KR20020010624A

KR20020010624A - 글루코스 탈수소효소

Info

Publication number: KR20020010624A
Application number: KR1020017013906A
Authority: KR
Inventors: 고지 소데
Original assignee: 고지 소데
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-05-01
Publication date: 2002-02-04
Also published as: WO2000066744A1; CA2372741A1; EP1176202A4; US20060019328A1; EP1176202A1; DE60029775D1; CN100410379C; CN1353759A; IL146137A0; DE60029775T2; US7049114B1; EP1176202B1; TWI224136B

Abstract

피롤로-퀴놀린 퀴논을 그의 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소에 있어서, 특정 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기(들)로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소. 본 발명의 개변형의 수용성 PQQGDH는 향상된 글루코스 친화성을 가진다.

Description

글루코스 탈수소효소{GLUCOSE DEHYDROGENASE}

혈중 글루코스는 당뇨병의 중요한 마커이다. 미생물을 이용한 발효 생산에 있어서, 공정을 모니터링하기 위하여 글루코스 수준을 분석한다. 종래의 글루코스 분석은 글루코스 옥시다제 (GOD) 또는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PDH)를 이용한 효소적 방법을 기초로 하였다. 그러나, GOD를 기초로 하는 분석법은 글루코스 산화 반응에 의해 발생하는 과산화수소를 정량하기 위하여 카탈라제 또는 퍼옥시다제를 분석 시스템에 첨가할 필요가 있었다. G6PDH는 분광학적 글루코스 분석법에 사용되어 왔는데, 상기의 경우 반응 시스템에 조효소 NAD(P)를 첨가하여야 하였다.

따라서, 본 발명은 향상된 글루코스 친화성을 갖는 개변형 수용성 PQQGDH를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 다른 목적은 혈중 글루코스 수준을 측정하기 위한 감수성을 증가시키기 위하여 글루코스에 대하여 높은 선택성을 가지는 개변형 수용성 PQQGDH를 제공하는 것이다.

본 발명은 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소 (PQQGDH)의 제조 및 글루코스 분석에서의 그의 용도에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용되는 플라스미드 pGB2의 구조를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 개변형 효소를 코딩하는 돌연변이 유전자의 작성 방법을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 개변형 PQQGDH를 사용한 글루코스 분석을 나타낸다.

본 발명의 가장 바람직한 실시 형태

개변형 PQQGDH의 구조

본 출원인은 수용성 PQQGDH를 코딩하는 유전자의 코딩 영역 내로 에러가 쉽게 일어나는 (error prone) PCR로 랜덤 돌연변이를 도입하여 아미노산 변이를 보유하는 수용성 PQQGDH의 라이브러리를 작제하였다. 상기 유전자로 E. 콜라이 (E. coli)를 형질전환시키고, 글루코스에 대한 PQQGDH의 활성에 대하여 스크리닝하여, 야생형 효소와 비교하여, 저-수준 글루코스에 대하여 향상된 반응성을 가지며 20mM 글루코스 및 100 mM 글루코스에 대하여 필적할만한 활성을 가지는 PQQGDH를 발현하는 다수의 클론을 수득하였다.

상기 클론 중 하나의 뉴클레오티드의 서열을 분석해 본 결과, Glu 277 이 Gly로 변이되었음이 나타났다. 상기 아미노산 잔기를 다양한 다른 아미노산 잔기로 치환할 경우, 모든 경우에 있어서 야생형 수용성 PQQGDH의 글루코스에 대한 친화성과 비교하여 글루코스 친화성이 향상된 탁월한 돌연변이 효소가 수득되었다.

이어서, 부위-특이적 돌연변이를 277번째 잔기 부근의 다른 잔기 내로 도입하여 글루코스에 대한 친화성을 측정하였다. 잔기 268-289에 의해 정의되는 영역 중 Ile278Phe 및 Asn279His를 보유하는 개변형 효소를 제조하여 활성을 분석하였더니 상기 개변형 효소가 글루코스에 대한 고 친화성을 가진다는 것이 나타났다.

상기와 같이 수득한 다수의 클론에 있어서, 야생형 PQQGDH의 활성과 비교하여 20 mM 글루코스에 대해서는 필적할만한 활성을 가지지만 20 mM 락토스에 대해서는 더 낮은 활성을 가지는 PQQGDH를 발현하는 클론을 추가로 스크리닝하였다.

상기 클론 중 하나의 뉴클레오티드 서열을 분석해 본 결과, Asn 452가 Asp로 변이되었음이 나타났다. 상기 잔기를 트레오닌, 리신, 이소류신, 히스티딘 또는 아스파테이트로 치환할 경우, 모든 경우에 있어서 야생형 수용성 PQQGDH의 글루코스에 대한 선택성과 비교하여 글루코스 선택성이 향상된 탁월한 돌연변이 효소가 수득되었다. 동일한 방식으로 452번째 잔기 부근의 다른 잔기 내로도 돌연변이를 도입하였다. Lys455Ile, Asp456Asn, Asp457Asn, Asn462Asp, Asp448Asn을 보유하는 돌연변이 효소를 작제하였다. 그 결과, 모든 돌연변이 효소는, 표 4에 나타낸 바와 같이, 글루코스에 대한 선택성이 향상되었음을 알 수 있었다.

본 발명의 바람직한 PQQ 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH의 잔기 448-468에 해당하는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 본 발명의 바람직한 개변형 PQQGDH에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 아스파라긴 462, 리신 452, 아스파테이트 456, 아스파테이트 457 또는 아스파테이트 448에 해당하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명의 개변형 PQQGDH는 하기 서열을 포함한다:

Xaa8 Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Val Thr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly

[여기서, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 및 Xaa8 은 임의의 천연 아미노산을 나타내되, 단 Xaa1 이 Asn 을 나타내고, Xaa2 가 Lys 을 나타내고, Xaa3 이 Asp 를 나타내고, Xaa4 가 Asp 를 나타내고, Xaa5 가 Asn 을 나타낼 경우, Xaa8 은 Asp 를 나타내지 않는다].

본 발명의 다른 바람직한 PQQ 글루코스 탈수소효소에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산 서열의 잔기 268-289 에 해당하는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 본 발명의 특히 바람직한 개변형 PQQGDH에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산 서열에 있어서, 글루타메이트 277이 알라닌, 아스파라긴, 리신, 아스파테이트, 히스티딘, 글루타민, 발린 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되어 있거나, 이소류신 278이 페닐알라닌으로 치환되어 있다.

Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp

[여기서, Xaa6 및 Xaa7 은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa6 이 Glu 를 나타낼 경우, Xaa7 은 Ile 를 나타내지 않는다]

본 발명의 개변형 글루코스 탈수소효소에 있어서, 글루코스 탈수소효소 활성을 유지하기만 한다면, 다른 아미노산 잔기가 부분적으로 결실되거나 치환될 수 있거나, 다른 아미노산 잔기가 부가될 수 있다.

또한, 당 업계의 숙련자는, 글루코스 친화성이 향상된 개변형 글루코스 탈수소효소를 수득하기 위하여, 본원의 교시에 따라 다른 박테리아로부터 유래된 수용성 PQQGDH 중 아미노산을 치환할 수 있다. 특히, 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH 중 글루타메이트 277, 이소류신 278, 아스파라긴 462, 리신 452, 아스파테이트 455, 아스파테이트 456, 아스파테이트 457 및 아스파테이트 448 에 해당하는 아미노산 잔기는, 배열 상태의 단백질의 일차 구조를 비교하거나, 효소의 일차 구조로부터 예상되는 이차 구조를 비교함으로써 용이하게 동정될 수 있다. 기질 친화성이 향상된 개변형 글루코스 탈수소효소는 본 발명에 따른 이러한 아미노산 잔기의 치환에 의해 수득될 수 있다. 이러한 개변형 글루코스 탈수소효소도 본 발명의 범위 이내에 있다.

개변형 PQQGDH의 제조 방법

아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 야생형 수용성 PQQGDH 를 코딩하는 유전자의 서열은 서열번호 2 에 정의된다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 를 코딩하는 유전자는, 야생형 수용성 PQQGDH를 코딩하는 유전자 중 특정 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 치환할 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환함으로써 작제할 수 있다. 이와 같은 다양한 부위-특이적 뉴클레오티드 서열 치환 기술은, 예를 들어 문헌 [Sambrook 등, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 미국 뉴욕 소재] 에 기재된 바와 같이 당 분야에 공지되어 있다.

이와 같이 수득한 변이 유전자를 유전자 발현 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 에 삽입하여 적당한 숙주 (예를 들어, E. 콜라이) 내로 형질전환시킨다. 다수의 외래 단백질 발현용 벡터/숙주 시스템이 공지되어 있고, 박테리아, 효모 또는 배양 세포와 같은 다양한 숙주가 적합하다.

에러가 쉽게 일어나는 PCR 에 의해 랜덤 돌연변이를 표적 영역 내로 도입하여 표적 영역에 변이를 수반하는 개변형 수용성 PQQGDH 의 유전자 라이브러리를 작제한다. 이러한 유전자로 E. 콜라이를 형질전환시켜, 각 클론에서 PQQGDH 의 글루코스에 대한 친화성을 스크리닝한다. 수용성 PQQGDH 를 E. 콜라이에서 발현시킬 경우 페리플라즘 (periplasm) 공간 내로 분비되므로, E. 콜라이 세포를 이용하여 효소 활성을 용이하게 분석할 수 있다. 상기 라이브러리를 20 mM의 글루코스의 존재 하에 PMS-DCIP 염료와 배합하여, PQQGDH 활성을 시각적으로 측정하여, 100 mM 글루코스에 있어서의 활성과 필적할만한 활성을 나타내는 클론을 선발하고, 뉴클레오티드 서열을 분석하여 돌연변이를 확인한다.

글루코스 선택성이 향상된 개변형 PQQGDH를 수득하기 위하여, 상기 라이브러리를 PMS-DCIP 염료와 배합하여 PQQGDH 활성을 시각적으로 측정하여, 야생형 PQQGDH의 활성과 필적할만한 20 mM 글루코스에 있어서의 활성을 나타내지만 20 mM 락토스에 있어서의 활성은 야생형 PQQGDH의 활성보다 낮은 클론을 선발하고, 뉴클레오티드 서열을 분석하여 돌연변이를 확인하였다.

상기와 같이 수득한 개변형 PQQGDH 발현 형질전환 세포를 배양하고, 원심분리 등의 수단으로 배양 배지로부터 회수한 후, 프렌치 프레스로 파열시키거나 삼투압적 쇼크를 주어 페리플라즘 효소를 배지 내로 분비시킨다. 효소를 초원심분리하여 수용성 PQQGDH-함유 분획을 얻을 수 있다. 이와는 달리, 적당한 숙주/벡터 시스템을 이용하여 발현 PQQGDH 를 배지 내로 분비시킬 수 있다. 생성된 수용성 분획을 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, HPLC 등에 의해 정제하여, 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 제조한다.

효소 활성의 분석 방법

본 발명의 PQQGDH 는, 글루코스를 산화시켜 글루코노락톤을 생성하는 반응을 촉매하는 조효소로서 PQQ 와 결부되어 있다.

효소 활성은 산화환원(redox) 염료의 발색 반응을 이용하여, PQQGDH-촉매 글루코스 산화로 환원된 PQQ 의 양을 측정하여 분석할 수 있다. 적당한 발색 시약으로는, 예를 들어, PMS (페나진 메토술페이트)-DCIP (2,6-디클로로페놀린도페놀), 포타슘 페리시아나이드 및 페로센을 들 수 있다.

글루코스 친화성

본 발명의 개변형 PQQGDH 의 글루코스 친화성은, 야생형의 친화성과 비교하여 매우 향상되어 있다. 따라서, 개변형 PQQGDH는 야생형 PQQGDH의 글루코스에 대한 Km 값보다 매우 낮은 글루코스에 대한 Km 값을 가진다. 개변형 PQQGDH 중에서, Glu277Lys 변이체는 8.8 mM의 글루코스에 대한 Km 값, 및 야생형 효소의 최대 활성과 필적할만한 최대 활성을 가져, 저 수준에서 글루코스에 대하여 향상된 반응성을 가진다.

따라서, 본 발명의 개변형 효소로 제작한 분석 키트 또는 효소 센서는, 글루코스 분석에 있어서의 고 민감성으로 인하여 저 수준의 글루코스를 검출할 수 있는 탁월한 잇점을 가진다.

선택성의 평가 방법

본 발명의 PQQGDH의 글루코스에 대한 선택성은, 기질로서 2-데옥시-D-글루코스, 만노스, 알로스, 3-o-메틸-D-글루코스, 갈락토스, 자일로스, 락토스 및 말토스와 같은 다양한 당을 사용하여, 상기한 바와 같이 효소 활성을 측정하고, 글루코스에 대한 활성에 대한 상대적 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

글루코스 분석 키트

본 발명은 또한 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 함유하는 글루코스 분석 키트에 관한 것이다. 본 발명의 글루코스 분석 키트는 분석을 1 회 이상 수행하기에 충분한 양의 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 포함한다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 에 덧붙여, 일반적으로 키트는 분석에 필요한 완충제, 매개체, 보정 곡선을 만들기 위한 표준 글루코스 용액 및 지시사항을 포함한다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 는 동결건조 시약 또는 적당한 방부 용액 중의 용액과 같은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 는, 아포 효소로 제공되어 사용 전에 홀로효소로 전환될 수도 있지만, 바람직하게는 홀로효소의 형태로 제공된다.

글루코스 센서

본 발명은 또한 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 이용한 글루코스 센서에 관한 것이다. 적당한 전극은, 본 발명의 효소를, 가교결합제를 이용하거나; 중합체 매트릭스에 봉입되거나; 투석막으로 코팅되거나; 광-가교결합성 중합체, 유전성 중합체 또는 산화환원 중합체를 이용하거나; 효소를 중합체 중에 고정시키거나, 페로센 또는 그의 유도체를 포함한 전자 매개체로 전극상에 흡착시키거나; 또는 이들의 임의 조합으로 고정화시킨 탄소, 금, 백금 등의 전극을 포함한다. 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 아포효소로서 고정화시켜 PQQ 를 개별적인 층 또는 용액 중의 형태로 제공할 수 있으나, 바람직하게는 전극 상의 홀로효소의 형태로 고정화시킨다. 일반적으로, 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 글루타르알데히드로 탄소 전극 상에 고정화시키고, 이어서 아민 함유 시약으로 처리하여 글루타르알데히드를 차단시킨다.

글루코스 농도는 하기와 같이 측정할 수 있다. PQQ, CaCl₂및 매개체를 완충제를 함유하는 항온 셀에 첨가하고 일정 온도에서 유지하였다. 적당한 매개체는, 예를 들어, 포타슘 페리시아나이드 및 페나진 메토술페이트를 포함한다. 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 고정화시킨 전극을 대극 (예로, 백금 전극) 및 참조 전극 (예로, Ag/AgCl 전극) 과 함께 작용 전극으로 사용하였다. 일정한 전압을 탄소 전극에 인가하여 정상 (steady) 전류에 도달한 후, 글루코스 함유 시료를 첨가하여 전류의 증가를 측정하였다. 시료 중 글루코스 농도는 표준 농도의 글루코스 용액으로 만들어진 보정 곡선으로부터 계산할 수 있다.

본원에 언급된 모든 특허 및 명세서의 개시내용은 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 특허 출원은 그 개시 전체가 본원에 참고문헌으로 포함되는 일본 특허 출원 1999-124285 및 2000-9137 를 우선권으로 한다.

하기 실시예로 본 발명을 보다 구체적으로 예시할 것이지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원인은 효소적 글루코스 분석법에 사용되어 왔던 효소 대신 신규한 효소로서 글루코스에 대한 친화성이 높은 PQQGDH가 유용하다는 것을 알아내었다.

PQQGDH는 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 가지는 글루코스 탈수소효소로서, 글루코스를 산화시켜 글루코노락톤을 생성시키는 반응을 촉매한다.

PQQGDH로는 막결합형 효소 및 수용성 효소를 포함하는 것으로 알려져 있다. 막결합형 PQQGDH는 분자량이 약 87 kDa인 단일 펩티드 단백질이며 다양한 그램 음성 박테리아에서 광범위하게 발견된다. 예를 들어 AM. Cleton-Jansen 등의 문헌 [J. Bacteriol. (1990) 172, 6308-6315] 참조. 한편, 수용성 PQQGDH는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus)의 여러 균주에서 동정되었으며 (Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59(8), 1548-1555), 그의 구조 유전자가 클로닝되어 아미노산 서열이 밝혀졌다 (Mol. Gen. Genet. (1989), 217: 430-436). A. 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH는 분자량이 약 50 kDa인 호모이량체이다. 상기 PQQGDH는 일차 단백질 구조에 있어서 다른 PQQ 효소와 상동성 (homology)을 거의 가지지 않는다.

최근, 활성 중앙을 포함하여 상기 효소의 고차원 구조를 보여주는 상기 효소의 X-선 결정 구조 분석의 결과가 보고되었다 (J. Mol. Biol., 289, 319-333 (1999), The crystal structure of the apo form of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus reveals a novel internal conserved sequence repeat; A. Oubrie 등, The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999), Structure and mechanism of soluble quinoprotein glucosedehydrogenase, A. Oubrie 등, PNAS, 96(21), 11787-11791 (1999), Active-site structure of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with methylhydrazine; A covalent cofactor-inhibitor complex, A. Oubrie 등). 상기 논문에 의하면, 수용성 PQQGDH는 6개의 W-모티프로 구성된 β-프로펠러 단백질이다.

본 출원인은, 종래의 수용성 PQQGDH를 개량하여 글루코스에 대한 친화성을 증가시킴으로써 임상 시험 또는 식품 분석에 응용할 수 있는 개변형 PQQGDH를 개발하기 위하여 예의연구를 수행한 결과, 수용성 PQQGDH의 특정 영역에 아미노산 변이를 도입함으로써 글루코스에 대하여 고 친화성을 가지는 효소를 수득하는 데 성공하였다.

따라서, 본 발명은 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 천연 수용성 글루코스 탈수소효소 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있으며, 천연 수용성 글루코스 탈수소효소와 비교하여 글루코스에 대한 친화성이 향상된 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소를 제공한다. 본 발명의 개변형 PQQGDH의 글루코스에 대한 Km 값은 천연 글루코스 탈수소효소의 Km 값보다 작으며, 바람직하게는 20 mM 미만, 더 바람직하게는 10 mM 미만이다.

바람직하게는, 본 발명의 개변형 글루코스 탈수소효소는, 다른 당에 대한 그의 친화성이 불변하거나 감소된다 해도 글루코스에 대해서는 친화성이 증가하여, 글루코스에 대하여, 천연 수용성 글루코스 탈수소효소보다 더 큰 선택성을 가진다.특히, 락토스 또는 말토스에 대한 반응성은 글루코스에 대한 반응성과는 반대로 야생형의 반응성보다 감소한다. 글루코스에 대한 반응성을 100%로 가정하면, 락토스 또는 말토스에 대한 활성은 바람직하게는 60% 이하, 더 바람직하게는 50% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 40% 이하이다.

본 발명의 PQQ 글루코스 탈수소효소의 실시 형태에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH의 잔기 268-289 또는 448-468에 해당하는 영역 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 즉, 천연 PQQ 글루코스 탈수소효소 중 관련 아미노산 잔기와는 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 본원에서 아미노산 넘버링은 개시 메티오닌을 +1 위치로 하여 출발한다.

본원에서 아미노산 잔기 또는 영역과 관련하여 사용되는 "(~에) 해당한다"라는 용어는, 몇몇 아미노산 잔기 또는 영역이, 구조적으로는 유사하지만 별개인 2종 이상의 단백질에 있어서 동등한 기능을 가진다는 것을 의미한다. 예를 들어 아시네토박터 칼코아세티쿠스와는 다른 유기체로부터 유래된 수용성 PQQGDH의 임의의 영역은, 상기 영역이 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH의 잔기 268-289에 의해 정의되는 영역에 대하여 아미노산 서열에 있어서 큰 유사성을 가지고, 상기 영역이 단백질의 2차 구조로부터 상기 단백질에서 동일한 기능을 가질 것으로 합리적으로 생각될 경우, "아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH의 잔기 268-289에 의해 정의되는 영역에 해당한다"라고 한다. 또한, 상기 영역 중 10번째 아미노산 잔기는 "아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH 중 277번째 잔기에 해당한다"라고 한다.

본 발명의 바람직한 개변형 PQQGDH에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산 서열 중 글루타메이트 277, 이소류신 278, 아스파라긴 462, 아스파라긴 452, 리신 455, 아스파테이트 456, 아스파테이트 457 또는 아스파테이트 448에 해당하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있다.

더 본 발명의 바람직한 개변형 PQQGDH에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서, 글루타메이트 277이 알라닌, 아스파라긴, 리신, 아스파테이트, 히스티딘, 글루타민, 발린 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있거나, 이소류신 278이 페닐알라닌으로 치환되어 있다.

[여기서, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 및 Xaa8은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단 Xaa1 이 Asn 을 나타내고, Xaa2 가 Lys 을 나타내고, Xaa3 이 Asp 를 나타내고, Xaa4 가 Asp 를 나타내고, Xaa5 가 Asn 을 나타낼 경우, Xaa8 은 Asp 를 나타내지 않는다].

다른 측면에 있어서, 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 하기 서열을 포함한다:

[여기서, Xaa6 및 Xaa7 은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa6이 Glu 를 나타낼 경우, Xaa7 은 Ile 를 나타내지 않는다].

또한 본 발명은 상기한 개변형 글루코스 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 유전자를 포함하는 형질전환체와, 본 발명의 개변형 글루코스 탈수소효소를 포함하는 글루코스 분석 키트 및 글루코스 센서를 제공한다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 효소 단백질은 글루코스에 대한 고 친화성 및 글루코스에 대한 고 산화 활성을 가져, 고도로 민감하고 고도로 선택적인 글루코스 분석에 적용될 수 있다.

실시예 1

변이 PQQGDH 유전자 라이브러리의 구축 및 스크리닝:

아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 PQQGDH 를 코딩하는 구조 유전자를 벡터 pTrc99A (Pharmacia) 의 다중클로닝 부위내로 삽입하여 플라스미드 pGB2 를 수득하였다 (도 1). 상기 플라스미드를 주형으로 사용하여 에러가 생기기 쉬운 PCR 로 다양한 영역 내로 랜덤 돌연변이를 도입하였다. PCR 반응은 94℃ 3 분; 94℃ 3 분, 50℃ 2 분 및 72℃ 2 분으로 30 사이클; 마지막으로 72℃ 10 분의 조건 하에서, 표 1 에 나타낸 조성을 갖는 용액 중에서 실시하였다.

TaqDNA 폴리머라아제 (5U/㎕)	0.5 ㎕
주형 DNA	1.0 ㎕
전방향 프라이머 ABF	4.0 ㎕
역방향 프라이머 ABR	4.0 ㎕
10 x Taq 폴리머라제 완충제	10.0 ㎕
1M β-머캅토에탄올	1.0 ㎕
DMSO	10.0 ㎕
5 mM MnCl₂	10.0 ㎕
10 mM dGTP	2.0 ㎕
2 mM dATP	2.0 ㎕
10 mM dCTP	2.0 ㎕
10 mM dTTP	2.0 ㎕
H₂O	51.5 ㎕
	100.0 ㎕

생성된 돌연변이 수용성 PQQGDH 라이브러리로 E. 콜라이를 형질전환시키고, 형성된 각 콜로니를 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 10 mM 글루코스 및 PMS-DCIP를 포함하는 제1 플레이트 및 100 mM 글루코스 및 PMS-CDIP를 포함하는 제2 플레이트 상에 콜로니를 추가로 복제(replica)-도말하고, 둘 모두에 있어서 PQQGDH 활성을 시각적으로 평가하였다. 둘 모두의 플레이트에 있어서 필적할만한 PQQGDH 활성을 나타내는 다수의 클론을 수득하였다.

상기 클론 중 하나를 랜덤하게 선발하여 뉴클레오티드 서열을 분석하였더니, 글루타메이트 277이 글리신으로 치환되었음이 나타났다.

실시예 2

실시예 1에서 수득한 각각의 콜로니를 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 20 mM 글루코스 및 PMS-DCIP를 포함하는 제1 플레이트 및 20 mM 락토스 및 PMS-CDIP를 포함하는 제2 플레이트 상에 콜로니를 복제-도말하고, 둘 모두에 있어서PQQGDH 활성을 시각적으로 평가하였다. 둘 모두의 플레이트에 있어서 글루코스 보다 락토스에 대한 활성이 매우 낮은 다수의 클론을 수득하였다.

상기 클론 중 하나를 랜덤하게 선발하여 뉴클레오티드 서열을 분석하였더니, 아스파라긴 452가 아스파테이트로 치환되었음이 나타났다.

실시예 3

개변형 PQQGDH 유전자의 구축:

서열번호 2 에 나타낸 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래 PQQGDH 의 구조 유전자를 기초로 하여, 플라스미드 pGB2 를 이용하여 도 2 에 나타낸 바와 같이 표준 방법에 따른 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 글루타메이트 277 또는 이소류신 278을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 주어진 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환하였다. 표 2 는 돌연변이 유발에 사용한 합성 올리고뉴클레오티드 표적 프라이머의 서열을 나타낸다. 표 2에 있어서, 예를 들어 "E277A"는 글루타메이트 277이 아스파테이트로 치환됨을 의미한다.

아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 PQQGDH 를 코딩하는 유전자의 일부를 포함하는 KpnI-HindIII 단편을 벡터 플라스미드 pKF18k (Takara Shuzo Co., Ltd.) 내로 통합시켜 주형으로 사용하였다. 상기 주형 50 fmol, Mutan^TM-Express Km Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) 에 들어있는 선별 프라이머 5 pmol 및 인산화된 표적 프라이머 50 pmol 을 키트에 들어있는 총 부피의 1/10 과 동일한 양 (20 ㎕) 의 어닐링 완충제와 혼합하고, 혼합물을 100℃ 에서 3 분 동안 가열하여 플라스미드를 단일 가닥으로 변성시켰다. 선별 프라이머는 pKF18k 의 카나마이신 내성 유전자 상의 이중 앰버 (amber) 돌연변이를 역전시키는 작용을 한다. 혼합물을 얼음 상에 5 분간 놔두어 프라이머를 어닐링시켰다. 상기 혼합물에 키트에 들어있는 연장 완충제 3 ㎕, T4 DNA 리가아제 1 ㎕, T4 DNA 폴리머라제 1 ㎕ 및 살균수 5 ㎕ 을 첨가하여 상보성 가닥을 합성하였다.

합성 가닥으로 DNA 미스매치 보수 (repair)-결핍주 E. 콜라이 BMH71-18mutS 를 형질전환시키고 밤새 진탕배양하여 플라스미드를 증폭시켰다.

이어서, 플라스미드 카피 (copy)를 배양물에서 추출하여 E. 콜라이 MV1184 를 형질전환시킨 후, 콜로니에서 추출하였다. 이러한 플라스미드를 서열분석하여, 목적한 돌연변이의 도입을 확인하였다. 이러한 단편들로 플라스미드 pGB2A 상의 야생형 PQQGDH 를 코딩하는 유전자의 KpnI-HindIII 단편을 치환하여 개변형 PQQGDH 의 유전자를 구축하였다.

동일한 방식으로 하기 서열: 5'-C ATC TTT TTG GAC ATG TCC GGC AGT AT-3' 의 올리고뉴클레오티드 표적 프라이머를 합성하여 아스파라긴 452를 히스티딘으로 치환하였다. 플라스미드 pGB2를 사용하여 도 2에 나타낸 방법으로 부위-특이적 돌연변이 유발을 수행하였다. 돌연변이 Asp448Asn, Asn452Asp, Asn452His, Asn452Lys, Asn452Thr, Asn452Ile, Lys455Ile, Asp456Asn, Asp457Asn 및 Asn462Asp 를 보유하는 개변형 PQQGDH 유전자도 또한 구축하였다.

실시예 4

개변형 효소의 제조:

야생형 또는 각각의 개변형 PQQGDH 를 코딩하는 유전자를 E. 콜라이 발현 벡터 pTrc99A (Pharmacia) 의 다중클로닝 부위 내로 삽입하고, 생성 플라스미드로 E. 콜라이 주 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환체를 사카구치 (Sakaguchi) 플라스크 내 L 배지 (암피실린 50 ㎍/ml 함유) 450 ml 중에서 37℃ 에서 밤새 진탕배양하고,1 mM CaCl₂및 500 μM PQQ 를 함유하는 L 배지 7 ℓ에 접종하였다. 배양 개시 약 3 시간 후, 이소프로필 티오갈락토시드를 최종 농도 0.3 mM 로 첨가하고, 배양을 1.5 시간 더 지속하였다. 배양 세포를 원심분리 (5,000 x g, 10 분, 4℃) 에 의해 배지로부터 회수하고, 0.85% NaCl 용액으로 2회 세척하였다. 수집한 세포를 프렌치 프레스로 파열시키고, 원심분리 (10,000 x g, 15 분, 4℃) 하여 파열되지 않은 세포를 제거하였다. 상청액을 초원심분리 (160,500 x g (40,000 r.p.m.), 90 분, 4℃) 하여 수용성 분획을 얻고, 이를 조 (crude) 효소시료로 하여 후속 실시예에서 사용하였다.

이렇게 수득한 수용성 분획을, 추가로 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 에 대해 밤새 투석하였다. 투석된 시료를 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 로 평형화시킨 양이온 크로마토그래피 칼럼 TSKgel CM-TOYOPEARL 650M (Tosoh Corp.) 상에 흡착시켰다. 상기 칼럼을 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 750 ml 로 세척한 후, 5 ml/분의 유속으로 0-0.2 M NaCl 함유 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 로 효소를 용출시켰다. GDH 활성을 갖는 분획을 수집하여, 10 mM MOPS-NaOH 완충제 (pH 7.0) 에 대해 밤새 투석하였다. 이렇게 해서, 전기영동상으로 균질한 개변형 PQQGDH 단백질을 수득하였다. 이를 하기 실시예에서 정제된 효소 시료로 사용하였다.

실시예 5

효소 활성의 분석:

10 mM MOPS-NaOH 완충제 (pH 7.0) 중 PMS (페나진 메토술페이트)-DCIP (2,6-디클로로페놀린도페놀) 을 이용하여, 분광계로 600 nm 에서 DCIP 의 흡광도 변화를 모니터링하고, 효소의 반응 속도를 흡광도의 감소율로 표현하여 효소 활성을 분석하였다. 1 분 당 DCIP 1 μmol 을 환원시키는 효소 활성이 1 U 이었다. pH 7.0 에서 DCIP 의 몰 흡광 계수는 16.3 mM^-1이었다.

실시예 6

글루코스에 대한 조 효소시료의 친화성 평가:

실시예 4 에서 수득한 개변형 PQQGDH 및 야생형의 조 효소시료 각각을 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 홀로효소로 전환시켰다. 187 ㎕ 분취량을, 3 ㎕의 활성화 시약 (48 ㎕의 6 mM DCIP, 8 ㎕의 600 mM PMS 및 16 ㎕의 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)로부터 제조함) 및 다양한 농도의 D-글루코스 용액 10 ㎕와 배합하고, 실시예 5에 나타낸 방법으로 실온에서 효소의 활성을 분석하였다. Km은 기질 농도 대 효소 활성을 플로팅함으로써 결정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

현재까지 보고된 글루코스에 대한 야생형 PQQGDH의 Km 값은 약 25 mM 이었다. 반대로, 글루타메이트 277 및 Ile278Phe 에서 돌연변이를 보유하는 본 발명에서 구축된 모든 효소의 글루코스에 대한 Km 값은 10 mM 미만이었다. 이러한 결과는, 본 발명의 개변형 PQQGDH 가 글루코스에 대하여 고 친화성을 가진다는 것을 나타낸다.

실시예 7

정제된 효소 시료의 글루코스 친화성 평가:

실시예 4 에서 수득한 개변형 효소 Glu277Lys 및 야생형 효소의 정제 시료 각각을, 실시예 6과 동일한 방식으로 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 홀로효소로 전환시켰다. 187 ㎕ 분취량을, 3 ㎕의 활성화 시약 (48 ㎕의 6 mM DCIP, 8 ㎕의 600 mM PMS 및 16 ㎕의 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)로부터 제조함) 및 다양한 농도의 D-글루코스 용액 10 ㎕와 배합하고, 실시예 5에 나타낸 방법으로 실온에서 효소의 활성을 분석하였다. Km 및 Vmax는 기질 농도 대 효소 활성을 플로팅함으로써 결정하였다. Glu277Lys 변이체의 글루코스에 대한 Km 값은 약 8.8 mM 이었고, 그의 Vmax 값은 3668 U/mg 이었다. 현재까지 보고된 야생형 PQQGDH 의 글루코스에 대한 Km 값은 약 25 mM 이었으며, 그의 Vmax 값은 측정 조건에 따라 2500-7000 U/mg 이었다. 상기 결과는, 개변형 PQQGDH Glu277Lys 이, 야생형 PQQGDH의 활성에 필적할만한 고 활성 및 글루코스에 대한 현저하게 향상된 친화성을 가지는 효소라는 것을 나타낸다.

실시예 8

기질 특이성의 평가:

다양한 개변형 효소의 조 시료에 있어서 기질 특이성을 시험하였다. 야생형 및 다양한 개변형 PQQGDH의 조 시료 각각을, 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 홀로효소로 전환시켰다. 187 ㎕ 분취량을, 3 ㎕의 활성화 시약 (6 mM DCIP, 600 mM PMS 및 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)를 포함함) 및 기질과 배합하였다. 시험한 기질은, 최종 농도 20 mM의 400 mM의 글루코스, 락토스및 말토스였으며, 각각의 시료를 실온에서 30분 동안 10 ㎕의 각각의 기질과 함께 인큐베이션하고, 실시예 5와 동일한 방식으로 효소 활성을 분석하여, 글루코스에 대한 활성의 퍼센트로서 표현한 상대적 활성을 측정하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모든 개변형 효소는 야생형 효소의 글루코스 선택성보다 더 큰 글루코스 선택성을 나타내었다.

실시예 9

글루코스 분석:

개변형 PQQGDH 를 글루코스의 분석에 사용하였다. 개변형 효소 Glu277Lys 및 Asn452Thr 각각을 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 홀로효소로 전환시키고, 다양한 농도의 글루코스, 및 5 μM PQQ 및 10 mM CaCl₂의 존재 하에서, 600 nm 에서의 DCIP 의 흡광도 변화를 기초로 하여 실시예 5 에 기재된 방법에 의해 효소 활성을 분석하였다. 도 3 에 나타낸 바와 같이, 개변형 PQQGDH Asn452Thr은 0.1 mM - 20 mM 범위의 글루코스 분석에 사용할 수 있었다. 개변형 PQQGDH Glu277Lys 를 사용하여서도 유사한 결과를 수득하였다.

실시예 10

효소 센서의 제조 및 평가:

각각의 개변형 효소 Glu277Lys 및 Asn452Thr 5 유닛을 카본 페이스트 20 mg 과 함께 동결건조하였다. 완전 혼합 후, 카본 페이스트 약 40 mg 을 예비충진하고, 필터 페이퍼 상에서 광택을 낸 카본 페이스트 전극의 표면 상에만 혼합물을 적용하였다. 상기 전극을, 1% 글루타르알데히드를 함유하는 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 실온에서 30 분 동안, 이어서 20 mM 리신을 함유하는 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 실온에서 20 분 동안 처리하여 글루타르알데히드를 차단시켰다. 전극을 실온에서 1 시간 이상 동안 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 평형화시킨 후, 4℃ 에서 보관하였다.

이와 같이 제조한 효소 센서를 사용하여 글루코스 수준을 측정하였다. 본 발명의 개변형 PQQGDH를 고정화한 효소 센서는 0.1 mM - 5 mM 범위의 글루코스 분석에 사용할 수 있다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 는 글루코스에 대한 고 친화성을 가져, 이러한 효소로 제조한 분석 키트 또는 효소 센서에 의해, 종래의 천연 PQQGDH와 비교하여 현저하게 향상된 민감성으로 저수준의 글루코스를 측정할 수 있다는 잇점을 제공할 것으로 기대된다.

Claims

피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소에 있어서, 천연 수용성 글루코스 탈수소효소 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있으며, 천연 수용성 글루코스 탈수소효소와 비교하여 글루코스에 대한 친화성이 향상된 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제1항에 있어서, 야생형 PQQGDH와 비교하여 고 글루코스 선택성을 가지는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 수용성 PQQGDH의 아스파라긴 462 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 아스파라긴 452 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 리신 455 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 아스파테이트 456 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 아스파테이트 457 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 아스파테이트 448 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 잔기 268-289 또는 448-468에 해당하는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 글루타메이트 277 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 이소류신 278 또는 상기 잔기에 해당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산 서열 중 잔기 268-289 또는 448-468로 정의되는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
하기 서열을 포함하는 PQQ 글루코스 탈수소효소:

Xaa8 Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Val Thr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly

[여기서, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 및 Xaa8은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단 Xaa1 이 Asn 을 나타내고, Xaa2 가 Lys 을 나타내고, Xaa3 이 Asp 를 나타내고, Xaa4 가 Asp 를 나타내고, Xaa5 가 Asn 을 나타낼 경우, Xaa8 은 Asp 를 나타내지 않는다].
하기 서열을 포함하는 PQQ 글루코스 탈수소효소:

Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp

[여기서, Xaa6 및 Xaa7 은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa6 이 Glu 를 나타낼 경우, Xaa7 은 Ile 를 나타내지 않는다].
제14항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 글루타민 277이 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제14항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 이소류신 278 이 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스탈수소효소.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 개변형 글루코스 탈수소효소를 코딩하는 유전자.
제17항의 유전자를 포함하는 벡터.
제17항의 유전자를 포함하는 형질전환체.
제19항에 있어서, 제17항의 유전자가 주 염색체 내로 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 개변형 글루코스 탈수소효소를 포함하는 글루코스 분석 키트.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 개변형 글루코스 탈수소효소를 포함하는 글루코스 센서.