TWI518181B - 一種利用深層海水促進植乳酸桿菌生成兒茶素、兒茶酚與綠原酸之方法 - Google Patents

Description

一種利用深層海水促進植乳酸桿菌生成兒茶素、兒茶酚與綠原酸之方法

本發明係利用深層海水進行植乳酸桿菌發酵以有效提高兒茶素、兒茶酚與綠原酸之益生菌發酵產物生成量的方法。

地球表面面積中海洋約佔了71%，平均水深約有3795公尺，而深層海水佔整個地球海域的95%。深層海水主要定義在位於海平面200公尺以下之海水，不受微生物或病原菌汙染，且具有低溫、富含礦物質、高營養鹽與豐富的微量元素(Hwang et al.,2009)以及永續再生性等特性(王等，2003)。日本用深層海水發酵已成功開發出專利的麵包製造方法，也運用在味噌、啤酒、清酒、麵包等，深層海水除具加速發酵的效果，也能使味道變得更加美味，並使麵包類產品之防霉效果獲得顯著提升。深層海水可促進發酵，深層海水所含的鎂、鈣與磷酸鹽離子與酵母生長有關(久武陸夫，2000)，可促進紅麴菌的生長及大量提升紅麴菌黃色素(monacin)與紅麴黃素(ankaflavin)之生成量(Lee et al.,2010)。

益生菌發酵是一種常見的食品加工方式。益生菌發酵依據 作用的方式不同，可分為分解與合成。分解是將原料所含成分經由微生物的分解酵素分解成其他化合物，一般多用於將原先無法利用或具汙染等大分子物質進行分解後，藉以提高原料利用度或將其汙染性降低(Lin et al.,2012)。合成則是原料提供成分經由微生物合成後，產生原先不具備之成分，而達到取得不易合成之成分或增加其功效等目的(Lee et al.,2013)。自然界中有許多物質具有許多不同的功效，但有些成分卻是人體所不易吸收利用的；因而透過微生物將這些物質轉換，藉由酵素分解成較小的分子促進吸收及利用。為此益生菌被加入食品、中草藥等進行發酵，藉由益生菌發酵增加食品中營養成分含量或提高其原有成分之活性，使食品營養價值得以增加並促進附加價值的產生(Rekha and Vijayalakshmi,2010)。人體無法消化分解許多物質，由於無法利用便會被丟棄，但這些物質卻可被許多微生物所利用；而經由微生物的酵素進行發酵後，可使原先無法利用而失去價值之物質透過發酵，在發酵過程中產生可利用之活性物質，增加其價值及其可利用度(Li et al.,2013)。中草藥會因產地的不同其功效而有所差異，因而將微生物加入中草藥，使原有成分經發酵分解提高其藥效(Bhushan et al.,2003)或改變原有成分之環境因子，以提高生物利用度(Rekha and Vijayalakshmi,2010)，甚至藉由微生物的代謝來合成產生新的活性物質；藉此增加中草藥之營養價值及功效，並可穩定中草藥之品質，以提升傳統中草藥之市場價值。

兒茶酚及兒茶素為常見之多酚類。兒茶酚具有良好的抗菌功效，研究指出兒茶酚對於xylella fastidiosa(葉緣焦枯病菌)相較於其他酚類有較好的抑菌功效(Maddox et al.,2010)。兒茶素於研究中被證實為良好 的抗氧化物質(Yang et al.,2013)。於先前研究中發現兒茶素具有促進骨骼肌脂肪氧化相關基因的表現(Sae-Tan et al.,2011)。另有研究指出餵食兒茶素有延長小鼠運動時間之功效，並發現餵食兒茶素具有降低運動後乳酸含量及提升血液中游離脂肪酸含量之效果(Murase et al.,2006)。而兒茶素於之前研究中發現增加兒茶素的攝取具有提升肌肉能力之效果(Kim et al.,2013)。目前已經可將兒茶素藉由人工方式合成，開始的原料為4-hydroxycinnamoyl CoA經由酵素縮合成查爾酮(chalcone)，再經由異構化形成柚皮素，而柚皮素經過氧化後形成聖草酚(eriodictyol)再次氧化形成花旗松素(taxifolin)後，最後再藉由leucoanthocyanidin reductase作用生產出兒茶素(Punyasiri et al.,2004；Rani et al.,2012)。

研究中指出綠原酸具有良好的抗氧化能力，並可增加細胞的增生促進傷口的癒合(Chen et al.,2013)；綠原酸在研究中發現具有降低IL-1、IL-6、COX-2等發炎因子的能力，進而可以抑制因發炎所導致之疾病(Liao et al.,2013)。綠原酸對於脂質、血糖等代謝也有良好的效果。研究中亦發現投食綠原酸給予高脂肪飲食大鼠具有降低其血清中三酸甘油酯和膽固醇等效果(Balzan et al.,2013)；於其他研究中則發現綠原酸亦具有改善脂質代謝、血糖代謝、提升肌肉肝醣含量等效果(Zhang et al.,2011)

本案發明人深刻了解先前技術之不足與缺陷，乃亟思加以改良創新，經多年苦心孤詣，終於成功研發完成本件用深層海水來提高植乳酸桿菌發酵時所產生益生菌發酵產物(兒茶酚、兒茶素與綠原酸)之產量，兒茶酚、兒茶素與綠原酸對人體之醫療與保健效果卓越，應用價值極高。本發明利用深層海水可有效提高益生菌發酵產物之產量，為益生菌發 酵產物之製程提供一有效方法。

本發明之目的為提供一種利用深層海水來提高植乳酸桿菌發酵時所產生益生菌發酵產物產量之方法，該方法係利用由綠茶、魚腥草及深層海水所製備之培養基質，以提高植乳酸桿菌發酵時之兒茶素、兒茶酚、綠原酸之產量。

其中該方法包括以下步驟：1.將綠茶及魚腥草粉末以1：1的比例混合(如1.8g綠茶及1.8g魚腥草粉末混合)，得一混合粉末；2.於該混合粉末中加入深層海水(如100mL深層海水，含1.8g綠茶及1.8g魚腥草粉末)，得一混合溶液；其中該混合粉末與深層海水的比例為3.6：100；其中該深層海水為海平面200公尺以下之海水，經習知的脫鹽透析技術處理後含有Mg 20.65~413mg/L、K 4.41~88.2mg/L、Na 10.90~218mg/L、Ca 0.171~3.42mg/L之脫鹽海水；3.將該混合溶液置於水浴槽中以攝氏50度進行萃取一小時，得一萃取後溶液；4.將該萃取後溶液以濾紙(20mm孔徑)過濾方式取上清液，其中該過濾方式亦可以其它合適的方式來過濾，如濾膜、濾網或半透膜等；5.將該上清液加入一培養基質，形成一培養基溶液，其中該培養基質為2%右旋糖(dextrose)、1%蛋白腖(peptone)及0.4%酵母萃取物(yeast extract)之培養基質；6.為避免高溫造成綠茶與魚腥草中成分受破壞，將該培養基溶液以攝氏75 度滅菌40分鐘，得一滅菌後之養基溶液；7.將該滅菌後之培養基溶液冷卻至室溫，得一冷卻之培養基溶液，其中該室溫係指攝氏25至37度；8.將植乳酸桿菌接種至該冷卻之培養基溶液中，最後得一接菌之培養基溶液，其中該植乳酸桿菌為寄存於財團法人食品工業發展研究所，登錄號碼為BCRC 10069與BCRC12250之菌株；9.將該接菌之培養基溶液於攝氏37度發酵10小時，最後得一發酵之培養基溶液；該發酵之培養基溶液含有兒茶素、兒茶酚與綠原酸。

本發明另提供一種利用深層海水促進植乳酸桿菌同時轉換生成兒茶素、兒茶酚與綠原酸之方法所生產之發酵培養基溶液，其中該發酵培養基溶液含有濃度為86.3~100.7mg/L的兒茶素、310.9~370.4mg/L的兒茶酚與33.6~35.7mg/L的綠原酸。

S101‧‧‧深層海水濃縮液

S102‧‧‧1至20倍濃度深層海水

S103‧‧‧綠茶與魚腥草粉

S104‧‧‧混合溶液

S105‧‧‧萃取

S106‧‧‧過濾

S107‧‧‧培養基質

S108‧‧‧滅菌

S109‧‧‧冷卻

S110‧‧‧接菌

S111‧‧‧發酵

S112‧‧‧植乳酸桿菌發酵產物

第一圖係利用深層海水製備植乳酸桿菌發酵產物之製備流程。

本發明以下列實施例作進一步說明，然該等實施例僅為表現與敘述本發明之發明含義與其精神，故所敘實施例等係做為說明之用，而不應做為限縮或被解釋為實施本發明之限制。

實施例一 材料與方法

植乳酸桿菌BCRC 10069菌株購自生物資源保存及研究中心，培養於MRS平面培養基(De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)agar)中；而深層海水 濃縮液係購自台灣海洋深層水公司，本方法將深層海水濃縮液稀釋至含有鎂離子20.65毫克/升、鈉離子10.90毫克/升、鉀離子4.41毫克/升與鈣離子0.171毫克/升時作為1倍深層海水濃度，其他5、10與20倍數深層海水的離子濃度如表一所示。

兒茶素、兒茶酚與綠原酸之分析是採用高效液像層析法(high performance liquid chromatography,HPLC)來分析；首先將植乳酸桿菌之發酵液以0.45μm濾膜過濾後，再進行HPLC-photodiode array，以檢測生物轉換前後酚類成分之變化。其中該高效液像層析法分析條件如下：Column(管柱)：Ascentis C18 column(25cm×4.6mm)Mobile phase(移動相)：solvent A(溶劑A)：9% Acetic acid(醋酸)；solvent B(溶劑B)：Methanol(甲醇)Gradient(梯度)：100% Acetic acid(0~20min)；100% Methanol(20~30min)；100% Acetic acid(30~40min)

實施例二. 魚腥草與綠茶複合培養基與海洋深層水提升兒 茶素、兒茶酚、綠原酸之產量

將植乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)BCRC 10069菌株以六種不同培養基來培養發酵，該六種不同培養基分別為MRS培養基、MRS培養基與深層海水、魚腥草培養基、魚腥草培養基與深層海水、魚腥草與綠茶複合培養基、魚腥草與綠茶複合培養基與深層海水；於進行發酵作用後，再以高效液像層析法分析兒茶素、兒茶酚與綠原酸之含量，如表二中所示魚腥草與綠茶複合培養基在加入深層海水後，魚腥草與綠茶複合培養基中的兒茶素、兒茶酚與綠原酸之含量分別增加11.4%、22.5%以及5.7%。

植乳酸桿菌菌株L.plantarum BCRC10069與L.plantarum BCRC12250於加入深層海水發酵後，均能提升兒茶素、兒茶酚及綠原酸產量

不同植乳酸桿菌菌株L.plantarum BCRC10069與L.plantarum BCRC12250生物轉換生產提升兒茶素、兒茶酚、綠原酸之效果如表三所示；與未加入深層海水相比，加入深層海水後不同植乳酸桿菌菌株L.plantarum BCRC10069與L.plantarum BCRC12250均能提升發酵後所產生之兒茶素、兒茶酚、綠原酸產量。

實施例四. 深層海水所發酵轉換出的物質較由超純水發酵所轉換出的物質多，且提升的效果會隨著深層海水濃度提高而逐漸增加

深層海水所發酵轉換出的物質均較由超純水發酵所轉換出的物質多，且提升的效果會隨著深層海水濃度提高而逐漸增加如表四，1倍至20倍濃度之深層海水均能提高兒茶素、兒茶酚、綠原酸之含量。且到達20倍濃度時具有最大提升效果，分別提升為純水中兒茶素、兒茶酚、綠原酸 含量的29.9%、46%與12.3%，即深層海水能促進植乳酸桿菌發酵後產生之兒茶素、兒茶酚、綠原酸含量提升。

實施例五. 培養時間與兒茶素、兒茶酚、綠原酸產量之關係

植乳酸桿菌L.plantarum BCRC 10069菌株在培養過程中兒茶素、兒茶酚、綠原酸產量之變化如表五所示，培養時間在10小時能獲得最高產量之兒茶素、兒茶酚、綠原酸，但繼續延長培養時間至24小時卻造成產量下降，其原因可能為兒茶素、兒茶酚、綠原酸被轉換為其他物質；因此培養時間10小時為最佳之培養時間。

S101‧‧‧深層海水濃縮液

S102‧‧‧1至20倍濃度深層海水

S103‧‧‧綠茶與魚腥草粉

S104‧‧‧混合溶液

S105‧‧‧萃取

S106‧‧‧過濾

S107‧‧‧培養基質

S108‧‧‧滅菌

S109‧‧‧冷卻

S110‧‧‧接菌

S111‧‧‧發酵

S112‧‧‧植乳酸桿菌發酵產物

Claims (9)

1. 一種利用深層海水促進植乳酸桿菌生成兒茶素、兒茶酚與綠原酸之方法，其中該方法包括以下步驟：(1)將綠茶及魚腥草粉末以1：1的比例混合，得一混合粉末；(2)於該混合粉末中加入深層海水，得一混合溶液，其中該混合粉末與深層海水的比例為3.6：100；(3)將該混合溶液於攝氏50度靜置萃取1小時，得一萃取後溶液；(4)將該萃取後溶液過濾取上清液；(5)將該上清液加入一培養基質，形成一培養基溶液；(6)將該培養基溶液以滅菌，得一滅菌後之培養基溶液；(7)將該滅菌後之培養基溶液冷卻至室溫，得一冷卻之培養基溶液；(8)將植乳酸桿菌接種至該冷卻之培養基溶液中，得一接菌之培養基溶液，該植乳酸桿菌為寄存於財團法人食品工業發展研究所，登錄號碼為BCRC 10069與BCRC 12250之菌株；(9)將該接菌之培養基溶液發酵，最後得一發酵之培養基溶液；該發酵之培養基溶液含有兒茶素、兒茶酚與綠原酸，該發酵時間係為8~12小時。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該深層海水為海平面200公尺以下之海水，經習知的脫鹽透析技術處理後含有Mg 20.65~413mg/L、K 4.41~88.2mg/L、Na 10.90~218mg/L、Ca 0.171~3.42mg/L之脫鹽海水。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該培養基質為2%右旋糖 (dextrose)、1%蛋白腖(peptone)及0.4%酵母萃取物(yeast extract)之培養基質。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該滅菌係指以攝氏75度滅菌40分鐘。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該室溫係指攝氏25至37度。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該發酵係指於攝氏37度發酵10小時。
7. 一種以申請專利範圍1所述之方法所生產之發酵培養基溶液。
8. 如申請專利範圍第7項所述之發酵培養基溶液，其中該發酵培養基溶液含有兒茶素、兒茶酚與綠原酸。
9. 如申請專利範圍第8項所述之發酵培養基溶液，其中該兒茶素的濃度為86.3~100.7mg/L、該兒茶酚的濃度為310.9~370.4mg/L及該綠原酸的濃度為33.6~35.7mg/L。