TWI224136B - Glucose dehydrogenase - Google Patents
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1224136 Α7 ____ Β7 五、發明說明(1) 技術範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於以吡咯并喹啉醌(p Q Q )作爲輔酶的 葡萄糖脫氫酵素(GDH)之製造以及對蔔萄糖定量之使 用。 技術背景 · 血中之葡萄糖濃度是糖尿病患者最重要標識物。又使 用於微生物發酵生產時,欲工藝過程的監測進行葡萄糖濃 度之定量。於過去,葡萄糖係採用葡萄糖氧化酵素( GOD)或葡萄糖一 6 —磷酸脫氫酵素(G6PDH)的 酵素法來定量。但欲採用GOD方法係隨著葡萄糖氧化反 應發生之過氧化氫來定量時必須預先添加觸媒酵素或過氧 化酵素於分析系中。雖G 6 P DH採用基於分光光學的方 法來定量葡萄糖,但在反應系中必須添加輔酶N A D ( p )。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 因此,本發明係提供對葡萄糖具有改良的熱安定性之 改變型水溶性P Q Q G D Η爲目的。本發明另一目的爲提 供一種欲增加血液中葡萄糖濃度測定的感度,對於葡萄糖 有著較高選擇性之改變型水溶性P Q Q G D Η。 發明的揭示 發明人發現一種作爲可代替至今使用於葡萄糖酵素定 量方法之新酵素,其對葡萄糖具有較高親和性之 P Q Q G D Η 。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 A7 B7 五、發明說明(2) P Q Q G D Η係以吡咯并喹啉醌(p Q Q )作爲輔酶 的葡萄糖脫氫酵素,可催化葡萄糖經氧化可生成葡萄酸內 酯之反應。 已知P Q Q G D Η有膜結合性酵素與水溶性酵素。膜 結合性P Q Q G D Η係一種分子量約8 7 k D a之單元體 胜肽蛋白質,在多種克蘭氏陰性菌可廣泛被發現。例如可 參考 AM. Cleton-Jansen et al·,J. Bacteriol. (1 990) 1 72, 630 8-63 1 5。另一方面,水溶性P Q Q G D H即在乙酸鈣不 動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)的幾個株裏確認其 存在,(Biosci· Biotech. Biochem. ( 1 995),59 (8),1 548-1 55 5 ),而其構造基因已被純系化並確明其胺基酸序列( Mol. Gen. Genet. ( 1 989),217:430-436 )。乙酸鈣不動桿菌 由來之水溶性P Q Q G D Η係含分子量約5 0 k D a之同 形二聚物與其他P Q Q酵素在蛋白質一元構造上之同系性 幾乎無存在。 最近,由本酵素的X線結晶構造解析結果,除活性中 心外明確了該酵素之高元構造。(〗.“〇1.6丨〇1.,289,3 1 9-333 ( 1 999), The crystal structure of the apo form of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus reveals a novel internal conserved sequence repeat; A. Oubrie et al., The EMB0 Journal, 1 8( 1 9) 5 1 87-5 1 94 ( 1 999), Structure and mechanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, A. Oubrie et al., PNAS, 96(2 1 ), 1 1 787- 1 179 1 (1999), Active-site structure of 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) --I I-----is---^« — — — — — 1 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1224136 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明(3) the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with methylhydrazine: A covalent cofactor-inhibitor complex, A. Oubrie et al.)。根據這些論文報告,水溶性 PQQGDH係由6個W-motif構成的冷一螺旋體蛋白質所 組成。 · 本發明者,以開發原來之水溶性? Q Q G D Η加予改 良,增加對其葡萄糖之親和性,使其能應用於臨床檢查或 食品分析等之改變型P q q G D Η,而經進行詳細硏究結 果,對於水溶性P Q Q G D Η之特定區域,導入胺基酸之 突變,成功地獲得對葡萄糖親和性叫較高之酵素。 亦即,對本發明係提供一種改變型葡萄糖脫氫酵素, 其特徵爲以吡咯并喹啉醌爲輔酶之水溶性葡萄糖脫氫酵素 而言,天然的水溶性葡萄糖脫氫酵素之1或1以上的胺基 酸殘基由其他的胺基酸殘基所取代,且與前述天然水溶性 葡萄糖脫氫酵素作比較,可提升對葡萄糖的親和性。本發 明的改變型P Q Q G D Η對葡萄糖的K m値比天然型的 P Q Q G D Η的K m値低,較佳爲不滿2 0 m Μ,更佳爲 不滿1 0 m Μ。 又,較佳的情況爲,雖本發明的改變型葡萄糖脫氫酵 素對葡萄糖的親和性增加,但對其他糖的親和性則無變化 或降低,因此與前述天然的水溶性葡萄糖脫氫酵素比較對 葡萄糖的具有較高選擇性。特別與對葡萄糖的反應性作比 較,對乳糖或麥芽糖的反應性比野生型低。對葡萄糖的反 應性爲1 0 0 %而言,對乳糖或麥芽糖的活性爲6 0 %以 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) --— — — — — — — · 11---- I 訂· —--1111 m (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1224136 Α7 _ Β7 五、發明說明(4) 下爲佳,較佳爲5 0 %以下,更佳爲4 0 %以下。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於本發明的其中一式樣,對本發明的p Q Q葡萄糖 脫氫酵素而言,相當於來自乙酸鈣不動桿菌水溶性 P QQGDH的第2 6 8號至第2 8 9號殘基或第4 4 8 號殘基至第4 6 8號殘之區域中,1或1以上的胺基酸殘 基由相異於其他胺基酸殘基,即天然存在的p Q Q葡萄糖 脫氫酵素中所對應的胺基酸殘基之胺基酸殘基所取代。且, 對於本發明說明書,胺基酸的位置以甲硫胺酸編號爲1。 關於使用本發明說明書的胺基酸殘基或區域時,所謂 「相當於」的用語,即表示對雖構造上類似但非相同之2 以上的蛋白質而言,具有相等價之胺基酸殘基或區域的機 能。例如來自乙酸鈣不動桿菌以外的生物之水溶性 P Q Q G D Η中,與來自乙酸鈣不動桿菌之水溶性 PQQGDH的第2 2 6號殘基至第2 8 9號殘基區域’ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其存在者高胺基酸序列類似性之區域,且由蛋白質的二元 構造可知對該區域對蛋白質而言可合理考慮爲具有相同的 功能時,該區域稱爲「與來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性 PQQGDH之第2 6 8號殘基至第2 8 9號殘基區域相 當」。且,該區域的第1 0號胺基酸殘基可稱爲「與來自 乙酸鈣不動桿菌的水溶性P Q Q G D Η之第2 7 7號殘基 相當」。 較佳爲本發明的改變型P Q Q G D Η中,序列號碼1 所表示的胺基酸序列第2 7 7號之榖胺酸殘基、第2 7 8 號的異亮胺酸殘基、第4 6 2號天冬胺酸殘基、第4 5 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1224136 A7 B7 五、發明説明(5) 號的天冬胺酸殘基、第4 5 5號的離胺酸殘基、第4 5 6 號的天冬胺酸殘基、第4 5 7號的天冬胺酸殘基或第 4 4 8號的天冬胺酸殘基相當之胺基酸殘基之1或1以上 分別由其他胺基酸殘基取代。 更佳情況爲,本發明的改變型P Q Q G D Η中,序列 號碼1所表示的胺基酸序列第2 7 7號穀胺酸殘基由選自 於丙胺酸、天冬醯酸、離胺酸、天冬胺酸、組胺酸、榖胺 醯胺、脯胺酸以及甘胺酸所成群之胺基酸殘基所取代,但 第2 7 8號異亮胺酸殘基由苯基丙胺酸殘基所取代。 又以其他觀點而言,本發明之改變型PQQGDH之 序列包含:
Xaa8 Thr Ala Gly Xaal Val Gin Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Val Thr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly (式中,Xaal ,Xaa2,Xaa3,Xaa4, X a a 5以及X a a 8爲任意的天然胺基酸殘基,但, Xaal 爲 Asn,Xaa2 爲 Lys,Xaa3 爲 Asp,Xaa4 爲 Asp,且 Xaa5 爲 Asn 時, Xaa8不爲Asp)。 又以其他觀點而言,本發明之改變型P Q Q G D H序 列包含: 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8 - 1224136 A7 __B7 ___ 五、發明說明(6 )
Ser Glu Gin Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu lie Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 〔式中,X a a 6以及X a a 7爲任意的天然胺基酸殘基 ,但,Xaa6爲Glu時Xaa7不爲lie〕。 本發明又提供,編碼上述改變型葡萄糖脫氫酵素的基 因,含該基因之載體及含該基因的轉形體,以及含本發明 之改變型葡萄糖脫氫酵素之葡萄糖分析組套及葡萄糖檢測 計。 本發明之改良型P Q Q G DH之酵素蛋白質顯示對葡 萄糖具有較高親和性,且因對葡萄糖具有高氧化活性,故 可應用於葡萄糖之高感度且高選擇性的測定。 實施發明之最良形態 改變型PQQGDH之構造 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明者,於編碼水溶性P Q Q G D Η的基因之編碼 區域中,以errer plon PCR法隨機導入突變,以構築導入胺 基酸殘基之突變的水溶性P Q Q G D Η之基因庫。然後將 這些轉形於大腸菌中,進行對葡萄糖的P Q Q G D Η活性 之篩選,對於2 0 m Μ的葡萄糖之活性與對於1 〇 〇 m Μ 的葡萄糖之活性相等,獲得多數可表現對低濃度的葡萄糖 而言比野生型酵素其反應性提升之P Q Q G D Η的純系。 就這些純系之一個進行基因序列之解析結果,得知第 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 Α7 _ Β7 五、發明說明(7) 2 7 7編號之G 1 u由G 1 y取代。且,將此殘基由種種 別的胺基酸殘基取代結果,無論由何種殘基所取代亦可獲 得較野生型水溶型P Q Q G D Η對葡萄糖親和性較高之優 良突變酵素。 再有關第2 2 7號殘基旁邊之其他殘基於部位特異性 上導入突變於,測定對葡萄糖的親和性。第2 6 8殘基至 第2 8 9殘基的區域中,做成第2 2 7號的I 1 e由 P h e取代的改變型酵素,以及第2 7 9號的A s η由 H i s取代的改變型酵素,測定其活性的結果,這些改變 型酵素具有對葡萄糖較高的親和性。 且’由上述多數的純系中,選出雖對2 0 m Μ濃度的 葡萄糖之活性與野生型P Q Q G D Η相當,但對2 0 m Μ 的乳糖之活性較野生型P Q Q G D Η低而表現 PQQGDH之純系。 就這些純系之一個進行基因序列之解析結果,得知第 4 5 2編號之A s η由A s p取代。且,將此殘基由蘇胺 酸、離胺酸、異亮胺酸、組胺酸或天冬胺酸殘基所取代結 果’無論由何種殘基所取代亦可獲得較野生型水溶型 P Q Q G D Η對葡萄糖親和性較高之優良突變酵素。且, 對第4 5 2號的殘基旁邊之其他胺基酸殘基同樣導入突變 。構築第4 5 5號的離胺酸由異亮胺酸、第4 5 6號天冬 胺酸殘基由天冬醯胺殘基、第4 5 7號的天冬胺酸殘基由 天冬醯胺殘基、第4 6 2號的天冬醯胺殘基由天冬胺酸殘 基、第4 4 8號的天冬胺酸殘基由天冬醯胺殘基分別被取 · I I I I I I I ^ — — — — — — — — · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本,頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -Ί υ - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224136 A7 ___B7___ 五、發明說明(8 ) 代之突變酵素。其結果,如表4所示,得知任一種突變酵 素對葡萄糖的選擇性提高。 本發明較佳爲對P Q Q葡萄糖脫氫酵素而言,對相當 於來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性P Q Q G D Η之第4 4 8 殘基至第4 6 8殘基區域,1或1以上的胺基酸殘基由其 他胺基酸殘基所取代。較佳爲本發明的改變型 P Q Q G D Η中,相當於序列號碼1所表示的胺基酸序列 的第4 6 2號之天冬醯胺殘基、第4 5 2號的天冬醯胺殘 基、第4 5 5號的離胺酸殘基、第4 5 6號的天冬胺酸殘 基、第4 5 7號的天冬胺酸殘基以及第4 4 8號的天冬胺 酸殘基之胺基酸殘基,1或1以上由其他胺基酸殘基所取 代。 又以其他觀點而言,本發明的改變型P QQGDH爲 包含序列=
Xaa8 Thr Ala Gly Xaal Val Gin Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Val Thr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly (式中,Xaal ,Xaa2,Xaa3,Xaa4, X a a 5以及X a a 8爲任意的天然胺基酸殘基,但, Xaal 爲 Asn,Xaa2 爲 Lys ,Xaa3 爲 Asp,Xaa4 爲 Asp,且 Xaa5 爲 Asn 時, Xaa8不爲Asp)。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 χ 297公t ) --------^ 1111111 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1224136 Α7 __ Β7 五、發明説明(9) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的其他較佳改變型P Q Q G D Η中,對序列號 碼1所表示的胺基酸序列之第2 6 8殘基至第2 8 9殘基 的區域,1或1以上的胺基酸殘基由其他胺基酸殘基所取 代。且,本發明特佳的改變型P Q Q G D Η中,序列號碼 1所表示的胺基酸序列之第2 2 7號榖胺酸殘基由選自於 丙胺酸、天冬醯胺、離胺酸、天冬胺酸、組胺酸、穀胺醯 胺、脯胺酸以及甘胺酸所成群的胺基酸殘基所取代,又, 第2 7 8號異亮胺酸殘基由苯基丙胺酸所取代。 又以其他觀點而言,本發明的改變型PQQGDH爲 包含序列:
Ser Glu Gin Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu lie Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp 〔式中,Xa a 6以及Xa a 7爲任意的天然胺基酸殘基 ’但 ’Xaa6 爲 Glu 時 Xaa?不爲 I 1 e〕。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 對於本發明的改變型葡萄糖脫氫酵素,不僅具有葡萄 糖脫氫酵素活性,且其他胺基酸殘基可欠缺或被取代,又 可附加其他胺基酸殘基。 且對於斯業者,即使對於來自其他係菌的水溶性 P Q Q G D Η而言,亦可經由本發明所記載的方法取代胺 基酸殘基,得到對葡萄糖親和性提高之改變型葡萄糖脫氫 酵素。特別與蛋白質的二次元構造作比較時,可容易辨識 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -12- 1224136 A7
五、發明說明(榨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 與來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性P Q Q G D Η之第2 7 7 號之榖胺酸殘基以及第2 7 8號的異亮胺酸殘基、第 4 6 2號的天冬醯胺殘基、第4 5 2號的天冬醯胺殘基、 第4 5 5號的離胺酸殘基、第4 5 6號的天冬胺酸殘基、 弟4 5 7號天冬胺酸殘基以及第4 4 8號的天冬胺酸殘基 相當之胺基酸殘基。因此本發明中,進行如此取代,故可 得到改良對基質的親和性之葡萄糖脫氫酵素。這些改變型 葡萄糖脫氫酵素皆爲本發明的範圍內。 改變型PQQGDH之製造方法 編碼來自乙酸鈣不動桿菌之天然水溶性P Q q G D Η 的基因序列定爲序列編號2。 編碼本發明之改變型P Q Q G D Η的基因,可經由編 碼天然之水溶性P Q Q G D Η基因,由編碼特定胺基酸殘 基之鹼基序列所取代而構築。如此種種部位特異性鹼基序 列之取代方法對於該技術領域上爲已知。例如,Sambrook, “Molecular cloning; A Laboratory Manual”、第 2 版、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 9 8 9,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 所記載。 如此所得的突變基因插入基因表現用載體(例如質體 ),將此轉形至適當的宿主(例如大腸菌)。爲使表現外 來的蛋白質之大部分載體•宿主系對於該技術分野而言爲 已知,作爲宿主例如有細菌、酵母、培養細菌等之種種可 使用。 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1224136 A7 五、發明說明(11) 導入隨機突變時’對於作爲目標之區域以errer pl〇n PCR法隨機導入突變,以構築其目的區域中導入突變之突 變水溶性P Q Q G D Η基因庫。將其轉形於大腸菌中,就 p Q Q G D H之對葡萄糖的親和性作各純系的篩選。水溶 性P Q Q G D Η於大腸菌內表現時,欲使分泌於周質空間 ,可直接使用菌體容易地進行酵素活性的檢測。此基因庫 ,於2 OmM葡萄糖存在下添加作爲色素的pms -D C I P,P Q Q G D Η的活性以目視法判定,選擇顯示 活性與對葡萄糖1 0 0 m Μ活性相等純系,解析基因序列 確認其突變。 且,欲獲得對於葡萄糖的選擇性提高之改變型 PQQGDH,此基因庫加入作爲色素的PMS-D C I Ρ做爲色素,以目視測定p q q g D Η活性,選擇 雖對2 0 m濃度葡萄糖其活性與野生型p q q g D Η相等 ’但對2 0 m Μ乳糖其活性比野生型p q q g D Η低可表 現P Q Q G D Η的純系,經基因序列解析確認其突變。 如上述所得之,培養表現改變型P Q Q G D Η之轉形 體,由培養液經離心分離等將菌體回收後,菌體以粉碎機 破碎,或以滲透刺激將周質酵素釋出於培養液中。將其進 行超離心分離,可得到含P Q Q G D Η之水溶性部分。或 採用適當的宿主載體系,亦能將表現之PQQGDH分泌 於培養液中。所得之水溶性部分,再由離子交換色層分離 法,親和力色層分離法,Η P L C等方法加以純化,即可 調製本發明之改變型PQQGDH。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -14- 1224136 B7__ 五、發明說明(榨 酵素活性之測定方)1 本發明之PQQGDH,係以PQQ做爲輔酶,具有 將葡萄糖氧化生成葡萄糖內酯之反應進行催化作用者。 酵素活性之測定,係由於P Q Q G D Η氧化同時被還 原的P QQ之量,以氧化還原色素之呈色反應來定量。呈 色試藥可用如PMS (吩嗪甲基硫酸鹽)一 DC I Ρ (2 ,6 -二氯化酚靛酚)、鐵氰化鉀、二茂鐵等。 對於葡萄糖的親和性 本發明的改變型P Q Q G D Η對葡萄糖的親和性較野 生型的親和性大幅度地高。即,改變型P Q Q G D Η的對 葡萄糖之Km値大大低於野生型P QQGDH對葡萄糖之 Km値。於改變型PQQGDH中G 1 u277Ly s對 葡萄糖之K m値有8 · 8 m Μ,又,由最大活性亦未遜色 於野生型酵素可知,對於低濃度的葡萄糖而言反應性有提 高。 因此,使用本改變型酵素做成的分析組套或酵素分析 儀其關於葡萄糖測定之感度很高,具有可測出低濃度的葡 萄糖之優點。 潠擇忡的評估方法 本發明的P Q Q G D Η對葡萄糖之選擇性’作爲基質 ,可使用2 一脫氧一 D -葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3 — 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 x 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -15- 1224136 A7 _— B7 五、發明說明( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ◦ 一甲基- D -葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖及麥芽糖等 各種糖,如上述測定酵素活性,可藉著調查對於葡萄糖作 爲基質時的活性之相對活性而進行評估。 葡萄糖分析細套 本發明又含符合本發明之改變型p Q Q G D Η之葡萄 糖分析組套爲特徵。本發明之葡萄糖分析組套,含有至少 分析一次之充分量的符合本發明之改良型p Q Q G D Η。 典型而Η,組套加上本發明之改變型PqqGDH,含有 分析所必須之緩衝液,介體、校正圖形的作製所需的含有 葡萄糖標準溶液,以及使用方法說明。符合本發明之改變 型P Q Q G D Η有種種形態,例如可提供作爲被凍結乾燥 的試藥,或作爲適當保存溶液中之溶液,較佳爲提供本發 明的改變型P Q Q G D Η經同化(h ο 1 〇化)的型態, 亦可以脫輔基酶蛋白的型態提供,使用時再進行同化。 葡萄糖檢測計 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 本發明又以使用符合本發明的改變型p Q q G D Η之 葡匍糖測爲特徵。作鳥電極使用碳黑電極、金電極、白 金電極等。此電極上固定化本發明之酵素。作爲固定化方 法,有採用交聯試藥方法,封入高分子格子型的方法,透 析膜包覆方法,光交聯性聚合物、導電性聚合物、氧化還 原聚合物等’或由二茂鐵或異衍生物所代表的電子介體一 齊固定在聚合物中,或吸著固定在電極上亦可,或使用這 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1224136 Α7 Β7 五、發明說明(1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 些物之組合亦可。本發明之改變性P Q Q G D Η雖宜在同 化形態固定化在電極上,但以脫輔基酶蛋白之形態固定化 ,P Q Q做爲別的層提供或溶液中提供。典型的方法是, 使用戊二醛將本發明之改變型P Q Q G D Η固定化在碳黑 電極上後,用含有胺基之試藥處理,將戊二醛阻蓋。 葡萄糖濃度之測定,可依下述方法來進行。先在恆溫 箱加入緩衝液,然後添加P Q Q及C a C 1 2,及介體維持 一定溫度。做爲介體可使用鐵氰化鈉,吩嗉甲基硫酸鹽等 。作爲活性電極使用固定化本發明之改變型P Q Q G D Η 的電極,對極(例如白金電極)及參考電極(例如A g / A g C 1電極)。首先外加一定電壓於碳電極,待電流穩 定後,添加含葡萄糖試料測定增加之電流。依從由標準濃 度之葡萄糖溶液所作製的修正曲線,能計算試料中之葡萄 糖濃度。 本案說明書而言,明確地引用的所有專利以及參考文 獻之內容。又,以本案發明所具有的優先權主張爲基礎之 申請案,日本專利出願平成1 1 — 1 0 1 1 4 3號及 2〇0 0 — 9 1 5 2號說明書內記載之內容,皆記載於本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 說明書中。 以下以實施例爲基準進而詳細說明本發明,但本發明 不受這些實施例所限定。 實施例1 突變P Q Q G D Η基因庫之構築及篩選 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1224136 A7 __ _B7___ 五、發明說明(15) 質體PGB2係由載體pTr c99A ( faruasia社製 )之多重純系化部位,插入編碼來自乙酸鈣不動桿菌之 PQQGDH的構造基因者(圖1)。以此質體爲模型, 依errer pl〇n PCR法於種種區域中,隨機導入突變。P C R 反應如表1所示組成之溶液中,先進行9 4 °C 3分間,·其 次,在94 °C、3分鐘,50 °C、2分鐘及72 t、2分 鐘的3 0次循環,最後,以7 2 °C 1 0分間之條件進行。 〔表1〕
Ta qDNA 聚合酵素(5U/// 1 ) 模型D N A 正向引子A B F
逆向引子A B R 1 0 X T a q聚合酵素緩衝液 1 Μ /3 —氫硫基乙醇 0 . 5 // 1 1 . 0 // 1 4 . 0 // 1 4 . 0 // 1 1 0 . 0 β 1 . 0 // 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〇 M MM s MmMmm Mmomo o D5 τ—12 i—_ τ—_
c n M p T G d p T A d p T c d p T T d
〇 2 H IX IX τ ^^Ίχ lx 、--1Ti^ . . ο ο ο ο · · τ—I 1 1 2 2 2 2 5 o o o ΊΜ -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1224136 Α7 Β7 五、發明說明( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將所得突變水溶性p Q Q G D Η之基因庫轉形至大腸 菌’所形成的各菌落移植於微量滴定皿。將菌落複印至另 一個培養皿中,其中一片加上濃度爲1 〇 m Μ的葡萄糖以 及PMS — DC I Ρ,另一片則加上濃度爲1 〇 〇mM的 葡萄糖以及PMS-DC I P,雙方的PQQGDH活性 以目視法測定。得到多數顯示2片培養皿相同 P Q Q G D Η活性的純系。 任選其中一片,進行基因序列解析結果,得知第 2 7 7號的榖胺酸突變成甘胺酸。 竇施例2 將實施例1所得的各菌落移植於微量滴定皿。將菌落 複印至另一個培養皿中,其中一片加上濃度爲2 OmM的 葡萄糖以及PMS - DC I P,另一片則加上濃度爲2 0 mM的乳糖以及PMS — DC I P,雙方的PQQGDH 活性以目視法測定。得到多數顯示與葡萄糖所示活性比較 ,對乳糖活性有大幅降低之純系。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 任選其中一片,進行基因序列解析結果,得知第 4 5 2號的天冬醯胺突變成天冬胺酸。 實施例3 改變型酵素P Q Q GDH基因之構築 以序列編號2所示來自乙酸鈣不動桿菌的 P Q Q G D Η構造基因爲準,依常法採用部位特異性突變 -iy - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 A7 _____B7 五、發明說明(17) 法,將編碼第2 7 7編號穀胺酸殘基,或第2 7 8編號異 亮胺酸殘基之鹼基序列,以編碼所定的胺基酸殘基之鹼基 序列所取代。部位特異性突變法使用質體p G B 2,如圖 2所示的方法進行。於突變所使用的合成寡核苷酸目標引 子的序列如表2所示。由表2中例如「E 2 7 7 A」,係 表示第2 7 7號的穀胺酸由丙胺酸所取代。 〔表2〕 於載體引子pKF18k (寶酒造(株))中插入含 有編碼來自乙酸鈣不動桿菌之P Q Q G D Η的一部份基因 之Κρη I— Hind 瓜斷片。將此作爲模型。混合 此模型50fm〇l與寶酒造(株)等Mutan (登錄 商標)-Express Km套組附屬之選擇引子5 p m ο 1 ,磷酸化 目標引子50pmo 1與全體(20//1)之1/10量 的同套組的連接緩衝液,以1 0 0 t、3分間之熱處理將 質體變性,使其成單股。選擇引子係爲了修復 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) :」如- ---------^----I---訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I224136 緩濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明說明(1δ) Ρ Κ F 1 8 k之卡那黴素耐性基因上的雙股琥珀突變之物 質。將它放置在冰上5分鐘,引子被連接。然後添加3 从1之同套組的伸縮緩衝液,1 // 1的T 4 D N A連接酶 ’ 1// 1的T4 DNA聚合酶及5// 1滅菌水,合成互 補股。 · 將它轉形於D N A之錯誤修復能欠缺株的E. con BMH7 1 — 1 8mu t S,進行一晚振盪培養以增幅質 體。 其次,由此萃取出的質體轉形於E.coli MV1 1 84,由該菌落萃取的質體。然後就這些質體進 行序列,確認做爲目標的突變已導入。將此片段由編碼質 體PGB2上野生型PQQGDH的基因,其Kpm I -Hind HI片段所替換,構築改變型PQQGDH之 基因。 同樣地合成序列: 5,-C ATC TTT TTG GAC ATG TCC GGC AGT AT-3’ 的寡核苷酸目標引子,第4 5 2號的天冬醯胺由組胺酸所 取代。部位特異性突變使用質體P G B 2,如圖2所示方 法進行。且,構築具有Asp448Asn,Asn452Asp,
Asn452His , Asn452Lys , Asn452Thr , Asn452Ile , Lys455Ile,Asp456Asn,Asp457Asn,Asn462Asp,的各突 變之改變型P QQGDH之基因。 裝--------訂-丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·# 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -21 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 ___B7 __ 五、發明説明(19) 實施例4 改變型酵素之製作 將編碼野生型或改變型P Q Q G D Η之基因,插入 E.coli用表現載體的p T r c 9 9 A farumasia社)之多 重純系化細胞,將構築的質體轉形於E.coli D Η 5 α株 。然後將其以4 5 02之L 一培養基(含有氨苄青黴素 5 〇 // g/m£,氯黴素 3 0 // g/m£),採用 sakaguti 燒瓶 以3 7 °C振盪培養一夜,移植於含1 m M C a C 1 2, δ 0 0 μ Μ P Q Q 7 1之L培地。培養開始後約3小 時,添加異丙基硫代半乳糖苷使其最終濃度爲〇 · 3 m Μ ,然後1 . 5小時培養。其次,將此培養液以離心分離( 500〇xg,10分鐘,4°C)回收菌體,然後把此菌 體以0 . 8 5 % N a C 1溶液洗滌二次。收集的菌體用 攪碎機加予破碎,用離心分離(1 0 0 0 〇 X g ’ 1 5分 ,4 °C )除去未破碎之菌體。其上淸用超離心分離( 160500xg(40000r.p.m.) ,9〇分 鐘,4 0 °C ),獲得水溶性部分。以它做爲初步純化酵素 樣品,用於以下的實施例。 再就此獲得的水溶性部分用1 0 m Μ磷酸緩衝液P Η 7 · 0進行一晚上透析。透析樣品以1 〇 πί Μ磷酸緩衝液 ρΗ7 · 0平衡化的陽離子交換色層分離用塡充柱TSKgel CM-T0Y0PEARL 6 5 0M (東s 〇株式會社)吸著。然 後以1 0 m Μ磷酸緩衝液p Η 7 · 0,0 · 7 5 0 洗滌 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210Χ297公釐) -22- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I224136 A7 s__B7__ 五、發明説明(20) 此塡充柱後,使用含0〜0·2M NaC1之pH 7 · 0,1 0 m Μ磷酸緩衝液,將酵素溶出。流速以5 2 / ni i η進行。其次,回收具有G D Η活性之部分,用 1 〇 m Μ M〇PS — Na〇H緩衝液(pH7·〇)透 析一夜。如此所獲得電泳上均一的改變型P Q Q G D Η蛋 白質。把此做爲純化酵素養品,使用於下述實施例中。 直_1拒例5 酵素活性之測定 酵素活性之測定在1 0 m Μ Μ〇P S — N a〇Η緩 衝液(ρ Η 7 · 0 )中,用P M S (吩嗪甲基硫酸鹽)一 DCIP(2,6 —二氯化酚靛酚),DCIP 之 600 n m的吸光度變化使用分光光度計追跡。以其吸光度之減 少速度作爲酵素之反應速度。此時,以1分鐘,1 A m 〇 1之D C I P被還原的酵素活性做爲一個單位。又 DC I P之PH7 · 0之莫耳吸光係數定爲1 6 · 3 m Μ — 1。 實施例6 對初步純化酵素樣品葡萄糖的親和性之評價 將實施例4所得的野生型及各改變型P Q Q G D Η之 粗精製酵素樣品,分別於1 # Μ P Q Q,1 m Μ C a C 1 2存在下同化一小時以上後,將此以1 8 7 // 1分 裝,添加3 // 1的活性試藥(6 m M D C I P 4 8 // 1 , (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) -23- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 A7 B7 五、發明説明(22) 現今所報告之野生型P Q Q G D Η對葡萄糖的κ m値 約2 5 m Μ。相對此,此次於所構築的第2 7 7號穀胺酸 殘基導入突變之酵素,以及第2 7 8號的異亮胺酸以苯基 丙胺酸取代之酵素中,任一種對葡萄糖的K m値皆未滿 1 0 m Μ。由此結果得知本發明的P Q Q G D Η係爲對葡 萄糖具有較高的親和性之酵素。 實施例7 純化酵素標品對葡萄糖親和性之評價 使用由實施例4所得之野生型酵素及 G 1 u 2 7 7 L y s改變型酵素之純化酵素樣品,與實施 例6分別於1//MPQQ,ImM CaC 12存在下進行 一小時以上同化。將此分別注入1 8 7 // 1 ,加上3 # 1 的活性試藥(6 m M D C I P 4 8 // 1 ,6 Ο〇 m Μ P M S 8//1 , lOOmM 磷酸緩衝液 pH 7.0 16//1)以及各濃度的D -葡萄糖溶液1〇 // 1 ,如實施例5所示方法於室溫下測定酵素活性。由基 質濃度對酵素活性的點圖中求得K m以及V m a X。對 G1 u277Lys的葡萄糖其Km値約爲8 · 8mM, V m a X値爲3 6 6 8 U /m g。現今所報告的野生型 PQQGDH對葡萄糖的Km値約爲2 5mM,Vma X 値則依測定條件下有2 5 Ο 0至7 Ο Ο 0 U /m g。由此 結果可知,G 1 u277Ly s改變型PQQGDH對葡 萄糖的親和性大幅度地提高,且,與野生型P Q Q G D Η (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ297公釐) -25- 1224136 A7 _B7 五、發明説明(23) 相比其係具有相當高的活性之酵素。 實施例8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基質特異性的評價 對於各改變型酵素的粗製酵素樣品而言對於基質特異 性作調查。實施例4所得之野生型以及各改變型 P Q Q G D Η之粗製酵素樣品分別於1 μ μ P Q q,i m M C a C 1 2存在下同化一小時以上,然後將其分注各 1 8 7 m£,添加3 // 1之活性試藥〔含有6 m Μ DCIP、600mM PMS、l〇mM磷酸緩衝液 P Η 7 · Ο )以及基質,作爲基質,分別最終濃度欲成爲 20mM,添加400mM的葡萄糖、乳糖以及1 的麥芽糖,於室溫下恆溫培養3 0分鐘,與實施例5進行 相同的酵素活性測定。其値以葡萄糖作基質時的活性爲 1 0 0,計算這些之相對活性。如表4所示,顯示任一本 發明的改變型酵素與野生型酵素比較,對葡萄糖具有較高 選擇性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 1224136
100% 100% 野生型 Asp448Asn Asn452Asp Asn452His Asn452Lys Asn45 2Thr Asn452Ile Ly s45 5Ile Asp456Asn Asp457Asn Asn462Asp 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 61% 48% 56% 39% 55% 42% 36% 49% 59% 43% 5 2% 61% 36% 50% 39% 42% 30% 28% 37% 41% 3 2% 41% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
· I I I I I I I 訂-------I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例9 葡萄糖的測定 使用改變型p Q Q G D H進行葡萄糖的測定。 G 1 u277Ly s改變型酵素以及As n45 2Th r 改變型酵素分別於1 // Μ P Q Q及1 m M C a C 1 2之 存在下E溫培養1小時以上進行同化,各種濃度得葡萄糖 以及5//MPQQ、1 〇mM Ca C 12之存在下測定其 酵素活性,方法則依據實施例5所記載的酵素活性測定法 ’以DC I P的6 〇 〇 nm之吸光度變化 斤爲指標。如圖 私紙張尺度適用中國國家規格⑽X 297公釐_丁 参 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 A7 B7 五、發明說明(约 3所示,使用Asn452Thr改變型PQQGDH, 可定量0 · 1至2〇mM範圍的葡萄糖。又,對 G 1 u 2 7 7 L y s改變型P Q Q G D Η亦得到相同的結 果。 复复例1〇 酵素檢測計之製作及評價 將5U之G 1 uSYTLy s改變型酵素以及 A s n 4 5 2Th r改變型酵素分別添加碳基質2 Omg ,加予凍結乾燥。然後將之充分混合後’塡充於已經塡充 碳基質約4 0 m g的碳基電極表面上’在濾紙上硏磨。然 後將此電極在含1 %戊二醛之1 〇 m Μ Μ〇P S緩衝液 (PH7 · 0)中,於室溫處理20分鐘後,再在含2〇 m Μ離胺酸之1 0 πί Μ Μ〇P S緩衝液(ρ Η 7 · 〇 ) 中,於室溫處理2 0分鐘後將戊二醛遮蔽。然後將此電極 在1 0 m Μ Μ Ρ〇S緩衝液(ρ Η 7 · 0 )中,於室溫 下平衡化一小時以上,電極保持於4 °C。 採用製作之酵素檢測計進行葡萄糖濃度之測定。使用 固定本發明的改變型P Q Q G D Η之酵素檢測計,進行 0 . 1 m Μ至5 m Μ的範圍之葡萄糖測定。 產業上的利用性 由改變型P Q Q G D Η對葡萄糖具有高親和性的事可 知,使用本酵素做成的檢測套組或酵素檢測計與使用過去 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -此' 裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂i 1224136 A7 五、發明說明(29 天然的P Q Q G D Η的狀況作比較,其可測出較低濃度的 葡萄糖測定,可望有著提高大幅感度之優點。 圖面之簡單說明 〔圖1〕圖1係表示本發明所用之質體PGB2之構 造。 〔圖2〕圖2係表示編碼本發明之改變型酵素的突然 突變基因之作成方法。 〔圖3〕圖3係表示使用本發明之改變型 PQQGDH葡萄糖分析。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
裝 ·1111111« % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) ^29-
Claims (1)
1224136
A8 … B8 C8 D8 々、申請專利範圍 1 第89 108206號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國93年7月29日修正 1 . 一種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 喹啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G DH之第2 7 7號的穀胺酸殘基由選自天冬醯酸、天冬胺 酸、丙胺酸、甘胺酸、榖胺醯胺、纈胺酸、組胺酸及離胺酸 所成群的胺基酸殘基取代者。 2 . —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 喹啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G DH之第2 7 8號的異亮胺酸殘基由苯基丙胺酸取代者。 3 · —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 _啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G D Η之第2 7 9號天冬醯胺殘基由組胺酸取代者。 4 · 一種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 _啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G ϋ Η之第4 4 8號天冬胺酸殘基由天冬醯胺取代者。 5 · —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 口奎啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus )的水溶性 P Q Q G 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) a4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224136 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) DH之第4 5 2號天冬醯胺殘基由選自天冬胺酸' 異亮胺 酸、榖胺醯胺、色胺酸Λ蘇胺酸 組胺酸及離胺酸所成群 胺基酸殘基取代者。 6 . —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 喹啉醌作爲輔酶的水溶液葡萄糖脫氫酵素中’來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus )的水溶性 P Q Q G DH之第4 5 3號的纈胺酸殘基由苯基丙胺酸取代者。 7 . —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 喹啉醌作爲輔酶的水溶液葡萄糖脫氫酵素中,對來自乙酸 15 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G D Η之第4 5 4號之榖胺醯胺殘基由脯胺酸或離胺酸取 代者。 8 . —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 喹啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G D Η之第4 5 5號的離胺酸由異亮胺酸取代者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9 . 一種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯并 喹啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸鈣 不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q G DH之第4 5 6號的天冬胺酸由天冬醯胺取代者。 1 0 _ —種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡咯 并喹啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸 錦不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 P Q Q GDH之第4 5 7號的天冬胺酸由天冬醯胺取代者。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) ~ " 1224136 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 1 1 . 一種改變型葡萄糖脫氫酵素,其特徵爲以吡略 幷喹啉醌作爲輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酵素中,來自乙酸 興不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性 PQQ GDH之第4 6 2號的天冬醯胺殘基由選自天冬胺酸、酪 胺酸、組胺酸及離胺酸所成群的胺基酸殘基取代者。 1 2 . —種基因,其特徵爲編碼如申請專利範圍第1 至11項中任一項之改變型葡萄糖脫氫酵素者。 1 3 _ —種葡萄糖檢測套組,其特徵爲含有如申請專 利範圍第1至1 1項中任一項的改變型葡萄糖脫氫酵素。 1 4 · 一種葡萄糖檢測計,其特徵爲將如申請專利範 圍第1至11項中任一項的改變型葡萄糖脫氫酵素裝置於 表面的電極所成者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐)
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