BRPI0114962B1 - mutante de glicose desidrogenase solúvel (s-gdh) dependente de pirroloquinolina quinona (pqq), processo para detecção, determinação ou medição da glicose em uma amostra, e dispositivo para realização do mesmo - Google Patents

Abstract

"variações da glicose desidrogenase solúvel dependente de pirroloquinolina quinona". a presente invenção refere-se a variações melhoradas das glicose desidrogenases solúveis (s-gdh) dependentes de pirroloquinolina quinona (pqq), aos genes que codificam a s-gdh mutada, às proteínas mutantes de s-gdh com maior especificidade ao substrato pela glicose e às diferentes aplicações destas variações da s-gdh, particularmente para a determinação das concentrações de açúcar, especialmente da glicose em uma amostra.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MUTANTE DE GLICOSE DESIDROGENASE SOLÚVEL (S-GDH) DEPENDENTE DE PIRROLOQUINOLINA QUINONA (PQQ)„ PROCESSO PARA DETECÇÃO, DETERMINAÇÃO OU MEDIÇÃO DA GLICOSE EM UMA AMOSTRA, E DISPOSITIVO PARA REALIZAÇÃO DO MESMO' A presente invenção se refere a variações melhoradas de glicose desidrogenases solúveis (s-GDH) dependentes de pirroloquinolina quinona (PQQ), aos genes que codificam s-GDH mutantes, a proteínas mutantes de s-GDH com maior especificidade ao substrato para a glicose e a diferentes aplicações destas variações de s-GDH, particularmente para a determinação de concentrações de açúcar, especial mente de glicose em uma amostra.

Foram caracterizados dois tipos de glicose desidrogenases dependentes de PQQ (EC 1.1.99.17): Uma é ligada à membrana (m-GDH), a outra é solúvel (s-GDH). Ambos os tipos não compartilham qualquer homo-logia de sequência significativa (Cleton-Jansen, A. M. e outros, Mol Gen Ge-net 217 (1989) 430-6; Cleton-Jansen, A. M. e outros, Antonie Van Leeuwe-nhoek 56 (1989) 73-9; Oubríe, A. e outros, Proc Natl Acad Sei USA 96 (1999) 11787-91). São também diferentes em relação tanto a sua cinética quanto as suas propriedades imunológicas (Matsushita, K. e outros, Biosci-ence Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555).

As quinoproteínas utilizam a quinona como co-fator para oxidar álcoois, aminas e aldoses em suas lactonas, aldeídos e ácidos alcoólicos correspondentes (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydro-genase pathway in Acinetobacter em "The Biology of Acineíobacter1' (1991) 295-312, Nova York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84, Davidson, V. L. - em "Principies and applications of quinoproteins" (1993) o livro todo, Nova York, Marcei Dekker; Anthony, C., Biochem J 320 (1996) 697-711; Anthony, C, e Ghosh, M. Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7; Anthony, C. e Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21). Entre as quinoproteínas, as que contêm o co-fator 2,7,9-tricarbóxi-1 H-pirrolo [2,3-f]-quinolina-4,5-diona (PQQ) ligado de forma não-covalente constituem o maior subgrupo (Duine 1991, supra), Todas as glicose desidrogenases bacterianas conhecidas até agora pertencem a este subgrupo com PQQ como o grupo prostético (Anthony e Ghosh 1997, supra, Goodwin e Anthony 1998, supra).

Nas bactérias, há dois tipos completamente diferentes de glicose desidrogenases dependentes de PQQ (EC 1.1.99.17): o tipo solúvel (s-GDH) e o tipo ligado à membrana (m-GDH) (Duine e outros, 1982; Matsushita e outros, 1989a,b). As m-GDHs são amplamente distribuídas nas bactérias Gram-negativas, as s-GDHs, entretanto, foram encontradas somente no espaço periplasmático de cepas de Acinetobacter, como A. calcoaceticus (Duine, 1991a; Cleton-Jansen e outros, 1988; Matsushita e Adachi, 1993) e A. baumannii (JP 11243949).

Através de buscas nos bancos de dados de seqüências, foram identificadas duas seqüências homólogas à s-GDH de comprimento completo de A. calcoaceticus em E. coli K-12 e Synechocystis sp. Adicionalmente, foram também descobertas duas seqüências incompletas homólogas à s-GDH de A. calcoaceticus no genoma de P. aeruginosa e de Bordetella períussis (Oubrie e outros 1999a), respectivamente. As seqüências de ami-noácidos deduzidas destas quatro proteínas não-caracterizadas são intimamente relacionadas à s-GDH de A. calcoaceticus com muitos resíduos no suposto sítio ativo absolutamente conservados. Provavelmente estas proteínas homólogas possuem uma estrutura similar e catalisam reações similares dependentes de PQQ (Oubrie e outros, 1999a).

Foi descoberto que as s-GDHs e m-GDHs bacterianas possuem seqüências bastante diferentes e especificidade ao substrato distinta. Por exemplo, A. calcoaceticus contém duas glicose desidrogenases dependentes de PQQ, uma m-GDH que é ativa in vivo e a outra denominada s-GDH para a qual só se pode mostra atividade in vitro. Cleton-Jansen e outros, (1988; 1989a,b) clonaram os genes para as duas enzimas GDH e determinaram as seqüências de DNA de ambos estes genes GDH. Não há homologia óbvia entre m-GDH e s-GDH corroborando para o fato de que m-GDH e s-GDH representam duas moléculas completamente diferentes. O gene de s-GDH de A. calcoaceticus foi clonado em E. coli atrás de uma seqüência líder e um promotor forte. Após ser sintetizada na célula, a s-GDH é translocada através da membrana citoplasmática para dentro do espaço periplásmico (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter em "The Biology of Acineto-bacter1' (1991) 295-312, Nova York, Plenum Press, Matsushita, K. e Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase em "Principies and application of Quinoproteins" (1993) 47-63, Nova York, Marcei Dekker). Assim como a s-GDH nativa de A. calcoaceticus, a s-GDH expressa em E. coli é também um homodímero, com uma molécula de PQQ e três íons cálcio por monômero (Dokter e outros, 1986 supra, 1987 supra, 1988 supra; Olsthoorn, A. e J. Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8; Oubrie, A. e outros, J Mol Biol 289 (1999) 319-33, Oubrie, A. e outros, Proc Natl Acad Sei USA 96 (1999) 11787-91, Oubrie, A. e outros, Embo J 18 (1999) 5187-94). s-GDH oxida uma ampla faixa de mono e dissacarídeos nas cetonas correspondentes que se hidrolisam adicionalmente nos ácidos aldônicos e é também capaz de doar elétrons para PMS (metossulfato de fenazina), DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol), WB (azul de Wurster) e ubiquinonas de cadeia curta tais como ubiquinona Q1 e ubiquino-na Q2 (Matsushita, K. e outros, Biochemistry 28 (1989) 6276-80; Matsushita, K. e outros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), para vários acepto-res artificiais de elétrons tal como metil sulfato de N-metilfenazônio (Olsthoorn, A. J. e Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8; Olsthoorn, A. J. e Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-61) e para polímeros que conduzem elétrons (Ye, L. e outros, Anal. Chem. 65 (1993) 238-41).

Em vista da alta atividade específica da s-GDH voltada para a glicose (Olsthoorn, A. J. e Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8) e de sua ampla especificidade por aceptores artificiais de elétrons, a enzima é bem adequada para aplicações analíticas, particularmente para ser utilizada em (bio-)sensor ou tiras de teste para a determinação de glicose em aplicações para diagnóstico (Kaufmann e outros, 1997 supra). A oxidação da glicose pode ser catalisada por pelo menos três grupos bastante diferentes de enzimas, isto é, por glicose desidrogenases ligadas a corante dependentes de NAD, por glicose oxidase de flavoproteína ou por GDHs de quinoproteína (Duine 1995). Foi observada uma auto-oxidação bastante lenta da s-GDH reduzida, demonstrando que o oxigênio é um aceptor de elétrons muito fraco para s-GDH (Olsthoorn e Duine 1996). A s-GDH pode doar elétrons de forma eficiente para PMS, DCPIP, WB e ubi-quinonas de cadeia curta tais como Q1 e Q2, mas não pode doar elétrons de forma eficiente diretamente para o oxigênio.

As tiras de teste tradicionais e os sensores para a monitoração do nível de glicose no sangue, no soro e na urina, por exemplo, de pacientes diabéticos utilizam a glicose oxidase. Entretanto, uma vez que a glicose oxi-dase transfere seus elétrons para o oxigênio, é sabido que o oxigênio pode ter um impacto negativo sobre as medidas que são baseadas nesta enzima. A vantagem principal das glicose desidrogenases dependentes de PQQ é a sua independência do oxigênio. Esta característica importante é, por exemplo, discutida na US 6.103.509, na qual foram investigadas algumas características da GDH ligada à membrana.

Uma contribuição importante para o campo foi o uso da s-GDH junto com substratos apropriados. Os métodos de ensaio e os dispositivos para as tiras de teste baseados na s-GDH são divulgados em detalhes na US 5.484.708. Esta patente contém ainda informação detalhada sobre a montagem dos ensaios e a produção de tiras de teste baseadas na s-GDH para a medida da glicose. Os métodos descritos naquela assim como nos •documentos citados estão incluídos aqui como referência.

Outras patentes ou pedidos de patente que se relacionam com o campo e que compreendem a informação específica sobre os vários modos de aplicações para as enzimas com a atividade da glicose desidrogenase são US 5.997.817; US 6.057.120; EP 620 283; e JP 11 -243949-A.

Um sistema comercial que utiliza a s-GDH e um indicador que produz uma alteração de cor quando a reação ocorre (Kaufmann e outros, 1997) é o sistema Glucotrend® distribuído pela Roche Diagnostics GmbH.

Apesar das vantagens importantes discutidas anteriormente há aiinda um problema inerente principal da s-GDH. A s-GDH possui um espectro de substratos bastante amplo quando comparada à m-GDH. Ou seja, s- GDH oxida não somente a glicose mas também vários outros açúcares incluindo a maltose, a galactose, a lactose, a manose, a xilose e a ribose (Dokter e outros 1986a). A reatividade com os açúcares sem ser a glicose pode em certos casos prejudicar a acurácia da determinação dos níveis de glicose no sangue, em alguns pacientes diabéticos. Em particular, os pacientes sob diálise peritoneal tratados com icodextrina (um polímero de glicose) podem conter em seus fluidos corporais, por exemplo, no sangue, altos níveis de outros açúcares, especialmente a maltose (Wens, R. e outros, Perit Dial Int 18 (1998) 603-9).

Portanto, as amostras clínicas, como por exemplo as obtidas de pacientes diabéticos, especialmente de pacientes com complicações renais e especialmente de pacientes sob diálise podem conter níveis significativos de outros açúcares, especialmente a maltose. As determinações de glicose em amostras obtidas de tais pacientes críticos podem ser prejudicadas pela maltose. Há poucos relatos na literatura sobre tentativas de produzir s-GDHs dependente de PQQ que exibam especificidade alterada ao substrato. Devido a um resultado negativo, a maior parte destes esforços não foi publicada. Igarashi, S. e outros, (1999) relatam que a introdução de uma mutação pontual na posição Glu277 leva a mutantes com um perfil de especificidade alterada ao substrato. Entretanto, nenhum destes mutantes, leva a uma especificidade melhorada pelo menos duas vezes maior para a glicose quando comparada, por exemplo, à xilose, à galactose ou à maltose.

Pode ser resumido que as tentativas conhecidas na técnica voltadas para melhorias das propriedades da s-GDH, especialmente de sua especificidade em relação à glicose, não foram bem sucedidas até a extensão necessária para a monitoração acurada dos níveis de glicose em pacientes que possuem também altos níveis de açúcares sem ser a glicose. Há portanto uma enorme demanda e necessidade clínica de formas mutantes de s-GDH que apresentem uma maior especificidade pela glicose como substrato.

Foi a tarefa da presente invenção fornecer novos mutantes ou variações de s-GDH com especificidade ao substrato significativamente maior pela glicose quando comparada a outras moléculas de açúcar selecionadas, por exemplo, como a galactose ou a maltose.

De forma surpreendente foi descoberto que é possível aumentar significativamente a especificidade ao substrato de s-GDH pela glicose, quando comparada com outros açúcares e resolver pelo menos parcialmente os problemas descritos anteriormente conhecidos na técnica. A especificidade ao substrato pela glicose quando comparada com outras moléculas de açúcar selecionadas foi significativamente aumentada através do fornecimento de s-GDH mutante de acordo com a presente invenção como é descrito aqui e nas reivindicações em anexo. Devido à maior especificidade ao substrato das novas formas de s-GDH, é possível um progresso técnico significativo para as determinações da glicose em vários campos de aplicação.

Sumário da Invenção: Foi descoberto agora de forma surpreendente que é possível fornecer mutantes de s-GDH com maior especificidade ao substrato pela glicose quando comparada a outros açúcares. São divulgadas novas variações de s-GDH que exibem uma especificidade ao substrato significativa-mente maior pela glicose, especialmente quando comparada àquela pela maltose. São também divulgadas moléculas mutantes de s-GDH, que, comparadas com a enzima do tipo selvagem, exibem atividade específica essencialmente equivalente à glicose como substrato mas uma atividade notavelmente reduzida por outras moléculas de açúcar selecionadas.

Tal comparação de uma atividade mutante específica para uma das várias outras moléculas de substrato é baseada em e calculada em relação às atividades enzimáticas originais de uma enzima do tipo selvagem, por exemplo, que é isolada de Acinetobacter calcoaceticus.

As proteínas s-GDH mutadas assim como as seqüências de po-linucleotídeos que codificam tais proteínas que exibem propriedades melhoradas, especialmente maior especificidade pela glicose, são também forne- cidas.

Foi descoberto que as s-GDH mutantes que compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição de aminoácido que corresponde a uma posição da sequência do tipo selvagem da s-GDH de A. calcoaceticus (SEQ ID Ne 24) selecionada do grupo que consiste nas posições 348 e 428 fornecem enzimas s-GDH com propriedades melhoradas, especialmente maior especificidade pela glicose. As variações que compreendem uma substituição na posição 348 exibem um efeito surpreendentemente positivo sobre a especificidade pela glicose.

Os mutantes de s-GDH melhorados podem ser utilizados com grande vantagem para a detecção ou medida específica da glicose em amostras biológicas, especialmente em dispositivos com tiras para teste ou em biossensores.

Os exemplos, as referências, a listagem de seqüências e as figuras a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo âmbito real é apresentado nas reivindicações em anexo. Entende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados sem sair do espírito da invenção.

Descrição das Figuras Figura 1: Seqüência de nucleotídeos (DNA) do gene da glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ de Acinetobacter calcoaceticus e a seqüência de aminoácidos correspondente (SEQ ID N9 23).

Figura 2: Seqüências de proteínas de s-GDH (em cima) dependente de PQQ de A. calcoaceticus e de s-GDH de A. baumannii (embaixo) alinhadas de acordo com a homologia das seqüências.

Figura 3: Ilustração do vetor pACSGDH referido no Exemplo 1 contendo as seqüências de DNA do tipo selvagem ou mutadas da glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ.

Figura 4: Seqüência de nucleotídeos (DNA) do vetor pACSGDH referido no Exemplo 1 contendo a seqüência de DNA do tipo selvagem da glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ (SEQ ID N9 25). Descrição detalhada da invenção: Em uma primeira modalidade a invenção refere-se a um mutante da forma solúvel de EC 1.1.99.17 também conhecido como glicose desidro-genase solúvel (s-GDH) dependente de PQQ, o dito mutante caracterizado pelo fato de que em relação à enzima do tipo selvagem correspondente e a respeito de pelo menos um outro substrato de açúcar selecionado, possui uma especificidade ao substrato melhorada de pelo menos duas vezes pela glicose.

As diretrizes fornecidas nesta invenção são facilmente aplicadas para qualquer isolado de s-GDH conhecido ou até mesmo ainda desconhecido. Estes isolados do tipo selvagem podem ser utilizados para avaliar os aumentos relativos na especificidade para as variações geradas partindo dos mesmos. A enzima do tipo selvagem da cepa LMD 79,41 do tipo Acineto-bacter calcoaceticus que corresponde à SEQ ID N9 24 é bem conhecida e bem caracterizada. No caso de uma enzima do tipo selvagem diferente sob investigação não estar bem caracterizada é vantajoso utilizar a s-GDH da cepa LMD 79,41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus como uma referência. Em uma modalidade preferida adicional as propriedades de uma variação melhorada de s-GDH são comparadas com as desta enzima do tipo selvagem. A presente invenção refere-se portanto também a um mutante de s-GDH o dito mutante caracterizado pelo fato de que em relação à enzima do tipo selvagem da SEQ ID Ns 24 e a respeito de pelo menos outro substrato de açúcar selecionado, este possui uma especificidade maior ao substrato de pelo menos duas vezes pela glicose.

Como foi discutido anteriormente, duas famílias de enzimas completamente diferentes com atividade de glicose desidrogenase, agrupadas sob EC 1.1.99.17, estão caracterizadas até hoje. Estas duas famílias de enzimas, entretanto, parecem não estar relacionadas uma com a outra.

Para a finalidade desta invenção somente a forma solúvel de GDH (s-GDH) é relevante e as variações melhoradas desta são discutidas posteriormente aqui. É sabido na técnica que a seqüência de DNA do tipo selvagem de uma glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ pode ser isolada de cepas de Acinetobacter. É mais preferido o isolamento da cepa LMD 79,41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus. A seqüência desta s-GDH do tipo selvagem (a proteína madura) é fornecida na Figura: 1 e na SEQ ID N- 24. Outras cepas de LMD de Acinetobacter podem ser também utilizadas como fonte de s-GDH do tipo selvagem. Tais sequências podem ser alinhadas com a seqüência obtida de A. calcoaceticus e podem ser feitas comparações das seqüências (ver a Figura: 2). Parece possível selecionar bibliotecas de DNA de outras cepas bacterianas, como por exemplo descrito para E. coli K-12 (Oubrie, A. e outros, J Mol Biol 289 (1999) 319-33) acima e identificar seqüências relacionadas com s-GDH em tais genomas. Tais seqüências e seqüências homólogas ainda não identificadas podem ser utilizadas para gerar mutantes de s-GDH com maior especificidade ao substrato pela glicose. O termo "mutante" ou "variação" no sentido da presente invenção refere-se a uma proteína s-GDH que comparada com uma seqüência do tipo selvagem correspondente exibe pelo menos uma substituição de amino-ácido. O versado na técnica irá considerar que há várias possibilidades para produzir polinucleotídeos que codificam uma seqüência polipeptídica de tal s-GDH mutada. É também evidentemente possível gerar mutantes que compreendem uma ou mais adições ou deleções de aminoácidos.

Um mutante de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato de que em relação à enzima do tipo selvagem correspondente este possui uma especificidade ao substrato pelo menos duas vezes maior pela glicose quando comparado com pelo menos um substrato de açúcar selecionado.

Com a finalidade de calcular a especificidade ou a reatividade cruzada ao substrato uma forma fácil é ajustar a atividade medida com a glicose como o substrato em 100% e comparar a atividade medida com o outro açúcar selecionado ao valor da glicose. Algumas vezes, para não ser redundante, por um lado simplesmente o termo especificidade é utilizado sem fazer referência especial à glicose e por outro lado um substrato selecionado de outro açúcar. O versado na técnica irá considerar que a comparação de (re)atividades é mais bem feita em concentrações equimolares das moléculas de substrato investigadas utilizando condições de ensaio bem definidas. De outra maneira, é preciso fazer correções para as diferenças nas concentrações.

As condições de ensaio padronizadas e bem definidas têm que ser escolhidas a fim de avaliar (os aumentos na) especificidade. A atividade enzimática da s-GDH para a glicose como substrato assim como para substratos de outros açúcares selecionados é medida como é descrito no Exemplo 6.

Com base nestas medidas a reatividade cruzada e (as melhorias em) a especificidade são avaliadas. A reatividade (cruzada) da s-GDH para um açúcar selecionado em porcentagem é calculada como Reatividade cruzada [%] = (atividade do açúcar selecionado/atividade da glicose) x 100%. A reatividade (cruzada) para a maltose da s-GDH do tipo selvagem de acordo com a fórmula anterior foi determinada como aproximadamente 105%. A reatividade (cruzada) da s-GDH do tipo selvagem para a galactose foi medida como aproximadamente 50% (cf. Tabela 1). A especificidade (aumentada) é calculada de acordo com a fórmula a seguir: atividade da glicose do mutante atividade da glicose do tipo especificidade = ------------------------------ x --------------:----------- (aumento) atividade do açúcar selecionado atividade do açúcar do tipo selvagem selecionado do mutante Quando comparada à enzima do tipo selvagem, uma forma de s-GDH com um aumento de pelo menos duas vezes na especificidade para a glicose versus a maltose (maltose/glicose) concordantemente com a maltose como o substrato possui no máximo 52,5% da atividade que é medida com a glicose como o substrato. Ou, se, por exemplo, uma s-GDH mutante possuir uma reatividade cruzada pela maltose de 20% (determinada e calculada como descrito acima), este mutante quando comparado com a s-GDH do tipo selvagem possui portanto um aumento de especificidade ao substrato de 5,25 vezes (maltose/glicose). O termo "atividade específica" para um substrato é bem conhecido na técnica, é preferencialmente utilizado para descrever a atividade en-zimática por quantidade de proteína. São conhecidos na técnica vários métodos para determinar a atividade específica de moléculas de GDH, utilizando a glicose ou outros açúcares como substratos (Igarashi, S. e outros, Bio-chem Biophys Res Commun 264 (1999) 820). Um dos métodos disponíveis para tal medida é descrito em detalhes na seção de exemplos.

Enquanto for possível, selecionar muitas moléculas de açúcar diferentes e investigar a especificidade pela glicose da s-GDH em comparação a qualquer tal molécula de açúcar selecionada, é preferido selecionar uma molécula de açúcar clinicamente relevante para tal comparação. Açúcares selecionados preferidos são selecionados por grupo que consiste em mannose, allose, galactose, xilose e maltose. Mais preferencialmente, a maltose ou a galactose é selecionada e a s-GDH mutante é testada em relação à maior especificidade ao substrato pela glicose que é comparada à galactose ou à maltose. Ainda em uma modalidade preferida o açúcar selecionado é a maltose.

Foi descoberto de forma surpreendente que os aumentos na especificidade pela glicose da s-GDH mutada, por exemplo, para maltose versus glicose, são bastante consideráveis. É portanto mais preferido que a dita especificidade ao substrato pela glicose quando comparada à especificidade ao substrato para pelo menos um dos outros substratos de açúcar selecionados seja maior pelo menos três vezes. Outras modalidades compreendem mutantes de s-GDH caracterizados por uma maior especificidade ao substrato pela glicose, que é pelo menos 5 vezes maior ou também preferida pelo menos 10 vezes maior, quando comparada à outra molécula de açúcar selecionada.

As mutações em s-GDH levam em muitos casos a variações de enzimas com atividade específica drasticamente reduzida pela glicose como substrato. Tal decréscimo na atividade específica (absoluta ou global) pela glicose como substrato, entretanto, pode ser crítico para as aplicações de rotina. De forma surpreendente foi descoberto que uma maior especificidade pela glicose não tem que funcionar às custas de uma atividade específica global drasticamente reduzida. É portanto preferido que a s-GDH com maior especificidade em relação à glicose como substrato exiba pelo menos 10% da atividade específica para a glicose que a medida com a enzima do tipo selvagem. É evidentemente mais preferido que tais enzimas mutadas exibam pelo menos 20% ou mais preferido pelo menos 50% da atividade respectiva à glicose da s-GDH do tipo selvagem.

Ainda em uma modalidade preferida adicional, a invenção refere-se a um mutante da forma solúvel de EC 1.1.99.17 também conhecido como glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ (s-GDH), o dito mutante caracterizado pelo fato de que a) a reatividade específica ao substrato em relação à glicose é essencialmente equivalente àquela da enzima do tipo selvagem e b) a reatividade específica ao substrato em relação à maltose é de 30% ou menor quando comparada a da enzima do tipo selvagem. A reatividade específica ao substrato (também denominada atividade específica) em relação à glicose é considerada como sendo essencialmente equivalente àquela da enzima do tipo selvagem se pelo menos 50% da atividade enzimática original para a glicose da enzima do tipo selvagem forem mantidos. São também preferidos os mutantes que exibem pelo menos 80% ou mais preferido, pelo menos 90% da atividade específica para a glicose que é medida para a enzima do tipo selvagem.

De forma bastante surpreendente foi descoberto, que é possível obter tais mutantes ou variações de s-GDH, que comparados com a s-GDH do tipo selvagem exibem atividade enzimática essencialmente equivalente para a glicose mas, todavia, reatividade específica pelo substrato significativamente reduzida em relação a outros açúcares selecionados, especialmente em relação à maltose. Os mutantes caracterizados pelo fato de que a reatividade específica pelo substrato em relação à glicose é essencialmente equivalente àquela da enzima do tipo selvagem e pelo fato de que a reativi- dade específica pelo substrato em relação à maltose é de 20% ou menor quando comparada à enzima do tipo selvagem são preferidos. São também preferidos tais mutantes para os quais a atividade específica para a maltose é de 15% ou até mesmo apenas de 10% ou menor da atividade específica para a maltose quando medida para a enzima do tipo selvagem correspondente, enquanto que a reatividade específica pela glicose é essencialmente equivalente à atividade específica para a glicose da enzima do tipo selvagem correspondente.

No caso da enzima do tipo selvagem não estar bem caracterizada é preferido utilizar a s-GDH da cepa LMD 79,41 do tipo Acinetobacter cal-coaceticus como referência. Ainda em uma modalidade preferida as propriedades de uma variação melhorada de s-GDH são comparadas às desta enzima do tipo selvagem e a presente invenção refere-se portanto a um mutante de s-GDH o dito mutante caracterizado pelo fato de que em relação à enzima do tipo selvagem da SEQ ID NQ 24 este exibe atividade enzimática essencialmente equivalente para a glicose mas, uma reatividade específica ao substrato significativamente reduzida (pelo menos 70% menor) em relação a pelo menos um outro substrato de açúcar selecionado.

De forma inesperada foi descoberto que é possível gerar mutantes s-GDH com maior especificidade substituta e de forma ainda mais inesperada foi descoberto que há apenas algumas posições de aminoácidos bem definidas que são de maior relevância a este respeito.

As conquistas da presente invenção são descritas em grande detalhe fazendo referência às posições de aminoácidos conhecidas da SEQ ID N9 24, a seqüência do tipo selvagem da s-GDH que é isolada da cepa LMD 79,41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus. As posições de aminoácidos em isolados diferentes de s-GDH correspondentes às posições da SEQ ID N9 24 são facilmente identificadas através da comparação com seqüências apropriadas. Preferencialmente o programa PileUp é utilizado para avaliar a homologia ou a identidade entre tais seqüências. As posições dos aminoácidos fornecidas aqui abaixo devem ser entendidas com as posições de aminoácidos da SEQ ID N9 24 ou de posições correspondentes a estas em ou- tras moléculas de s-GDH, a não ser que seja feita referência específica a uma outra SEQ ID N9 diferente ou a um isolado de s-GDH diferente. A fim de evitar redundâncias apenas em alguns casos é fornecido um elo específico ao fato de que posições correspondentes em isolados diferentes podem estar modificadas da mesma maneira, enquanto que para conveniência na maioria dos casos simplesmente e somente a posição correspondente da SEQ ID N9 24 é utilizada.

Foi descoberto que os mutantes que compreendem uma substituição de aminoácido na posição correspondente à posição 348 da s-GDH exibem um efeito notável sobre a especificidade pela glicose. Como é demonstrado na tabela 1, pode ser identificada e gerada um grande número de variações de s-GDH com maior especificidade pela glicose, contanto que pelo menos o aminoácido na treonina da posição 348 - como a que corresponde à posição da sequência da s-GDH do tipo selvagem de A. calcoaceti-cus - seja substituída por um outro aminoácido apropriado.

Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se portanto a uma proteína mutante de s-GDH dependente de PQQ que compreende uma substituição de resíduo de aminoácido na posição de aminoácido que corresponde à posição 348 da seqüência da s-GDH do tipo selvagem conhecida do A. calcoaceticus (SEQ ID N9 24).

Foi também descoberto, que substituições combinadas de ami-noácidos nas posições de aminoácidos correspondentes às posições 348 e 428 da SEQ ID N9 24 são vantajosas para gerar mutantes ou variações de s-GDH com especificidade significativamente maior para a glicose. Não é conhecido na técnica se os resíduos 348 ou 428 da s-GDH que é isolada da cepa LMD 79,41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus contribuem para a ligação de s-GDH ao substrato (Oubrie, A. e outros, Embo J 18 (1999) 5187-94; Oubrie, A. e Dijkstra, B. W., Protein Sei 9 (2000) 1265-73). Não se tem uma explicação química ou física em mãos pela qual as substituições destes resíduos de aminoácidos alteram a especificidade da s-GDH pela glicose quando comparada a outras moléculas de açúcar de interesse.

Foi descoberto em adição que a substituição do aminoácido 76 possui também um efeito positivo sobre a especificidade da s-GDH pela glicose.

Ainda em uma modalidade preferida a s-GDH mutada é caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido de treonina na posição 348 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em alanina, glicina e serina. Em uma modalidade mais preferida a glici-na é utilizada para substituir a treonina na posição 348.

Um grupo das variações de s-GDH preferidas de acordo com esta invenção compreende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 348 e em pelo menos uma das posições 76, 143, 168, 169 e 428.

Ainda em uma modalidade adicional uma proteína mutante de s-GDH dependente de PQQ compreende uma substituição de resíduo de aminoácido na posição 428 da seqüência do tipo selvagem correspondente de Acinetobacter calcoaceticus, na qual o resíduo de asparagina da seqüência do tipo selvagem é substituído por outros resíduos de aminoácido apropriados. Preferencialmente, tal resíduo de aminoácido é selecionado do grupo que consiste em leucina, prolina e valina. É preferido substituir a asparagina na posição 428 pela prolina.

Foi provado ainda que o aminoácido glutamina na posição 76 pode ser substituído para melhorar os problemas impostos pela reatividade cruzada da s-GDH com outras moléculas de açúcar. As posições da seqüência de outros isolados de s-GDH que correspondem a esta posição da seqüência são facilmente identificadas por uma busca de homologia sobre a SEQ ID N5 3. Em uma outra modalidade preferida o mutante de acordo com a presente invenção compreende portanto uma substituição da glutamina na posição 76 da seqüência do tipo selvagem correspondente do Acinetobacter calcoaceticus. É preferido selecionar o aminoácido utilizado em cada substituição em uma posição que corresponde à posição 76 na SEQ ID NQ 24 do grupo que consiste em alanina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, me-tionina, prolina e serina.

Como é descrito acima, uma substituição do aminoácido na posição 348 da seqüência da s-GDH correspondendo à sequência do tipo selvagem isolada de A. calcoaceticus, pode ser utilizada para aumentar significativamente a especificidade da s-GDH pela glicose. Os mutantes adicionalmente melhorados são obtidos através do fornecimento de uma proteína s-GDH mutante que compreende pelo menos duas substituições de aminoá-cidos, em que o aminoácido correspondente à posição 348 da SEQ ID N9 24 é substituído.

Uma modalidade adicional da presente invenção é portanto uma s-GDH mutante que compreende pelo menos duas substituições de aminoá-cidos em uma posição de aminoácido que corresponde a uma posição da seqüência da s-GDH do tipo selvagem conhecida do A. calcoaceticus (SEQ ID N9 24), as ditas posições de aminoácidos substituídas sendo selecionadas do grupo que consiste nas posições 16, 22, 76, 116, 120,127, 143, 168, 169, 171, 177, 227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 348, 349, 355, 422, 428 e 438, em que o resíduo de aminoácido T348 é substituído. É também preferido, que uma variação da s-GDH com pelo menos dois resíduos de aminoácidos substituídos compreenda uma substituição na posição 348 e pelo menos uma substituição adicional selecionada do grupo de posições que compreende as posições 76, 143, 168, 169 e 428.

Ainda em uma modalidade preferida as pelo menos duas posições de aminoácidos que são substituídas em uma s-GDH mutante são selecionadas do grupo que consiste nas posições de aminoácido 76, 348 e/ou 428.

Foi descoberto que os mutantes que compreendem as substituições nos resíduos de aminoácidos que correspondem às posições 348 e 428 são muito vantajosos para aumentar a especificidade da s-GDH pela glicose em comparação com outros substratos de açúcar. É especialmente preferido planejar e selecionar mutantes de s-GDH, que compreendem uma substituição em ambas as posições 348 e 428. São mais preferidos os mutantes que compreendem as substituições preferidas que são descritas anteriormente em ambas estas posições. É mais preferida uma variação de s- GDH que compreende T348G e N428P. A terminologia T348G e N428P é conhecida na técnica para indicar que a treonina na posição 348 é substituída pela glicina e a glutamina na posição 428 é substituída pela prolina.

As proteínas s-GDH mutantes que compreendem em adição às substituições nas posições 348 e 428 ainda as substituições nas posições 76, 127 e 143, representam também modalidades preferidas da presente invenção.

Os exemplos preferidos adicionais de proteínas s-GDH mutadas de acordo com a presente invenção compreendem as substituições de ami-noácidos nas posições 76 e 348 e ainda tais mutantes compreendendo substituições nas posições 76 e 428. Ainda em uma modalidade preferida a proteína s-GDH mutada de acordo com a presente invenção compreende substituições dos resíduos de aminoácidos nas posições 76, 348 e 428.

Ainda em uma modalidade preferida adicional a variação da s-GDH de acordo com a presente invenção compreende pelo menos três substituições de aminoácidos, os pelo menos três resíduos de aminoácidos substituídos correspondendo às posições de aminoácidos da sequência da s-GDH do tipo selvagem conhecida do A. calcoaceticus (SEQ ID NQ 24), as ditas posições de aminoácidos substituídas sendo selecionadas do grupo que consiste nas posições 171,227, 230, 245, 341,348, 349 e 428, em que ambos os resíduos de aminoácidos T348 e N428 são substituídos. Preferencialmente tais mutantes triplos compreendem pelo menos uma das substituições a seguir: Y171G, H227F, P230H, E245D ou M341V.

As variações de s-GDH preferidas com especificidade enormemente melhorada para a glicose compreendem substituições nas posições 348 e 428 em combinação com substituições nas posições 245 ou 341 ou em ambas. A análise da seqüência de aminoácidos revelou que os motivos da seqüência encontrados na s-GDH do tipo selvagem de A. calcoaceticus de um lado e de A. baumannii de outro lado parecem ser muito conservados ao longo das posições de maior relevância para aumentar a especificidade pela glicose que são identificadas na presente invenção, isto é, nas posições 76, 348 e 428, que correspondem à s-GDH do tipo selvagem de A. calcoa-ceticus (cf., Figura 2).

Uma modalidade preferida de acordo com a presente invenção portanto é uma proteína mutante da s-GDH dependente de PQQ que compreende a seqüência de aminoácidos de WPXaaVAPS (SEQ ID N9 1), em que o dito resíduo Xaa é um resíduo de aminoácido sem ser a treonina. A SEQ ID N9 1 corresponde à posição 346-352 da s-GDH do tipo selvagem de A. calcoaceticus ou à posição 347-353 da s-GDH do tipo selvagem de A. baumannii. É ainda preferido um mutante de s-GDH em que o dito Xaa na SEQ ID N9 1 representa alanina, glicina ou serina, mais preferido, Xaa representa glicina.

Um mutante de s-GDH dependente de PQQ, que compreende a seqüência de aminoácidos de TAGXaaVQK (SEQ ID N9 2), em que o dito resíduo de Xaa é um resíduo de aminoácido sem ser a asparagina, é uma outra modalidade preferida da invenção. A SEQ ID Ns 2 corresponde à posição 425-431 da s-GDH do tipo selvagem de A. calcoaceticus ou à posição 426-432 da s-GDH do tipo selvagem de A. baumannii.

Preferencialmente o mutante de s-GDH que compreende a SEQ ID N9 2 é caracterizado pelo fato de que o dito resíduo Xaa é selecionado do grupo que consiste em leucina, prolina e valina, mais preferido Xaa é um resíduo de prolina. São conhecidas várias possibilidades na técnica para produzir proteínas mutantes. Com base nas descobertas importantes da presente invenção que divulgam a importância clínica das posições de aminoácidos 348 e 428 e também a utilidade da posição 76, o versado na técnica pode agora produzir facilmente variações apropriadas adicionais de s-GDH. Tais variações por exemplo podem ser obtidas através dos métodos conhecidos como mutagênese aleatória (Leung, D. W. e outros, Technique 1 (1989) 11-15) e/ou mutagênese direcionada (Hill, D. E. e outros, Methods Enzymol 155 (1987) 558-68). Um método alternativo para produzir uma proteína com as propriedades desejadas é fornecer construções quiméricas, que contêm elementos de seqüência provenientes de pelo menos duas fontes diferentes ou sintetizar completamente um gene de s-GDH apropriado. Tais procedimentos conhecidos na técnica podem ser utilizados em combinação com a informação divulgada na presente invenção para fornecer mutantes ou variações da s-GDH que compreendem pelo menos uma substituição de amino-ácido em uma posição da seqüência que corresponde às posições 348 e/ou 428 da SEQ ID N9 24.

Uma variação da s-GDH de acordo com a presente invenção pode por exemplo, ser produzida partindo de um gene de s-GDH que é isolado da cepa LMD 79,41 da cepa Acinetobacter calcoaceticus assim como partindo de uma seqüência homóloga. No contexto deste pedido de patente entende-se que o termo "homólogo" compreende a s-GDH do tipo selvagem que é isolada de outros microorganismos, contanto que a homologia de seqüência quando comparada à SEQ ID N9 24 seja de pelo menos 90%. Em outras palavras, após o alinhamento apropriado utilizando o programa Pi-leUp, pelo menos 90% dos aminoácidos de tal s-GDH são idênticos aos aminoácidos descritos na SEQ ID N9 24.

Será entendido que há naturalmente variações de seqüências de DNA e de aminoácidos ou que podem ser introduzidas intencionalmente utilizando métodos conhecidos na técnica. Estas variações podem resultar em até 10% de diferenças nos aminoácidos na seqüência global, devido a dele-ções, substituições, inserções, inversões ou adições de um ou mais resíduos de aminoácidos na dita seqüência quando comparada à SEQ ID N9 24. Tais substituições de aminoácidos podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade da polaridade, na carga, na solubilidade, na hidrofobicidade, na hídrofílicídade e/ou na natureza anfípátíca dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspár-tico e o ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente incluem a lisina e a arginina; os aminoácidos com grupos com cabeça polar não carregada ou com grupos com cabeça não polar que possuem valores de hidrofi-licidade similares incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonia, fenilalanina, tirosina. Outras variações consideradas incluem sais e ésteres dos polipeptídeos mencionados anteriormente, assim como precursores dos polipeptídeos mencionados acima, por exemplo, precursores que possuem substituição N-terminal tal como a metionina, N-formilmetionina utilizada como seqüências líder. Tais variações podem ser feitas sem necessariamente sem sair do âmbito e do espírito da presente invenção.

De acordo com os procedimentos conhecidos no estado da técnica ou de acordo com os procedimentos fornecidos na seção de exemplos, é possível obter seqüências de polinucleotídeos que codificam qualquer um dos mutantes de s-GDH que foram discutidos anteriormente. A invenção compreende portanto também seqüências de polinucleotídeos isoladas que codificam proteínas mutantes de s-GDH que foram descritas anteriormente. A presente invenção inclui ainda um vetor de expressão que compreende uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a presente invenção ligada de forma operacional a uma seqüência promotora capaz de direcionar a sua expressão em uma célula hospedeira. A presente invenção inclui ainda um vetor de expressão que compreende uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a presente invenção ligada de forma operacional a uma seqüência promotora capaz de direcionar a sua expressão em uma célula hospedeira. Os vetores preferidos são plasmídeos tal como o pACSGDH exibido nas Figuras 3 e 4.

Os vetores de expressão úteis na presente invenção contêm tipicamente uma origem de replicação, um promotor localizado a montante na seqüência de DNA e estes são seguidos pela seqüência de DNA que codifica todas ou partes das variações da s-GDH. A seqüência de DNA que codifica todas ou partes das variações da s-GDH é seguida pelas seqüências de terminação da transcrição pelo restante do vetor. Os vetores de expressão podem incluir ainda outras seqüências de DNA conhecidas na técnica, por exemplo, seqüências líder de estabilidade que fornecem estabilidade ao produto de expressão, seqüências líder secretoras são responsáveis pela secreção do produto de expressão, seqüências que permitem que a expres- são do gene estrutural seja modulada (por exemplo, através da presença ou da ausência de nutrientes ou de outros indutores no meio de crescimento), seqüências marcadoras que são capazes de fornecer seleção fenotípica para as células hospedeiras transformadas e as seqüências que fornecem sítios para divagem através de endonucleases de restrição.

As características do vetor de expressão real utilizado têm que ser compatíveis com a célula hospedeira, que será empregada. Por exemplo, quando se clona em um sistema de células de E. coli, o vetor de expressão deve conter promotores isolados do genoma de células de E. coli (por exemplo, lac ou trp). As origens de replicação adequadas em vários hospedeiros de E. coli incluem, por exemplo, uma origem de replicação do plasmí-deo ColE1. Os promotores adequados incluem, por exemplo, lac e trp. É também preferido que o vetor de expressão inclua uma seqüência que codifica um marcador selecionável. O marcador selecionável é preferencial mente um gene de resistência a antibiótico. Como marcadores selecionáveis, a resistência à ampicilina ou a resistência à canamicina podem ser empregadas convenientemente. Todos estes materiais são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente.

Os vetores de expressão adequados contendo as seqüências codificadoras e controle adequadas podem ser construídos utilizando técnicas padronizadas do DNA recombinante conhecidas na técnica, das quais muitas estão descritas em Sambrook e outros (1989). A presente invenção refere-se adicionalmente a células hospedeiras que contêm um vetor de expressão que compreende uma seqüência de DNA que codifica toda ou parte da s-GDH mutante. As células hospedeiras contêm preferencialmente um vetor de expressão que compreende toda ou parte de uma das seqüências de DNA que possuem uma ou mais mutações exibidas na Tabela 1. São também preferidas as células hospedeiras que contêm um vetor de expressão que compreende uma ou mais seqüências de DNA reguladoras capazes de direcionar a replicação e/ou a expressão de e ligadas de forma operacional a uma seqüência de DNA que codifica toda ou parte da s-GDH mutante. As células hospedeiras adequadas inclu- em, por exemplo, E. coli HB101 (ATCC 33694) disponível na Promega (2800 Woods Hollow Road, Madison, Wi, USA), XL1-Blue MRF disponível na Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) e similares.

Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras através de vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a transformação de células hospedeiras com vetores de expressão pode ser realizada através do método de transformação de protoplastos mediada pelo polietileno glicol (Sambrook e outros 1989). Entretanto, podem ser empregados outros métodos para introduzir vetores de expressão em células hospedeiras, por exemplo, eletroporação, injeção biolística ou fusão de protoplastos.

Uma vez que um vetor de expressão que contém uma variação de s-GDH foi introduzido em uma célula hospedeira apropriada, a célula hospedeira pode ser cultivada sob condições que permitem a expressão das variações da s-GDH desejadas. As células hospedeiras contendo um vetor de expressão que contém uma sequência de DNA que codifica toda ou parte da s-GDH mutante são, por exemplo, identificadas, através de uma ou mais das abordagens gerais a seguir: hibridização do DNA, a presença ou a ausência de funções de gene marcador, avaliação do nível de transcrição que é medido através da produção de produtos da transcrição de mRNA da s-GDH na célula hospedeira e detecção do produto gênico imunologicamente. Preferencialmente as células hospedeiras transformadas são identificadas através de ensaio enzimático, por exemplo, de detecção colorimétrica. A presente invenção também ensina a produção e seleção de variações da s-GDH. A mutagênese aleatória e a mutagênese por saturação são realizadas como é conhecido na técnica. As variações são analisadas em relação à especificidade ao substrato pela glicose, pela maltose assim como por outros açúcares. As condições de ensaio escolhidas são adaptadas para garantir que os pequenos acréscimos esperados causados por exemplo, por uma substituição de um único aminoácido, possam ser medidos. Isto foi realizado através do ajuste das condições de ensaio de forma que a atividade da enzima do tipo selvagem (ou parental) seja próxima ao limite de detecção mais baixo. Um modo de seleção ou de separação de mutantes apropriados é fornecido no Exemplo 3. Qualquer alteração ou acréscimo quando comparado à enzima do tipo selvagem através desta maneira pode ser claramente detectado.

Deve ser, evidentemente, entendido que nem todos os vetores de expressão e as seqüências reguladoras de DNA funcionariam equivalentemente bem para expressar as seqüências de DNA da presente invenção. Nem todas as células hospedeiras funcionarão equivalentemente bem com o mesmo sistema de expressão. Entretanto, um versado comum na técnica pode fazer uma seleção entre os vetores de expressão, as seqüências reguladoras de DNA e as células hospedeiras utilizando as diretrizes fornecidas aqui sem experimentação desnecessária e sem sair do âmbito da presente invenção. A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de variações de s-GDH da presente invenção que compreende o cultivo de uma célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a produção da s-GDH mutante da invenção. Para as células hospedeiras bacterianas, as condições de cultivo típicas são meio líquido contendo o antibiótico apropriado e o agente de indução. Os antibióticos apropriados típicos incluem a am-picilina, a canamicina, o cloranfenicol, a tetraciclina e similares. Os agentes de indução típicos incluem IPTG, glicose, lactose e similares. É preferido que os polipeptídeos da presente invenção sejam obtidos através da produção em células hospedeiras que expressam uma seqüência de DNA que codifica a s-GDH mutante. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser também obtidos através da tradução in vitro do mRNA codificado por uma seqüência de DNA que codifica a s-GDH mutante. Por exemplo, as seqüências de DNA podem ser sintetizadas como foi descrito anteriormente e inseridas em um vetor de expressão adequado, que por sua vez pode ser utilizado em um sistema de transcrição/tradução in vitro.

Um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado como é definido e descrito acima ligado de forma operacional a uma seqüência promotora capaz de promover sua expressão em um sistema de síntese de peptídeos sem células representa uma outra modalidade preferida da presente invenção.

Os polipeptídeos produzidos por exemplo através de procedimentos que são descritos acima, podem então ser isolados e purificados utilizando várias técnicas de purificação de proteínas de rotina. Por exemplo, podem ser empregados procedimentos cromatográficos tais como a croma-tografia de troca iônica, a cromatografia por filtração em gel e a cromatogra-fia por afinidade.

Uma das aplicações principais das variações de s-GDH melhoradas desta invenção é para o uso em tiras de teste para monitorar o nível de glicose no sangue em pacientes diabéticos. Devido à insensibilidade da glicose desidrogenase dependente de PQQ em relação ao oxigênio, um sistema utilizando as variações melhoradas da s-GDH está menos sujeito à interferência pelo oxigênio do que os sistemas baseados na glicose oxidase. Mais importante, uma vez que as variações da s-GDH possuem maior especificidade em relação à glicose e atividade enzimática relativa significativamente reduzida em relação a outros açúcares, a interferência causada pela maltose, galactose e/ou outros açúcares relacionados que podem estar presentes em uma amostra a ser analisada é significativamente reduzida. Evi-dentemente que muitos tipos de amostras podem ser investigados. Fluidos corporais como soro, plasma, fluido intestinal ou urina são fontes preferidas para tais amostras. A invenção também compreende um método para a detecção, a determinação ou a medida da glicose em uma amostra utilizando um mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção. É especialmente preferido que o método melhorado para a detecção da glicose em uma amostra seja caracterizado pelo fato de que a dita detecção, determinação ou medida da glicose seja realizada utilizando um sensor ou dispositivo com tira de teste.

Ainda dentro do âmbito da presente invenção está um dispositivo para a detecção ou para a medida da glicose em uma amostra que compreende um mutante de s-GDH de acordo com esta invenção assim como ou- tros reagentes necessários para a dita medida.

As variações da s-GDH desta invenção com maior especificidade ao substrato podem ser também utilizadas com enorme vantagem em biossensores (DOosta, E. J. e outros, Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavi-cius, V. e outros, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V. e outros, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281) para a monitoração on-line da glicose em uma amostra ou em um reator. Para esta finalidade, as variações da s-GDH podem, por exemplo, ser utilizadas para revestir um eletrodo de vidro insensível ao oxigênio com um complexo de ósmio contendo um reticulado de epóxi condutor de redox (Ye e outros, 1993, supra) para uma determinação mais acurada da concentração de glicose. Há ainda outras aplicações possíveis das variações da s-GDH com a especificidade ao substrato aumentada de acordo com esta invenção. Por exemplo, estas variações da s-GDH podem ser utilizadas em um processo de obtenção do ácido aldônico. A s-GDH do tipo selvagem possui uma alta circulação na oxidação do substrato que produz o ácido glucônico e outros ácidos aldônicos. Através da utilização das variações da s-GDH, que são mais específicas para a glicose, a produção do ácido glucônico resultaria em uma quantidade muito menor de subprodutos. Com as outras variações de s-GDH com especificidade ao substrato diferente, é possível produzir ácidos aldônicos diferentes quando necessário.

Nos exemplos a seguir, todos os reagentes, enzimas de restrição e outros materiais foram obtidos da Roche Diagnostics Alemanha, a não ser que outras fontes comerciais sejam especificadas e foram utilizados de acordo com as instruções dadas pelos fornecedores. As operações e os métodos empregados para a purificação, para a caracterização e para a clonagem do DNA são bem conhecidos na técnica (Ausubel, F. e outros, em "Current protocols in molecular biology11 (1994), Wiley Verlag) e podem ser adaptados quando necessário pelos versados na técnica.

Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a presente invenção. Não é pretendido que estes exemplos limitem o âmbito da presente invenção, mas que forneçam um entendimento adicional da invenção.

Exemplo 1 Clonagem e expressão da glicose desidroqenase solúvel dependente de PQQ do tipo selvagem de A. calcoaceticus em E. coli O gene da s-GDH foi isolado da cepa LMD 79,41 de Acineto-bacter calcoaceticus de acordo com procedimentos padronizados. O gene da s-GDH do tipo selvagem foi subclonado em um plasmídeo contendo o promotor mgl para expressão ajustável (conforme Pedido de Patente WO 88/09373). A nova construção foi chamada de pACSGDH (ver as Figuras 3 e 4). Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em um organismo selecionado do grupo de E. coli. Estes organismos foram então cultivados sob condições apropriadas e as colônias exibindo a atividade da s-GDH foram selecionadas. O plasmídeo pACSGDH foi isolado de uma cultura mantida durante a noite de 200 mL do clone mencionado acima utilizando o QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) de acordo com os protocolos do fabricante. O plasmídeo foi ressuspenso em 1 mL de água bidestilada. A concentração do plasmídeo foi determinada utilizando um Fotômetro Beckman DU 7400. O rendimento foi de 600 pg. Então a qualidade do plasmídeo foi determinada através de eletroforese em gel de agarose.

Exemplo 2: PCR Mutagênica Para gerar mutações aleatórias no gene s-GDH, foi realizada a PCR mutagênica (reação em cadeia da polimerase). O plasmídeo pACSGDH e a sequência de DNA que codifica as enzimas mutadas (produto da PCR proveniente da PCR mutagênica) foram digeridos com as enzimas de restrição Sph I e Eco RI. Os produtos foram purificados em gel. As sequências de DNA digeridas foram ligadas e uma alíquota da mistura de reação da ligação foi utilizada para transformar células competentes de E. coli. Os transformantes foram selecionados subseqüentemente em placas de LB contendo ampicilina.

Para análise, foram escolhidas colônias individuais, crescidas durante a noite em meio LB contendo ampicilina e submetidas à seleção (ver o Exemplo 3).

Mistura de reação da PCR mutagênica: 40 ng de pACSGDH

tampão 1 x sem MgCI2 (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1699 105) dCTP, dTTP 1 mM dATP, dGTP 0,2 mM (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1969 064) 40 pmoles de Iniciador GF23 (5'-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC) (= SEQ ID NQ 4) 40 pmoles de GR23 (5-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA) (= SEQ ID

Ne 5) MgCI2 7 mM MnCI2 0,6 mM 5 U de Taq DNA polimerase (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1146 165) Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer), 30 ciclos: 95°C 1 minuto, 45°C 2 minutos, 72°C 2 minutos - Purificação dos produtos da PCR utilizando o High Pure PCR Product Purification Kit da Roche Diagnostics GmbH (Cat. 1 732 676) de acordo com o protocolo dos fabricantes. - Digestão dos fragmentos da PCR com 25 U de Sphl (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 606 120) em tampão H 1 x (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1 417 991) a 37°C durante a noite; - Adição de 25 U de EcoRI (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 703 737) e digestão adicional durante 3,5 horas - Digestão de 50 pg de pACSGDH com 180 U de Sphl e 180 U de EcoRI em tampão H 1 x durante 4 horas a 37°C. - Eletroforese em gel do pACSGDH digerido e dos fragmentos digeridos utilizando géis de agarose (0,8%) - Extração das moléculas de DNA utilizando QIAquick Gel Ex-traction Kit (Qiagen, Cat. 28706) de acordo com o protocolo do fabricante • Determinação da concentração dos fragmentos e do vetor digerido utilizando um Fotômetro Beckman DU 7400. - Determinação da qualidade dos produtos purificados através de eletroforese em gel de agarose - Ligação de 100 ng de vetor digerido com 140 ng de fragmentos da PCR utilizando 1 U da T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 481 220) em um volume de 20 pL a 16°C durante a noite - Eletroporação de células XL1F eletrocompetentes (Stratagene) com 1 pL da reação de ligação com 2,5 KV em cubetas de 0,2 cm utilizando um Produtor de Pulsos para E. cofi da BioRad (BioRad) - Após o crescimento em 1 mL de LB a 37°C durante uma hora, as bactérias foram plaqueadas em placas de LB com Ágar contendo Ampici-lina (100 pg/mL de Ampicilina) e crescidas durante a noite a 37°C. - 50% destes clones expressando a s-GDH mutada eram ativos utilizando o método de seleção a seguir.

Exemplo 3: Seleção As colônias mutantes em placas de ágar descritas anteriormente foram inoculadas com agulha em placas para microtitulação (mtp) contendo 200 pL de meio LB contendo Ampicilina/cavidade e foram incubadas durante a noite a 37°C. Estas placas são chamadas de placas mãe.

De cada placa mãe, foram transferidos 5 pL de amos-tra/cavidade para uma mtp contendo 5 pL por cavidade de B (B = Reagente para Extração de Proteína Bacteriana; Pierce Ns 78248) para o rompimento celular e foram adicionados 240 pL de pirrolo-quinolina quinona (PQQ) 0,0556 mM; Hepes 50 mM, CaCI2 15 mM pH 7,0/cavidade para ativação da s-GDH. Para completar a formação da holoenzima, a mtp foi incubada a 25°C durante 2 horas e a 10°C durante a noite. Esta placa é chamada de placa de trabalho.

Partindo da placa de trabalho 2 x 10 pL de amostra/orifício foram transferidos para duas mips vazias. Depois disso, uma foi testada com glicose e a outra com maltose ou outras moléculas de açúcar selecionadas como um substrato. Todas as moléculas de açúcar foram utilizadas em concentrações equimolares. A dE/min foi calculada e o valor utilizando a glicose como subs- trato foi ajustado para 100% de atividade. O valor obtido com o outro açúcar foi comparado com o valor da glicose e calculado em atividade percentual ((dE/min de Maltose/dE de Glicose)*100). Isto é equivalente à reatividade cruzada da enzima (mutante).

Exemplo 4: Seqüenciamento do gene s-GDH mutante proveniente da PCR mutagênica O plasmídeo contendo o gene s-GDH mutante que leva à atividade de 50% maltose/glicose foi isolado (High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, N9 1754785) e seqüenciado utilizando um ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit e os seqüenciadores ABI 3/73 e 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).

Foram utilizados os iniciadores a seguir: Filamento mensageiro: GDH F2: 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG- 3' (= SEQ ID N2: 6) GDH F3: 5'-GAT GCT GAT GGG CAG AAT GG-3’ (= SEQ ID N2: 7) GDH F4: 5'-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3’ (= SEQ ID N2: 8) GDH F5: 5‘-ACG ATC CAA CTT GTG GAG AG-3' (= SEQ ID N2: 9) Filamento anti-mensageiro: GDH R1: 5'-CGA TTA AGT TGG GTA ACG CC- 3' (= SEQ ID N2: 10) GDH R2: 5 -ATA CGG AAA ATG ACA CCA CG-3' (= SEQ ID N2: 11) GDH R3: 5'-GGG CCT TGT TC A GAC TGC AA- 3' (= SEQ ID N2: 12) GDH R4: 5'-CAA GAC GAC CTG ACT GAT GG-31 (= SEQ ID N9: 13) GDH R5: 5'-CAT AAC AAC GCG TGC GGC TT-3' (= SEQ ID N2: 14) Resultados: => 6 mutações no nível de seqüência de DNA => 4 mutações no nível de aminoácido: na posição 340 (enzima madura) alteração de E para G

na posição 348 (enzima madura) alteração de T para S

na posição 369 (enzima madura) alteração de N para H

na posição 413 (enzima madura) alteração de S para N

Exemplo 5: Mutantes da s-GDH obtidos através da mutação por saturação O QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Cat. 200518) foi utilizado para substituir os aminoácidos do tipo selvagem sucessivamente em posições definidas da proteína s-GDH ou dos mutantes da s-GDH (purificação de plasmídeos como foi descrito anteriormente) por outros aminoácidos aleatórios.

Os iniciadores a 5'- e a 3'- utilizados para a mutagênese eram complementares um ao outro e continham NNN em uma posição central. Estes nucleotídeos estavam flanqueados por 12 até 16 nucleotídeos em cada extremidade. As seqüências dos nucleotídeos eram idênticas às se-qüências do filamento do cDNA ou às seqüências do filamento complementar ao cDNA flanqueando o códon para o aminoácido que tinha que ser substituído. Ao invés do códon, o iniciador continha NNN, portanto os oligo-nucleotídeos codificam cada códon.

Para cada posição definida, foi realizada uma reação de PCR.

As reações da PCR e as digestões com Dpnl foram realizadas de acordo com o manual.

Depois disso, 1 μΙ_ de cada reação foi utilizado para a eletropo-ração de células XL1F. As células foram cultivadas e a atividade da s-GDH dos clones foi determinada como foi descrito anteriormente.

Para garantir estatisticamente que todas as variações para os 20 aminoácidos tivessem sido selecionadas, foram testados 200 clones para cada posição.

Foram utilizados os iniciadores a seguir: para a posição 340 Filamento mensageiro EGF 5'-TCC AAC TTG TGG ANN N AT GAC CTA CAT TT-3' (= SEQ ID N9: 15) Filamento anti-mensageiro EGR 5'- AAA TGT AGG TCA TNN NTC CAC AAG TTG GA-3' (= SEQ ID N9: 16) para a posição 348 Filamento mensageiro TSF 5'- CAT TTG CTG GCC ANN NGT TGC ACC GTC AT-3‘ (= SEQ ID N9: 17) Filamento anti-mensageiro TSR 5'- ATG ACG GTG CAA CNN NTG GCC AGC AAA TG-3' (= SEQ ID N9: 18) para a posição 369 Filamento mensageiro NHF 5'-TAC TGG TTG GGA ANN NAC ATT ATT GGT TC -3' (= SEQ ID N9: 19) Filamento anti-mensageiro NHR 5'- GAA CCA ATA ATG TNN NTT CCC AAC CAG TA-3' (= SEQ ID N9: 20) para a posição 413 Filamento mensageiro SNF 5-TGA TGT GAT TGC ANN NCC AGA TGG GAA TG -3' (= SEQ ID N9: 21) Filamento anti-mensageiro SNR 5'- CAT TCC CAT CTG GNN NTG CAA TCA CAT CA-3' (= SEQ ID Ne: 22) Resultados: As alterações dos aminoácidos nas posições 340, 369 e 413 não modificaram a especificidade pelo substrato. Somente a vacilação na posição 348 produziu clones com uma especificidade pelo substrato de 25-100% (maltose/glicose). Vários ciclos de PCR mutagênica e de mutagênese por saturação foram realizados. Foi descoberto e confirmado que as posições 348 e 428 são de maior importância e que a troca de outros aminoácidos pode aumentar mais a especificidade pela glicose da s-GDH mutada. Os dados e as posições representativas são fornecidos na tabela 1.

Tabela 1: Exemplos para variações de s-GDH com maior especificidade pela glicose Abreviações: n.t. = não testado SA = atividade específica (U/mg de proteína) com a glicose como substrato Exemplo 6: Purificação do mutante de s-GDH T348G

As células cultivadas (LB-Amp. 37°C) foram coletadas e ressus-pensas em tampão fosfato de potássio pH 7,0. O rompimento celular foi realizado através de passagem na prensa "French Press" (7000 a 9000 kPa (700-900 bar)). Após a centrifugação, o sobrenadante foi aplicado em uma coluna de S-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotec) equilibrada com tampão fosfato de potássio pH 7,0 10 mM. Após lavar, a s-GDH foi eluída utilizando um gradiente de sal de NaCI de 0 - 1 M. As frações exibindo atividade de s-GDH foram agrupadas, submetidas à diálise contra tampão fosfato de potássio pH 7,0 e submetidas novamente à cromatografia em coluna de S-sepharose reequilibrada. As frações ativas foram agrupadas e submetidas a uma filtração em gel utilizando uma coluna de Superdex® 200 (Amersham Pharmacia Biotec). As frações ativas foram agrupadas e armazenadas a -20°C.

Ensaio enzimático e determinação da Proteína da s-GDH T348G mutante e do tipo selvagem A determinação de proteína foi realizada utilizando o Reagente para Ensaio de Proteína nô 23225 da Pierce (curva de calibração com BSA, 30 minutos 37°C).

As amostras de GDH foram diluídas até 1 mg de proteína/mL com pirrolo-quinolina quinona (PQQ) 0,0556 mM; Hepes 50 mM; CaCI2 pH 7,0 15 mM e incubadas a 25°C durante 30 minutos para reconstituição ou ativação.

Após a ativação, 50 μί de amostra foram adicionados a 1000 μΙ_ de uma solução de tampão citrato 0,2 M (pH 5,8; a 25°C) contendo 0,315 mg de (4-(dimetilfosfinilmetil)-2-metil-pirazolo-[1.5a]-imidazol-3-il)-(4-nitrosofenil)-amina/mL (ver a Patente U.S. 5.484.708) como um mediador e 33 mM de açúcar). A extinção a 620 nm é monitorada durante os primeiros 5 minutos a 25°C.

Uma Unidade de atividade enzimática corresponde à conversão de 1 mMol de mediador/minuto sob as condições de ensaio acima. Cálculo: Atividade = (volume total * dE/min [U/mL]) : (ε * volume da amostra * 1) (ε = coeficiente de extinção; neste exemplo c620nm = 30 [1 * mmol'1 * cm'1]). O ensaio foi realizado com glicose, maltose e galactose (Merck, Alemanha).

Resultados: Exemplo 7: Determinação da glicose na presença ou na ausência da malto-se 0 tipo selvagem e o T348G mutante de s-GDH foram aplicados para a determinação da glicose. As amostras de referência continham 65 mg de glicose/dL. A amostra "teste" continha 65 mg de glicose/dL e 130 mg de maltose/dL. As mesmas quantidades de atividade de GDH (U/mL; ver o ensaio enzimático) foram utilizadas para cada ensaio.

Em uma cubeta foram misturados: 1 mL de 0,315 mg de (4-{dimetilfosfinilmetil)-2-metil-pirazolo-[1.5a]-imidazol-3-il)-(4-nitrosofenil)-amina/mL de citrato pH 5,8 0,2 M 0,015 mL de amostra (glicose ou glicose + maltose) O ensaio foi iniciado adicionando 0,050 mL de 90 U/mL de s-GDH. A alteração de absorção a 620 nm foi monitorada. Após 5 minutos foram observados valores constantes e a dE/5 minutos foi calculada. O valor obtido medindo a amostra de referência com a s-GDH do tipo selvagem foi ajustado para 100%. Os outros valores foram comparados com este valor de referência e calculados em %.

Resultados: Pode ser claramente observado que o "valor para glicose" medido é notavelmente menos prejudicado quando a s-GDH mutada é utilizada nesta determinação.

Lista de Referências Anthony C., 1996. Quinoprotein-catalysed reactions. Biochem. J. 320(3):697-711 Anthony C., Ghosh M., 1997. The structure e function of PQQ-containing quinoproteins. Curr. Sei. 72(10):716-727 Anthony, C., Biochem J 320 (1996) 697-711 Anthony, C. e Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727 Anthony, C. e Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21 Anthony, C., Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7 Ausubel, F., et al., em "Current protocols em molcular biology" (1994), Wiiey Verlag Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9 Cleton-Jansen, A. M., et al., J Bacteriol 170 (1988) 2121-5 Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol Gen Genet217 (1989) 430-6 Davidson, V. L. em "Principies e applications of quinoproteins" (1993) o livro todo, New York, Marcei Dekker D'Costa, E. J., et al., Biosensors2 (1986) 71-87 Dokter, P., et al., FEMS Microbiology Letters 43 (1987) 195-200 Dokter, P., et al., Biochem J 239 (1986) 163-7 Dokter, P., et al., Biochem J 254 (1988) 131-8 Duine, J. A. Energy generation e the glucose dehydrogenase pathway em Acinetobacter em "The Biology of Acinetobacteb' (1991) 295-312, New York, Plenum Press Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23 Duine, J. A., et al., Arch Microbiol 131 (1982) 27-31 Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84 Goodwin, P. M. e Anthony, C., Adv Microb Physiol 40 (1998) 1-80 Hill, D. E., et al., Methods Enzymol 155 (1987) 558-68 Igarashi, S., et al., Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820-4 Kaufmann, N., et al. Development e evaluation of a new system for de-termining glucose from fresh capillary blood e heparinised venous blood em "Glucotrend" (1997) 1-16, Mannheim, Boehringer Mannheim GmbH

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Claims (7)

1. Mutante de glicose desidrogenase solúvel (s-GDH) dependente de pirroloquinolina quinona (PQQ), caracterizada pelo fato de que consiste em SEQ ID NO:24 compreendendo uma substituição na posição de aminoácido 348 e, opcionalmente compreendendo uma ou mais substituições adicionais em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 16, 22, 76, 87, 116, 120, 122, 124, 127, 143, 146, 169, 171, 177, 227, 230, 245, 246, 255, 277, 295, 298, 299, 308, 317, 341, 349, 355, 386, 422, 428, 436 e 438.

2. Mutante de s-GDH de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as substituições de aminoácidos adicionais são nas posições 87, 122, 124, 146, 169, 171, 245, 246, 298, 341, 348, 386 e 436.

3. Mutante de s-GDH de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição 428.

4. Mutante de s-GDH de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as referidas substituições adicionais são D87R, N122K, S124K, S146G, L169F, Y171G, E245D, Q246H, V298L, M341V, T348S, L386F, N428P e V436P.

5. Processo para detecção, determinação ou medição da glicose em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a amostra com um mutante de s-GDH como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita detecção, determinação ou medição da glicose é realizada utilizando um sensor ou um dispositivo com tiras de teste.

7. Dispositivo para detecção ou medição da glicose em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende um mutante da s-GDH, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e outros reagentes necessários à dita medida.