其应用，菌株的分类名称为：黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva），其保藏编号为CGMCC No.13931。将所述不同浓度伴生细菌活菌（103～105/mL）加入到培养了5～7 d的竹黄菌发酵液中，继续培养获得竹红菌素。本发明能有效提高竹红菌素的产量，且对人畜无毒害作用，对环境无污染。

Description

一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物菌株，具体涉及一株天然药用真菌子实体伴生细菌-黄褐假单胞菌，本发明还涉及该菌株在提高竹红菌素产量中的应用。
背景技术
竹黄菌（Shiraia bambusicola P. Heen）又名天竹花、竹三七等，属于子囊菌亚门（Ascomycotina）、肉座菌科（Hypocreaceae）、竹黄属（Sharaia）。竹黄菌主要寄生于短穗竹属（Brachystachyum Keng.）竹子的细嫩枝干上，形成粉红色、龟裂瘤状的子实体，称作竹黄，其主要分布在中国南部的浙江、云南等地，作为我国传统珍稀药用真菌，具有止咳祛痰、祛风利湿等功效，常被用于治疗虚寒胃痛、坐骨神经痛、气管炎等疾症。现代药理学研究表明竹红菌素（hypocrellins, Has）是竹黄菌的主要活性成分，包括竹红菌甲素（hypocrellin A, HA）、乙素（hypocrellin B, HB）、丙素（hypocrellin C, HC）及丁素（hypocrellin D, HD），其中竹红菌甲素HA是最主要的成分。目前竹红菌素在临床上用于治疗外阴白斑、皮肤白色病变以及瘢痕疙瘩等皮肤病。同时，竹红菌素作为非卟啉类的新型光敏剂，有更广的吸收光谱、更好的光诱导单线态氧（Molecular single oxygen, 1O2）产生能力、较低的光暗毒性等优点，使其在各种皮肤病、肿瘤、病毒等的光化学疗法（photodynamictherapy，PDT）上的应用潜能受到人们广泛的关注，具有广泛的应用价值。
由于竹黄野生资源有限，竹红菌素产量低成为了其医疗及工业中应用最大的障碍，因此竹黄菌液态深层发酵成了生产竹红菌素的首选方法。但目前通过人工发酵方法所产竹红菌素产量较低，为了提高竹红菌素产量，常用的方法包括人工培育子实体、化学合成、选育高产菌株、优化培养条件、添加诱导子等。而通过外源诱导提高竹红菌素产量的研究较少。如：Du等人从竹子中分离得到的内生真菌的甲醇/氯仿提取物能够刺激提高竹红菌素产量，但粗提物有效成分未见报道，所以并不能确定发挥刺激作用的有效成分（Du W,Liang Z, Zou X, et al. Effects of microbial elicitor on production ofhypocrellin by Shiraia bambusicola. Folia microbiologica, 2013, 1-7.）。另有在竹黄菌中转入竹红菌素合成过程中关键基因来提高其含量，如Deng等人将竹红菌素合成关键酶基因多铜氧化酶 (MCO) 在竹黄菌中过表达，该方法对于提高竹红菌素产量效果显著（Deng H, Gao R, Chen J, et al. An efficient polyethylene glycol-mediatedtransformation system of lentiviral vector in Shiraia bambusicola. ProcessBiochemistry, 2016, 1357-1362.），但由于基因工程目前处于尝试阶段，尚无大规模生产的应用。
因此，寻求新的外源诱导培养方法，以提高竹红菌素产量，对于竹红菌素的推广应用有着重要的意义。
发明内容
本发明的发明目的是提供一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株，并提供利用该菌株提高竹红菌素产量的方法。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株，其分类名称为：黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva），其保藏编号为CGMCCNo. 13931，保藏日期为2017年3月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明的上述细菌是从竹黄子实体分离得到的野生型菌株，已进行保藏，其生物学特征：
1、菌落形态特征：在基础LB培养基上生长良好，细菌菌落特征：黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）菌株在LB平板培养基上为奶油黄色，菌落混浊半透明，表面光滑湿润，边缘整齐。
2、菌体形态特征：菌体细胞呈短杆状，有荚膜，大小为0.5 × 1.0 µm。
3、主要生理生化特征：在4～37℃条件下生长状况良好，最优条件为30℃，革兰氏染色鉴定其为革兰氏阴性菌，通过极性鞭毛运动，具有严格的呼吸型代谢，具有精氨酸水解途径，可利用D-核糖、甘露糖核糖醇、酮基-D-葡萄糖酸葡萄糖等。
该菌株16S rDNA基因序列见附页，与黄褐假菌（P. fulva）及类黄色假单胞菌（P. parafulva）相似度达99%。
该菌株基因序列，经序列同源性分析、Blast比对、形态特征及生理生化指标等比对，鉴定为黄褐假单胞菌（P. fulva）。
本发明实现另一发明目的的技术方案是，伴生细菌菌株黄褐假单胞菌 （P. fulva）在发酵法制备竹红菌素中的应用。
具体的应用方法为，将所述伴生细菌活菌加入到培养了5～7 d的竹黄菌发酵液中，继续培养获得竹红菌素。优选地，将所述伴生细菌活菌加入到培养了6 d的竹黄菌发酵液中，促进效果最为明显。
上述技术方案中，每50mL竹黄菌发酵液中加入所述伴生细菌活菌的菌液1 mL，菌液浓度为103～105 cfu /mL。
所述伴生细菌活菌的菌液制备方法是，取黄褐假单胞菌单个菌落置于LB培养基中，在30℃下，摇床震荡培养8 h获得种子液，取1 mL种子液于LB培养基中同样条件下培养12 h，4000 rpm离心10min，去上清，加入无菌水调整菌液浓度为103～105 cfu /mL。
其中，所述LB培养基为，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2-7.4。
上述技术方案中，所述竹黄菌发酵液的制备方法是，取竹黄菌小块置于改良PDB培养基，在28℃下，摇床震荡培养6 d。
其中，竹黄菌小块的大小为3×3 mm，改良PDB培养基的组分为，土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.75 g/L，盐酸硫胺0.01 g/L。
加入所述伴生细菌活菌后，继续培养至8 d收取竹黄菌菌丝。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的伴生细菌加入培养中的竹黄菌培养液中，可使竹红菌素含量提高至2.7倍左右，且对人畜无毒害作用，对环境无污染。
附图说明
图1是本发明实施例1中培养的黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）的形态特征。
本发明提供的黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）已经于2017年3月27日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）进行保藏，保藏编号为CGMCC No. 13931。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
本实施例中采用了一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株，其分类名称为：黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva），其保藏编号为CGMCC No. 13931，保藏日期为2017年3月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）的形态特征参见附图1所示。
本实施例中，LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2-7.4。改良PDB培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO40.75 g/L，盐酸硫胺0.01 g/L。
取本发明的黄褐假单胞菌单个菌落置于LB培养基中，在30℃下，摇床震荡培养8h，取1 mL种子液于LB培养基中同样条件下培养12 h，4000 rpm离心10min，去上清，加入无菌水调整菌液浓度为103 cfu /mL。
取竹黄菌小块（3 × 3 mm）置于改良PDB培养基，在28℃下，摇床震荡培养6 d，取1mL细菌种子液（103 cfu /mL）加入，继续培养至8 d收取竹黄菌菌丝，称重，并提取检测竹红菌素含量。
将相同体积的无菌水代替菌液，其余内容相同，作空白对照组。
结果如下：
细菌处理后的竹黄菌其竹红菌素含量（18.66 mg/g）明显优于对照组（8.30 mg/g），竹红菌素含量提高了2.25倍。
实施例2：
本实施例中，LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2-7.4。改良PDB培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO40.75 g/L 盐酸硫胺0.01 g/L。
取本发明的黄褐假单胞菌单个菌落置于LB培养基中，在30℃下，摇床震荡培养8h，取1 mL种子液于LB培养基中同样条件下培养12 h，4000 rpm离心10min，去上清，加入无菌水调整菌液浓度为104 cfu /mL。
取竹黄菌小块（3 × 3 mm）置于改良PDB培养基，在28℃下，摇床震荡培养6 d，取1mL细菌种子液（104 cfu /mL）加入，继续培养至8 d收取竹黄菌菌丝，称重，并提取检测竹红菌素含量。
将相同体积的无菌水代替菌液，其余内容相同，作空白对照组。
结果如下：
细菌处理后的竹黄菌其竹红菌素含量（22.52 mg/g）明显优于对照组（8.30 mg/g），竹红菌素含量提高了2.71倍。
实施例3：
本实施例中，LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2-7.4。改良PDB培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO40.75 g/L 盐酸硫胺0.01 g/L。
取本发明的黄褐假单胞菌单个菌落置于LB培养基中，在30℃下，摇床震荡培养8h，取1 mL种子液于LB培养基中同样条件下培养12 h，4000 rpm离心10min，去上清，加入无菌水调整菌液浓度105 cfu /mL。
取竹黄菌小块（3 × 3 mm）置于改良PDB培养基，在28℃下，摇床震荡培养6 d，取1mL细菌种子液（105 cfu /mL）加入，继续培养至8 d收取竹黄菌菌丝，称重，并提取检测竹红菌素含量。
将相同体积的无菌水代替菌液，其余内容相同，作空白对照组。
结果如下：
细菌处理后的竹黄菌其竹红菌素含量（17.43 mg/g）明显优于对照组（8.30 mg/g），竹红菌素含量提高了2.10倍。
实施例4：
在实施例1中其它条件相同的情况下，改变加入菌液的时间进行效果对比实验，结果表明，在竹黄菌培养0-4d时加入菌液，会抑制竹红菌素的合成，处理后的竹黄菌中竹红菌素含量低于5.44mg/g，在第5天和第7天加入菌液，竹红菌素含量为10.35～13.48mg/g，与对照组相比能明显促进竹红菌素的合成，在第6天加入菌液促进效果最明显。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学
<120> 一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株及其应用
<130> T17189T
<160> 1
<210> 1
<211> 1075
<212> DNA
<213> 黄褐假单胞菌 (Pseudomonas fulva)
<400> 1
acctttggcc gcagccctaa aacatgcaag tcgagcggat gacagggagc ttgctccttg 60
attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg ggacaacgtt 120
tcgaaaggaa cgctaatacc gcatacgtcc tacgggagaa agcaggggac cttcgggcct 180
tgcgctatca gatgagccta ggtcggatta gcttgttggt gaggtaatgg ctcaccaagg 240
cgacgatccg taactggtct gagaggatga tcagtcacac tggaactgag acacggtcca 300
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc 360
atgccgcgtg tgtgaagaag gtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggt 420
tgtagattaa tactctgcaa ttttgacgtt accgacagaa taagcaccgg ctaactctgt 480
gccagcagcc gcggtaatac agagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540
gcgcgtaggt ggtttgttaa gttggatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat 600
ccaaaactgg caagctagag tacggtagag ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagata taggaaggaa caccagtggc gaaggcgacc acctggactg atactgacac 720
tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgtcaac tagccgttgg aatccttgag attttagtgg cgcagctaac gcattaagtt 840
gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 900
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggccttgaca 960
tgcagagaac tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa ctctgaccca gtgctgcatg 1020
gctgtcgtca gctcgtgtcg tgggatgtgg gttaagtccg gtaacgaggg gcaaa 1075

Claims (10)

1.一株提高竹红菌素发酵产率的伴生细菌菌株，其分类名称为：黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva），其保藏编号为CGMCC No. 13931，保藏日期为2017年3月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述伴生细菌菌株在发酵法制备竹红菌素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述伴生细菌活菌加入到培养了5～7 d的竹黄菌发酵液中，继续培养获得竹红菌素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述伴生细菌活菌加入到培养了6 d的竹黄菌发酵液中。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：加入的所述伴生细菌活菌的菌液1 mL/50mL，浓度为103～105 cfu /mL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述伴生细菌活菌的菌液制备方法是，取黄褐假单胞菌单个菌落置于LB培养基中，在30℃下，摇床震荡培养8 h获得种子液，取1 mL种子液于LB培养基中同样条件下培养12 h，4000 rpm离心10min，去上清，加入无菌水调整菌液浓度为103～105 cfu /mL。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述LB培养基为，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2-7.4。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述竹黄菌发酵液的制备方法是，取竹黄菌小块置于改良PDB培养基，在28℃下，摇床震荡培养6 d，改良PDB培养基的组分为，土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.75 g/L，盐酸硫胺0.01 g/L。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：竹黄菌小块的大小为3×3 mm。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：加入所述伴生细菌活菌后，继续培养至8d收取竹黄菌菌丝。
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