WO2004063360A2 - Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12 - Google Patents

Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12 Download PDF

Info

Publication number
WO2004063360A2
WO2004063360A2 PCT/EP2003/014102 EP0314102W WO2004063360A2 WO 2004063360 A2 WO2004063360 A2 WO 2004063360A2 EP 0314102 W EP0314102 W EP 0314102W WO 2004063360 A2 WO2004063360 A2 WO 2004063360A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
hema
dsmz509
seq
genetically modified
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/014102
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004063360A3 (de
WO2004063360A9 (de
Inventor
Heiko Barg
Dieter Jahn
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Priority to EP03785798A priority Critical patent/EP1592785A2/de
Priority to JP2004565964A priority patent/JP2006512913A/ja
Priority to US10/541,920 priority patent/US20060105432A1/en
Priority to AU2003294837A priority patent/AU2003294837A1/en
Priority to CA002512857A priority patent/CA2512857A1/en
Publication of WO2004063360A2 publication Critical patent/WO2004063360A2/de
Publication of WO2004063360A3 publication Critical patent/WO2004063360A3/de
Priority to IL169352A priority patent/IL169352A0/en
Priority to NO20053205A priority patent/NO20053205L/no
Publication of WO2004063360A9 publication Critical patent/WO2004063360A9/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/42—Cobalamins, i.e. vitamin B12, LLD factor

Definitions

  • the present invention a method for the production of vitamin B12 using a genetically modified Bacillus megaterium strain and vectors for the production of genetically modified bacteria of the genus Bacillus.
  • vitamin B 12 was indirectly discovered by its effects on the human body by George Minot and William Murphy (Stryer, L, 1988, In Biochemie, fourth edition, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York).
  • vitamin B ⁇ 2 could be cleaned and isolated for the first time, so that eight years later, in 1956, Dorothy Hodgkin's complex three-dimensional crystal structure was elucidated (Hodgkin, DC et al., 1956, Structure of Vitamin B 12 . Nature 176, 325-328 and Nature 178, 64-70).
  • vitamin B ⁇ 2 The naturally occurring end products of vitamin B ⁇ 2 biosynthesis are 5 ⁇ -deoxyadenosyIcobalamin (coenzyme B- ⁇ 2 ) and methylcobalamin (MeCbl), while vitamin B 12 by definition stands for cyanocobalamin (CNCbl), which is the one mainly manufactured by industry and represents traded form.
  • CNCbl cyanocobalamin
  • vitamin B 2 is the same for the designation of all three analog molecules.
  • B. megaterium The species ß. megaterium was first described by De Bary over 100 years ago (1884). Although generally classified as a soil bacterium, B. megaterium can also be found in various other habitats such as sea water, sediments, rice, dried meat, milk or honey. It often occurs in the company of pseudomonas and actinomycetes. B. megaterium, like its close relative Bacillus subtilis, is a gram-positive bacterium and is characterized, among other things, by its relatively pronounced, eponymous size of 2x5 ⁇ m, a G + C content of approx. 38% and a very pronounced one Ability to sporulate.
  • ß. megaterium can be equated with the pseudomonas without restriction (Vary, PS, 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
  • ß. megaterium no alkaline proteases, so that hardly any degradation was observed in the production of heterologous proteins. It is also known that ß. megaterium products of commercial interest are effectively secreted, such as B. is used in the production of ⁇ - and ß-amylase. It is also with ß. megaterium because of its size possible to accumulate a high biomass up to a too high one Population density leads to death. Of paramount importance in industrial production using ß.
  • megaterium is already used today in a variety of industrial applications, such as the production of ⁇ - and ß-amylase, penicillin amidase, the processing of toxic waste or the aerobic vitamin B- ⁇ 2 production (summarized in Vary, PS, 1994, Microbiology , 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
  • the object of the present invention is to provide genetically modified Bacillus megaterium strains with which the production of vitamin B12 can be further improved.
  • This also requires the provision of suitable vectors which allow overexpression of the enzymes for the formation of uroporphyinogen-III from glutamyl tRNA and advantageously a repression of the heme biosynthetic pathway combined with an increased metabolic flow towards vitamin B12.
  • the vectors according to the invention should make it possible to stably integrate the desired genetic changes into the chromosome of the bacterial strain.
  • an induction of the gene expression of the chromosomally encoded hemAXCDBL operon and / or the repression of the heme biosynthetic pathway should be controllable in the course of the fermentation.
  • the problem is solved by providing a genetically modified Bacillus megaterium strain containing a gene hemA [KK] according to SEQ ID No. 4 coding for a feedback-resistant glutamyl tRNA reductase and / or part of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 (hemZ) as antisense RNA (ashemZ).
  • a genetically modified Bacillus megaterium strain which has a gene hemA [KK] according to SEQ ID No. 4 coding for a feedback-resistant glutamyl tRNA synthase, organized in a hemA [KK] XCDBL operon and / or an antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. 3 contains.
  • the present invention also includes a nucleotide sequence as shown in SEQ ID No. 1 coding for a coproporphyrinogen III oxidase.
  • This nucleotide sequence according to the invention is further distinguished by the fact that it contains upstream (5 'or upstream) and / or downstream (3' or downstream) sequences with a regulatory function for the region of the hemZ gene coding for a coproporphyrinogen III oxidase ,
  • sequences with a regulatory function are understood to be those sequences which transcribe, RNA stability or that can affect RNA processing and translation.
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers. However, this list is not limiting for the present invention.
  • the nucleotide sequence according to the invention preferably comes from SEQ ID No. 1 from Bacillus megaterium.
  • the present invention also relates to so-called isolated nucleic acids.
  • an isolated nucleic acid or an isolated nucleic acid fragment is to be understood as a polymer from RNA or DNA which can be single or double-stranded and optionally can contain natural, chemically synthesized, modified or artificial nucleotides.
  • the term DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.
  • a coproporphyrinogen III oxidase according to SEQ ID No. 2 Subject of the present invention.
  • the amino acid sequence according to SEQ ID No. is preferred. 2 by a nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 encoded.
  • alleles are to be understood as functionally equivalent, ie essentially equivalent nucleotide sequences.
  • Function-equivalent sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code, still have the desired functions.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial, e.g. B. obtained by chemical synthesis and possibly adapted to the codon use of the host organism nucleotide sequences.
  • functionally equivalent sequences include those which have a modified nucleotide sequence which gives the enzyme, for example, a desensitivity or resistance to inhibitors.
  • all the usual B. megaterium strains which are suitable as vitamin B12 production strains can be used.
  • vitamin B12 production strains are to be understood as Bacillus megaterium strains or homologous microorganisms which have been modified by classic and / or molecular genetic methods in such a way that their metabolic flow increasingly runs in the direction of the biosynthesis of vitamin B12 or its derivatives ( metabolic engineering).
  • these production strains one or more genes and / or the corresponding enzymes, which are at key and correspondingly complexly regulated key positions in the metabolic pathway (bottleneck), are changed or even deregulated.
  • the present invention encompasses all known vitamin B12 production strains of the genus Bacillus or homologous organisms.
  • the strains advantageous according to the invention include, in particular, the strains of B. megaterium DSMZ32, DSMZ 509 and DSMZ 2894.
  • Bacterial strains genetically modified according to the invention can in principle be produced by classical mutagenesis and preferably by targeted molecular biological techniques and corresponding selection processes.
  • interesting starting points for targeted genetic engineering manipulation include branches of the biosynthetic pathways leading to vitamin B-12, through which the metabolic flow can be controlled in the direction of maximum vitamin B 12 production.
  • Targeted modifications of genes involved in the regulation of the metabolic flow also include studies and changes in the regulatory areas before and after the structural genes, such as the optimization and / or the exchange of promoters, enhancers, terminators, ribosome binding sites, etc.
  • the improvement of Stability of the DNA, mRNA or the proteins encoded by them for example by reducing or preventing degradation by nucleases or proteases, is included according to the invention.
  • the hemA [KK] gene according to SEQ ID No. is in the genetically modified Bacillus megaterium strain. 4 integrated into the bacterial chromosome.
  • Another variant of a genetically modified Bacillus megaterium strain is characterized in that part of the hemZ gene is plasmid-encoded as antisense RNA (ashemZ) in this bacterium and is present in an increased number of copies.
  • part of the hemZ gene is to be understood to mean that, starting from the nucleotide sequence of the hemZ gene according to SEQ ID No. 1, the production of various antisense RNAs possible.
  • Procedures for making antisense RNA e.g. via PCR, are known to the person skilled in the art and belong to common laboratory practice. The differences can result, for example, from the length of the antisense RNAs produced or from the selection of the regions of the hemZ nucleotide sequence from which the antisense RNA (s) are derived.
  • the length of the antisense mRNA sequences can vary, for example, between a few nucleotides and the entire sequence section of the coding region.
  • An antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. is preferred according to the invention.
  • the increased number of copies may be due to an increased replication of a corresponding vector, resulting in an increased number of copies.
  • an increased number of copies can also be achieved by multiple integration of a gene or parts thereof into the bacterial chromosome.
  • the invention also includes a genetically modified Bacillus megaterium strain in which the hemA [KK] gene is incorporated into the bacterial Chromosome is integrated and part of the hemZ gene is present as an antisense RNA (ashemZ) in an increased number of copies.
  • the present invention also relates to a genetically modified Bacillus megaterium strain in which the hemA [KK] gene, organized in the hemA [KK] XCDBL operon, and / or the part of the hemZ-
  • promoter stands. Examples of inducible promoters are the xylose inducible XylA promoter or the beta-galactosidase inducible promoter (Miller, J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
  • the xylose-inducible promoter is preferably the xylA promoter of the xylose operon from pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991,
  • xylose to the culture medium can increase the initiation of the transcription of the genes which are under the control of the xylA promoter, that is to say here the gene expression of hemA [KK] XCDBL and / or ashemZ.
  • Suitable vectors according to the invention are constructed for the production of the genetically modified Bacillus megaterium strains described above, which are also the subject of the present invention.
  • the present invention thus comprises an integrative vector containing a gene hemA [KK] coding for a feedback-resistant glutamyl-tRNA reductase according to SEQ ID No. 4 and sequences operatively linked thereto for induced gene expression, selection, replication and / or integration into the chromosome of the host cell.
  • An integrative vector is to be understood as a vector which, by site-specific recombination at a defined point in the
  • Host cell chromosome is integrated and there together with the chromosome replicated. In a variant according to the invention, this site-specific recombination takes place via the homologous sequences of the hemA gene.
  • homologous sequences are to be understood as those which are complementary to and / or hybridize with the nucleotide sequences according to the invention.
  • hybridizing sequences includes, according to the invention, substantially similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA, which enter into a specific interaction (binding) with the aforementioned nucleotide sequences under stringent conditions known per se.
  • homologous sequences can be isolated from other organisms on the basis of the DNA sequence described in SEQ ID NO: 4 or parts of these sequences, for example using conventional hybridization methods or the PCR technique. These DNA sequences hybridize to the sequences mentioned under standard conditions. Short oligonucleotides, for example the conserved regions, which can be determined by comparing them with other hemA genes in a manner known to the person skilled in the art, are advantageously used for hybridization. However, longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization. These standard conditions vary depending on the nucleic acid used: oligonucleotide, longer fragment or complete sequence or depending on the type of nucleic acid DNA or RNA used for the hybridization. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C.
  • These specified temperatures for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approx. 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks of genetics, such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be made according to formulas known to the person skilled in the art, for example depending on the length of the nucleic acids, the type of hybrid or the G + C content. The person skilled in the art can obtain further information on hybridization from the following textbooks: Ausubel et al.
  • homologous sequences of the sequence mentioned in SEQ ID NO: 4 are understood to mean, for example, variants which have at least 95% homology at the derived amino acid level, preferably at least 96% homology, particularly preferably at least 97 or 98% homology, very particularly preferably at least 99 or Have 99.9% homology.
  • the homology was calculated over the entire amino acid range.
  • the PileUp program was used (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Homology is to be understood as identity for the present invention. Both terms are synonymous.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of, for example, the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • These regulatory nucleotide sequences can be of natural origin or can be obtained by chemical synthesis.
  • any promoter that can control gene expression in the corresponding host organism is suitable as a promoter.
  • chemically inducible promoters are preferred, by means of which the expression of the genes underlying them in the host cell can be controlled at a specific point in time.
  • the ⁇ -galacosidase, arabinose or xylose-inducible system may be mentioned here as an example.
  • the xylose-inducible system and here the xylA promoter from pWH1520 is preferred.
  • the invention therefore also includes an integrative vector of the type described above, in which the gene expression is under the control of the xylA promoter.
  • sequences for selection, replication and / or integration into the chromosome of the host cell have been described in the literature.
  • Various selection markers are known, e.g. Genes that confer resistance to ampicillin, tetracycline, kanamycin or erythromycin.
  • this list is not exhaustive or limiting for the present invention.
  • Sequences which are advantageous according to the invention for selection are the ampicillin resistance gene for selection of the vector in E. coli or the erythromycin resistance gene for selection in B. megaterium.
  • an origin of replication in E. coli are pBR322 (Sutcliffe, JG, 1979, Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol., 43, Pt 1: 77-90 or in B. megaterium pE194ts or repF.
  • the temperature sensitive Origin pE194ts for ß. megaterium only allows replication below 40 ° C, which means that a selection pressure for integration into the chromosome can be built up above this "permissive" temperature (Rygus et. al, 1992).
  • the repF gene product is described as an in-trans acting element required for replication of the plasmid in Gram-positive bacteria (Villafane et al., 1987).
  • an integrative vector according to the invention is characterized in that it has at least one temperature-sensitive origin of replication.
  • An integrative vector which has the temperature-sensitive origin of replication pE194ts is preferred.
  • Another variant of the present invention comprises an integrative vector which is characterized in that it contains a genetically modified nucleotide sequence of the hemA gene (hemA [KK]) which codes for a feedback-resistant glutamyl-tRNA synthase, the amino acid sequence of which is an insertion of at least two positively charged amino acids.
  • the genetically modified nucleotide sequence contained in the integrative vector preferably codes for a feedback-resistant glutamyl tRNA which has 2 to 6, preferably 2 to 4 and particularly preferably two additional amino acids. These additional amino acids can be obtained at the level of the nucleotide sequence encoding them by inserting two or, accordingly, up to 6 triplets according to procedures known to the person skilled in the art, e.g. via PCR, into the coding nucleotide sequence.
  • a preferred variant of the integrative vector contains a genetically modified nucleotide sequence of the hemA gene (hemA [KK]) which codes for a feedback-resistant glutamyl-tRNA synthase, the amino acid sequence of which at positions 3 and 4 of the N-terminus has an insertion of two has positively charged amino acids.
  • the positively charged amino acids are preferably lysine residues.
  • a feedback-resistant form of an enzyme is to be understood as a protein whose activity is no longer inhibited by the end product of the metabolic pathway (or a metabolic branch). According to the invention, the enzyme of a feedback-resistant glutamyl tRNA reductase with the amino acid sequence according to SEQ ID No. 5 encoded by the hemA [KK] gene from B. megaterium.
  • the genetically modified nucleotide sequence of the hemA gene includes naturally occurring variants of the hemA sequence described here as well as an artificial, e.g. B. obtained by chemical synthesis, and optionally adapted to the codon use of the host organism nucleotide sequence. Genetic changes include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • sense mutations which can lead to the exchange of conserved amino acids at the protein level, but which do not lead to a fundamental change in the activity of the protein and are therefore function-neutral.
  • certain amino acids can be replaced by those with similar physicochemical properties (space filling, basicity, hydrophobicity, etc.).
  • arginine residues are exchanged for lysine residues, valine residues for isoleucine residues or aspartic acid residues for glutamic acid residues.
  • This also includes changes in the nucleotide sequence that affect the N- or C-terminus of a protein at the protein level, but without significantly affecting the catalytic function of the protein, but probably the regulation of the activity.
  • the present invention comprises a vector containing part of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 (hemZ) as antisense RNA
  • Chromosome of the host cell Chromosome of the host cell.
  • a preferred embodiment of the vector according to the invention contains an antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. 3 and also operatively linked sequences for induced gene expression, selection, replication and / or integration into the chromosome of the host cell.
  • antisense RNA ashemZ
  • antisense RNA preferably an antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. Third
  • the number of copies of the corresponding genes can be increased to achieve increased gene expression (overexpression). Furthermore, the promoter and / or regulatory region and / or the
  • Ribosome binding site which is located upstream of the structural gene, are changed accordingly so that expression takes place at an increased rate.
  • Expression cassettes which are installed upstream of the structural gene can act in the same way. With inducible promoters it is also possible to increase expression in the course of vitamin B12 production.
  • genes or gene constructs can either be present in plasmids with different copy numbers or can be integrated and amplified in the chromosome.
  • the activity of the enzyme itself can also be increased, for example by an increased catalytic activity or a deregulated or feedback-desensitive (feedback-resistant) activity Inhibitors or enhanced by preventing the breakdown of the enzyme protein.
  • overexpression of the genes in question can be achieved by changing the media composition and culture management.
  • the (expressed) antisense RNA formed is attached to the corresponding (complementary) Range of the mRNA coding for the coproporphyrinogen III oxidase. It thereby preferably blocks the ribosome binding site of the hemZ gene and in this way inhibits the translation and expression of the key enzyme involved in heme biosynthesis. This in turn results in reduced heme biosynthesis, with the advantage of an increased flow of metabolic metabolites in the direction of vitamin B12 production.
  • the present invention furthermore relates to a vector comprising part of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 (hemZ) as antisense-RNA (ashemZ), preferably an antisense-RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. 3, in which the gene expression is under the control of the xylA promoter.
  • this vector can in principle also integrate into the chromosome of the host cell, for example if it is equipped with a temperature-sensitive origin of replication.
  • a variant of this vector has at least one temperature-sensitive origin of replication.
  • Such a vector variant preferably has the temperature-sensitive origin of replication pE194ts.
  • the vectors according to the invention are produced by fusion of the aforementioned components, such as promoter, coding gene segments, origin of replication, genes for selection, etc., according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning ; a laboratory manual 2 nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the present invention furthermore relates to the use of the integrative vector containing the hemA [KK] gene of the type described above for the production of a Bacillus megaterium strain genetically modified according to the invention.
  • the present invention also includes the use of a nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 for the production of an antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. 3.
  • an antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. 3 for the production of a vector of the aforementioned type containing part of the hemZ gene according to SEQ ID No. 1 as antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No. 3 in the present invention.
  • the present invention furthermore relates to the use of a vector containing part of the hemZ gene according to SEQ ID No. 1 as antisense RNA (ashemZ) according to SEQ ID No.
  • the integrative vector containing the hemA [KK] gene and the vector containing an antisense RNA (ashemZ) can also be transferred into a suitable Bacillus megaterium strain and the resulting genetically modified strain can be used to produce vitamin B12.
  • the present invention thus also relates to the use of a genetically modified Bacillus megaterium strain of the type described for the production of vitamin B12.
  • the present invention furthermore relates to a process for the production of vitamin B12 by means of a culture comprising a genetically modified Bacillus megaterium strain of the type described, the fermentation being carried out under aerobic conditions.
  • a transition from aerobic to anaerobic fermentation conditions takes place in the exponential growth phase of the aerobically fermented cells. With this so-called shift or a two-stage fermentation process, vitamin B12 production can be increased even further.
  • a method is advantageous in which the transition from aerobic to anaerobic fermentation takes place as soon as the aerobic culture has reached its maximum optical density, but at least an optical density of approximately 2 to 3.
  • the optical density is usually determined at 570-600 nm.
  • anaerobic conditions are understood to mean those conditions which occur when the bacteria are transferred to anaerobic bottles after aerobic cultivation and are fermented there.
  • the transfer to the anaerobic bottles takes place in particular in the two-stage process as soon as the aerobically grown bacterial cells are in the exponential growth phase. This means that after the transfer to the anaerobic bottles, the bacteria consume the oxygen present there and no more oxygen is added.
  • These conditions can also be called semi-anaerobic.
  • the corresponding procedures are common laboratory practice and known to the person skilled in the art. Comparable conditions also prevail if the bacteria are first cultivated aerobically in a fermenter and then the oxygen supply is successively reduced, so that semi-anaerobic conditions develop over time.
  • the oxygen can also be actively expelled via gassing with inert gas, such as nitrogen.
  • inert gas such as nitrogen.
  • strictly anaerobic conditions can also be created, for example, by adding reducing agents to the culture medium.
  • an aerobic cultivation (preculture) of the bacteria is not absolutely necessary.
  • the bacteria can also be grown under anaerobic conditions and then fermented further under semi-anaerobic or strictly anaerobic conditions.
  • the inoculum is taken directly from the stock and used to produce vitamin B12 under anaerobic conditions.
  • the fermentation of the genetically modified Bacillus megaterium strain according to the invention can be carried out in a batch approach. Variants in which the fermentation takes place in a fed-batch approach or in continuous culture are also included according to the invention.
  • a method is advantageous in which the expression of the hemA [KK] XCDBL operon and / or the expression of the nucleotide sequence (ashemZ) coding for an antisense RNA of the hemZ gene is induced by adding xylose to the fermentation medium.
  • the present invention also relates to a variant of the method mentioned for the production of vitamin B12, in which the expression of the hemA [KK] XCDBL operon according to SEQ ID No. 4 and / or the expression of the nucleotide sequence (ashemZ) coding for an antisense RNA of the hemZ gene according to SEQ ID No. 3 is induced by the addition of xylose to the fermentation medium.
  • concentrations of xylose of approximately 0.1 to 1% have proven to be advantageous.
  • An addition of about 0.2 to 0.5% xylose to the culture medium is preferred. It is particularly preferred to add about 0.20-0.25%, in particular 0.23%, xylose under aerobic and 0.4-0.5%, in particular 0.5% under anaerobic fermentation conditions.
  • megaterium strain which has the ⁇ em-4 [KK] XCDßL operon integrated in the chromosome under the induced control of the xylA promoter (“integrated strain” ) leads to an increase in the vitamin B-
  • integral strain XCDßL operon integrated in the chromosome under the induced control of the xylA promoter
  • a comparison strain is to be understood as a B. megaterium strain which also carries a vector, but without an ashemZ insert.
  • the culture medium at least cobalt and / or 5-aminolevulinic acid is added to the culture medium.
  • the fermentation is advantageously carried out under aerobic conditions with the addition of about 250 ⁇ M cobalt; Under anaerobic conditions, the addition of up to 500 ⁇ M cobalt is advantageous.
  • the vitamin B-12 content can be increased by adding about 200 to 750 ⁇ M, preferably 250 to 500 ⁇ M cobalt per liter of culture medium can be raised.
  • the vitamin BT2 formed can be processed from the fermentation medium. Measures to do this are part of common laboratory practice and will not be discussed further here.
  • Titration reagent was KOH solution.
  • the titration reagent was NaOH solution.
  • MgCI 2 20.0 mM titration reagent was NaOH solution.
  • the titration reagent was NaOH solution.
  • Luria-Bertani Broth (LB) was used with full medium as in Sambrook et. al (1989). For solid media, an additional 15 g agar per liter was added.
  • Additives such as carbon sources, amino acids, antibiotics or salts were either added to the media and autoclaved together with them or prepared as concentrated stock solutions in water and sterilized or sterile filtered. The substances were added to the autoclaved and cooled to below 50 ° C media. In the case of light-sensitive substances such as tetracycline, care was taken to incubate in the dark. The final concentrations usually used were as follows, but this does not exclude a variation:
  • Aerobic bacterial cultures were incubated in baffled flasks at 37 ° C and a speed of 180 rpm. The incubation times were varied according to the desired optical densities of the bacterial cultures. Growth conditions for Bacillus megaterium
  • Aerobic cultures were incubated in baffled flasks at 250 rpm and 37 ° C for the best possible aeration.
  • Anaerobic cultures were cultivated in a volume of 150 ml in 150 ml anaerobic bottles at 37 ° C. and 100 rpm. In both cases, attention was paid to inoculation in a ratio of 1: 100 from overnight cultures, and the use of constant conditions for the overnight cultures.
  • ß Megaterium cultures pre-incubated aerobically and switched to anaerobic growth conditions at a desired density, ß. Megaterium was first incubated in Shikan flasks at 250 rpm and 37 ° C. In the middle of the exponential growth or at the beginning of the stationary phase, the entire culture was transferred to a 150 ml anaerobic bottle and cultivated further at 37 ° C. and 100 rpm.
  • Bacteria were removed from a glycerol culture using a sterile inoculation loop and fractionally streaked on an LB agar plate to which an appropriate antibiotic had been added, so that individual colonies can be seen on the plate after incubation at 37 ° C. overnight were. If bacteria from a liquid culture were used, they were spread on the LB agar plate with a Drygalski spatula and then incubated at 37 ° C. overnight.
  • the cell density of a bacterial culture was determined by measuring the optical density (OD) at 578 nm, it being assumed that an OD 57 8 of one corresponds to a cell count of 1x10 9 cells.
  • Glycerol cultures produced. 850 ⁇ l of a bacterial Overnight culture mixed thoroughly with 150 ⁇ l sterile 85% glycerol and then stored at -80 ° C.
  • the transformation was carried out by electroporation using a gene pulser with connected pulse controller (BioRad). In addition, 40 ⁇ l competent £ were added. co // - cells and 1 ⁇ g plasmid DNA transferred into a transformation cuvette and exposed in the Gene Pulser to a field strength of 12 kV / cm at 25 ⁇ F and a parallel resistance of 200 ⁇ . In the event that more than 2 ⁇ l of the plasmid DNA had to be added, dialysis was carried out.
  • the transformed cells were incubated in a 1 ml LB medium at 37 ° C. on the thermal shaker for half an hour immediately after the transformation. From the approaches were then spread different volumes on LB plates with the appropriate antibiotic additive and incubate overnight at 37 ° C.
  • 500 ⁇ l of the protoplast suspension were mixed with 0.5 to 1 ⁇ g DNA in SMMP buffer and 1.5 ml PEG-P solution was added. After incubation at Rt for 2 min, 5 ml of SMMP buffer were added, mixed carefully and the suspension was centrifuged (3000 x g; 5 min; RT). Immediately afterwards, the supernatant was removed and the barely visible sediment was resuspended in 500 ⁇ l SMMP buffer. The suspension was incubated at 37 ° C. for 90 min with gentle shaking. Then 50-200 ⁇ l of the transformed cells were mixed with 2.5 ml of cR5 top agar and placed on LB agar plates which contained the antibiotics suitable for the selection. Transformed colonies became visible after one day incubation at 37 ° C.
  • PCR primer 1 5'-TTTATATTCATATTCCATTTTG-3 'PCR primer 2: 5'-GGTAATCCAAAAATAAAATC-3'
  • a 480 bp PCR fragment was amplified, which has 65.1% identity with the hemZ gene from B. subtilis and is a partial sequence of the hemZ gene from B. megaterium.
  • a unidirectional PCR i.e. a so-called vectorette PCR, carried out with the vector system from Sigma-Genosys.
  • Vectorette PCR enables the amplification of unknown DNA areas that border on known sequence sections.
  • a first primer is designed based on the known DNA sequence.
  • the genome is cut with a restriction endonuclease and all the resulting ends are connected with a known short DNA sequence. After synthesis of the primary strand, this short sequence (vectorette) serves as the target sequence of the second primer.
  • the entire restriction digest fused with the vectorette units can be regarded as a kind of gene bank, the vectorette bank, with the aid of which any sequence can be amplified.
  • the PCR primer complementary to it for the second round of amplification can only hybridize when the primer specific for the known sequence region has been extended and the complementary sequence has been formed. This guarantees that the desired DNA is only amplified.
  • a prerequisite for a successful vectorette PCR is an amplifiable fragment size of the genomic DNA sought. The fragment size should not exceed 6-7 kb so that a special DNA polymerase (Taq) can synthesize the fragment without termination until the end.
  • Taq DNA polymerase
  • An adequate restriction enzyme for digesting the genomic DNA is determined by Southern blot pre-analysis. This was the Restriction enzyme Clal selected.
  • the fragment size determined by the Southern blot analysis allows the size of the expected PCR fragment to be calculated and thus facilitates its identification.
  • a strand of the complete hemZ gene from Bacillus megaterium was isolated by the vectorette PCR.
  • the entire hemZ gene could be completely amplified and sequenced from this sequence by inverse PCR.
  • the sequence is according to SEQ ID No. 1 shown.
  • the starting plasmids were pWH1967E (Schmiedel, D. et al., 1997, Appl. Micorbiol. Biotechnol., 47 (5): 543-546) and pMM1520 (Malten, Marco, 2002, production and secretion of a dextran sucrase in Bacillus megaterium, doctoral thesis , Institute of Microbiology (Prof. Dr. D. Jahn), Technical University Braunschweig).
  • the two plasmids were first cut with Pstl and Hindill. The complete batch was then applied to an agarose gel and the fragments of interest eluted.
  • the eluted fragment of pWH1967E (4198 bp) contained erythromycin resistance, the repF gene, the temperature sensitive origin pE194ts and half an ampicillin resistance.
  • the fragment of pMM1520 (1485 bp) contained the xylA 'promoter from ⁇ . megaterium, directly upstream of the promoter, a multiple cloning site, the origin from pBR322 and the second part of the ampicillin resistance gene, which complements the ampicillin resistance.
  • the cohesive ends of the two fragments have now been ligated.
  • the resulting plasmid was named pHBintE.
  • the cloning strategy is shown schematically in FIG. 1.
  • the cloned plasmid pHBintE (Fig. 1) thus has the following properties. It has ampicillin resistance for selection in E. coli and erythromycin resistance for selection of ß. megater / um transformants.
  • the temperature sensitive Origin pE194 ts for ß. megaterium permits replication only below 40 ° C., which means that a selection pressure for integration into the chromosome can be built up above this “permissive” temperature (Rygus et al, 1992).
  • the repF gene product is described as a trans-acting element, required for replication of the plasmid in gram positive bacteria (Villafane et al., 1987).
  • the plasmid also contains the xylA 'promoter with a multiple cloning site directly upstream. This promoter enables the induction of inserted into the multiple cloning site Genes with xylose.
  • the first 27 amino acids of the alignment report for HemA are of ⁇ . Megaterium with "KK-deregulated HemA", ß. megaterium INildtyp and from S. typhimurium. There is again clarified at which 15 place the insertion should take place.
  • the HemA [KK] mutant was cloned by means of PCR. Chromosomal DNA from ß served as template. megaterium. Since the sequence of the hemA gene from ß. megaterium was known, primers could be derived. The sequences of the primers are shown below:
  • the derived primers had no complete homology to ß. megate / m sequence.
  • 6 bases were exchanged for a Spel interface (italics).
  • the codon usage indicates the probability with which a particular base triplet codes for an amino acid in the genome of the organism.
  • ß. Megaterium is the most common triplet for lysine "AAA" with a percentage usage of 76%.
  • a Kpnl interface was inserted into the reverse primer. The primers were synthesized by MWG, Ebersbach.
  • the PCR-amplified hemA [KK] mutant was purified using a Quiagen PCR purification kit, cut with Spei and Kpnl and purified again.
  • the plasmid pHBintE was also cut with Spei and Kpnl and purified with a PCR purification kit from Quiagen. After determining the concentration, these two fragments were ligated with a vector / insert ratio of 1: 4 to the integration vector called pHBiHemAKK.
  • the cloning strategy for the plasmid pHBiHemAKK is shown schematically in FIG. 3.
  • pHBiHemAKK differs from pHBintE essentially only by the insertion of the hemA [KK] mutant, it retains its properties. There is also ampicillin and erythromycin resistance for selection in E. coli and in ß. megaterium available. The origin pBR322 and in ß are used for replication in E. coli. megaterium of the temperature-sensitive Origin pE194ts and repF. Xyl A 'and the hemA [KK] mutant were ligated to a translation fusion and are under the control of the xyl promoter. Due to the hemA [KK] insertion, pHBiHemAKK has a homologous section to the ß. megaterium chromosome and thus additionally the possibility to integrate into the chromosome via "single crossing over recombination".
  • the temperature-sensitive Origin pE194ts is important for the selection of this integration event. Since the plasmid is replicated at 30 ° C, ß. megater / tym transformants on erythromycin can be selected at this temperature. When the temperature is raised to 42 ° C, the plasmid can no longer be replicated. This means that only the Transformants can grow that have integrated the plasmid and thus the erythromycin resistance into their chromosome. The integration of pHBiHemA [KK] in the ß. megater / wm chromosome thus enables xylose-inducible overexpression of the entire ⁇ emAXODß operon.
  • the B. megaterium strain DSMZ509 with integrated plasmid pHBiHemA [KK] is referred to below as HBBml.
  • Primer forward contains BamHi interface 5'-GCGGGATCCCTTGAACTGAGCACCTTGACCGG-3 'primer reverse (ashemZ): contains Spel interface 5'-TCGACTAGTCGGACGTAAAAAACGTTCATCTTCTATACC-3'
  • the amplified BamHI / Spel antisense RNA fragment was then purified and cloned into the vector pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599), which had previously been identified with the Restriction endonucleases Spei and BamHI was linearized.
  • the resulting plasmid pHBasHemZ which contains an antisense hemZ RNA under the control of the xylA promoter, is shown in FIG. 4.
  • the inserted antisense hemZ RNA according to SEQ ID No. 3 has a length of 129 bp, which begins 82 nucleotides before the start codon of the actual hemZ gene.
  • An overview of the location of the antisense hemZ RNA is given below:
  • the transcript of the antisense RNA consequently forms a double-stranded RNA with the ⁇ emZ mRNA and thus blocks the ribosome binding site of the hemZ gene for the ribosomes.
  • ß. Megaterium DSMZ509 first transformed with pHBiHemAKK using protoplast transformation.
  • the transformed strain was cultured on agar plates with the addition of erythromycin (1 ⁇ g / ml and 75 ⁇ g / ml). 30 ° C was chosen as the cultivation temperature because the plasmid can be replicated at this temperature. After 24 hours of growth, colonies were identified at all concentrations of erythromycin indicated. Inoculation of some colonies on agar plates with an erythromycin additive (75 ⁇ g / ml) also led to growth under the conditions mentioned after 24 hours. This was the transformation of pHBiHemAKK into ß. megaterium DSMZ509 successful.
  • a 110 ml LB culture with 5 ⁇ g / ml erythromycin and 0.23% xylose was inoculated with these transformants and incubated at 30 ° C. under aerobic conditions (250 rpm shaking). After approx. 12 h, the temperature was raised to 42 ° C., so that no further replication of the plasmid could take place and a pressure for integration was built up. After a further 12 h, inoculation was carried out for a total of 3 days in new LB medium and incubation was continued at 42 ° C. After this time, there was good growth of the LB medium, which indicated the integration of the plasmid into the chromosome, since transformants with freely replicable plasmids under these conditions would not have been able to pass on the plasmid by replication.
  • FIG. 5 shows that when 298 ⁇ M ALA and 250 ⁇ M CoCl 2 are added, the growth of ⁇ . megaterium DSMZ509-pHBasHemZ (-! -) is significantly worse over the entire course than with the comparative transformer DSMZ509-pWH1520 (- + -). This means that the heme formation has been reduced by the antisense RNA.
  • ALA the precursor of all tetrapyrroles
  • the growth disadvantage of the transformants in comparison to the non-transformed strain is due to the additional replication of the plasmids and the addition of antibiotics in the medium.
  • Figure 6 confirms that the antisense hemZ RNA formed inhibits growth.
  • the growth of DSMZ509-pHBasHemZ (-! -) is always worse than that of the comparative transformant (- + -).
  • the antisense-ftemZ-RNA transformant thus reaches a maximum OD 578 of 8.3, while the maximum OD 578 of the comparative transformant is 10.0. This means that the coproporphyrinogen III oxidase has been inhibited.
  • S. typhimurium metE cysG double mutants were incubated overnight on minimal medium containing methionine and cysteine at 37 ° C., scraped off the plate and washed with 40 ml of isotonic NaCl solution. After centrifugation, the cell sediment was resuspended in isotonic saline. The washed bacterial culture was thoroughly mixed with 400 ml of 47-48 ° C minimal medium agar containing cysteine.
  • Vitamin B12 determination with the ELISA test 10 ⁇ l of the ß resuspended in deionized, sterile water and boiled in a water bath for 15 min. Megater / um samples were placed on the cooled plates and incubated at 37 ° C for 18 h. The diameters of the grown Salmonella colonies are then proportional to the content of vitamin B in the applied B. megaterium samples. By comparison with a calibration curve, made from the addition of 0.01, 0.1, 1, 10 and 40 pmol vitamin B12, the content of vitamin B12 in the examined samples was inferred. This standard method allows the detection of small amounts of vitamin B12 in biological materials quickly and very reproducibly. Vitamin B12 determination with the ELISA test
  • the basis is an antigen-antibody reaction, in which wells
  • Microtiter plate are coated with specific antibodies against vitamin B12. After the addition of enzyme-labeled vitamin B12 (enzyme conjugate) and sample solutions or vitamin B12 standard solutions, free and enzyme-labeled vitamin B12 compete for the vitamin B12 antibody binding sites (competitive enzyme immunoassay). Unbound enzyme-labeled vitamin B12 is then removed in a washing step. The detection is done by adding substrate / chromogen solution (tetramethylbenzidine / urea peroxide). Bound enzyme conjugate converts the chromogen into a blue end product. The addition of the stop reagent leads to a color change from blue to yellow. The measurement is carried out photometrically at 450 nm. Thus, the absorbance of the solution is inversely proportional to the vitamin B12 concentration in the sample.
  • enzyme-labeled vitamin B12 enzyme conjugate
  • sample solutions or vitamin B12 standard solutions free and enzyme-labeled vitamin B12 compete for the vitamin B12 antibody binding sites (competitive enzyme immunoassay). Unbound enzyme-
  • the mixture was mixed (shaking function in the fusion device) and incubated (15 min; RT). Following the incubation, the wells were emptied by tapping the microtiter plate and washed with 250 ⁇ l wash buffer per well. The cavities were emptied again by tapping and the washing step was repeated twice. Equitemporally, two drops of stop reagent were added per cavity, mixed and incubated for 10 min at room temperature in the dark. After the equitemporal addition of two drops of the stop reagent per cavity, the absorbance at 450 nm was measured in the Packard fusion device. The percentage absorbance was calculated as follows for evaluation:
  • a calibration line could now be determined by plotting the absorbance in% over log (ppb). Using the straight line equation, the dilution factor and the known cell density (OD578), the vitamin B12 content of the samples could then be given in ⁇ g / (l x OD).
  • FIG. 10 show the results of the vitamin B 2 determination when growing with glucose (1, 2, 5, 6) and when growing with glucose with the addition of 298 ⁇ M ALA and 250 ⁇ M CoCI 2 (3, 4, 7 , 8).
  • Figure 9 shows the vitamin B- ⁇ 2 concentrations based on the cell density of the respective culture. It can be seen there that in three out of four cases (No. 2, 6 and 8) DSMZ509-pHBasHemZ produced more vitamin B 12 than the comparative transformant (No. 1, 5 and 7).
  • DSMZ509-pHBasHemZ forms six hours after induction (No. 8) 10% more vitamin B 12 than DSMZ509-pWH1520.
  • the vitamin B 12 content is shown in pmol / OD 578 and in ⁇ g / l (FIGS. 11-12).
  • Vitamin B ⁇ 2 synthesis is coming.
  • FIG. 12 The presentation of the results in ⁇ g per liter of bacterial culture (FIG. 12) shows that the antisense- ⁇ emZ-RNA transcribing transformant (No. 3, 6 and 9) also produced the most vitamin B- ⁇ 2 overall, although this
  • the samples were resuspended in 1 ml of sterile, deionized water and the optical densities were then adjusted by dilution with water. 1 ml of these adjusted samples were now mixed with 50 ⁇ l lysozyme (1 mg / ml) and incubated at 37 ° C. for 30 min in a shaker at 300 rpm. The samples were then placed in an ultrasonic bath for 10 minutes and then centrifuged at 4000 ⁇ g for 3 minutes. The fluorescence measurement was now carried out with the supernatant. The following settings were made:
  • Em Slit 12 nm
  • Scan speed 200 nm / min
  • the growth curves with the addition of CoCI 2 and ALA gave the first indications of an inhibition of heme synthesis by antisense- ⁇ emZ-RNA.
  • the antisense ⁇ emZ-RNA inducible by xylose inhibits the ribosome binding site by occupying the hemZ-mR A and thus prevents translation to HemZ. This leads to a reduced formation of the HemZ protein, which catalyzes the reaction of coproporphyrinogen III to protoporhyrinogen IX. Since the actual metabolite flow is interrupted at this point, coproporphyrinogen III accumulates.
  • coproporphyrinogen III The direct detection of coproporphyrinogen III in samples proves to be difficult since coproporphyrinogen III is oxidized to coproporphyrin III in air. Preliminary tests showed that the fluorescence spectrum of coproporphyrin III has emission peaks at approximately 579 nm and approximately 620 nm. Relative amounts of coproporphyrinogen III should therefore be able to be detected indirectly using fluorescence spectra, the oxidized form (coproporphyrin III) being measured.
  • Figure 1 shows the schematic representation of the cloning of the integrative plasmid pHBintE for ß. megaterium.
  • the starting plasmids pWH1967E and pMM1520 were cut with the endonucleases Pstl and Hindi II.
  • the 4198 bp fragment (between Pstl-2786 and Hindlll-6984) from pWH1967E and the 1485 bp fragment (between Hindlll-7212 and Pstl-1307) from pMM1520 were eluted and ligated.
  • FIG. 2 shows a representation of the first 27 amino acids of the alignment report for 1.) S. typhimurium HemA, 2.) ß. megaterium HemA and 3.) ß. megaterium HemAKK.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the cloning strategy of the plasmid pHBiHemAKK.
  • the hemA [KK] mutant amplified by PCR and the vector pHBintE were cut with Spei and Kpnl, respectively, and the resulting cohesive ends were ligated to the integration vector pHBiHemAKK.
  • Figure 4 shows a schematic representation of the plasmid pHBasHemZ.
  • the interfaces Spei and BamHI indicated in the illustration were used to insert the antisense RNA.
  • Figure 5 shows the growth behavior of the ß. megater / um strain DSMZ509 and transformants of this strain at 37 ° C in Mopso minimal medium with glucose as carbon source and the addition of 298 ⁇ M ALA and 250 ⁇ M CoCI 2 . Transfer (shift) from aerobic to anaerobic growth took place at the end of the exponential phase (after 11 h). Growth of DSMZ509 untransformed (-A-), DSMZ509 pWH1520 (- + -) and DSMZ509 pHBasHemZ (-! -). The gene expression of the xylA promoter on pHBasHemZ and pWH1520 was induced by adding 0.5% (w / v) xylose after 10 h of growth. Samples were taken at the times indicated and the optical density at 578 nm was determined.
  • Figure 6 shows the growth behavior of the ß. megater / tm strain DSMZ509-pWH1520 (- + -) and DSMZ509-pHBasHemZ (-! -) in Mopso minimal medium with glucose as a carbon source and the addition of 298 ⁇ M ALA and 250 ⁇ M CoCI 2 under aerobic growth conditions. Induction was carried out by adding 0.5% (w / v) xylose at an OD 5 8 of 2. Samples were taken at the times indicated and the optical density at 578 nm was determined.
  • Figure 7 shows the content of vitamin B ⁇ 2 in ⁇ g / POD under aerobic growth conditions of ß.
  • Megaterium DSMZ509 (1), DSMZ509-pWH1520-cobA (2) and DSMZ509 with integrated pHBiHemAKK (3) in LB medium, measured with an ELISA test. Induction was carried out with 0.5% (w / v) xylose after 5 h of growth; the cell harvest after 10 h of growth. 1 DSMZ509
  • FIG. 8 shows the content of vitamin B 12 in ⁇ g / l under aerobic growth conditions of ⁇ .
  • FIG. 3 DSMZ509 with integrated pHBiHemAKK
  • Figure 9 shows the vitamin B 12 production in the transfer experiment of ß. megaterium DSMZ509-pWH1520 and DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso minimal medium with glucose as carbon source measured with an ELISA test. Induction was carried out with 0.5% (w / v) xylose after 9 h (1, 2, 5, 6,) or 10 h (3, 4, 7, 8) growth. The transfer from aerobic to anaerobic ⁇ took place one hour after induction. The content of vitamin B 12 is given in ⁇ g per liter of bacterial culture and OD 578 .
  • Figure 10 shows the vitamin B- ⁇ 2 production in the transfer experiment of ß. megaterium DSMZ509-pWH1520 and DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso minimal medium with glucose as carbon source measured with an ELISA test. Induction was carried out with 0.5% (w / v) xylose after 9 h (1, 2, 5, 6,) or 10 h (3, 4, 7, 8) growth. The transfer from aerobic to anaerobic took place one hour after induction. The content of vitamin B 12 is given in ⁇ g per liter of bacterial culture.
  • DSMZ509-pWH1520 with the addition of 250 ⁇ M CoCI 2 and 298 ⁇ M ALA, 3 h after induction.
  • DSMZ509-pHBasHemZ with the addition of 250 ⁇ M CoCI 2 and 298 ⁇ M ALA, 3 h after induction.
  • 6 DSMZ509-pHBasHemZ without additives, 6 h after induction.
  • 7 DSMZ509-pWH1520 with the addition of 250 ⁇ M CoCI 2 and 298 ⁇ M ALA, 6 h after induction.
  • Figure 11 shows the vitamin B- 2 production in the transfer experiment of ß. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 and DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso minimal medium with glucose as carbon source.
  • the transfer from aerobic to anaerobic took place one hour after induction.
  • Induction was carried out with 0.5% (w / v) xylose after 9 h growth.
  • the vitamin B 2 content per cell mass is given in pmol / OD 578 .
  • Figure 12 shows the vitamin B-
  • Figure 13 shows the vitamin B 2 production in the transfer experiment of ß. Megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 and DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso minimal medium with glucose as a carbon source with the addition of 298 ⁇ M ALA and 250 ⁇ M CoCI 2 .
  • the transfer from aerobic to anaerobic took place one hour after induction.
  • Induction was carried out with 0.5% (w / v) xylose after 10 h growth.
  • the content of vitamin B 12 per cell mass is given in pmol / OD 578 .
  • Figure 14 shows the vitamin B 12 production in the transfer experiment of ß. Megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 and DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso minimal medium with glucose as a carbon source with the addition of 298 ⁇ M ALA and 250 ⁇ M CoCI 2 .
  • the transfer from aerobic to anaerobic took place one hour after induction.
  • Induction was carried out with 0.5% (w / v) xylose after 10 h growth. It is the content of vitamin B- t2 in ⁇ g per liter Bacteria culture indicated.
  • FIG. 15 shows the difference fluorescence spectrum of B.megaterium DSMZ509-pHBasHemZ minus the fluorescence spectrum of DSMZ509-pWH1520 with excitation at 409 nm.
  • the emission peaks at 579 nm and 618 nm indicate coproporphyrin III and thus an accumulation of the metabolite pH in DSMasH50Z compared to DSMZ509-pWH1520.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend einen genetisch verändertenBacillus megaterium Stamm, einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm sowie Vektoren zu dessen Herstellung.

Description

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12
Die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 unter Einsatz eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes sowie Vektoren zur Herstellung genetisch veränderter Bakterien der Gattung Bacillus.
Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B12 indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L, 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531 , Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin Bι2 erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin Bι2-Biosynthese sind 5Λ-DesoxyadenosyIcobalamin (Coenzym B-ι2) und Methylcobalamin (MeCbl), während Vitamin B12 per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin Bι2 einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle.
Die Spezies ß. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von 2x5 μm, einem G+C-Gehalt von ca. 38 % und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge an B. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in B. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an ß. megaterium (Priest, F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporen-bildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer- negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von ß. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z.B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann ß. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Die Vorteile der breiten Anwendung von ß. megaterium bei der industriellen Produktion verschiedenster Enzyme, Vitamine etc. sind vielfältig. Ein Vorteil ist sicherlich in einer relativ gut entwickelten Genetik zu sehen, die innerhalb des Bacillus-Gen s nur von ß. subtilis übertroffen wird. Zweitens weist ß. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß ß. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezerniert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und ß-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit ß. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, bis eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels ß. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von ß. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß ß. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird ß. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von α- und ß-Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin B-ι2-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Aufgrund seiner vielfältigen Vorteile zum Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte ist der Einsatz von Bacillus megaterium wirtschaftlich sehr interessant. Zur Steigerung der Produktivität wirtschaftlich interessanter Produkte erfolgt zunehmend der Einsatz genetisch optimierter Bakterienstämme. Allerdings treten mit genetisch veränderten Bakterienstämmen regelmäßig Probleme hinsichtlich der Stabilität der in ihnen enthaltenen frei replizierbaren Plasmide auf. Ferner ist eine weitere Verbesserung des Stoffwechselflusses in Richtung Vitamin B12 sowie die gezielte Steuerung der Expression chromosomal kodierter Gene im Verlauf der Bakterien-Fermentation zur optimalen Steuerung der Produktausbeute wünschenswert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, genetisch veränderte Bacillus megaterium Stämme zur Verfügung zu stellen, mit denen die Herstellung von Vitamin B12 weiter verbessert werden kann. Dies erfordert ferner die Bereitstellung geeigneter Vektoren, die eine Überexpression der Enzyme zur Bildung von Uroporphyinogen-Ill aus Glutamyl-tRNA sowie in vorteilhafter Weise eine Repression des Häm- Biosyntheseweges verbunden mit einem gesteigerten Stoffwechselfluß in Richtung Vitamin B12 ermöglichen. Gleichzeitig sollten die erfindungsgemäßen Vektoren es ermöglichen, die gewünschten genetischen Veränderungen stabil in das Chromosom des Bakterienstammes zu integrieren. Ferner sollte eine Induktion der Genexpression des chromosomal kodierte hemAXCDBL-Operons und/oder die Repression des Häm- Biosyntheseweges im Verlauf der Fermentation gezielt steuerbar sein.
Die Aufgabe wird gelöst, durch die Bereitstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes enthaltend ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase und/oder einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ).
In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm umfaßt, der ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA- Synthase, organisiert in einem hemA[KK]XCDBL-Operon und/oder eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 enthält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für eine Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase.
Diese erfindungsgemäße Nukleotidsequenz zeichnet sich ferner dadurch aus, daß sie zu dem für eine Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase kodierenden Bereich des hemZ-Gens vorgeschaltete (5'- oder upstream) und/oder nachgeschaltete (3'- oder downstream) Sequenzen mit regulatorischer Funktion enthält.
Unter Sequenzen mit regulatorischer Funktion sind im Sinne der Erfindung solche Sequenzen zu verstehen, welche die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen können. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker. Diese Aufzählung ist jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Bevorzugt stammt die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 aus Bacillus megaterium. Die vorliegende Erfindung betrifft dabei auch sogenannte isolierte Nukleinsäuren. Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Ferner ist eine Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase gemäß SEQ ID No. 2 Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodiert. Es sind jedoch auch Allele der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für eine Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase in der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktioneil äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionen äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht. Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, d.h. für die Herstellung der genetisch veränderten Bacillus megaterium Stämme alle üblichen B. megaterium-Stämme eingesetzt werden, die als Vitamin B12- Produktionsstämme geeignet sind.
Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Bacillus megaterium-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-Produktionsstämme der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ32, DSMZ 509 und DSMZ 2894.
Erfindungsgemäß genetisch veränderte Bakterienstämme können prinzipiell durch klassische Mutagenese und bevorzugt durch gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u.a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B-12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin B12-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechesflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z.B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc.. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist in dem genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm das hemA[KK]-Gen gemäß SEQ ID No. 4 in das Bakterien-Chromosom integriert.
Eine weitere Variante eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes zeichnet sich dadurch aus, daß in diesem Bakterium ein Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) plasmidkodiert, in erhöhter Kopienzahl vorliegt.
Unter einem Teil des hemZ-Gens ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß ausgehend von der Nukleotidsequenz des hemZ-Gens gemäß SEQ ID No. 1, die Herstellung verschiedener antisense-RNAs möglich. Vorgehensweisen zur Herstellung von antisense-RNA, z.B. über PCR, sind dem Fachmann bekannt und gehören zur gängigen Laborpraxis. Die Unterschiede können sich beispielsweise durch die Länge der erstellten antisense-RNAs ergeben oder durch die Auswahl der Bereiche der hemZ- Nukleotidsequenz von der die antisense-RNA(s) abgeleitet wird (werden). Die antisense-mRNA-Sequenzen können dabei hinsichtlich ihrer Länge beispielsweise zwischen wenigen Nukleotiden und dem gesamten Sequenzabschnitt des Kodierbereichs variieren. Bevorzugt ist erfindungsgemäß eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
Die erhöhte Kopienzahl kann__ durch eine verstärkte Replikation eines entsprechenden Vektors, resultierend in einer erhöhter Kopienzahl, bedingt sein.
Prinzipiell kann eine erhöhte Kopienzahl auch durch eine mehrfache Integration eines Gens oder Teile davon in das Bakterienchromosom erreicht werden.
Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm, bei dem das hemA[KK]-Gen in das Bakterien- Chromosom integriert ist und ein Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) in erhöhter Kopienzahl vorliegt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm, bei dem das hemA[KK]-Gen, organisiert in dem hemA[KK]XCDBL-Operon, und/oder der Teil des hemZ-
Gens als antisense-RNA (ashemZ) unter der Kontrolle eines induzierbaren
Promotors steht. Beispiele für induzierbare Promotoren sind der Xylose- induzierbare XylA-Promotor oder der ein Beta-Galaktosidase-induzierbarer Promotor (Miller, J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring J arbor, New York) Erfindunsgemäß bevorzugt handelt es sich bei dem Xylose-induzierbaren Promotor um den xylA-Promotor des Xylose-Operons aus pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991,
Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599). Durch die Zugabe von Xylose zum Kulturmedium kann die Initiation der Transkription der unter der Kontrolle des xylA-Promotors liegenden Gene, also hier die Genexpression von hemA[KK]XCDBL und/oder ashemZ, gesteigert werden.
Zur Herstellung der zuvor beschriebenen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stämme werden erfindungsgemäß geeignete Vektoren konstruiert, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
So umfaßt die vorliegende Erfindung einen integrativen Vektor enthaltend ein Gen hemA[KK] kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA- Reduktase gemäß SEQ ID No. 4 sowie operativ damit verknüpfte Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
Unter einem integrativen Vektor ist ein Vektor zu verstehen, der durch ortsspezifische Rekombination an einer definierten Stelle in das
Wirtszellchromosom integriert wird und dort zusammen mit dem Chromosom repliziert. In einer erfindungsgemäßen Variante erfolgt diese ortsspezifische Rekombination über die homologen Sequenzen des hemA-Gens.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen.
Solche homologen Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 4 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide, beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen hemA-Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42°C und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid ( beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid) zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA- Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind unter homologen Sequenzen der in SEQ ID NO: 4 genannten Sequenz beispielsweise Varianten zu verstehen, die mindestens 95 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 96 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 97 oder 98 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 99 oder 99,9 % Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Unter Homologie ist für die vorliegende Erfindung Identität zu verstehen. Beide Begriffe sind synonym. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Erfindungsgemäß bevorzugt sind chemisch induzierbare Promotoren, durch die die Expression der ihnen unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden können. Beispielhaft sei hier das ß- Galakosidase-, Arabinose- oder Xylose-induzierbare-System genannt. Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Xylose-induzierbare-System und hierbei der xylA-Promotor aus pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599).
Erfindungsgemäß umfaßt ist somit auch ein integrativer Vektor der zuvor beschriebenen Art, bei dem die Genexpression unter der Kontrolle des xylA- Promotors steht.
Beispiele für Sequenzen zur Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle sind in der Literatur zahlreich beschrieben. So sind verschiedene Selektionsmarker bekannt, wie z.B. Gene, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin oder Erythromycin vermitteln. Diese Aufzählung ist jedoch nicht abschließend oder limitierend für die vorliegenden Erfindung. Erfindungsgemäß vorteilhafte Sequenzen zur Selektion sind das Ampicillinresistenzgen zur Selektion des Vektors in E. coli oder das Erythromycinresistenzgen zur Selektion in B. megaterium.
Vorteilhafte Varianten eines Replikationsursprungs in E. coli sind pBR322 (Sutcliffe, J.G., 1979, Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol., 43, Pt 1: 77-90 bzw. in B. megaterium pE194ts oder repF. Der temperatursensitive Origin pE194ts für ß. megaterium läßt eine Replikation nur unterhalb von 40 °C zu, wodurch oberhalb dieser „permissiven" Temperatur ein Selektionsdruck für eine Integration in das Chromosom aufgebaut werden kann (Rygus et. al, 1992). Das repF Genprodukt wird beschrieben als ein in-trans-agierendes Element, das für die Replikation des Plasmids in Gram-positiven Bakterien erforderlich ist (Villafane et al., 1987).
Eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen integrativen Vektors zeichnet sich dadurch aus, daß er wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung aufweist. Bevorzugt ist ein integrativer Vektor der den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts aufweist.
Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung umfaßt einen integrativen Vektor der sich dadurch auszeichnet, daß er eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) enthält, die für eine feedback- resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz eine Insertion von wenigstens zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Bevorzugt kodiert die in dem integrativen Vektor enthaltene genetische veränderte Nukleotidsequenz für eine feed-back-resistente Glutamyl-tRNA, die 2 bis 6, bevorzugt 2 bis 4 und besonders bevorzugt zwei zusätzliche Aminosäuren aufweist. Diese zusätzlichen Aminosäuren können auf der Ebene der sie kodierenden Nukleotidsequenz durch die Insertion von zwei oder entsprechend bis zu 6 Triplets nach dem Fachmann bekannten Vorgehensweisen, z.B. über PCR, in die kodierende Nukleotidsequenz eingeführt werden.
Eine bevorzugte Variante des integrativen Vektors enthält eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]), die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz an Position 3 und 4 des N-Terminus eine Insertion von zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei den positiv geladenen Aminosäuren um Lysinreste. . Unter einer feedback-resistenten Form eines Enzyms ist ein Protein zu verstehen, das durch das Endprodukt des Stoffwechselweges (oder eines Stoffwechselzweiges) in seiner Aktivität nicht mehr gehemmt wird. Erfindungsgemäß ist auch das Enzym einer feedback-resistenten Glutamyl- tRNA-Reduktase mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 5 kodiert durch das hemA[KK]-Gen aus B. megaterium umfaßt.
Die genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) umfaßt dabei natürlich vorkommende Varianten der hier beschriebenen hemA-Sequenz sowie eine künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenz. Genetische Veränderungen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.
Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die katalytische Funktion des Proteins, wohl aber die Regulation der Aktivität, wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben. Bevorzugt werden 6 Nukleotide, die in Anlehnung an den Kodongebrauch von B. megaterium für Lysin kodieren, in die kodierende Nukleotidsequenz eingefügt. Diese Veränderungen können nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA
(ashemZ) sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten
Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das
Chromosom der Wirtszelle.
Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Vektors enthält eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
Bevorzugt ist eine verstärkte Replikation des Vektors resultierend in einer erhöhten Kopienzahl eines Teils des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ), bevorzugt einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise können Expressionskassetten wirken, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern.
Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein.
Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein, beispielsweise durch eine erhöhte katalytische Aktivität oder eine deregulierte oder feedback-desensitive (feedback-resistente) Aktivität gegenüber Inhibitoren oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.ln der Wirtszelle enthaltend einen Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) lagert sich die gebildete (exprimierte) antisense-RNA an den entsprechenden (komplemantären) Bereich des für die Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase kodierenden mRNA an. Vorzugsweise blockiert sie dadurch die Ribosomenbindungsstelle des hemZ- Gens und hemmt auf diese Weise die Translation und Expression des an der Häm-Biosynthese beteiligten Schlüsselenzyms. Dies wiederum hat eine reduzierte Häm-Biosynthese zur Folge, mit dem Vorteil eines gesteigerten Flusses an Stoffwechselmetaboliten in Richtung der Vitamin-B12-Produktion.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Vektor enthaltend einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ), bevorzugt einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3, bei dem die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-Promotors steht. Ferner kann auch dieser Vektor prinzipiell in das Chromosom des Wirtszelle integrieren, beispielsweise wenn er mit einem temperatursensitiven Replikationsursprung ausgestattet ist. Eine Variante dieses Vektors weist wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung auf. Bevorzugt weist eine solche Vektorvariante den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts auf.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Vektoren erfolgt durch Fusion der zuvor erwähnten Komponenten, wie Promotor, kodierende Genabschnitte, Replikationsursprung, Gene zur Selektion etc. nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung des integrativen Vektors enthaltend das hemA[KK]-Gen der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung eines erfindungsgemäß genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes.
Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 zur Herstellung einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3. Außerdem ist die Verwendung einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines Vektors der zuvor genannten Art enthaltend einen Teil des hemZ-Gens gemäß SEQ ID No. 1 als antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 in der vorliegenden Erfindung umfaßt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung eines Vektors enthaltend ein Teil des hemZ-Gens gemäß SEQ ID No. 1 als antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes der erfindungsgemäßen Art. Erfindungsgemäß kann auch der integrative Vektor enthaltend das hemA[KK]-Gen und der Vektor enthaltend eine antisense- RNA (ashemZ) in einen geeigneten Bacillus megaterium Stamm übertragen werden und der resultierende genetisch veränderte Stamm zur Herstellung von Vitamin B12 eingesetzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die Verwendung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes der beschriebenen Art zur Herstellung von Vitamin B12.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm der beschriebenen Art, wobei die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird. In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in der exponehtiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen ein Übergang von aeroben zu anaeroben Fermentationsbedingungen. Durch diesen sogenannten Shift bzw. ein zweistufiges Fermentationsverfahren kann die Vitamin B12 Produktion noch weiter gesteigert werden.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist hierbei ein Verfahren, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte, wenigstens jedoch eine optische Dichte von etwa 2 bis 3 erreicht hat. Die Bestimmung der optischen Dichte erfolgt in der Regel bei 570-600 nm.
Unter anaeroben Bedingungen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. Der Zeitpunkt der Überführung in die Anaerobierflaschen erfolgt insbesondere bei dem zweistufigen Verfahren, sobald sich die aerob angezüchteten Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. D.h. nach der Überführung in die Anaerobierflaschen verbrauchen die Bakterien den dort vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semi-anaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt. Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi-anaerobe Bedingungen einstellen. Alternativ kann der Sauerstoff auch aktiv über eine Begasung mit Inertgas, wie Stickstoff, ausgetrieben werden. In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden. Generell ist für eine erfindungsgemäße Fermentation unter anaeroben Bedingungen (ob nun semi-anaerob oder strikt anaerob), eine aerobe Anzucht (Vorkultur) der Bakterien nicht zwingend erforderlich. D.h. die Bakterien können auch unter anaeroben Bedingungen angezüchtet werden und anschließend unter semi-anaeroben oder strikt anaeroben Bedingungen weiter fermentiert werden. Denkbar ist auch, daß das Inoculum direkt aus der Stammhaltung entnommen und zur Herstellung von Vitamin B12 unter anaeroben Bedingungen eingesetzt wird. Die Fermentation des erfindungsgemäß genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes kann in einem batch-Ansatz erfolgen. Varianten, bei denen die Fermentation in einem fed-batch-Ansatz oder in kontinuierlicher Kultur erfolgt, sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ein Verfahren, bei dem die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons und/oder die Expression der für eine antisense- RNA des hemZ-Gens kodierenden Nukleotidsequenz (ashemZ) durch Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Variante des genannten Verfahrens zur Herstellung von VitaminB12, bei dem die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons gemäß SEQ ID No. 4 und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierende Nukleotidsequenz (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 durch die Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
Bei erfindungsgemäßen VitaminB12-Herstellungsverfahren erweisen sich Konzentrationen an Xylose von etwa 0,1 bis 1% als vorteilhaft. Bevorzugt wird ein Zusatz von etwa 0,2 bis 0,5 % Xylose zum Kulturmedium. Besonders bevorzugt ist der Zusatz von etwa 0,20-0,25%, insbesondere 0,23% Xylose unter aeroben und 0,4-0,5%, insbesondere 0,5 % unter anaeroben Fermentationsbedingungen. Die erfindungsgemäße Überexpression des Λem.4[KK] CDßL-Operons in dem genetisch veränderten B. megaterium Stamm, der das Λem-4[KK]XCDßL-Operon unter der induzierten Kontrolle des xylA-Promotors im Chromosom integriert aufweist („integrierter Stamm"), führt zu einer Steigerung des Vitamin B-|2-Gehaltes um einen Faktor von wenigstens 15-40, bevorzugt 20-35, besonderes bevorzugt 22 beim Vergleich des B. megaterium Stammes DSMZ509 mit dem „integrierten" Stamm (μg/L x OD). Bei der Berechnung der Steigerung der Vitamin B12-Produktin in μg/l ergibt sich eine Steigerung um einen Faktor von wenigstens 15-40, bevorzugt 20- 35, besonderes bevorzugt 30.
Die erfindungsgemäße Überexpression des ashemZ-Gens in einem genetisch veränderten B. megaterium Stamm, wie z.B. DSMZ509,, die beispielsweise aufgrund einer erhöhten Kopienzahl in der Zelle beruht und zusätzlich durch die Zugabe von Xylose zum Kulturmedium induziert werden kann, führt zum Zeitpunkt von etwa 3 Stunden nach der Induktion mit Xylose zu einem Vitamin B12-Gehalt, der um den Faktor von etwa 15-40%, bevorzugt 20-35%, besonderes bevorzugt 22% gegenüber dem Vergleichsstamm gesteigert ist. Zum Zeitpunkt von etwa 6 Stunden nach der Induktion mit Xylose kann beispielsweise eine Steigerung des Vitamin B12- Gehaltes von etwa 16% vorliegen.
Unter einem Vergleichsstamm ist ein B. megaterium Stamm zu verstehen, der ebenfalls einen Vektor, jedoch ohne ashemZ-lnsert, trägt.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dem Kulturmedium wenigstens Cobalt und/oder 5-Aminolävulinsäure zugegeben wird. Vorteilhaft erfolgt die Fermentierung unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von etwa 250 μM Cobalt; unter anaeroben Bedingungen ist ein Zusatz von bis zu 500 μM Cobalt vorteilhaft. Bei der Zugabe von 5-Aminolävulinsäure sind sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen bis zu 300 μM vorteilhaft. In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Vitamin B-12 Gehalt durch die Zugabe von etwa 200 bis 750 μM, vorzugsweise 250 bis 500 μM Cobalt pro Liter Kulturmedium angehoben werden.
Bei Wachstum mit Cobalt und ALA werden in dem genetisch veränderten B. megaterium DSMZ509-pHBasHemZ sechs Stunden nach der Induktion mit Xylose wenigstens 1-25%, bevorzugt 5-18% und besonders bevorzugt 10 % mehr Vitamin B12 als in dem Vergleichsstamm gebildet. Dies zeigt, daß die Transkription der antisense- .emZ-RNA nicht nur die Synthese von Hamen inhibiert, sondern gleichzeitig zu einer erhöhten Vitamin B12-Bildung führt. Durch die Inhibierung der Häm-Synthese wird der Metabolitenfluß der Tetrapyrrolsynthese verstärkt in den Vitamin B12- Syntheseweg gelenkt.
Im Anschluß an die Fermentation kann das gebildete Vitamin BT2 aus dem Fermentationsmedium aufbereitet werden. Maßnahmen dazu gehören zur gängigen Laborpraxis und werden hier nicht weiter ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:
Bakterienstämme und Plasmide
Es wurden Bakterienstämme und Plasmide gemäß den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 eingesetzt.
Tabelle 1 : Verwendete Bakterienstämme
Figure imgf000021_0001
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig Tabelle 2: Verwendete Plasmide
Figure imgf000022_0002
Puffer und Lösungen Minimalmedien
Mopso-Minimalmedium
Mopso(pH 7.0) 50.0 mM
Tricin (pH 7.0) 5.0 mM
MgCI2 520.0 μM K2SO4 276.0 μM
FeSO4 50.0 μM
CaCI2 1.0 mM
MnCI2 100.0 μM
NaCI 50.0 mM KCI 10.0 mM
K2HPO4 1.3 mM
Figure imgf000022_0001
D-Glucose 20.2 mM
NH4CI 37.4 mM
Titrationsreagenz war KOH-Lösung.
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Lösungen zur Protoplastentransformation von Bacillus megaterium
SMMP-Puffer
Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g/i
Saccharose 500.0 mM
Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM
MgCI2 20.0 mM
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
PEG-P-Lösunα
PEG 6000 40.0 % (w/v)
Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM
MgCI2 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
cR5 Top-Agar
Saccharose 300.0 mM
Mops (pH 7.3) 31.1 mM
NaOH 15.0 mM
L-Prolin 52.1 mM D-Glucose 50.5 mM
K2SO4 1.3 mM
MgCI2 x 6 H2O 45.3 mM
KH2PO4 313.0 μM
CaCI2 13.8 mM Agar-Agar 4.0 % (w/v)
Casaminoacids 0.2 % (w/v)
Hefe-Extrakt 10.0 % (w/v)
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
Medien und Medienzusätze
Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook et. al (1989) beschrieben, gearbeitet. Für feste Medien wurden zusätzlich 15 g Agar pro Liter zugesetzt.
Zusätze
Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren, Antibiotika oder Salze wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen mit diesen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50 °C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende, die eine Variation jedoch nicht ausschließt:
ALA 298 μM
Ampicillin (für E. coli) 296 μM CoCI2 (in aeroben Kulturen) 250 μM
Erythromycin (für B. megaterium) 0.55 μM
102 μM
Glucose 22 mM Lysozym 1 mg/ml Tetracyclin (in festen Medien) 23 μM Tetracyclin (in flüssigen Medien) 68 μM Xylose 33 mM
Mikrobiologische Techniken
Sterilisation
Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für 20 min bei 120 °C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert (Porendurchmesser des Filters 0.2 μm), Glaswaren mindestens 3 h bei 180 °C hitzesterilisiert.
Allgemeine Wachstumsbedingungen für Bakterien-Flüssigkulturen Mit einer sterilen Impföse wurden von einer LB-Agar-Platte oder aus einer Glycerinkultur Bakterien entnommen und in das Nährmedium gegeben, welches bei Bedarf ein Antibiotikum enthielt.
Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37 °C und einer Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert. Wachstumsbedingungen für Bacillus megaterium
Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 150 ml in 150 ml Anaerobenflaschen bei 37 °C und 100 rpm kultiviert. In beiden Fällen wurde auf eine Animpfung im Verhältnis 1:100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet. Um höhere Ausbeuten an Zellmasse unter anaeroben Bedingungen zu erzielen, wurden ß. megaterium Kulturen aerob vorinkubiert und bei einer Wunschdichte auf anaerobe Wachstumsbedingungen umgestellt, ß. megaterium wurde dazu zunächst in Shikanekolben bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. In der Mitte des exponentiellen Wachstums bzw. zum Anfang der stationären Phase wurde die gesamte Kultur in eine 150 ml Anaerobenflasche überführt und weiterhin bei 37 °C und 100 rpm kultiviert.
Plattenkulturen von Bakterien
Mit einer sterilen Impföse wurden aus einer Glycerinkultur Bakterien entnommen und auf einer LB-Agar-Platte, die bei Bedarf mit einem entsprechenden Antibiotikum versetzt war, fraktioniert ausgestrichen, so dass nach einer Inkubation bei 37 °C über Nacht einzelne Kolonien auf der Platte zu sehen waren. Wenn Bakterien aus einer Flüssigkultur verwendet wurden, so wurden diese auf der LB-Agar-Platte mit einem Drygalski-Spatel ausgestrichen und anschließend über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Bestimmung der Zelldichte
Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, dass einer OD578 von eins eine Zellzahl von 1x109 Zellen entspricht.
Lagerung von Bakterien
Zur längerfristigen Aufbewahrung von Bakterien wurden sogenannte
Glycerinkulturen hergestellt. Dazu wurden 850 μl einer Bakterien- Übernachtkultur mit 150 μl sterilem 85%igem Glycerin gründlich vermischt und danach bei -80 °C gelagert.
Molekularbiologische Methoden
Das Standardwerk für die beschriebenen molekularbiologischen Methoden ist Sambrook et al. (1989).
Herstellung kompetenter Zellen Zur Herstellung von kompetenten E. coli-Ze\\en wurden 500 ml Flüssigkulturen mit LB-Medium bis zu einer OD578 von 0.5-1 kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (4000 x g; 15 min; 4 °C). Das Zellsediment wurde in sterilem, deionisiertem Wasser gut resuspendiert, abzentrifugiert (4000 x g; 8 min; 4 °C), erneut mit sterilem, deionisiertem Wasser gewaschen und wieder zentrifugiert (4000 x g; 8 min; 4 °C). Nach Waschen des Sediments mit 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung wurde abzentrifugiert (4000 x g; 8 min; 4 °C) und das Sediment in so wenig wie möglich 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung resuspendiert. Die kompetenten E. co/-Zellen wurden sofort für die Transformation verwendet oder bei -80 °C eingefroren.
Transformation von Bakterien durch Elektroooration
Die Transformation erfolgte durch Elektroporation mit Hilfe eines Gene Pulsers mit angeschlossenem Pulse Controller (BioRad). Dazu wurden je 40 μl kompetente £. co//-Zellen und 1 μg Plasmid-DNA in eine Transformationsküvette überführt und im Gene Pulser einer Feldstärke von 12 kV/cm bei 25 μF und einem parallelen Widerstand von 200 Ω ausgesetzt. Für den Fall, dass mehr als 2 μl der Plasmid-DNA zugegeben werden mußte, wurde dialysiert.
Zur anschließenden Regeneration wurden die transformierten Zellen sofort nach der Transformation in 1 ml LB-Medium eine halbe Stunde bei 37 °C auf dem Thermoschüttler inkubiert. Von den Ansätzen wurden anschließend verschiedene Volumina auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Protoplastentransformation von Bacillus megaterium
Protoplastenpräparation
50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von ß. megaterium angeimpft und bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD578 von 1 wurden die Zellen abzentrifugiert (10000 x g; 15 min; 4 °C) und in 5 ml frisch hergestellten SMMP-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37 °C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation (3000 x g; 8 min; Rt) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10 % (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80 °C eingefroren werden.
Transformation
500 μl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 μg DNA in SMMP- Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension zentrifugiert (3000 x g; 5 min; RT). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 μl SMMP- Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50 - 200 μl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach eintägiger Inkubation bei 37 °C sichtbar.
Klonierung und Seguenzierung des hemZ-Gens aus Bacillus megaterium
Zur Sequenzierung des hemZ-Gens aus Bacillus megaterium DSMZ509 wurde genomische DNA isoliert und als template in eine PCR Reaktion mit nachfolgenden primern eingesetzt: PCR-Primer 1: 5'-TTTATATTCATATTCCATTTTG-3' PCR-Primer 2: 5'-GGTAATCCAAAAATAAAATC-3'
Es wurde ein 480 bp langes PCR-Fragment amplifiziert, das 65,1% Identität mit dem hemZ-Gen aus B. subtilis aufweist und eine Teilsequenz des hemZ- Gens aus B. megaterium darstellt. Zur Vervollständigung der hemZ- Teilsequenz wurde eine unidirektionale PCR, d.h. eine sogenannte Vectoretten-PCR, mit dem Vectorettensystem der Firma Sigma-Genosys durchgeführt.
Die Vectoretten-PCR ermöglicht die Amplifikation von unbekannten DNA- Bereichen, die an bekannte Sequenzabschnitte angrenzen. Dabei wird ein erster Primer anhand der bekannten DNA-Sequenz entworfen. Zur Etablierung einer bekannten DNA-Sequenz für die Hybridisierung des zweiten nötigen PCR-Primers wird das Genom mit einer Restriktionsendonuclease zerschnitten und alle entstandenen Enden mit einer bekannten kurzen DNA- Sequenz verbunden. Diese kurze Sequenz (Vectorette) dient nach Synthese des Primärstranges als Zielsequenz des zweiten Primers. Den gesamten mit den Vectoretteneinheiten fusionierten Restriktionsverdau kann man als eine Art Genbank, die Vectorette-Bank, betrachten, mit deren Hilfe sich jede beliebige Sequenz amplifizieren läßt. Da die Vectorette aus einem teilweise ungepaarten Oligonucleotiddoppelstrang besteht, kann der zu ihr komplementäre PCR-Primer für die zweite Amplifikationsrunde erst hybridisieren, wenn der für den bekannten Sequenzbereich spezifische Primer verlängert wurde und die komplementäre Sequenz entstanden ist. Das garantiert die alleinige Amplifikation der Wunsch-DNA. Vorbedingung für eine erfolgreiche Vectoretten-PCR ist eine amplifizierbare Fragmentgröße der gesuchten, genomischen DNA. Dabei sollte die Fragmentgröße 6-7 kb nicht überschreiten, damit eine spezielle DNA- Polymerase (Taq) das Fragment ohne Abbruch bis zum Ende synthetisieren kann. Ein adäquates Restriktionsenzym zum Verdau der genomischen DNA wird durch Southern Blot-Voranalyse bestimmt. Hierzu wurde das Restriktionsenzym Clal gewählt. Die durch die Southern Blot-Analyse bestimmte Fragmentgröße erlaubt die Kalkulation der Größe des zu erwartenden PCR-Fragments und erleichtert damit dessen Identifikation. Durch die Vectoretten-PCR wurde ein Strang des vollständigen hemZ-Gens aus Bacillus megaterium isoliert. Durch inverse PCR konnte ausgehend von dieser Sequenz das gesamte hemZ-Gen vollständig amplifiziert und sequenziert werden. Die Sequenz ist gemäß SEQ ID No. 1 dargestellt.
Vektorkonstruktionen Konstruktion von pHBintE
Als Ausgangsplasmide fungierten pWH1967E (Schmiedel, D. et al., 1997, Appl. Micorbiol. Biotechnol., 47 (5): 543-546) und pMM1520 (Malten, Marco, 2002, Produktion und Sekretion einer Dextransucrase in Bacillus megaterium, Doktorarbeit, Institut für Mikrobiologie (Prof. Dr. D. Jahn), Technische Universität Braunschweig). Die beiden Plasmide wurden zunächst jeweils mit Pstl und Hindill geschnitten. Anschließend wurde jeweils der komplette Ansatz auf ein Agarosegel aufgetragen und die interessierenden Fragmente eluiert. Das eluierte Fragment von pWH1967E (4198 bp) enthielt eine Erythromycinresistenz, das repF-Gen, den temperatursensitiven Origin pE194ts und eine halbe Ampicillinresistenz. Das Fragment von pMM1520 (1485 bp) enthielt den xylA'-Promotor aus ß. megaterium, direkt stromaufwärts des Promotors eine multiple cloning site, den Origin aus pBR322 und den zweiten Teil des Ampicillinresistenz-Gens, das die Ampicillinresistenz komplementiert. Die kohäsiven Enden der beiden Fragmente wurden nun ligiert. Das so erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pHBintE. Die Klonierungsstrategie ist in Fig. 1 schematisch dargestellt.
Das klonierte Plasmid pHBintE (Fig. 1) hat somit die folgenden Eigenschaften. Es weist eine Ampicillinresistenz zur Selektion in E. coli- und eine Erythromycinresistenz zur Selektion von ß. megater/um-Transformanten auf. Die wichtigen Elemente zur Replikation in E. coli (pBR322) und ß. megaterium (pE194ts und repF) sind vorhanden. Der temperatursensitive Origin pE194 ts für ß. megaterium läßt eine Replikation nur unterhalb von 40 °C zu, wodurch oberhalb dieser „permissiven" Temperatur ein Selektionsdruck für eine Integration in das Chromosom aufgebaut werden kann (Rygus et al, 1992). Das repF Genprodukt wird beschrieben als ein trans-agierendes Element, das für die Replikation des Plasmids in Grampositiven Bakterien erforderlich ist (Villafane et al., 1987). Des weiteren enthält das Plasmid den xylA'-Promotor mit einer multiplen cloning site direkt stromaufwärts. Dieser Promotor ermöglicht die Induktion von in die multiple cloning site eingefügten Genen mit Xylose. ιo-
Konstruktion von pHBiHemAfKK]
In Fig. 2 sind die ersten 27 Aminosäuren des Alignment Reports für HemA von ß. megaterium mit „KK-dereguliertem HemA", ß. megaterium INildtyp und von S. typhimurium dargestellt. Dort ist nochmals verdeutlicht, an welcher 15 Stelle die Insertion stattfinden soll.
Die Klonierung der HemA[KK]-Mutante erfolgte mittels PCR. Als Template diente chromosomale DNA von ß. megaterium. Da die Sequenz des hemA- Gens von ß. megaterium bekannt war, konnten Primer abgeleitet werden. Die Sequenzen der Primer sind nachfolgend dargestellt:
20
Forward 5' GGGG CT GTCAAATGCATAAAAAAATTATAGCAGTCGG 3'
Reverse 5' CTGGGGTΛCCCCATATCAACCATTATTCAATCC 3'
Die abgeleiteten Primer hatten keine vollständige Homologie zur ß. megate /m-Sequenz. In den Forward-Primer wurden zum einen 6 Basen gegen eine Spel-Schnittstelle ausgetauscht (kursiv). Zum anderen wurden
25 weitere 6 Basen zur Klonierung der HemA[KK]-Mutante durch eine 6 Basen lange DNA-Sequenz, die für zwei Lysine codiert, ersetzt (unterstrichen). Die Stelle der Insertion ist so gewählt, dass die „KK-Insertion" an die dritte und vierte Position des N-Terminus der Aminosäuresequenz gelangt. Da der genetische Code degeneriert ist, wurde zur Ermittlung der wahrscheinlichsten
30 Sequenz die Codon-Usage von ß. megaterium benutzt. Die Codon-Usage gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit im Genom des Organismus ein bestimmtes Basentriplett für eine Aminosäure codiert. Bei ß. megaterium ist für Lysin „AAA" mit einer prozentualen Verwendung von 76 % das häufigste Triplett. In den Reverse-Primer wurde eine Kpnl-Schnittstelle eingefügt. Die Synthese der Primer erfolgte durch die Firma MWG, Ebersbach.
Die über PCR amplifizierte hemA[KK]-Mutante wurde mit einem PCR- Purification-Kit von Quiagen gereinigt, mit Spei und Kpnl geschnitten und erneut gereinigt. Das Plasmid pHBintE wurde ebenfalls mit Spei und Kpnl geschnitten und mit einem PCR-Purification-Kit von Quiagen gereinigt. Nach der Konzentrationsbestimmung wurden diese beiden Fragmente mit einem Vektor/Insert Verhältnis von 1 :4 zu dem Integrationsvektor mit der Bezeichnung pHBiHemAKK ligiert. Die Klonierungsstrategie für das Plasmid pHBiHemAKK ist in Fig. 3 schematisch dargestellt.
Da pHBiHemAKK sich im wesentlichen nur durch die Insertion der hemA[KK]- Mutante von pHBintE unterscheidet, behält es dessen Eigenschaften bei. Es sind weiterhin die Ampicillin- und die Erythromycinresistenz zur Selektion in E. coli bzw. in ß. megaterium vorhanden. Zur Replikation in E. coli dient der Origin pBR322 und in ß. megaterium der temperatursensitive Origin pE194ts und repF. Xyl A' und die hemA[KK]-Mutante wurden zu einer Translationsfusion ligiert und stehen unter der Kontrolle des xyl-Promotors. Aufgrund der hemA[KK]-lnsertion besitzt pHBiHemAKK einen homologen Abschnitt zum ß. megaterium Chromosom und damit zusätzlich die Möglichkeit über „Single crossing over recombination" in das Chromosom zu integrieren.
Zur Selektion dieses Integrationsereignisses ist der temperatursensitive Origin pE194ts von Bedeutung. Da bei 30 °C das Plasmid repliziert wird, können ß. megater/tym-Transformanten auf Erythromycin bei dieser Temperatur selektioniert werden. Bei Erhöhung der Temperatur auf 42 °C kann das Plasmid nicht mehr repliziert werden. Dies bedeutet, dass nur die Transformanten wachsen können, die das Plasmid und damit die Erythromycin Resistenz in ihr Chromosom integriert haben. Die Integration von pHBiHemA[KK] in das ß. megater/wm-Chromosom ermöglicht somit eine Xylose-induzierbare Überexpression des gesamten ΛemAXODß -Operons. Zudem enthält das Plasmid durch die feedback deregulierte Mutante des HemA-Proteins eine verbesserte Möglichkeit zur Überproduktion von Vitamin Bι2. Der B. megaterium Stamm DSMZ509 mit integriertem Plasmid pHBiHemA[KK] wird im Folgenden mit HBBml bezeichnet.
Konstruktion von pHBasHemZ
Ausgehend von genomischer DNA, isoliert aus B. megaterium DSMZ509, wurde mittels PCR und der nachfolgend aufgeführten primer nach gängiger Laborpraxis ein 129 bp langes BamHI/Spel-Fragment aus dem 5'-Bereich der mRNA des hemZ-Gens in Form einer antisense-RNA amplifiziert.
Primer forward (ashemZ): enthält BamHi-Schnittstelle 5'-GCGGGATCCCTTGAACTGAGCACCTTGACCGG-3' Primer reverse (ashemZ): enthält Spel-Schnittstelle 5'-TCGACTAGTCGGACGTAAAAAACGTTCATCTTCTATACC-3'
PCR-Bedingungen: 7 min/ 95 °C 30 mal: 1 min/ 95 °C
1 min/ 64 °C
1 min/ 72 °C 7 min/ 72 °C
Anschließend wurde das amplifizierte BamHI/Spel-antisense-RNA-Fragment aufgereinigt und in den Vektor pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991 , Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599) kloniert, der zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Spei und BamHI linearisiert wurde. Das resultierende Plasmid pHBasHemZ, welches eine antisense-hemZ-RNA unter der Kontrolle des xylA-Promotors enthält, ist in Fig. 4 dargestellt.
Die inserierte antisense-hemZ-RNA gemäß SEQ ID No. 3 weist eine Länge von 129 bp auf, die 82 Nukleotide vor dem Startcodon des eigentlichen hemZ Gens beginnt. Eine Übersicht über die Lage der antisense-hemZ-RNA ist nachfolgend gegeben:
Figure imgf000033_0001
Das Transkript der antisense RNA bildet demzufolge mit der ΛemZ-mRNA eine doppelsträngige RNA und blockiert so die Ribosomenbindestelle des hemZ-Gens für die Ribosomen.
Transformation und Integration von pHBiHemAKK in Bacillus megaterium
Um den vorliegenden Integrationsvektor in das Chromosom integrieren zu können, wurde ß. megaterium DSMZ509 zunächst mit pHBiHemAKK mittels Protoplastentransformation transformiert. Der transformierte Stamm wurde auf Agarplatten mit einem Zusatz von Erythromycin (1 μg/ml und 75 μg/ml) kultiviert. Als Kultivierungstemperatur wurde 30 °C gewählt, weil bei dieser Temperatur das Plasmid repliziert werden kann. Nach 24 Stunden Wachstum sind Kolonien bei allen angegebenen Konzentrationen von Erythromycin identifiziert worden. Auch ein Überimpfen einiger Kolonien auf Agarplatten mit einem Erythromycinzusatz (75 μg/ml) führte unter den genannten Bedingungen nach 24 Stunden zum Wachstum. Damit war die Transformation von pHBiHemAKK in ß. megaterium DSMZ509 erfolgreich.
Mit diesen Transformanten wurde eine 110 ml LB Kultur mit 5 μg/ml Erythromycin und 0,23 % Xylose angeimpft und unter aeroben Bedingungen (250 rpm Schütteln) bei 30 °C inkubiert. Nach ca. 12 h wurde die Temperatur auf 42 °C erhöht, so dass keine weitere Replikation des Plasmides erfolgen konnte und dadurch ein Druck zur Integration aufgebaut wurde. Nach weiteren 12 h wurde für insgesamt 3 Tage jeweils in neues LB-Medium überimpft und weiter bei 42 °C inkubiert. Nach dieser Zeit zeigte sich ein guter Bewuchs des LB-Mediums, der die Integration des Plasmids ins Chromosom anzeigte, da Transformanten mit frei replizierbaren Plasmiden unter diesen Bedingungen keine Weitergabe des Plasmides durch Replikation möglich gewesen wäre.
Wachstumsverhalten des genetisch veränderten B. megaterium DSMZ509 ß. megaterium DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAfKKI unter aeroben Bedingungen
Zur Überprüfung der Wachstumsfähigkeit des neuen Stammes wurden Wachstumskurven in LB-Medium aufgenommen mit Zusatz von 5 μg/ml Erythromycin und 0,23 % Xylose bei 42 °C unter aeroben Bedingungen. Es zeigte sich für die pHBiHemAKK-Integrationstransformante ein gutes aerobes Wachstum wenn im Medium eine geringe Menge Xylose vorhanden ist.
ß. megaterium DSMZ509 mit pHBasHemZ im Transferexperiment
Bei sogenannten „Transferexperimenten" wird ß. megaterium zunächst unter aeroben Bedingungen kultiviert, um eine hohe Zelldichte zu erzielen. Anschließend wird die Kultur zum Ende der exponentiellen Phase zu anaeroben Bedingungen überführt, da unter anaeroben Bedingungen die Bakterien einen wesentlich höheren Vitamin B12-Gehalt erreichen (Barg, H., 2000, Vitamin B12-Produktion durch Bacillus megaterium, Diplomarbeit, Albert Ludwigs-Universität, Freiburg).
Es wurden der nicht-transformierte Stamm ß. megaterium DSMZ509 und die Transformanten DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ bei Wachstum mit Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle verglichen. Den Kulturen der Transformanten wurden wieder 30 μg/ml Tetracyclin zugesetzt. Die Induktion mit 0.5 % (w/v) Xylose erfolgte nach 9 Stunden Wachstum; das bedeutet 1 Stunde vor dem Transfer von aeroben zu anaeroben Bedingungen.
Da kein deutlicher Unterschied des Wachstums der antisense-hemZ-RNA bildenden Transformante und der Vergleichstransformante festgestellt wurde, wurden Wachstumsvergleiche mit der Zugabe von CoCI2 und ALA unternommen. Aufgrund der Zugabe von ALA sollte es auch zu einem vermehrten Metabolitenfluß in den Häm-Syntheseweg kommen. Eine Inhibierung durch die antisense-ΛetnZ-RNA sollte somit einen deutlichen Wachstumsunterschied in Bezug zur Vergleichstransformante zeigen. Bei diesem Transferexperiment erhielten die Kulturen der Transformanten erneut einen Tetracyclin-Zusatz von 30 μg/ml und zusätzlich eine Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA. Die Induktion mit 0.5 % (w/v) Xylose erfolgte nach 10 Stunden Wachstum (entspricht 1 Stunde vor dem Transfer).
Die Figur 5 zeigt, daß bei Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI2 das Wachstum von ß. megaterium DSMZ509-pHBasHemZ (-!-) über den gesamten Verlauf deutlich schlechter ist als bei der Vergleichstransformante DSMZ509-pWH1520 (-+-). Dies bedeutet, daß eine Reduktion der Häm- Bildung durch die antisense RNA stattgefunden hat. Die Zugabe von ALA (dem Vorläufermolekül aller Tetrapyrrole) scheint die Tetrapyrrolsynthese derart zu stimulieren, daß sich die Inhibierung der Coproporphyrinogen III-
Oxidase (HemZ) durch die antisense-ΛemZ-RNA im Wachstum bemerkbar macht.
Mit der Zugabe von ALA und CoCI2 werden geringere Zelldichten erreicht als beim Wachstum ohne diese Zusätze. Die erreichten Zelldichten hatten bei den Transformanten eine OD578 von 3.9 für die antisense Transformante und 5.2 für die Vergleichstransformante (ohne Zusätze: 8.7 und 8.8). Der nicht- transformierte Stamm DSMZ509 (-A-) zeigt über den gesamten Verlauf das beste Wachstum und hatte zum Zeitpunkt des Transfers mit einer OD578 von 7.8 die höchste Zelldichte (ohne Zusätze: 10.8).
Der Wachstumsnachteil der Transformanten im Vergleich zum nicht- transformierten Stamm ist bedingt durch die zusätzliche Replikation der Plasmide und durch den Antibiotikazusatz im Medium.
Bacillus megaterium DSMZ509-pHBasHemZ bei Cobalt- und ALA-Zusatz unter aeroben Bedinungen
Bei den vorangegangenen Transferexperimenten fand nach der Induktion lediglich eine Stunde Wachstum unter aeroben Bedingungen statt. Da Häme hauptsächlich unter aeroben Bedingungen benötigt werden, wurde ein Wachstumsvergleich der beiden ß. megaterium Transformanten DSMZ509- pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und der Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Induktion mit 0.5 % Xylose (w/v) fand bei einer OD578 von 2 statt.
Die Figur 6 bestätigt, daß die gebildete antisense-hemZ-RNA das Wachstum hemmt. Auch hier ist das Wachstum von DSMZ509-pHBasHemZ (-!-) zu jedem Zeitpunkt schlechter als das der Vergleichstransformante (-+-). So erreicht die antisense-ftemZ-RNA bildenden Transformante eine maximale OD578 von 8.3, während die maximale OD578 der Vergleichstransformante 10.0 beträgt. Dies bedeutet, daß eine Inhibierung der Coproporphyrinogen III- Oxidase stattgefunden hat. Quantitative Vitamin Bι?-Analvse
Zur quantitativen Vitamin Bι2-Bestimmung wurden zwei verschiedene Methoden angewendet. Zum einen erfolgte die Bestimmung anhand des Wachstums von S.typhimurium metE cysG Doppelmutanten, zum anderen mit dem RIDASCREEN®FAST Vitamin Bι2 ELISA Test der Firma r-biopharm in Verbindung mit dem Plattenlesegerät Fusion von Packard.
Vitamin B12-Bestimmung mit S. typhimurium metE cvsG Doppelmutanten Es wurden in verschiedenen Wachstumsphasen Proben von ß. megaterium-
Kulturen genommen. Nach Bestimmung der OD578 wurden die Zellen durch
Zentrifugieren (4000 x g; 15 min; 4 °C) vom Medium abgetrennt. Die erhaltenen Zellsedimente sowie die abgenommenen Medien wurden anschließend gefriergetrocknet.
S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37 °C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer NaCI-Lösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48 °C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt.
10 μl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten ß. megater/um-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37 °C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellen Kolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin Bin der aufgetragenen B. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01, 0.1, 1 , 10 und 40 pmol Vitamin B12, wurde auf den Gehalt an Vitamin B12 in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B12-Mengen in biologischen Materialien. Vitamin B12-Bestimmung mit dem ELISA-Test
Testprinzip:
Grundlage ist eine Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der Vertiefungen einer
Mikrotiterplatte mit spezifischen Antikörpern gegen Vitamin B12 beschichtet sind. Nach der Zugabe von enzymmarkiertem Vitamin B12 (Enzymkonjugat) und Probelösungen bzw. Vitamin B12-Standardlösungen konkurrieren freies und enzymmarkiertes Vitamin B12 um die Vitamin B12- Antikörperbindungsstellen (kompetetiver Enzymimmunoassay). Nicht gebundenes enzymmarkiertes Vitamin B12 wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat-/ Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin/Harnstoffperoxid). Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stop-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm. Somit ist die Extinktion der Lösung umgekehrt proportional zur Vitamin B12-Konzentration in der Probe.
Durchführung:
Aus der zu messenden B. megaterium-Flüssigkultur wurden 2 ml Proben zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums entnommen und die OD578 bestimmt. Durch anschließendes Zentrifugieren (4000 x g; 5 min; 4 °C) wurden die Zellen vom Medium getrennt, der Überstand verworfen und das Sediment gefriergetrocknet. Nun wurden die benötigten Reagenzien (Standards, Enzymkonjugat und Waschpuffer-Konzentrat) des Testkits auf Raumtemperatur gebracht und wie in der zugehörigen Vorschrift beschrieben vorbereitet und verdünnt. Unmittelbar vor dem Test erfolgte die Vorbereitung der Proben. Hierzu wurden die gefriergetrockneten Zellen in 0.5 ml sterilem, deionisiertem Wasser resuspendiert. Durch die Zugabe von 50 μl Lysozym-Lösung (1 mg/ml), anschließender Inkubation (30 min; 37 °C; Schütteln bei 300 rpm), Ultraschall (5 min) und Kochen (3 min; 100 °C) wurde ein quantitativer Zellaufschluß erreicht. Die Proben wurden nun mit Eis auf Raumtemperatur gekühlt und zentrifugiert (4000 x g; 5 min; 15 °C). Der Überstand wurde entnommen und mit dem Probenverdünnungspuffer 1:5 verdünnt. Nun konnten jeweils 50 μl der verdünnten Proben bzw. der verdünnten Vitamin B12-Standards in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert werden. Nach der Zugabe von 50 μl des verdünnten Enzymkonjugats, wurde gemischt (Schüttel-Funktion im Fusion-Gerät) und inkubiert (15 min; RT). Im Anschluß an die Inkubation wurden die Kavitäten durch Ausklopfen der Mikrotiterplatte entleert und mit 250 μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen. Die Kavitäten wurden wieder durch ausklopfen entleert und der Waschschritt zweimal wiederholt. Nun wurden äquitemporal zwei Tropfen Stop-Reagenz pro Kavität zugegeben, gemischt und 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der äquitemporalen Zugabe von zwei Tropfen des Stop-Reagenzes pro Kavität wurde die Extinktion bei 450 nm im Fusion-Gerät von Packard gemessen. Zur Auswertung wurde die prozentuale Extinktion wie folgt errechnet:
Extinktion Standard bzw. Probe
• 100 = Extinktion in %
Extinktion Nullstandard
Anhand der Auftragung der Extinktion in % über log(ppb) konnte nun eine Eichgerade ermittelt werden. Über die Geradengleichung, den Verdünnungsfaktor und die bekannte Zelldichte (OD578) konnte anschließend der Vitamin B12- Gehalt der Proben in μg/(l x OD) angegeben werden.
ELISA-Vitamin B12-Bestimmungen von Bacillus megaterium DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK
Zur Überprüfung der Vitamin B12-Gehalte von Kulturen mit Xylose induzierbarem hemA[KK]XCDBL-Operon wurden der integrierte Stamm, sowie DSMZ509 und Z509-pWH1520-cobA als Vergleichsstämme aerob kultiviert. Nach zehn Stunden Wachstum und 5 Stunden nach Induktion (t = 5) wurden die Proben nach dem ausgearbeiteten ELISA-Vitamin B12-Test aufgeschlossen und die Vitamin B12-Gehalte vermessen. Bereits die zentrifugierten Zellpellets ließen durch ihre rot-braune Färbung gegenüber der gelblichen DSMZ509-Vergleichskultur auf einen erhöhten Gehalt an Tetrapyrrolen schließen. Der ELISA-Test bestätigt dies, wie die Figuren 7 und 8 zeigen.
Die vermutete Überexpression des hemA[KK]XCDBL-Operons führte zu einer Steigerung des Vitamin B12-Gehaltes von 0,07 (g/l*OD578 des Wildstammes (DSMZ509) auf 1,59 (g/l*OD578 beim integrierten Stamm. Dies entspricht einer Steigerung um den Faktor 22. Berechnet man die Steigerung in (g/l, so ergibt sich sogar eine Steigerung um den Faktor 30 (von 0,26 (g/l bei DSMZ509 auf 8,51 μg/l bei DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK).
ELISA-Vitamin B^-Bestimmung von Bacillus megaterium DSMZ509- pHBasHemZ Bei den Transferexperimenten wurden drei Stunden (T=3) und sechs Stunden (T=6) nach der Xyloseinduktion Proben der ß. megaterium Transformanten DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ genommen. Diese wurden anhand eines ELISA-Tests der Firma R-Biopharm, der ausführlich im Material und Methodenteil beschrieben ist, auf Vitamin B-ι2 untersucht. Die Überführung von aeroben zu anaeroben Bedingungen fand bei den Transferexperimenten eine Stunde nach der Induktion statt. In Figur 9 und Figur 10 sind die Ergebnisse der Vitamin B 2-Bestimmung bei Wachstum mit Glucose (1, 2, 5, 6) und bei Wachstum mit Glucose unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI2 (3, 4, 7, 8) dargestellt. Figur 9 zeigt die Vitamin B-ι2-Konzentrationen bezogen auf die Zelldichte der jeweiligen Kultur. Dort ist zu erkennen, daß DSMZ509-pHBasHemZ in drei von vier Fällen (Nr. 2, 6 und 8) mehr Vitamin B12 gebildet hat als die Vergleichstransformante (Nr. 1, 5 und 7). So liegt der Vitamin Bι2-Gehalt der antisense-/?emZ-RNA bildenden Transformante bei Wachstum ohne Zugaben zum Zeitpunkt T = 3 (Nr. 2) um 21 % höher und bei T = 6 (Nr. 6) um 16 % höher als der der Vergleichstransformante. Bei Wachstum mit Cobalt und ALA bildet DSMZ509-pHBasHemZ sechs Stunden nach der Induktion (Nr. 8) 10 % mehr Vitamin B12 als DSMZ509-pWH1520.
In Figur 10 ist der Unterschied der Vitamin B-ι2-Konzentrationen zwischen den Kulturen ohne Cobalt und ALA Zugabe zu denen mit einer Zugabe größer. Dies ist bedingt durch die höheren Zelldichten, die bei Wachstum ohne Zugaben erreicht wurden.
Bio-Assav-Vitamin B.?-Bestimmung von Bacillus megaterium DSMZ509- pHBasHemZ
Zur Bestimmung der Vitamin B-ι -Gehalte in den Transferexperimenten wurden mittels Bio-Assay Proben zu drei verschiedenen Zeitpunkten genommen. Die Probenahme erfolgte: 1.) zum Zeitpunkt der Induktion (T=0),
2.) drei Stunden nach der Induktion (T=3) und 3.) sechs Stunden nach der
Induktion während der stationären Phase (T=stationär). Der Transfer von aeroben zu anaeroben Bedingungen fand dabei eine Stunde nach der Induktion statt. Es wurden die Vitamin Bι2-Gehalte der ß. megaterium
Stämme DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ gemessen. Zum einen bei Wachstum mit Glucose, zum anderen bei
Wachstum mit Glucose und der Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA.
Die Bestimmung wurde mit der S. typhimurium metE cysG-Doppelmutante AR3612 durchgeführt. Der Gehalt an Vitamin B12 ist in pmol/OD578 und in μg/l dargestellt (Figuren 11-12).
In Figur 11 zeigt sich bei Wachstum mit Glucose, daß die Vitamin Bι2-Gehalte bezogen auf die Zelldichte bei DSMZ509-pHBasHemZ (Nr. 3, 6 und 9) zu jedem Zeitpunkt am höchsten sind. Dies zeigt somit erneut, daß es durch die
Inhibierung der Häm-Synthese zu einem vermehrten Metabolitenfluss in die
Vitamin Bι2 Synthese kommt.
Die Darstellung der Ergebnisse in μg pro Liter Bakterienkultur (Figur 12) zeigt, daß die antisense-ΛemZ-RNA transkribierende Transformante (Nr. 3, 6 und 9) auch insgesamt am meisten Vitamin B-ι2 produziert hat, obwohl diese
Transformante eine niedrige Zelldichte erzielte. Figur 13 zeigt, daß bei einer Zugabe von CoCI2 und ALA zum Medium die antisense-Λe Z-RNA transkribierende Transformante lediglich drei Stunden nach der Induktion den höchsten Vitamin B12-Gehalt erzielt (Nr. 6). Dies scheint zunächst damit erklärbar zu sein, daß die Induktion nicht umgehend zu einer maximalen Plasmidreplikation führt, sondern erst anlaufen muß. Die Betrachtung der Vitamin Bι2-Gehalte pro Liter Bakterienkultur zeigt, daß aufgrund des besseren Wachstums der untransformierte Stamm DSMZ509 mehr Vitamin B-ι2 produziert als die anderen beiden transformierten Stämme (Figur 14).
Methoden der relativen Coproporphyrinogen III Bestimmung Fluoreszenzspektren
Aus der zu messenden ß. megater/um-Flüssigkultur wurden 2 ml Proben zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums entnommen und die OD578 bestimmt. Durch anschließendes Zentrifugieren (4000 x g; 5 min; 4 °C) wurden die Zellen vom Medium getrennt, der Überstand verworfen und das Sediment gefriergetrocknet.
Unmittelbar vor einer Messung wurden die Proben in 1 ml sterilem, deionisiertem Wasser resuspendiert und anschließend die optischen Dichten durch Verdünnen mit Wasser angeglichen. 1 ml dieser angeglichenen Proben wurden nun mit 50 μl Lysozym (1 mg/ml) versetzt und bei 37 °C für 30 min im Rüttler bei 300 rpm inkubiert. Nun wurden die Proben für 10 min ins Ultraschallbad gestellt und im Anschluß 3 min bei 4000 x g zentrifugiert. Mit dem Überstand wurde nun die Fluoreszenzmessung durchgeführt. Dabei lagen folgende Einstellungen vor:
Start: 430 nm
End: 680 nm
Excitation: 409 nm
Ex Slit 12 nm
Em Slit: 12 nm Scan Speed: 200 nm/min
Die Wachstumskurven mit der Zugabe von CoCI2 und ALA ergaben die erste Hinweise auf eine Inhibierung der Häm-Synthese durch antisense-ΛemZ- RNA. Die durch Xylose induzierbare antisense-ΛemZ-RNA inhibiert durch Besetzen der hemZ-mR A die Ribosomenbindestelle und verhindert damit eine Translation zu HemZ. Dadurch kommt es zu einer verringerten Bildung des HemZ-Proteins, das die Reaktion von Coproporphyrinogen III zu Protoporhyrinogen IX katalysiert. Da der eigentliche Metabolitenfluß an dieser Stelle unterbrochen ist, kommt es zu einer Anhäufung von Coproporphyrinogen III.
Der direkte Nachweis von Coproporphyrinogen III in Proben erweist sich als schwierig, da Coproporphyrinogen III an der Luft zu Coproporphyrin III oxidiert wird. Vorversuche ergaben, daß das Fluoreszenzspektrum von Coproporphyrin III bei ca. 579 nm und ca. 620 nm Emmissionspeaks aufweist. Relative Mengen von Coproporphyrinogen III sollten demnach anhand von Fluoreszenzspektren indirekt nachgewiesen werden können, wobei die oxidierte Form (Coproporphyrin III) gemessen wird.
Um einen Unterschied von relativen Coproporphyrinogen III Mengen in DSMZ509-pHBasHemZ und der Vergleichstransformante DSMZ509- pWH1520 zu zeigen, wurden Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Von den Wachstumsversuch mit Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und einer Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI2 wurden drei Stunden nach der Induktion mit 0.5 % (w/v) Xylose Proben von den Transformanten DSMZ509-pHBasHemZ und DSMZ509-pWH1520 genommen. Durch Verdünnen mit Wasser wurden die optischen Dichten der Proben zunächst angeglichen. Anschließend wurde ein Zellaufschluß durchgeführt und der Zellextrakt vermessen. Die Einzelspektren dieser Proben zeigen einen ähnlichen Verlauf, wobei das Spektrum der antisense-fremZ-RNA tragenden Transformante stets eine höhere Fluoreszenz zeigt. Der Unterschied der beiden Spektren scheint sich bei den Peaks (bei 579 nm und 612 nm) zu vergrößern. Um diesen Unterschied zu verdeutlichen, ist in Figur 15 das Differenzspektrum der beiden Proben (DSMZ509-pHBasHemZ minus DSMZ509-pWH1520) dargestellt. Die Peaks bei 579.83 nm und 617.86 nm zeigen, daß die antisense-RNA bildende Transformante in Bezug zur Vergleichstransformante Coproporphyrinogen III anhäuft. Dies ist ein sicherer Nachweis, daß eine Inhibierung der Häm-Biosynthese anhand von antisense RNA erzielt worden ist. Somit ist man mit DSMZ509-pHBasHemZ in der Lage durch eine gezielte Xylose-Induktion den Häm-Biosyntheseweg zu unterbinden, was andererseits einen ungestörten Metabolitenfluss in den Vitamin B12-Syntheseweg erlauben sollte.
Legende zu den Figuren
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert.
Figur 1 zeigt die Schematische Darstellung der Klonierung des integrativen Plasmids pHBintE für ß. megaterium. Die Ausgangsplasmide pWH1967E und pMM1520 wurden mit den Endonukleasen Pstl und Hindi II geschnitten. Das 4198 bp Fragment (zwischen Pstl-2786 und Hindlll-6984) von pWH1967E und das 1485 bp Fragment (zwischen Hindlll-7212 und Pstl- 1307) von pMM1520 wurden eluiert und ligiert.
Figur 2 zeigt eine Darstellung der ersten 27 Aminosäuren des Alignment Report für 1.) S. typhimurium HemA, 2.) ß. megaterium HemA und 3.) ß. megaterium HemAKK.
Unterstrichen: Insertion von zwei positiv geladenen Lysinresten (KK) an Position 3 und 4 des N-Terminus.
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der Klonierungsstrategie des Plasmids pHBiHemAKK. Die durch PCR amplifizierte hemA[KK]-Mutante und der Vektor pHBintE wurden jeweils mit Spei und Kpnl geschnitten und die entstandenen kohäsiven Enden zum Integrationsvektor pHBiHemAKK ligiert.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids pHBasHemZ. Die in der Darstellung angegebenen Schnittstellen Spei und BamHI wurden verwendet, um die antisense RNA zu inserieren.
Figur 5 zeigt das Wachstumsverhalten des ß. megater/um-Stammes DSMZ509 und Transformanten dieses Stammes bei 37 °C in Mopso- Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und dem Zusatz von 298μM ALA und 250 μM CoCI2. Transfer (shift) von aeroben zu anaeroben Wachstum fand am Ende der exponentiellen Phase statt (nach 11 h). Wachstum von DSMZ509 untransformiert (-A-), DSMZ509 pWH1520 (-+-) und DSMZ509 pHBasHemZ (-!-). Induktion der Genexpression des xylA- Promotors auf pHBasHemZ und pWH1520 erfolgte durch Zugabe von 0.5 % (w/v) Xylose nach 10 h Wachstum. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Figur 6 zeigt das Wachstumsverhalten des ß. megater/tm-Stammes DSMZ509-pWH1520 (-+-) und DSMZ509-pHBasHemZ (-!-) in Mopso- Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und dem Zusatz von 298 μM ALA und 250 μM CoCI2 unter aeroben Wachstumsbedingungen. Induktion erfolgte durch Zugabe von 0.5 % (w/v) Xylose bei einer OD5 8 von 2. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Figur 7 zeigt den Gehalt von Vitamin Bι2 in μg/POD unter aeroben Wachstumsbedingungen von ß. megaterium DSMZ509 (1), DSMZ509- pWH1520-cobA (2) und DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK (3) in LB- Medium, gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 5 h Wachstum; die Zellernte nach 10 h Wachstum. 1 = DSMZ509
2 = DSMZ509-pWH1520-cobA
3 = DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK
Figur 8 zeigt den Gehalt von Vitamin B12 in μg/l unter aeroben Wachstumsbedingungen von ß. megaterium DSMZ509 (1), DSMZ509- pWH1520-cobA (2) und DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK (3) in LB- Medium, gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 5 h Wachstum; die Zellernte nach 10 h Wachstum. 1 = DSMZ509 2 = DSMZ509-pWH1520-cobA
3 = DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK Figur 9 die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von ß. megaterium DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h (1, 2, 5, 6,) bzw. 10 h (3, 4, 7, 8) Wachstum. Der Transfer vom aeroben zum anaerobeή fand eine Stunde nach der Induktion statt. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur und OD578 angegeben.
1 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 3 h nach Induktion.
2 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 3 h nach Induktion. 3 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion.
4 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA,
3 h nach Induktion.
5 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 6 h nach Induktion. 6 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 6 h nach Induktion.
7 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
8 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA,
6 h nach Induktion.
Figur 10 zeigt die Vitamin B-ι2-Produktion im Transferexperiment von ß. megaterium DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso- Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h (1 , 2, 5, 6,) bzw. 10 h (3, 4, 7, 8) Wachstum. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben.
1 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 3 h nach Induktion. 2 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 3 h nach Induktion.
3 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion. 4 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion.
5 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 6 h nach Induktion.
6 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 6 h nach Induktion. 7 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
8 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCI2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
Figur 11 zeigt die Vitamin B-|2-Produktion im Transferexperiment von ß. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin Bι2 pro Zellmasse in pmol/OD578 angegeben.
1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion.
4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion. 5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion.
9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion.
Figur 12 zeigt die Vitamin B-|2-Produktion im Transferexperiment von ß. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben. 1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion. 2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion.
4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion. 6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion.
9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion.
Figur 13 zeigt die Vitamin Bι2-Produktion im Transferexperiment von ß. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI2. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 10 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 pro Zellmasse in pmol/OD578 angegeben.
1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion. 4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion. 9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion
Figur 14 zeigt die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von ß. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI2. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 10 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B-t2 in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben.
1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion. 4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion. 9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion
Figur 15 zeigt das Differenz-Fluoreszenzspektrum von B.megaterium DSMZ509-pHBasHemZ minus dem Fluoreszenzspektrum von DSMZ509- pWH1520 bei einer Anregung mit 409 nm. Die Emissionspeaks bei 579 nm und 618 nm zeigen Coproporphyrin III an und damit eine Anhäufung des Metaboliten in DSMZ509-pHBasHemZ im Vergleich zu DSMZ509-pWH1520.

Claims

Ansprüche:
1. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm enthaltend ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase und/oder einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ).
2. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm nach Anspruch 1 enthaltend ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 organisiert in einem hemA[KK]XCDBL-Operon und/oder eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß
SEQ ID No. 3.
3. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das hemA[KK]-Gen in das Chromosom des Bakteriums integriert ist.
4. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß einem der Ansprüche 1-3, bei dem der Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) plasmidkodiert, in erhöhter Kopienzahl vorliegt.
5. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß einem der Ansprüche 1-4, bei dem das hemA[KK]-Gen, organisiert in dem hemA[KK]XCDBL-Operon und/oder der Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
6. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß Anspruch 5, der als induzierbaren Promotor den xylA-Promotor aufweist.
7. Integrativer Vektor enthaltend ein Gen hemA[KK] kodierend für eine feedback resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase gemäß SEQ ID No. 4 sowie operativ damit verknüpfte Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
8. Integrativer Vektor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) enthält, die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz eine Insertion von wenigstens zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist.
9. Integrativer Vektor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) aufweist, die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz an Position 3 und 4 des N-Terminus eine Insertion von zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist.
10. Integrativer Vektor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die insertierten positiv geladenen Aminosäuren Lysin sind.
11. Integrativer Vektor gemäß einem der Ansprüche 7-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-
Promotors steht.
12. Integrativer Vektor gemäß einem der Ansprüche 7-11 , dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung aufweist.
13. Integrativer Vektor gemäß einem der Ansprüche 7-12, dadurch gekennzeichnet, daß er den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts aufweist.
14. Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für eine Coproporphyrinogen-I I I-Oxidase.
15. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu dem für eine Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase kodierenden Bereich des hemZ-Gens vorgeschaltete und/oder nachgeschaltete Sequenzen mit regulatorischer Funktion enthält.
16. Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Bacillus megaterium stammt.
17. Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2.
18. Coproporphyrinogen-Ill-Oxidase gemäß Anspruch 17 kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14-16.
19. Vektor enthaltend einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ) sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
20. Vektor gemäß Anspruch 19 enthaltend eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
21. Vektor gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-Promotors steht.
22. Vektor gemäß einem der Ansprüche 19-21 , dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung aufweist.
23. Vektor gemäß einem der Ansprüche 19-22, dadurch gekennzeichnet, daß er den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts aufweist.
24. Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierende Nukleotidsequenz (ashemZ) durch Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons gemäß SEQ ID No. 4 und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierende Nukleotidsequenz (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 durch die Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24-26, dadurch gekennzeichnet, daß in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen ein Übergang von aeroben zu anaeroben Fermentationsbedingungen erfolgt.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24-27, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium wenigstens Cobalt und/oder 5-Aminolävulinsäure zugegeben wird.
29. Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14-16 zur Herstellung einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
30. Verwendung einer antisense RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 19-23.
31. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 19-23 zur Herstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes gemäß einem der Ansprüche 1-6.
32. Verwendung des integrativen Vektors gemäß einem der Ansprüche 7-13 zur Herstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium
Stammes gemäß einem der Ansprüche 1-6.
33. Verwendung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes gemäß einem der Ansprüche -1-6 zur Herstellung von Vitamin B12.
PCT/EP2003/014102 2003-01-11 2003-12-12 Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12 WO2004063360A2 (de)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03785798A EP1592785A2 (de) 2003-01-11 2003-12-12 Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12
JP2004565964A JP2006512913A (ja) 2003-01-11 2003-12-12 ビタミンｂ１２の改良生産法
US10/541,920 US20060105432A1 (en) 2003-01-11 2003-12-12 Method for the production of vitamin b12
AU2003294837A AU2003294837A1 (en) 2003-01-11 2003-12-12 Improved method for the production of vitamin b12
CA002512857A CA2512857A1 (en) 2003-01-11 2003-12-12 Improved method for the production of vitamin b12
IL169352A IL169352A0 (en) 2003-01-11 2005-06-23 Improved method for the production of vitamin b12
NO20053205A NO20053205L (no) 2003-01-11 2005-06-30 Forbedret fremgangsmate for produksjon av vitamin B12.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10300719.9 2003-01-11
DE10300719A DE10300719A1 (de) 2003-01-11 2003-01-11 Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2004063360A2 true WO2004063360A2 (de) 2004-07-29
WO2004063360A3 WO2004063360A3 (de) 2004-12-09
WO2004063360A9 WO2004063360A9 (de) 2005-08-11

Family

ID=32519821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/014102 WO2004063360A2 (de) 2003-01-11 2003-12-12 Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20060105432A1 (de)
EP (1) EP1592785A2 (de)
JP (1) JP2006512913A (de)
CN (1) CN1759175A (de)
AU (1) AU2003294837A1 (de)
CA (1) CA2512857A1 (de)
DE (1) DE10300719A1 (de)
IL (1) IL169352A0 (de)
NO (1) NO20053205L (de)
WO (1) WO2004063360A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105999A1 (de) * 2004-04-01 2005-11-10 Basf Aktiengesellschaft Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7404489B1 (en) 2003-03-04 2008-07-29 Qol Medical, Llc Cyanocobalamin low viscosity aqueous formulations for intranasal delivery
US20070111964A1 (en) 2005-08-17 2007-05-17 Fleming And Company, Pharmaceuticals Vitamin B12 nasal spray and method of use
KR20140101010A (ko) * 2006-06-23 2014-08-18 파 파마슈티컬, 인크. 비내 전달용 시아노코발라민 저점도 수성 제형
ES2644422T3 (es) * 2007-05-08 2017-11-28 Provivo Oy Cepas modificadas genéticamente que producen metabolitos de antraciclina útiles como fármacos para el cáncer
CN102021214B (zh) * 2009-09-22 2013-04-17 华东理工大学 基于氧消耗速率的维生素b12发酵生产控制工艺
JP2018514221A (ja) * 2015-05-03 2018-06-07 ヒノ−マン・リミテッド アオウキクサにおけるビタミンｂ１２の産生手段および方法
CN107365718B (zh) * 2017-04-27 2021-02-02 延边大学 巨大芽孢杆菌myb3及其在秸秆发酵饲料中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018826A2 (de) * 2001-08-22 2003-03-06 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von vitamin b12

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0731480A (ja) * 1993-07-27 1995-02-03 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk Ｌ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコードするＤＮＡ断片

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018826A2 (de) * 2001-08-22 2003-03-06 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von vitamin b12

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRODY S S ET AL: "PREDICTED STRUCTURE AND FOLD RECOGNITION FOR THE GLUTAMYL TRNA REDUCTASE FAMILY OF PROTEINS" PROTEINS: STRUCTURE, FUNCTION AND GENETICS, ALAN R. LISS, US, Bd. 37, Nr. 3, 15. November 1999 (1999-11-15), Seiten 485-493, XP008005535 ISSN: 0887-3585 *
MARTENS J-H: "Dissertation: Gezielte Entwicklung von Bacillus megaterium f}r biotechnologische Anwendungen" DISSERTATION DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG, 2. August 2002 (2002-08-02), Seiten 1-180, XP002250679 *
MOSER JUERGEN ET AL: "Methanopyrus kandleri glutamyl-tRNA reductase" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, Bd. 274, Nr. 43, 22. Oktober 1999 (1999-10-22), Seiten 30679-30685, XP002205498 ISSN: 0021-9258 *
MOSER JUERGEN ET AL: "V-shaped structure of glutamyl-tRNA reductase, the first enzyme of tRNA-dependent tetrapyrrole biosynthesis" EMBO JOURNAL, IRL PRESS, EYNSHAM, GB, Bd. 20, Nr. 23, 3. Dezember 2001 (2001-12-03), Seiten 6583-6590, XP002205499 ISSN: 0261-4189 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN Bd. 1995, Nr. 05, 30. Juni 1995 (1995-06-30) & JP 07 031480 A (COSMO SOGO KENKYUSHO:KK), 3. Februar 1995 (1995-02-03) *
RAUX E ET AL: "Cobalamin (vitamin B12) biosynthesis: Identification and characterization of a Bacillus megaterium cobl operon" BIOCHEMICAL JOURNAL, PORTLAND PRESS, LONDON, GB, Bd. 335, Nr. 1, 1. Oktober 1998 (1998-10-01), Seiten 159-166, XP002250675 ISSN: 0264-6021 *
RAUX E ET AL: "Vitamin B12: Insights into biosynthesis's mount improbable" BIOORGANIC CHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC., NEW YORK, NY, US, Bd. 27, Nr. 2, April 1999 (1999-04), Seiten 100-118, XP002250673 ISSN: 0045-2068 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105999A1 (de) * 2004-04-01 2005-11-10 Basf Aktiengesellschaft Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006512913A (ja) 2006-04-20
WO2004063360A3 (de) 2004-12-09
WO2004063360A9 (de) 2005-08-11
AU2003294837A1 (en) 2004-08-10
NO20053205L (no) 2005-10-03
CA2512857A1 (en) 2004-07-29
AU2003294837A8 (en) 2004-08-10
IL169352A0 (en) 2007-07-04
EP1592785A2 (de) 2005-11-09
CN1759175A (zh) 2006-04-12
DE10300719A1 (de) 2004-07-22
US20060105432A1 (en) 2006-05-18
NO20053205D0 (no) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19610984A1 (de) Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen
WO2003002711A2 (de) EINE NEUE GRUPPE VON α-AMYLASEN SOWIE EIN VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG UND GEWINNUNG NEUER α-AMYLASEN
DE112007002823T5 (de) Fermentative Herstellung von Hydroxytyrosol
WO2010052319A1 (en) Improved production of riboflavin
DE69728377T2 (de) Verbesserte mutanten von (2,5 dkg) reduktase a
Goldberg et al. Optimization of a medium for a high yield production of spore-crystal preparation of Bacillus thuringiensis effective against the Egyptian cotton leaf worm Spodoptera littoralis Boisd.
DE69931162T2 (de) Metabolisch veränderte mikrobiellen zelle mit veränderten metabolitherstellung
WO2004063360A2 (de) Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12
EP2358893A2 (de) Verfahren zur herstellung von riboflavin
WO2005105999A1 (de) Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12
DE112019000467T5 (de) Rekombinanter Mikroorganismus, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10
EP1421202A2 (de) Verfahren zur herstellung von vitamin b12
EP0751218A2 (de) Saccharose-Stoffwechsel-Mutanten
DE102004030938A1 (de) Neue, Polyaminosäuren bildende oder abbauende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
DE69931176T2 (de) Neue bacillus subtilis stämme für lebensmittelfermentierung
EP2499253B1 (de) Mikroorganismen mit gesteigerter sucrosemutaseaktivität
EP1432809A2 (de) Verfahren zur herstellung von vitamin b12
DE3786578T2 (de) Biotin-Synthetase kodierendes Gen und dessen Verwendung.
WO2004090138A1 (de) Verfahren zur herstellung von vitamin b12
DE10150359A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12
EP1282715B1 (de) Verfahren zur mikrobiellen herstellung von difructoseanhydrid-iii, dafür einsetzbarer mikroorganismus sowie enzym mit inulase-ii-aktivität und dafür kodierende dna-sequenzen
EP1492877A2 (de) Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12
WO2008006734A2 (de) Uv-sensitive sicherheitsstämme für die biotechnologische produktion
EP1623025A1 (de) Glukose dehydrogenase und ihre herstellung
WO2001073038A2 (de) Verfahren zur biotechnologischen herstellung von l-alaninol

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003785798

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 169352

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004565964

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2512857

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006105432

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10541920

Country of ref document: US

COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PAGE 14/15, DRAWINGS, ADDED

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038B01442

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003785798

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10541920

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003785798

Country of ref document: EP