KR20030048447A - 가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스디히드로게나아제의 변이체 - Google Patents

가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스디히드로게나아제의 변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ) 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 의 개선된 변이체, 변이된 s-GDH 를 코딩하는 유전자, 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 의 돌연변이 단백질, 및 상기 s-GDH 변이체의 다른 적용, 구체적으로는 당의 농도, 특히 샘플내의 글루코오스의 농도를 결정하기 위한 적용에 관한 것이다.

Description

가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 변이체{VARIANTS OF SOLUBLE PYRROLOQUINOLINE QUINONE-DEPENDENT GLUCOSE DEHYDROGENASE}
두 가지 형태의 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (EC 1.1.99.17)의 특징이 밝혀졌다: 하나는 막 결합 형태 (m-GDH)이고, 다른 하나는 가용성 형태 (s-GDH)임. 상기 두 가지 형태들은 현저한 서열 상동성을 전혀 공유하지 않는다 (Cleton-Jansen, A. M., 등, Mol Gen Genet 217 (1989) 430-6; Cleton-Jansen, A. M., 등, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9; Oubrie, A., 등, Proc Natl Acad Sci USA 96 (1999) 11787-91). 또한, 동역학적 특성 및 면역학적 특성에 대해서도, 이들은 상이하다 (Matsushita, K., 등, Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555).
퀴노단백질은 알콜, 아민 및 알도오스를 이들의 대응 락톤, 알데히드 및 알돌산으로 산화시키기 위하여 퀴논을 보조인자 (cofactor)로서 사용한다 (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway inAcinetobacterin "The Biology ofAcinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84, Davidson, V. L. - in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker; Anthony, C., Biochem J 320 (1996) 697-711; Anthony, C. 및 Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21). 퀴노단백질 중에서, 비공유 결합으로 결합된 보조인자 2,7,9-트리카르복시-1H-피롤로[2,3-f]퀴놀린-4,5-디온 (PQQ)를 함유하는 것들은 가장 큰 아속 (sub-group)을 구성한다 (Duine 1991, supra). 지금까지 알려진 모든 박테리아의 글루코오스 디히드로게나아제는 삽입기로서 PQQ 를 갖는 상기 아속에 속한다 (Anthony 및 Ghosh 1997, supra, Goodwin and Anthony 1998, supra).
박테리아에는, 두 가지의 완전히 상이한 형태의 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (EC 1.1.99.17)가 있다: 가용성 형태 (s-GDH) 및 막 결합 형태 (m-GDH) (Duine 등, 1982; Matsushita 등, 1989a,b). m-GDH 는 그람 음성 박테리아에서 광범위하게 단리되지만, s-GDH 는 아시네토박터 균주, 예컨대 A. 칼코아세티쿠스 (Duine, 1991a; Cleton-Jansen 등, 1988; Matsushita 및 Adachi, 1993) 및 A.바우만니이 (JP 11243949)의 주변세포질 공간에서만 발견된다.
서열 데이터베이스를 검색할지라도, 전장 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 와 상동성을 갖는 두 개의 서열만이E.ColiK-12 및 신네코사이스티스 sp. 에서 확인되었다. 또한, A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 와 상동성을 갖는 두 개의 불완전한 서열이 P. 아에루기노사 및 보르데텔라 페르투시스의 게놈에서 각각 발견되었다 (Oubrie 등, 1999a). 상기 네 개의 특징이 밝혀지지 않은 단백질로부터 유추된 아미노산 서열은 추정 활성 부위의 많은 수의 잔기가 절대적으로 보존된 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 와 밀접하게 관련되어 있다. 이러한 상동성을 갖는 단백질은 유사한 구조를 갖고 유사한 PQQ 의존성 반응을 촉매하는 것으로 여겨진다 (Oubrie 등, 1999a).
박테리아의 s-GDH 및 m-GDH 는 상당히 다른 서열 및 다른 기질 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, A. 칼코아세티쿠스는 두 가지의 다른 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (하나는 생체내에서 활성인 m-GDH 이고, s-GDH로 지칭된 다른 하나는 실험관내에서만 활성이 보여질 수 있는 것임)를 함유한다. Cleton-Jansen 등 (1988;1989a,b)은 상기 두 가지 GDH 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하였고, 상기 두 가지 GDH 유전자의 DNA 서열을 결정하였다. m-GDH 및 s-GDH 사이에는 명백히 상동성이 없으며, 이는 m-GDH 및 s-GDH 가 완전히 상이한 두 개의 분자라는 사실을 확인시켜준다.
A. 칼코아세티쿠스 유래의 s-GDH 유전자가E.coli에서 리더 서열 (leader sequence) 및 강한 프로모터 뒤에서 클로닝되었다. 세포내에서 합성된 후, s-GDH 는 세포질막을 통해 주변세포질 공간으로 운송된다 (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway inAcinetobacter in "TheBiology ofAcinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press, Matsushita, K. 및 Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). A. 칼코아세티쿠스 유래의 본래 s-GDH 와 같이,E.coli에서 발현된 s-GDH 도 또한 단량체당 하나의 PQQ 분자 및 세 개의 칼슘 이온을 갖는 동일이합체(homodimer)이다 (Dokter 등, 1986 supra, 1987 supra 1988 supra; Olsthoorn, A. 및 J. Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8; Oubrie, A., 등, J Mol Biol 289 (1999) 319-33, Oubrie, A., 등, Proc Natl Acad Sci USA 96 (1999) 11787-91, Oubrie, A., 등, Embo J 18 (1999) 5187-94). s-GDH 는 폭넓은 범위의 모노- 및 디사카라이드를 대응 케톤으로 산화시키고, 추가적으로 알돈산으로 가수분해시키며, 또한 전자를 PMS (페나진 메토술페이트), DCPIP (2,6-디클로로페놀인도페놀), WB (Wurster's blue) 및 짧은 사슬의 유비퀴논 (ubiquinone), 예컨대 유비퀴논 Q1 및 유비퀴논 Q2 (Matsushita, K., 등, Biochemistry 28 (1989) 6276-80; Matsushita, K., 등, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), 몇몇 인공 전자 수용체, 예컨대 N-메틸페나조늄 메틸 술페이트 (Olsthoorn, A. J. 및 Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8 ; Olsthoorn, A. J. 및 Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-61) 및 전기전도성 중합체 (Ye, L., 등, Anal. Chem. 65 (1993) 238-41)로 전달할 수 있다.
글루코오스에 대한 s-GDH 의 높은 특이적 활성 (Olsthoorn, A. J. 및 Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8) 및 이의 폭넓은 인공 전자 수용체특이성으로 인해, 이 효소는 분석적 적용, 구체적으로 진단적 적용에 있어서 글루코오스 측정을 위한 (바이오)센서 또는 검사 스트립으로의 사용에도 또한 적합하다 (Kaufmann 등, 1997 supra).
글루코오스 산화는, 세 가지 이상의 매우 뚜렷한 군의 효소, 즉 NAD-의존성 염료-연결된 글루코오스 디히드로게나아제, 플라보단백질 글루코오스 옥시다아제 또는 퀴노단백질 GDH 에 의해 촉매될 수 있다 (Duine 1995). 감소된 s-GDH 의 상당히 느린 자기산화 (autooxidation) 가 관찰되며, 이는 산소가 s-GDH 에 대한 매우 불량한 전자 수용체이라는 것을 나타낸다 (Olsthoorn 및 Duine 1996). s-GDH 는 PMS, DCPIP, WB 및 짧은 사슬의 유비퀴논, 예컨대 Q1 및 Q2 에 효율적으로 전자를 전달할 수 있지만, 산소에 전자를 효율적으로 직접 전달할 수 없다.
예컨대 당뇨병 환자로부터의 혈액, 혈청 및 뇨 중의 글루코오스 수준을 모니터링하기 위한 종래의 검사 스트립 및 센서는 글루코오스 옥시다아제를 사용한다. 그러나, 글루코오스 옥시다아제는 그의 전자를 산소에 전달하기 때문에, 산소가 상기 효소를 기초로하는 글루코오스 측정 상에 부정적인 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 주요한 이점은 산소로부터의 이들의 독립성이다. 이런 중요한 특징은, 예컨대 막 결합 GDH 의 일부 특징을 조사한 US 6,103,509호에 기재되어 있다.
적당한 기질과 함께 s-GDH 를 사용하는 것은 상기한 분야에 중요한 공헌을 이루어낼 수 있다. s-GDH 에 기초한 검사법 및 검사 스트립 장치는 US 5,484,708호에 상세히 개시되어 있다. 상기 특허는 또한 글루코오스 측정을 위한 검사의 준비 (set up) 및 s-GDH 에 기초한 검사 스트립의 제조에 대한 상세한 정보를 포함한다. 인용문헌에 또한 언급된 방법은 본원 명세서에 참고자료로서 포함된다.
상기 분야에 관련된 다른 특허 또는 출원들로 US 5,997,817호; US 6,057,120호; EP 620,283호; 및 JP 11-243949-A호는 글루코오스 디히드로게나아제 활성과 함께 효소에 대한 다양한 적용 방식에 대한 구체적인 정보를 포함한다.
s-GDH, 및 반응이 발생할 경우 색변화를 생성하는 지시약 (Kaufmann 등 1997)을 이용한 시스템으로, Roche Diagnostics GmbH 가 시판하는 Glucotrendsystem 이 있다.
상술한 중요한 이점에도 불구하고, s-GDH 의 주요한 본질적인 문제점이 존재한다. s-GDH 는 m-GDH 와 비교하여 보다 폭넓은 기질 분포범위를 갖는다. 즉, s-GDH 는 글루코오스 뿐만 아니라 말토오스, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 크실로오스 및 리보오스를 포함한 몇몇 기타 당도 또한 산화시킨다 (Dokter 등 1986a). 글루코오스 이외의 당에 대한 반응성은, 일부 경우에, 몇몇 당뇨병 환자에게서 혈액 글루코오스 수준의 측정 정확성을 감소시킨다. 구체적으로, 이코덱스트린 (icodextrin; 글루코오스 중합체)으로 처방된 복막투석 중의 환자는 이들의 체액, 예컨대 혈액 중에 높은 수준의 기타 당, 특히 말토오스를 함유할 수 있다 (Wens, R. 등, Perit Dial Int 18 (1998) 603-9).
따라서, 예컨대 당뇨병 환자, 특히 신장 합병증을 갖는 환자 및 투석 중의 환자로부터 수득된 임상 샘플은 현저한 수준의 기타 당, 특히 말토오스를 함유할 수 있다. 이러한 위독한 환자로부터 수득된 샘플의 글루코오스 측정은 말토오스에의해 방해될 수 있다.
변형된 기질 특이성을 나타내는 개질된 PQQ 의존성 s-GDH 의 제조를 시도하는 문헌이 드물게 존재한다. 부정적인 결과로 인해, 상기한 노력의 대부분은 공개되지 못하였다. Igarashi S. 등 (1999)은 Glu277 위치에 점 돌연변이 (point mutation)를 도입함으로써 변형된 기질 특이성 프로필을 갖는 돌연변이를 유도할 수 있음을 보고하였다. 그러나, 상기 변이체 중 어떤 것도 예컨대 크실로오스, 갈락토오스 또는 말토오스와 비교된 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 2배 이상 증가시키지 못하였다.
s-GDH 의 특성, 특히 이의 글루코오스에 대한 특이성의 개선을 목적으로 하는 당업계에 공지된 시도들은 글루코오스 이외의 당의 높은 수준을 갖는 환자에게서 글루코오스 수준의 정확한 모니터링에 요구되는 범위까지는 성공적으로 미치지 못하였다는 것으로 요약될 수 있다.
따라서, 기질로서 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 특징으로 하는 s-GDH 의 돌연변이 형태에 대한 상당한 요구 및 임상적 필요성이 존재한다.
본 발명은 가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ) 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 의 개선된 변이체, 변이된 s-GDH 를 코딩하는 유전자, 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 의 돌연변이 단백질, 및 상기 s-GDH 변이체의 다른 적용, 구체적으로는 당의 농도, 특히 샘플내의 글루코오스의 농도를 결정하기 위한 적용에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 예컨대 갈락토오스 또는 말토오스와 같은 기타 선택 당 분자와 비교하여 글루코오스에 대해 현저하게 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 의 신규 돌연변이 또는 변이체를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명은 기타 당과 비교하여 글루코오스에 대한 s-GDH 의 기질 특이성을 현저하게 개선시킬 수 있어, 당업계에 알려진 상술한 문제점들을 적어도부분적으로 해결할 수 있음을 발견하였다.
기타 선택 당 분자와 비교한 글루코오스에 대한 기질 특이성은, 하기의 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 설명한 본 발명에 따른 돌연변이 s-GDH 를 제공하는 것에 의해 현저하게 개선될 수 있다. 신규한 형태의 s-GDH 의 개선된 기질 특이성으로 인해, 다양한 적용 분야에서 글루코오스 측정에 대한 현저한 기술적 진보를 가능하게 한다.
본 발명의 개요
본 발명은 기타 선택 당과 비교하여 기질로서의 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 돌연변이를 제공할 수 있음을 놀랍게도 발견하였다. 특히 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대해 현저하게 더욱 높은 기질 특이성을 나타내는 신규한 s-GDH 변이체를 개시한다.
또한, 야생형 효소와 비교하여, 기질로서의 글루코오스에 대해 본질적으로는 동일한 특이적 활성을 나타내지만, 기타 선택 당 분자에 대해서는 현저하게 감소된 활성을 나타내는 돌연변이 s-GDH 를 개시한다.
디양한 기타 기질 분자 중 하나에 대한 돌연변이의 특이적 활성의 상기 비교는, 예컨대 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 단리된 야생형 효소의 본래의 효소 활성에 기초하여 계산된다.
변이된 s-GDH 단백질, 및 개선된 특성, 특히 글루코오스에 대한 증가된 특이성을 나타내는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 또한 제공된다.
348 및 428 위치로 이루어진 군으로부터 선택된, A. 칼코아세티쿠스로부터공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24) 중의 위치에 대응하는 아미노산 위치의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 s-GDH 돌연변이는, 개선된 특성, 특히 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 s-GDH 효소에 제공함을 발견하였다. 348 위치의 치환을 포함하는 변이체가 글루코오스 특이성에 대하여 현저한 긍정적인 효과를 나타낸다.
상기 개선된 s-GDH 변이체는, 특히 검사 스트립 장치 또는 바이오센서내 생물학적 시료 중의 글루코오스의 특이적 검출 또는 측정에 상당히 이롭게 사용될 수 있다.
하기 실시예, 참고문헌, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕는 것을 목적으로 하지만, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 요지를 벗어남 없이, 기재된 절차내에서 변형이 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: 아시네토박터 칼코아세티쿠스 PQQ 의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 유전자의 뉴클레오타이드 (DNA) 서열 및 대응 아미노산 서열 (서열번호 23).
도 2: 서열 상동성에 따라 배열(alignment)된, A. 칼코아세티쿠스 PQQ 의존성 s-GDH (위쪽) 및 A. 바우만니이 s-GDH (아래쪽)의 단백질 서열.
도 3: 가용성 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 야생형 또는 변이된 DNA 서열을 함유하는, 실시예 1 에 언급된 pACSGDH 벡터의 도시.
도 4: 가용성 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 야생형 DNA 서열을 함유하는, 실시예 1 에 언급된 pACSGDH 벡터의 뉴클레오타이드 (DNA) 서열 (서열번호 25).
본 발명의 상세한 설명
제 1 의 구현예에 의하면, 본 발명은 PQQ 의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH)로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 돌연변이에 관한 것이며, 상기 돌연변이는, 대응 야생형 효소와 비교하여, 기타 선택 당 기질 하나 이상에 대하여 2배 이상의 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 가짐을 특징으로 한다.
본 발명에 나타낸 목적들은 임의의 공지된 또는 지금까지 알려지지 않은 s-GDH 의 단리물에 쉽게 적용된다. 상기 야생형 단리물은 그로부터 생성된 변이체에 대한 특이성의 상대적 개선을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
서열번호 24 에 대응하는 아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 의 야생형 효소는 자명하게 공지되어 있고 특징이 밝혀져 있다. 조사중인 다른 야생형 효소의 특징이 잘 밝혀지지 않은 경우, 참고로서 아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 유래의 s-GDH 를 사용하는 것이 이롭다. 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, s-GDH 의 개선된 변이체의 특성은 상기 야생형 효소와 비교된다. 따라서, 본 발명은 또한 서열번호 24 의 야생형 효소와 비교하여, 하나 이상의 기타 선택 당에 대하여 2배 이상 증가된 글루코오스에 대한 기질 특이성을 가짐을 특징으로 하는 s-GDH 의 돌연변이에 관한 것이다.
상술한 바와 같이, EC 1.1.99.17 하에서 함께 군(群)지워진 글루코오스 디히드로게나아제 활성을 갖는 완전히 상이한 계열의 두 가지 효소는, 현재 특징이 밝혀져 있다. 그러나, 상기 두 가지 효소 계열은 서로 관련되어 있지 않은 것으로 보여진다.
본 발명의 목적으로 위해서는, 가용성 형태의 GDH (s-GDH)만이 관련되며, 이의 개선된 변이체는 하기에서 설명한다.
가용성 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 야생형 DNA 서열이 아시네토박터의 균주들로부터 단리될 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 로부터의 단리가 가장 바람직하다. 상기 야생형 s-GDH (성숙 단백질)의 서열을 도 1 및 서열번호 24 에 나타낸다. 아시네토박터의 다른 LMD 균주도 또한 야생형 s-GDH 의 재료로서 사용될 수 있다. 이러한 서열을 A. 칼코아세티쿠스로부터 수득된 서열에 배열하여, 서열 비교할 수 있다 (도 2 참고). 또한, 예컨대 상기E.coliK-12 (Oubrie, A., 등, J Mol Biol 289 (1999) 319-33)에 대해 기재된 바와 같은 다른 박테리아 균주의 DNA 라이브러리를 스크리닝하고, 상기 게놈내에서 s-GDH 에 관련된 서열을 동정하는 것이 가능한 것으로 보인다. 상기 서열 및 아직 동정되지 않은 상동성을 갖는 서열은 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 관점에서, 용어 "돌연변이" 또는 "변이체"는 대응 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 나타내는 s-GDH 단백질에 관한 것이다. 당업자는 이러한 변이된 s-GDH 의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들을 생성하기 위한 다양한 실행수단이 있다는 것을 이해할 것이다. 물론, 하나 이상의 아미노산 첨가 또는 결실 (deletion)을 포함하는 돌연변이를 생성할 수도 있다.
본 발명에 따른 돌연변이는, 대응 야생형 효소와 비교하여, 하나 이상의 기타 선택 당 기질과 비교된 글루코오스에 대한 기질 특이성이 2배 이상 개선됨을 특징으로 한다.
기질 특이성 또는 교차반응성을 계산하기 위해서, 하나의 용이한 방법은 기질로서 글루코오스를 이용하여 측정된 활성을 100%로 설정하고, 상기 글루코오스 값에 대하여 기타 선택 당을 이용하여 측정된 활성을 비교하는 것이다. 종종, 중복을 피하기 위해서, 용어 특이성은 간단히 한편으로는 글루코오스에 대해, 다른 한편으로는 선택된 기타 당 기질에 대해 특별한 언급없이 사용된다.
당업자는, 통상적으로 정의된 검사 조건을 사용하여 조사된 기질 분자의 동일 몰농도에서 활성 (반응성)의 비교가 최선으로 수행된다는 것이 이해될 것이다. 그렇지 않다면, 농도의 차이에 대한 보정이 이루어져야만 한다.
표준화되고 통상적으로 정의된 검사 조건이, 특이성 (특이성의 개선)을 평가하기 위해 선택되어야만 한다. 기질로서 글루코오스 및 기타 선택 당 기질에 대한 s-GDH의 효소적 활성은 실시예 6 에 기재된 바와 같이 측정된다.
이러한 측정에 기초하여, 교차반응성 및 특이성 (특이성의 개선)이 평가된다.
백분율로, 선택 당에 대한 s-GDH 반응성 (교차반응성)은 하기와 같이 계산된다:
교차반응성 [%] = (선택 당에 대한 활성/글루코오스에 대한 활성) × 100%.
상기 수학식에 따른 야생형 s-GDH 의 말토오스에 대한 반응성(교차반응성)은 약 105%인 것으로 측정되었다. 갈락토오스에 대한 야생형 s-GDH 반응성(교차반응성)은 약 50%인 것으로 측정된다 (표 1 참조).
(개선된) 특이성은 하기 수학식에 따라 계산된다:
야생형 효소와 비교된 것으로써, 글루코오스 대 말토오스 (즉, 기질로서 말토오스를 잉요한 것) (말토오스/글루코오스)에 대한 특이성이 두 배 이상 개선된 s-GDH 형태는 기질로서 글루코오스를 이용하여 측정된 활성의 52.5% 이하이다. 또는, 예컨대 돌연변이 s-GDH 가 20%의 말토오스에 대한 교차반응성 (상술한 바와 같이 측정되고 계산됨)을 가질 경우, 야생형 s-GDH 와 비교된 상기 돌연변이는 따라서 5.25 배 개선된 기질 특이성 (말토오스/글루코오스)을 갖는다.
용어 기질에 대한 "특이적 활성"은 당업계에 통상적으로 알려져 있으며, 단백질 함량에 대한 효소 활성을 설명하기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 기질로서 글루코오스 또는 기타 당을 사용하여 GDH 분자의 특이적 활성을 측정하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다 (Igarashi, S., 등, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820). 이러한 측정에 이용할 수 있는 방법중 하나는 실시예 섹션에서 상세히 설명한다.
가능할지라도, 수많은 기타 당 분자를 선택하고 임의의 상기 선택 당 분자와 비교하여 s-GDH 의 글루코오스 특이성을 조사함으로써, 상기 비교를 위한 임상적으로 관련된 당 분자를 선택하는 것이 바람직하다. 바람직한 선택 당은, 만노오스, 알로오스, 갈락토오스, 크실로오스 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 말토오스 또는 갈락토오스가 선택되며, 돌연변이 s-GDH 는 갈락토오스 또는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성에 대해 검사된다. 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 선택 당은 말토오스이다.
놀랍게도, 변이된 s-GDH 의 글루코오스에 대한 특이성 (예컨대, 말토오스 대 글루코오스)의 개선이 상당히 현저하다는 것이 확인되었다. 따라서, 하나 이상의 선택된 기타 당 기질에 대한 기질 특이성과 비교된 글루코오스에 대한 상기 기질 특이성은 3배 이상 개선되는 것이 또한 바람직하다. 다른 바람직한 구현예는, 선택된 기타 당 분자와 비교하여 5배 이상 높은, 또한 바람직하게는 10배 이상 높은 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 특징으로 하는 s-GDH 돌연변이를 포함한다.
많은 경우에, s-GDH 의 돌연변이는 기질 글루코오스에 대해 현저하게 감소된 기질 특이성을 갖는 효소 변이체를 유도한다. 그러나, 기질 글루코오스에 대한 (절대적인 또는 전체적인) 특이적 활성의 상기 감소는 통상적인 적용을 위해 중요할 수 있다. 놀랍게도, 글루코오스에 대한 개선된 특이성은 현저하게 감소된 전체적인 특이적 활성의 손실을 수행하지 않는다는 것이 확인되었다. 따라서, 기질 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 갖는 s-GDH 는 야생형 효소를 이용하여 측정된 글루코오스에 대한 특이적 활성의 10% 이상을 나타내는 것이 바람직하다. 물론, 상기 변이된 효소가 야생형 s-GDH 의 개개의 글루코오스 활성의 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상을 나타내는 것이 더욱 바람직하다.
또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 PQQ 의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH)로 또한 알려진 EC1.1.99.17 의 가용성 형태의 돌연변이에 관한 것이며, 상기 돌연변이는 하기를 특징으로 한다:
a) 글루코오스에 대한 기질 특이적 반응성은 필수적으로 야생형 효소의 것과 본질적으로는 동일하고;
b) 말토오스에 대한 기질 특이적 반응성은 야생형 효소와 비교하여 30% 이하임.
글루코오스에 대한 기질 특이적 반응성 (또한, 특이적 활성이라고도 함)은, 야생형 효소의 글루코오스에 대한 본래 효소 활성의 50% 이상이 유지된다면, 야생형 효소의 것과 본질적으로는 동일한 것으로 간주한다. 또한, 바람직하게는, 돌연변이는 야생형 효소에 대해 측정된 글루코오스에 대한 특이적 활성의 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 나타낸다.
매우 놀랍게도, 야생형 s-GDH 와 비교하여 본질적으로는 동일한 글루코오스에 대한 효소 활성을 나타내지만, 그럼에도 불구하고 다른 선택 당, 특히 말토오스에 대해서는 현저하게 감소된 기질 특이적 반응성을 나타내는 상기 s-GDH 돌연변이 또는 변이체를 얻을 수 있다는 것이 발견되었다. 글루코오스에 대한 기질 특이적반응성이 야생형 효소의 것과 본질적으로는 동일하고, 말토오스에 대한 기질 특이적 반응성이 야생형 효소와 비교하여 20% 이하인 것을 특징으로 하는 돌연변이가 바람직하다. 또한, 말토오스 특이적 활성이 대응 야생형 효소에서 측정된 말토오스 특이적 활성의 15% 이하, 심지어는 단지 10% 이하인 반면, 글루코오스에 대한 반응성은 대응 야생형 효소의 글루코오스에 대한 특이적 반응성과 본질적으로는 동일한 상기 돌연변이가 바람직하다.
야생형 효소의 특징이 잘 알려지지 않은 경우에, 아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 유래의 s-GDH 를 참고로서 사용하는 것이 바람직하다. 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, s-GDH 의 개선된 변이체의 특성은 상기 야생형 효소와 비교되고, 따라서 본 발명은 서열번호 24 의 야생형 효소와 비교하여 본질적으로 동일한 글루코오스에 대한 효소 활성을 나타내지만 하나 이상의 기타 선택 당 기질에 대해서는 현저하게 감소된 (적어도 70% 미만) 기질 특이적 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 s-GDH의 돌연변이에 관한 것이다.
개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 돌연변이를 생성할 수 있다는 것이 예상치 못하게도 확인되었으며, 더욱 예상치 못하게도 이와 관련하여 주요 관련성이 존재하는 단지 몇몇 잘 정의된 아미노산 위치가 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 성취를, 아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 로부터 단리된 s-GDH 의 야생형 서열 (서열번호 24)로부터 공지된 아미노산 위치를 참조하여 상세히 설명한다. 서열번호 24 의 위치에 대응하는 상이한 s-GDH 단리물의 아미노산 위치는 적당한 서열 비교를 통해 쉽게 확인된다. 바람직하게는 PileUp 프로그램이 상기한 서열들 사이의 상동성 및 동질성을 평가하기 위해 사용된다. 서열번호 또는 상이한 s-GDH 단리물에 대해 특별한 언급이 없다면, 본원 명세서에 나타낸 아미노산 위치는 서열번호 24 의 아미노산 위치 또는 다른 s-GDH 분자 내에서 그에 대응하는 위치의 아미노산 위치로서 이해되어야만 한다. 중복을 피하기 위해서, 몇몇 경우에만 상이한 단리물의 대응 위치가 동일한 방식으로 변형될 수 있다는 사실에 대해 특별히 후술하였고, 편의상 대대분의 경우에 서열번호 24 로부터 대응 위치만을 간단히 나타내었다.
s-GDH 의 348 위치에 대응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이는 글루코오스에 대한 특이성에 현저한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 표 1 에 보여진 바와 같이, A. 칼코아세티쿠스 유래의 야생형 s-GDH 서열 위치에 대응하는 것으로서 348 위치의 트레오닌에서 하나 이상의 아미노산이 적당한 다른 아미노산으로 치환될 경우, 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 갖는 다양한 s-GDH 변이체들이 동정될 수 있고 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예는 A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24)의 348 위치에 대응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질에 관한 것이다.
또한, 서열번호 24의 348 및 428 위치에 대응하는 아미노산 위치에서의 아미노산들의 조합된 치환이 현저하게 개선된 글루코오스에 대한 특이성을 갖는 s-GDH 돌연변이 또는 변이체를 생성하는데 더욱 이롭다는 것을 확인하였다.
아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 로부터 단리된 s-GDH 의 348또는 428 잔기는 s-GDH 의 기질 결합에 기여한다고는 당업계에서 알져지지 않았다 (Oubrie, A., 등, Embo J 18 (1999) 5187-94; Oubrie, A. 및 Dijkstra, B. W., Protein Sci 9 (2000) 1265-73). 상기 아미노산 잔기들의 치환이 관심있는 기타 당 분자들과 비교된 글루코오스에 대한 s-GDH 의 기질 특이성을 변형시키는 이유에 대해서, 화학적 또는 물리적 해석도 전혀 이루어지지 않았다.
76 위치의 아미노산의 치환이 또한 s-GDH 의 글루코오스 특이성에 긍정적인 효과를 가짐이 확인되었다.
또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 변이된 s-GDH 는 348 위치의 아미노산 잔기 트레오닌이 알라닌, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 한다. 가장 바람직한 구현예에 의하면, 348 위치의 트레오닌은 글리신으로 치환된다.
본 발명에 따른 바람직한 s-GDH 변이체의 하나의 군은, 348 위치의 아미노산 잔기의 치환, 및 76, 143, 168, 169 및 428 위치들 중 하나 이상의 치환을 포함한다.
또 다른 구현예에 의하면, PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질은 아시네토박터 칼코아세티쿠스의 대응 야생형 서열 중의 428 위치의 아미노산 잔기 치환, 즉 야생형 서열의 아스파라긴 잔기의 다른 적당한 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 아미노산 잔기는 루신, 프롤린 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 428 위치의 아스파라긴은 프롤린으로 치환된다.
76 위치의 아미노산인 글루타민은 기타 당 분자와의 s-GDH 교차반응성에 의해 나타나는 문제점을 개선시키기 위해 치환될 수 있다는 것이 증명되었다. 이 서열 위치에 대응하는 기타 s-GDH 단리물의 서열 위치는 서열번호 3 에 기초한 상동성 검색에 의해서 쉽게 확인된다. 따라서, 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에 따른 돌연변이는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 대응 야생형 서열 중 76 위치의 글루타민의 치환을 포함한다.
서열번호 24 의 76 위치에 대응하는 위치의 상기 치환에 사용되는 아미노산은 알라닌, 아스파트산, 글루탐산, 글리신, 메티오닌, 프롤린 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, A. 칼코아세티쿠스로부터 단리된 야생형 서열에 대응하는 s-GDH 서열 중 348 위치의 아미노산의 치환은 s-GDH 의 글루코오스 특이성을 현저하게 개선시키기 위해서 사용될 수 있다. 둘 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 s-GDH 단백질 (서열번호 24 의 348 아미노산 위치에 대응하는 아미노산도 치환됨)를 제공함으로써, 더욱 개선된 돌연변이가 수득된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 구현예는, A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24) 중의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서의 둘 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 돌연변이 s-GDH 이고, 이때 치환된 아미노산 위치는 16, 22, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 348, 349, 355, 422, 428 및 438 위치들로 이루어진 군으로부터 선택되며, 아미노산 잔기 T348 이 치환된다. 또한, 둘 이상의 치환된 아미노산 잔기를 갖는 s-GDH 변이체는, 348 위치의 치환, 및 76, 143, 168, 169 및 428 위치들을 포함하는 위치의 군로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 치환을 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 돌연변이 s-GDH 내에 치환된 둘 이상의 아미노산 위치는 76, 348 및/또는 428 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다.
348 및 428 위치에 대응하는 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 돌연변이는, 기타 당 기질과 비교하여 글루코오스에 대한 s-GDH 의 특이성을 개선시키기 위해 매우 이로운 것으로 확인되었다. 348 및 428 위치 모두에서의 치환을 포함하는 s-GDH 의 돌연변이를 고안하고 선택하는 것이 특히 바람직하다. 상기 위치 둘 다에서의 상술한 바람직한 치환을 포함하는 돌연변이가 가장 바람직하다. T348G 및 N428P 를 포함하는 s-GDH 변이체가 가장 바람직하다.
용어 T348G 및 N428P 는 348 위치의 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 428 위치의 글루타민이 프롤린으로 치환되는 것을 나타내는 것으로 당업계에 알려져 있다.
348 및 428 위치의 치환과 더불어 76, 127 및 143 위치의 치환을 또한 포함하는 돌연변이 s-GDH 단백질은 또한 본 발명의 바람직한 구현예를 나타낸다.
본 발명에 따른 변이된 s-GDH 단백질의 더욱 바람직한 예는 76 및 348 위치의 아미노산 치환을 포함하며, 또한 상기 돌연변이는 76 및 428 위치의 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에 따른 변이된 s-GDH 단백질은 76, 348 및 428 위치의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.
여전히 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에 따른 s-GDH 변이체는 셋 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 셋 이상 치환된 아미노산 잔기는 A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24)의 아미노산 위치에 대응하며, 상기 치환된 아미노산 위치는 171, 227, 230, 245, 341, 348, 349 및 428 위치들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 아미노산 잔기 T348 및 N428 모두가 치환된다. 바람직하게는, 상기 계열의 돌연변이는 하기 치환중 하나 이상을 포함한다: Y171G, H227F, P230H, E245D 또는 M341V.
글루코오스에 대한 상당히 개선된 특이성을 갖는 바람직한 s-GDH 변이체는 245 또는 341 위치 또는 상기 두 위치의 치환과 조합하여, 348 및 428 위치들의 치환을 포함한다.
아미노산 서열 분석을 통해, 한편으로는 A. 칼코아세티쿠스 및 다른 현편으로는 A. 바우만니이 유래의 야생형 s-GDH 에서, 본 발명에서 확인된 글루코오스에 대한 특이성을 개선시키는데에 중요하게 관련된 위치, 즉 A. 칼코아세티쿠스 유래의 야생형 s-GDH 에 대응하는 76, 348 및 428 위치 부근이 매우 보존된 것으로 나타난다는 것이 밝혀졌다 (도 2 참조).
따라서, 본 발명에 따른 바람직한 구현예는 WPXaaVAPS [식중, 상기 Xaa 잔기는 트레오닌 이외의 아미노산 잔기임]의 아미노산 서열 (서열번호 1)을 포함하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질이다. 서열번호 1 은 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH 의 346-352 위치 또는 A. 바우만니이 야생형 s-GDH 의 347-353 위치에대응한다.
또한, s-GDH 돌연변이에서 서열번호 1 의 상기 Xaa 가 알라닌, 글리신 또는 세린을 나타내는 것이 바람직하며, Xaa 가 글리신을 나타내는 것이 가장 바람직하다.
TAGXaaVQK [식중, 상기 Xaa 잔기는 아스파라긴 이외의 아미노산 잔기임]의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 포함하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이는 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예이다. 서열번호 2 는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH 의 425-431 위치 또는 A. 바우만니이 야생형 s-GDH 의 426-432 위치에 대응한다.
바람직하게는, 서열번호 2 를 포함하는 상기 s-GDH 돌연변이는 상기 Xaa 잔기가 루신, 프롤린 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 Xaa 가 프롤린 잔기인 것을 특징으로 한다.
돌연변이 단백질을 제조하기 위한 수많은 실현수단들이 당업계에 공지되어 있다. 348 및 428 위치의 아미노산의 상당한 중요성 및 76 위치의 유용성을 개시하는 본 발명의 중요한 발견에 기초하여, 당업자는 s-GDH 의 더욱 적당한 변이체를 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 변이체는 랜덤 돌연변이형성 (Leung, D. W., 등, Technique 1 (1989), 11-15) 및/또는 직접적인 돌연변이형성 (Hill, D. E., 등, Methods Enzymol 155 (1987) 558-68) 과 같은 공지된 방법들에 의해서 수득될 수 있다. 목적하는 특성을 갖는 단백질을 제조하기 위한 또 다른 방법은, 둘 이상의 상이한 재료로부터 유래한 서열 요소를 함유하는 키메라 구축물을 제공하는 방법 또는 적당한 s-GDH 유전자를 완전히 합성하는 방법이 있다. 당업계에 공지된이러한 절차들은, 서열번호 24 의 348 및/또는 428 위치에 대응하는 서열 위치 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 s-GDH 의 돌연변이 또는 변이체를 제공하기 위하여 본 발명에 개시된 정보들과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 s-GDH 변이체는, 예를 들어 아시네토박터 칼코아세티쿠스형 균주 LMD 79.41 로부터 단리된 s-GDH 유전자 및 상동성을 갖는 서열로부터 출발하여 제조될 수 있다. 본원과 관련하여, 용어 "상동성을 갖는"은, 서열번호 24 와 비교된 서열 상동성이 90% 이상으로 제공되는, 다른 미생물로부터 단리된 야생형 s-GDH 를 포함하는 것을 의미한다. 다시 말해서, PileUp 프로그램을 이용하여 적당히 배열한 후에, s-GDH 의 아미노산 중 90% 이상이 서열번호 24 에 기재된 아미노산과 동일한 것이다.
DNA 및 아미노산 서열의 변이는 천연에 존재하는 것이거나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 의도적으로 도입될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 변이는, 서열번호 24 와 비교된 상기 서열내에 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입, 전도 (inversion) 또는 첨가로 인해, 전체적인 서열에 대해 10% 이하의 아미노산 차이를 형성할 수 있다. 상기 아미노산 치환은, 예를 들어 연관된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽 친화성의 유사성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 음전하 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함하고; 양전하 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 값을 갖는, 비전하 극성 헤드 기 (head group) 또는 비(非)극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 하기를 포함한다: 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신. 기타 고려될 수 있는 변이는, 상기한 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 전구체 (예컨대, 리더 서열로서 사용되는 메티오닌, N-포르밀메티오닌과 같이 N-말단 치환을 갖는 전구체)의 염 및 에스테르를 포함한다. 상기 변이는, 필수적으로는 본 발명의 범위 및 개념을 벗어남 없이, 만들어질 수 있다.
당업계의 기술 상황에서 공지된 절차에 따라, 또는 실시예 섹션에서 나타낸 절차에 따라, 상술한 임의의 s-GDH 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상술한 s-GDH 돌연변이 단백질을 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 또한 포함한다.
본 발명은 또한 숙주 세포내에서 발현을 유도할 수 있는 포로모터 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 바람직한 벡터는 도 3 및 4 에서 보여진 pACSGDH 와 같은 플라스미드이다.
본 발명에 유용한 발현 벡터는 전형적으로는 복제 기원(origin of replication), DNA 서열의 상위 영역에 위치된 프로모터, 및 그 뒤의 s-GDH 변이체의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. s-GDH 변이체의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열은 전사말단 서열 및 나머지 벡터가 뒤이어진다. 또한, 발현 벡터는 당업계에 공지된 다른 DNA 서열, 예컨대 발현 산물의 안정성을 제공하는 안정성 리더 서열 (stability leader sequence), 발현 산물의 분비를 제공하기 위한 분비 리더 서열 (secretory leader sequence), 구조 유전자의 발현을 (예컨대, 성장 배지 중의 영양분 또는 다른 유도제(inducer)의 존재 또는 부재에 의해)변형시키는 서열, 형질전환된 숙주 세포의 표현형 선별을 제공할 수 있는 표식 서열 (marking sequence), 및 리스트릭션 엔도뉴클레아제 (restriction endonuclease) 에 의한 절단 부위를 제공하는 서열을 또한 포함할 수 있다.
실제 발현 벡터의 특징은 사용될 숙주 세포에 적합해야만 한다. 예를 들어,E.coli세포계에서 클로닝할 경우, 발현 벡터는E.coli세포의 게놈으로부터 단리된 프로모터 (예컨대,lac또는trp)를 함유해야만 한다. 다양한E.coli숙주에 있어서의 적합한 복제 기원은, 예컨대 ColE1 플라스미드 복제 기원을 포함한다. 적합한 프로모터는, 예컨대lac및trp를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 선별가능한 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 선별가능한 마커는 바람직하게는 항생제 내성 유전자이다. 선별가능한 마커로서, 암피실린 내성 또는 카나마이신 내성이 편리하게 사용될 수 있다. 상기 물질 모두는 당업계에 공지되어 있고 시판된다.
목적하는 코딩 및 조절 서열을 함유하는 적합한 발현 벡터는, 당업계에 공지된 표준 재조합 DNA 기술 (대부분 Sambrook 등 (1989)에 기재되어 있음)을 사용하여 구축될 수 있다.
본 발명은 추가적으로 돌연변이 s-GDH 의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 함유한 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 바람직하게는 표 1 에 나타낸 하나 이상의 돌연변이를 갖는 DNA 서열 중 하나의 일부 또는 전부를 포함하는 발현 벡터를 함유한다. 돌연변이 s-GDH 의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결되고, 복제 및/또는 발현을 유도할 수 있는하나 이상의 조절 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 함유한 숙주 세포가 또한 바람직하다. 적합한 숙주 세포는, 예컨대 Pomega 로부터 입수가능한E.coliHB101 (ATCC 33694) (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA), Stratagene 로부터 입수가능한 XL1-Blue MRF (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) 등을 포함한다.
발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해서 숙주 세포에 도입할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터에 의한 숙주 세포의 형질전환이 폴리에틸렌 글리콜 매개 원형질체 형질전환법 (Sambrook 등, 1989)에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 방법, 예컨대 전기천공법 (electroporation), 바이오리스틱 주입법 (biolistic injection) 또는 원형질 융합법이 또한 사용될 수 있다.
s-GDH 변이체를 함유하는 발현 벡터가 적당한 숙주 세포로 도입된다면, 숙주 세포는 목적하는 s-GDH 변이체의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양할 수 있다. 돌연변이 s-GDH 의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터를 함유한 숙주 세포는, 예컨대 하기의 일반적인 접근법 중 하나 이상에 의해 확인된다: DNA 하이브리드형성, 마커 유전자 기능의 존재 또는 부재, 숙주 세포내 s-GDH mRNA 전사체의 생성에 의해 측정된 전사 수준의 평가, 및 유전자 산물의 면역학적 검출. 형질전환된 숙주 세포는 바람직하게는 효소 검사법, 예컨대 비색계 검출 (colourimetric detection)에 의해 확인된다.
본 발명은 또한 s-GDH 변이체의 생성 및 스크리닝에 관한 것이다. 랜덤 돌연변이형성 및 침투 돌연변이형성이 당업계에 공지된 바와 같이 수행된다. 변이체는 글루코오스, 말토오스 및 기타 당에 대한 기질 특이성에 대해 분석된다. 선택된 검사 조건은 예컨대 단일 아미노산 치환에 의해 초래된 예상되는 약간의 강화를 확실하게 측정할 수 있는 것을 채용한다. 이는 야생형 (또는 모체) 효소 활성이 낮은 검출 한계에 가깝도록 검사 조건을 조정하는 것에 의해 성취된다. 적당한 돌연변이의 선별 또는 스크리닝을 위한 하나의 방식은 실시예 3 에 나타내었다. 이러한 방식으로 야생형 효소와 비교된 임의의 변화 또는 개선이 명확히 검출될 수 있다.
물론, 모든 발현 벡터 및 DNA 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위해 동등하게 기능하지는 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 모든 숙주 세포가 동일 발현계에 대해 동등하게 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어남 없이, 실험을 통하지 않고서도, 본원에 제공된 지침을 사용하여, 발현 벡터, DNA 조절 서열 및 숙주세포에 대한 선택을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이 s-GDH 의 제조에 적합한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 s-GDH 변이체의 제조 방법에 관한 것이다. 박테리아 숙주 세포에 대한 전형적인 배양 조건은, 적절한 항생제 및 유도제를 함유하는 액체 배지이다. 전형적인 적절한 항생제는 암피실린, 카나마이신, 클로로암페니콜, 테트라사이클린 등을 포함한다. 전형적인 유도제는 IPTG, 글루코오스, 락토오스 등을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 돌연변이 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열을 발현하는숙주 세포내에서의 생산에 의해 수득되는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 돌연변이 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열에 의해 코딩된 mRNA 의 실험관내 번역에 의해서 수득될 수 있다. 예를 들면, DNA 서열은 상술한 바와 같이 합성될 수 있고, 적합한 발현 박터내로 삽입될 수 있으며, 이는 차례대로 실험관내 전사/번역계로 사용될 수 있다.
무세포 펩티드 합성계 (cell-free peptide synthesis system)에서 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 상기 정의되고 설명된 단리 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예를 나타낸다.
이어서, 예컨대 상기 설명된 절차에 의해 생산된 폴리펩티드는 다양한 통상적인 단백질 정제 기술에 의해서 단리되고 정제될 수 있다. 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 절차가 사용될 수 있다.
본 발명의 개선된 s-GDH 변이체의 주요 적용중 하나는, 당뇨병 환자에게서 혈액 글루코오스 수준을 모니터링하기 위한 검사 스트립내에서의 용도이다. 산소에 대한 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 비민감성으로 인해, 개선된 s-GDH 변이체를 사용하는 계는 글루코오스 옥시다아제에 기초한 계 보다 산소에 의한 간섭을 덜 받는 경향이 있다. 더욱 중요하게는, s-GDH 변이체는 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 갖고 기타 당에 대해서는 현저하게 감소된 상대적 효소 활성을 갖기 때문에, 분석될 샘플내에 존재할 수 있는 말토오스, 갈락토오스 및/또는 기타관련 당으로 인한 간섭이 현저하게 감소된다. 물론, 수많은 종류의 샘플이 조사될 수 있다. 혈청, 혈장, 장액 또는 뇨와 같은 체액이 상기 샘플을 위한 바람직한 재료이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이를 사용하는 샘플내 글루코오스의 검출, 결정 또는 측정 방법을 포함한다. 글루코오스의 검출, 결정 또는 측정이 센서 또는 검사 스트립 장치를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 샘플내 글루코오스의 개선된 검출 방법이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이 및 상기 측정에 요구되는 기타 시약들을 포함하는 샘플내 글루코오스의 검출 또는 측정용 장치는 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 변이체는 또한 샘플 또는 반응기내의 글루코오스를 온라인 모니터링하기 위한 바이오센서 (D'Costa, E. J., 등, Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., 등, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., 등, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281)내에 상당히 이롭게 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, s-GDH 변이체는, 글루코오스 농도의 더욱 정확한 측정을 위한 산화환원 전도성 에폭시 네트워크를 함유한 오스뮴 착물을 갖는 산소 비민감 유리 전극(Ye 등, 1993, supra)을 피복하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 변이체의 다른 가능한 적용도 존재한다. 예를 들면, 상기 s-GDH 변이체는 알돈산 제조 공정내에 사용될 수 있다. 야생형 s-GDH 는 글루콘산 및 기타 알돈산을 제조하는 기질 산화에있어서 높은 전환율을 갖는다. 글루코오스에 대해 더욱 특이적인 s-GDH 변이체를 사용하는 것에 의해서, 글루콘산의 제조는 훨씬 낮은 부산물을 초래할 수 있다. 다른 기질 특이성을 갖는 기타 s-GDH 변이체를 이용하여, 요구되는 다른 알돈산을 제조할 수 있다.
하기 실시예에서, 모든 시약, 제한 효소 및 기타 물질은, 다른 시판원이 특정되어 있지 않다면, Roche Diagnostics Germany 로부터 입수하였고, 상기 공급원에 의해 제공된 지침서에 따라 사용하였다. DNA 의 정제, 특징분석 및 클로닝에 사용된 조작 및 방법은 당업계에 통상적으로 공지되어 있고 (Ausubel, F., 등, in "Current protocols in molecular biology" (1994), Wiley Verlag), 당업자가 요구하는 바와 같이 채용할 수 있다.
하기 실시예는 또한 본 발명을 예시한다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하려는 의도를 갖지는 않고, 단지 본 발명의 이해를 제공할 뿐이다.
실시예 1 : E.coli 에서의 야생형 A. 칼코아세티쿠스 가용성 PQQ 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 클로닝 및 발현
표준 절차에 따라 아시네토박터 칼코아세티쿠스 균주 LMD 79.41 로부터 s-GDH 유전자를 단리하였다. 야생형 s-GDH 유전자를 조정가능한 발현을 위한 mgl 프로모터 (특허출원 WO 88/09373 참조)를 함유하는 플라스미드에 서브클로닝하였다. 이 신규 구축물을 pACSGDH (도 3 및 4 참조)라 명명하였다. 재조합 플라스미드를E.coli군으로부터 선택된 숙주 유기체로 도입하였다. 이어서, 상기 유기체를 적당한 조건하에서 배양하고, s-GDH 활성을 나타내는 콜로니를 선택하였다.
QIAGEN 플라스미드 Maxi Kit (Qiagen) 을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상술한 클론의 하룻밤 배양액 200 ㎖ 로부터 플라스미드 pACSGDH 를 단리하였다. 상기 플라스미드를 1 ㎖ 의 DNase 없는 물(bidest. water) 중에 재현탁하였다. 플라스미드의 농도를 Beckman DU 7400 광도계를 사용하여 결정하였다. 수득량은 600 ㎍ 이었다. 이어서, 플라스미드의 질을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 결정하였다.
실시예 2: 돌연변이형성 PCR
s-GDH 유전자의 랜덤 돌연변이를 형성하기 위해서, 돌연변이형성 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응)을 수행하였다. pACSGDH 플라스미드 및 변이된 효소를 코딩하는 DNA 서열 (돌연변이형성 PCR 로부터의 PCR 산물)을 제한 효소SphI및EcoRI으로 절단하였다. 상기 산물을 겔 정제하였다. 절단된 DNA 서열을 라이게이션시키고, 라이게이션 반응 혼합물의 분액을 가용성 (competent)E.coli세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 그 후, 형질전환체를 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에서 선별하였다.
검사를 위해, 개개의 콜로니를 선택하고, 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 하룻밤동안 성장시킨 다음, 스크리닝을 수행하였다 (실시예 3 참조).
돌연변이형성 PCR 반응 혼합물:
40 ng 의 pACSGDH;
MgCl2없는 1 ×완충액 (Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 1699 105);
dCTP, dTTP 1 mM;
dATP, dGTP 0.2 mM (Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 1969 064);
40 pmol GF23 프라이머 (5'-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC) (= 서열번호 4);
40 pmol GR23 (5'-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA) (= 서열번호 5);
7 mM MgCl2;
0.6 mM MnCl2;
5 U Taq DNA 폴리머라아제 (Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호 1146 165)
Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer), 30 회: 95℃ 1 분, 45℃ 2 분, 72℃ 2 분;
- Roche Diagnostics GmbH 로부터의 High Pure PCR Product Purification Kit (카탈로그 번호 1 732 676)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 산물을 정제함.
- 37℃에서 하룻밤 동안, 1 ×완충액 H (Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호 1 417 991) 중의 25USphI(Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호 606 120)에 의해 PCR 절편을 절단하고; 25UEcoRI(Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호703 737)를 첨가한 다음, 3.5 시간 동안 추가적으로 절단함.
- 37℃에서 4 시간 동안, 1 ×완충액 H 중의 180USphI및 180UEcoRI에 의해 50 ㎍의 pACSGDH 를 절단함.
- 아가로오스 겔 (0.8%)를 사용하여, 절단된 pACSGDH 및 상기 절단된 절편을 겔 전기영동함.
- QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, 카탈로그 번호 28706)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 DNA 분자를 추출함.
- Beckman DU 7400 광도계를 사용하여, 상기 절편 및 절단된 벡터의 농도를 결정함.
- 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제된 산물의 질을 결정함.
- 20㎕의 부피, 16℃에서, 하룻밤 동안, 1U T4 DNA 리가아제 (Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호 481 220)를 사용하여, 140 ng 의 mPCR 절편과 100 ng 의 상기 절단된 벡터를 라이게이션함.
- BioRadE. coliPulser (BioRad)를 사용하여, 0.2 ㎝ 큐벳에서, 2.5 KV 에 의해, 1㎕의 라이게이션 반응액으로 전기가용성 XL1F 세포 (Stratagene)를 전기천공함.
- 37℃에서 1 시간 동안 1 ㎖의 LB 에서 성장시킨 후, 박테리아를 LB-암피실린 아가 플레이트 (100 ㎍/㎖ 암피실린) 상에 치상하고, 37℃에서 하룻밤동안 성장시킴.
- 하기 스크리닝 방법을 사용한 결과, 변이된 s-GDH 를 발현하는 상기 클론중 50% 가 활성이었음.
실시예 3: 스크리닝
상술한 아가 플레이트 상의 돌연변이 콜로니를 200 ㎕ 의 LB 암피실린 배지/웰을 함유하는 마이크로타이터 플레이트 (mtp)내에 넣고, 37℃ 에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이 플레이트를 마스터 플레이트라 명명하였다.
각각의 마스터 플레이트로부터, 5 ㎕ 샘플/웰을, 세포 파괴를 위하여, 웰당 5 ㎕ 의 B (B = 박테리아 단백질 추출 시약; Pierce no. 78248)를 함유한 mtp 로 옮기고; s-GDH 의 활성화를 위하여, 0.0556 mM 피롤로-퀴놀린 퀴논 (PQQ) 240 ㎕, 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2(pH 7.0/웰)을 첨가하였다. 완전효소 (holoenzyme)의 형성을 완성하기 위하여, mtp 를 25℃에서 2 시간 배양하고, 10℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 상기 플레이트를 작업 플레이트라고 부른다.
작업 플레이트로부터, 2 ×10 ㎕ 샘플/홀을 두 개의 빈 mtp 로 옮겼다. 그 후, 하나는 글루코오스에 대해서 검사하고, 다른 하나는 기질로서 말토오스 또는 기타 선택 당 분자에 대해서 검사하였다. 모든 당 분자는 동등 몰농도로 사용하였다.
dE/분이 계산되었고, 기질로서 글루코오스를 사용한 상기 값을 100% 활성으로 설정하였다. 기타 당으로부터 수득된 값을 글루코오스 값과 비교하여, 백분율 활성 [(dE/분 말토오스/dE 글루코오스) ×100]을 계산하였다. 이는 (돌연변이) 효소의 교차반응성에도 동일하다.
실시예 4: 돌연변이형성 PCR 로부터의 돌연변이 s-GDH 유전자의 서열결정
50% 말토오스/글루코오스 활성을 유도하는 돌연변이 s-GDH 유전자를 함유하는 플라스미드를 단리하고 (High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, No. 1754785), ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit 및 ABI 3/73 및 3/77 서열결정기 (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 서열결정하였다.
하기 프라이머가 사용되었다:
센스 가닥:GDH F2 : 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (서열번호 6)
GDH F3: 5'-GAT GCT GAT GGG CAG AAT GG-3' (서열번호 7)
GDH F4: 5'-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3' (서열번호 8)
GDH F5: 5'-ACG ATC CAA CTT GTG GAG AG-3' (서열번호 9)
안티센스 가닥:
GDH R1: 5'-CGA TTA AGT TGG GTA ACG CC-3' (서열번호 10)
GDH R2: 5'-ATA CGG AAA ATG ACA CCA CG-3' (서열번호 11)
GDH R3: 5'-GGG CCT TGT TCA GAC TGC AA-3' (서열번호 12)
GDH R4: 5'-CAA GAC GAC CTG ACT GAT GG-3' (서열번호 13)
GDH R5: 5'-CAT AAC AAC GCG TGC GGC TT-3' (서열번호 14)
결과:
=> DNA 서열 수준 상에서 6 개의 돌연변이
-> 아미노산 상에서 4 개의 돌연변이:
(성숙 효소의) 340 위치에서, E 로부터 G 로 변화;
(성숙 효소의) 348 위치에서, T 로부터 S 로 변화;
(성숙 효소의) 369 위치에서, N 로부터 H 로 변화;
(성숙 효소의) 413 위치에서, S 로부터 N 으로 변화;
실시예 5: 침투 돌연변이형성에 의해 수득된 s-GDH 돌연변이
s-GDH 단백질 또는 s-GDH 돌연변이 (상술한 바와 같은 플라스미드 정제)의 정의된 위치의 야생형 아미노산을 다른 랜덤 아미노산으로 성공적으로 치환하기 위해서, QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 카탈로그 번호 200518)가 사용되었다.
돌연변이형성을 위해 사용되는 5'- 및 3'-프라이머는 서로 상보적이고, 중심 위치에 NNN 을 함유한다. 이러한 뉴클레오타이드는 각 말단에 12 내지 16 개의 뉴클레이타이드가 인접해 있다. 상기 뉴클레오타이드의 서열은 치환되어야 할 아미노산에 대한 코돈에 인접해 있는 cDNA 가닥 또는 상보적인 cDNA 가닥과 동일하다. 따라서, 상기 코돈 대신에, 프라이머는 모든 코돈에 대한 올리코뉴클레오타이드 코드인 NNN 을 함유하였다.
모든 정의된 위치에 대하여, 하나의 PCR 반응이 수행되었다.
PCR 반응 및DpnI절단은 매뉴얼에 따라 수행되었다.
그 후, 각 반응액 1 ㎕ 를 XL1F 세포의 전기천공에 사용하였다. 세포를 성장시키고, 클론들의 s-GDH 활성을 상술한 바와 같이 측정하였다.
20 개 아미노산의 모든 변이체가 스크리닝되었다는 것이 통계적으로 보증하기 위해서, 각 위치에 대해서 200 개의 클론을 검사하였다.
하기 프라이머가 사용되었다:
ㆍ 340 위치:
센스 가닥, EGF 5'-TCC AAC TTG TGG ANN N AT GAC CTA CAT TT-3' (서열번호 15)
안티센스 가닥, EGR 5'-AAA TGT AGG TCA TNN NTC CAC AAG TTG GA-3' (서열번호 16)
ㆍ 348 위치:
센스 가닥, TSF 5'-CAT TTG CTG GCC ANN NGT TGC ACC GTC AT-3' (서열번호 17)
안티센스 가닥, TSR 5'-ATG ACG GTG CAA CNN NTG GCC AGC AAA TG-3' (서열번호 18)
ㆍ 369 위치:
센스 가닥, NHF 5'-TAC TGG TTG GGA ANN NAC ATT ATT GGT TC -3' (서열번호 19)
안티센스 가닥, NHR 5'-GAA CCA ATA ATG TNN NTT CCC AAC CAG TA-3' (서열번호 20)
ㆍ 413 위치:
센스 가닥, SNF 5'-TGA TGT GAT TGC ANN NCC AGA TGG GAA TG -3' (서열번호 21)
안티센스 가닥, SNR 5'-CAT TCC CAT CTG GNN NTG CAA TCA CAT CA-3' (서열번호 22)
결과:
340, 369 및 413 위치의 아미노산 변화는 기질 특이성을 변화시키지 못하였다. 단지 348 위치의 변화만이 25 내지 100 % (말토오스/글루코오스)로부터의 기질 특이성을 갖는 클론을 생산하였다.
수많은 횟수의 돌연변이형성 PCR 및 침투 돌연변이형성이 수행되었다. 348 및 428 위치들이 주요한 중요성을 가지며, 기타 아미노산의 교환이 또한 변이된 s-GDH 의 글루코오스에 대한 특이성을 더욱 개선시킬 수 있다는 것이 발견되었고 확인되었다. 대표적인 데이터 및 위치를 하기 표 1 에 나타낸다.
글루코오스에 대한 개선된 특이성을 갖는 s-GDH 변이체에 대한 예 (약자: n.t. = 검사되지 않음; SA = 기질로서 글루코오스에 대한 특이적 활성 (U/㎎ 단백질))
야생형 아미노산에 대해변형된 아미노산 글루코오스전환율 말토오스전환율 갈락토오스전환율 SA
야생형 100% 105% 50% 1000
340 E 에서 G348 T 에서 S369 N 에서 H413 S 에서 N 100% 50% 25% 700
22 I 에서 L295 Q 에서 L422 L 에서 I 100% 123% 14% 178
348 T 에서 D 100% 80% n.t. n.t.
348 T 에서 A 100% 67% n.t. n.t.
348 T 에서 G 100% 22% 20% 910
428 N 에서 P348 T 에서 G 100% 8% 25% n.t.
428 N 에서 V348 T 에서 G 100% 22% 22% n.t.
127 T 에서 M143 D 에서 Q348 T 에서 G428 N 에서 P 100% 1% 32% n.t.
76 Q 에서 A348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
76 Q 에서 M348 T 에서 G 100% 18% n.t. n.t.
76 Q 에서 D348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
76 Q 에서 P348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
76 Q 에서 S348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
76 Q 에서 G348 T 에서 G 100% 20% n.t. n.t.
76 Q 에서 E348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
143 D 에서 E348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
171 Y 에서 H348 T 에서 G308 K 에서 N 100% 19% n.t. n.t.
171 Y 에서 D348 T 에서 G317 F 에서 V 100% 18% n.t. n.t.
127 T 에서 S169 L 에서 H348 T 에서 G355 Y 에서 H 100% 11% n.t. n.t.
16 N 에서 D120 T 에서 S177 Q 에서 R277 Y 에서 H348 T 에서 G 100% 22% n.t. n.t.
116 I 에서 T255 N 에서 T299 K 에서 R348 T 에서 G 100% 20% n.t. n.t.
227 H 에서 Y348 T 에서 G438 N 에서 S 100% 18% n.t. n.t.
341 M 에서 V348 T 에서 G 100% 20% n.t. n.t.
348 T 에서 G349 V 에서 G428 N 에서 P 100% 10% n.t. n.t.
171 Y 에서 G230 P 에서 H348 T 에서 G428 N 에서 P 100% 3% n.t. n.t.
230 P 에서 H348 T 에서 G428 N 에서 P 100% 10% n.t. 200
227 H 에서 F230 P 에서 H348 T 에서 G428 N 에서 P 100% 6% n.t. n.t.
143 D 에서 E348 T 에서 G 100% 17% n.t. n.t.
143 D 에서 E348 T 에서 G428 N 에서 P 100% 1% 32% n.t.
169 G 에서 X230 P 에서 H348 T 에서 G428 N 에서 P 100% 2% n.t. n.t.
실시예 6: 돌연변이 s-GDH T348G 의 정제
성장된 세포 (LB-Apm. 37℃)를 회수하고, 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.0)에 재현탁하였다. 프렌치 프레스 통과 (French Press passage) (700-900 bar)에 의해 세포 파괴를 수행하였다. 원심분리 후, 상청액을 10 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.0)으로 평형화시킨 S-세파로오스 (Amersham Pharmacia Biotec) 컬럼에 적용하였다. 세척 후, 염 구배 0 - 1 M NaCl 을 사용하여 s-GDH 를 용출하였다. s-GDH 활성을 나타내는 분획을 모으고, 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.0)에 대해 투석한 다음, 다시 평형화시킨 S-세파로오스 컬럼 상에서 다시 크로마토그래피를 수행하였다. 활성 분획을 모으고, Superdex200 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotec)을 사용하여 겔 여과를 수행하였다. 활성 분획을 모으고, -20℃에서 저장하였다.
돌연변이 T348G 및 야생형 s-GDH 의 효소 검사 및 단백질 측정
Pierce 사의 Protein Assay Reagent no. 23225 를 사용하여 단백질 측정을 수행하였다 (BSA 에 의한 보정 곡선, 30 분, 37℃).
0.0556 mM 피롤로-퀴놀린 퀴논 (PQQ), 50 mM Hepes, 15 mM CaCl2(pH 7.0)로 GDH 샘플을 1 ㎎ 단백질/㎖ 로 희석하고; 재구성 또는 활성화를 위하여, 25℃에서 30 분간 배양하였다.
활성화 후, 매개자로서 0.315 ㎎/㎖ 의 (4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1,5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로소페닐)-아민 (특허 US 5,484,708호 참조)및 33 mM 당을 함유하는 1000 ㎕ 의 0.2 M 시트레이트 완충액 (25℃에서 pH 5.8)에, 50 ㎕ 의 샘플을 첨가하였다.
620 ㎚ 에서의 흡광이 25℃에서 처음 5 분동안에 모니터링되었다.
1U 의 효소 활성은 상기 검사 조건하에서 1 mmol 매개자/분(min.)의 전환율에 대응한다:
계산: 활성 = (총 부피 ×dE/분 [U/㎖]) : (ε×샘플 부피 ×1)
(식중, ε= 흡광 계수; 본 실시예에서, ε620nm= 30 [1 ×mmol-1×㎝-1]).
본 검사는 글루코오스, 말토오스 및 갈락토오스 (Merch, Germany)에 대해 수행하였다.
결과:
샘플 특이적 활성U/mg단백질(기질로서 글루코오스) 말토오스/글루코오스전환율 (%) 갈락토오스/글루코오스전환율 (%)
야생형 1000 105% 50%
돌연변이 T348G 910 22% 20%
실시예 7: 말토오스의 존재 또는 부재하에서 글루코오스의 측정
s-GDH 의 야생형 및 돌연변이 T348G 를 글루코오스 측정에 적용하였다. 참고 샘플은 65㎎ 글루코오스/㎗ 를 함유하였다. "검사" 샘플은 65 ㎎/㎗ 의 글루코오스 및 130 ㎎/㎗ 의 말토오스를 함유하였다. GDH 활성의 동일량 (U/㎖; 효소 검사 참조)이 각 검사에 사용되었다.
큐벳에서, 하기가 혼합되었다:
0.315 ㎎/㎖ 의 (4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1,5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로소페닐)-아민/0.2 M 시트레이트 (pH 5.8), 1 ㎖;
샘플 (글루코오스, 또는 글루코오스 + 말토오스), 0.015 ㎖.
0.050 ㎖의 90 U/㎖ s-GDH 을 첨가하여 검사를 시작하였다. 620 ㎚ 에서 흡광도 변화를 모니터링하였다. 5 분후에, 상수값을 구하고, dE/5분을 계산하였다. 야생형 s-GDH 를 갖는 참고 샘플을 측정하여 수득된 값을 100 %로 설정하였다. 다른 값을 이 참고값과 비교하여, 백분율 (%)로 계산하였다.
결과:
65 mg/dl 의글루코오스 65 mg/dl 의 글루코오스, 및130 mg/dl 의 말토오스
야생형 s-GDH 100% 190%
돌연변이 s-GDH T348G 100% 130%
변이된 s-GDH 가 상기 측정에 사용될 경우, 측정된 "글루코오스 값"이 현저하게 덜 감소된다는 것을 명확히 알 수 있다.
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Claims (30)

  1. 대응 야생형 효소와 비교하여, 하나 이상의 기타 선택 당 기질에 대하여, 2 배 이상 증가된 글루코오스에 대한 기질 특이성을 가짐을 특징으로 하는, PQQ 의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH)로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 돌연변이.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 선택 당이 말토오스 및 갈락토오스로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 돌연변이.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 선택 당이 말토오스임을 특징으로 하는 돌연변이.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스에 대한 기질 특이성이 3 배 이상 개선됨을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스에 대한 기질 특이성이 5 배 이상 개선됨을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이.
  6. 하기를 특징으로 하는, PQQ 의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH)로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 돌연변이:
    a) 글루코오스에 대한 기질 특이적 반응성은 야생형 효소의 것과 본질적으로는 동일하고;
    b) 말토오스에 대한 기질 특이적 반응성은 야생형 효소와 비교하여 30% 이하임.
  7. 제 6 항에 있어서, 말토오스에 대한 상기 기질 특이적 반응성이 야생형 효소와 비교하여 20% 이하임을 특징으로 하는 돌연변이.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 s-GDH 가 A. 칼코아세티쿠스 및 A. 바우만니이로 이루어진 아시네토박터 종 군의 균주로부터 단리됨을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이.
  9. A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24) 중의 348 위치에 대응하는 아미노산 위치의 아미노산 잔기 치환을 포함함을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질.
  10. A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24) 중의 위치에 대응하는 아미노산 위치의 둘 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하고, 상기 치환된 아미노산 위치가 16, 22, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177,227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 348, 349, 355, 422, 428 및 438 위치들로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 아미노산 잔기 T348 이 치환됨을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서, A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24) 중의 위치에 대응하는 상기 아미노산 위치, 즉 348 위치의 아미노산 및 16, 116, 120, 127, 169, 171, 177, 227, 255, 277, 299, 317, 355 및 438 의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 치환됨을 특징으로 하는 돌연변이.
  12. 제 10 항에 있어서, 348 및 428 위치의 아미노산 잔기의 치환을 포함함을 특징으로 하는 돌연변이 단백질.
  13. A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호 24) 중의 위치에 대응하는 아미노산 위치의 3 개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하고, 상기 치환된 아미노산 위치는 171, 227, 230, 245, 341, 348, 349 및 428 위치들로 이루어진 군으로부터 선택되며, T348 및 N428의 아미노산 잔기 모두가 치환됨을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 428 위치의 아스파라긴이 루신, 프롤린 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환됨을 특징으로 하는돌연변이.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 348 위치의 트레오닌이 알라닌, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 돌연변이.
  16. WPXaaVAPS (서열번호 1) [식중, 상기 Xaa 잔기는 트레오닌과는 다른 아미노산 잔기임]의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 Xaa 잔기가 글리신임을 특징으로 하는 돌연변이 단백질.
  18. TAGXaaVQK (서열번호 2) [식중, 상기 Xaa 잔기는 아스파라긴 이외의 아미노산 잔기임]의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 Xaa 잔기가 프롤린임을 특징으로 하는 돌연변이 단백질.
  20. ADGXaaNGL (서열번호 3) [식중, 상기 Xaa 잔기는 글루타민 이외의 아미노산 잔기임]의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 PQQ 의존성 s-GDH 의 돌연변이 단백질.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 Xaa 잔기가 아스파트산, 글루탐산, 메티오닌, 프롤린, 세린, 알라닌 또는 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 돌연변이.
  22. 제 9 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연변이 단백질을 코딩하는 단리 폴리뉴클레오타이드.
  23. 숙주 세포내에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, 제 22 항에 정의된 단리 폴리뉴클레오타이드를 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  24. 제 23 항에 따른 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 숙주 세포.
  25. 효소 변이체의 제조에 적합한 조건하에서 제 24 항에 따른 숙주 세포의 배양을 포함함을 특징으로 하는 s-GDH 변이체의 제조 방법.
  26. 무세포 펩티드 합성계 (cell-free peptide synthesis system)에서 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 제 22 항에 정의된 단리 폴리뉴클레오타이드를 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  27. 상기 효소 변이체의 제조에 적합한 조건하에, 무세포 펩티드 합성계에서, 제 26 항에 따른 발현 벡터 구축물을 갖는 s-GDH 변이체의 제조 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연변이를 사용하여, 샘플내의 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법에 있어서, 상기 개선 방법이 상기 샘플을 상기 돌연변이와 접촉시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 글루코오스의 검출, 결정 또는 측정이 센서 또는 검사 스트립 장치를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연 변이, 및 상기 측정에 요구되는 기타 시약을 포함함을 특징으로 하는 샘플내 글루코오스의 검출 또는 측정을 위한 장치.
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