CN110527673A - 一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用 - Google Patents

一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入，S3、菌的培养，S4、菌体破碎过滤处理，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化，本发明涉及生物工程技术领域。该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用。

Description

一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用。
背景技术
葡萄糖脱氢酶(GDH)广泛参与生物体中的葡萄糖代谢途径，特别是芽孢杆菌在芽孢形成阶段的关键酶，借助于辅酶NAD(P)+，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成葡萄糖酸内酯，辅酶NAD(P)+则被还原为NAD(P)H，自二十世纪八十年代起，研究人员就已经克隆了来源于芽孢杆菌的GDH，并在大肠杆菌中进行了高效表达，来源于芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶家族，是由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，单体的分子量约为30kDa，野生型的GDH热稳定性和pH稳定性都不理想，因此，在实际应用上受到了一定的限制，鉴于此，研究人员开始对编码GDH的基因进行体外定向进化的研究，DN46在66℃的半衰期为540分钟，而F20仅为1.3分钟。GDH的三维结构研究表明，突变体通过增强疏水作用和减小离子的排斥作用显著增强了亚基与亚基之间的相互作用力，稳定了酶的三维结构，从而提高了酶的稳定性，在底物特异性方面，GDH对其天然底物β-D-葡萄糖的特异性并不高，对结构类似的木糖、半乳糖、甘露糖都有较弱的催化作用。
现有的葡萄糖脱氢酶制备过程中，大多只进行单一的电泳提纯或沉淀提纯，然而，这样的提纯方法提纯效果较差，提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白含量较高，十分不利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，不能实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，无法达到通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，从而给葡萄糖脱氢酶的使用带来极大的不利。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，解决了现有的提纯方法提纯效果较差，提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白含量较高，十分不利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，不能实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，无法达到通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高目的的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；
S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；
S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；
S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；
S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；
S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。
优选的，所述步骤S6中透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快。
优选的，所述步骤S3中培养瓶的培养基内含有45-50μl/ml的氨苄青霉素。
优选的，所述步骤S3中离心分离菌体的时间为8-10分钟，分离温度为2-4℃。
优选的，所述步骤S4中磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为100-110MPa。
优选的，所述步骤S4中离心分离的时间为10-15分钟，分离温度为2-4℃。
优选的，所述步骤S5中离心分离的时间为80-100分钟，分离温度为2-4℃。
优选的，所述步骤S6中葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量2-5倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和混合缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.2-0.5ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每1-2分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。
优选的，其制备的葡萄糖脱氢酶可应用于生物能源、食品工业、生物化工、生物传感或分析检测中。
(三)有益效果
本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用。与现有技术相比具备以下有益效果：该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：首先选自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶的结构基因为原材料，先将选取的原材料置于离心分离设备中，以转速为800-900r/min，温度为26-30℃的条件下进行充分旋转分离，然后再进行突变诱导，诱导完成后加入定向酶进行葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌菌株中，S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体，S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，从而确保了葡萄糖脱氢酶的正常使用。
附图说明
图1为本发明制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明实施例提供三种技术方案：一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，具体包括以下实施例：
实施例1
S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：首先选自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶的结构基因为原材料，先将选取的原材料置于离心分离设备中，以转速为850r/min，温度为28℃的条件下进行充分旋转分离，然后再进行突变诱导，诱导完成后加入定向酶进行葡萄糖脱氢酶基因的构建，突变诱导是在载体质粒中插入包含编码来自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因一部分的片断，并将这作为模板，然后将模板和载体质粒在试剂盒中附带的选择引物的1/10量的同试剂盒中的退火缓冲液一起混合，经100℃热处理2分钟，使质粒变性，成为一条链，将混合物在冰上放置3分钟，使引物退火，再在其中加入2μL的同试剂盒中的延伸缓冲液、1μL的T4DNA连接酶、1μL的T4DNA聚合酶以及5μL的灭菌水，合成互补链，将这个质粒转化到DNA错配修复缺陷性菌株大肠杆菌中，摇床培养10h扩增该质粒，接着，将从中抽提的质粒转化大肠杆菌，并从其菌落中抽提质粒，然后，对于这些质粒进行测序，以确认导入了目的突变，将这一片段替换质粒上编码野生型葡萄糖脱氢酶的基因片断，构建成编码具有Q209R、D229R以及N240R三个突变的修饰型葡萄糖脱氢酶，选择引物是用于恢复抗卡那霉素基因上的双重琥珀突变的引物；
S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1突变诱导后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌株中；
S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在425mL培养基中，在温度为36.5℃下通过震荡设备培养10h，然后接种在6L的培养基中，培养开始后2.5小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/mL，然后再培养13小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体，培养瓶的培养基内含有47μl/ml的氨苄青霉素，离心分离菌体的时间为9分钟，分离温度为3℃；
S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.7％的NaCl溶液洗2次，将该菌体悬浮在缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去，磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为105MPa，离心分离的时间为13分钟，分离温度为3℃；
S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中3℃透析10h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物，离心分离的时间为90分钟，分离温度为3℃；
S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.15μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可，透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快，葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量2-5倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.3ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每1.5分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。
实施例2
S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：首先选自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶的结构基因为原材料，先将选取的原材料置于离心分离设备中，以转速为800r/min，温度为26℃的条件下进行充分旋转分离，然后再进行突变诱导，诱导完成后加入定向酶进行葡萄糖脱氢酶基因的构建，突变诱导是在载体质粒中插入包含编码来自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因一部分的片断，并将这作为模板，然后将模板和载体质粒在试剂盒中附带的选择引物的1/10量的同试剂盒中的退火缓冲液一起混合，经100℃热处理1分钟，使质粒变性，成为一条链，将混合物在冰上放置1分钟，使引物退火，再在其中加入1μL的同试剂盒中的延伸缓冲液、1μL的T4DNA连接酶、1μL的T4DNA聚合酶以及5μL的灭菌水，合成互补链，将这个质粒转化到DNA错配修复缺陷性菌株大肠杆菌中，摇床培养8h扩增该质粒，接着，将从中抽提的质粒转化大肠杆菌，并从其菌落中抽提质粒，然后，对于这些质粒进行测序，以确认导入了目的突变，将这一片段替换质粒上编码野生型葡萄糖脱氢酶的基因片断，构建成编码具有Q209R、D229R以及N240R三个突变的修饰型葡萄糖脱氢酶，选择引物是用于恢复抗卡那霉素基因上的双重琥珀突变的引物；
S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1突变诱导后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌菌株中；
S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400mL培养基中，在温度为36℃下通过震荡设备培养8h，然后接种在5L的培养基中，培养开始后2小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/mL，然后再培养10小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体，培养瓶的培养基内含有45μl/ml的氨苄青霉素，离心分离菌体的时间为8分钟，分离温度为2℃；
S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5％的NaCl溶液洗2次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去，磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为100MPa，离心分离的时间为10分钟，分离温度为2℃；
S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2℃透析8h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物，离心分离的时间为80分钟，分离温度为2℃；
S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可，透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快，葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量2倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.2ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每1分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。
实施例3
S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：首先选自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶的结构基因为原材料，先将选取的原材料置于离心分离设备中，以转速为900r/min，温度为30℃的条件下进行充分旋转分离，然后再进行突变诱导，诱导完成后加入定向酶进行葡萄糖脱氢酶基因的构建，突变诱导是在载体质粒中插入包含编码来自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因一部分的片断，并将这作为模板，然后将模板和载体质粒在试剂盒中附带的选择引物的1/10量的同试剂盒中的退火缓冲液一起混合，经100℃热处理3分钟，使质粒变性，成为一条链，将混合物在冰上放置5分钟，使引物退火，再在其中加入3μL的同试剂盒中的延伸缓冲液、1μL的T4DNA连接酶、1μL的T4DNA聚合酶以及5μL的灭菌水，合成互补链，将这个质粒转化到DNA错配修复缺陷性菌株大肠杆菌中，摇床培养12h扩增该质粒，接着，将从中抽提的质粒转化大肠杆菌，并从其菌落中抽提质粒，然后，对于这些质粒进行测序，以确认导入了目的突变，将这一片段替换质粒上编码野生型葡萄糖脱氢酶的基因片断，构建成编码具有Q209R、D229R以及N240R三个突变的修饰型葡萄糖脱氢酶，选择引物是用于恢复抗卡那霉素基因上的双重琥珀突变的引物；
S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1突变诱导后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌菌株中；
S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在450mL培养基中，在温度为37℃下通过震荡设备培养12h，然后接种在7L的培养基中，培养开始后3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/mL，然后再培养15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体，培养瓶的培养基内含有50μl/ml的氨苄青霉素，离心分离菌体的时间为10分钟，分离温度为4℃；
S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.85％的NaCl溶液洗3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去，磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为110MPa，离心分离的时间为15分钟，分离温度为4℃；
S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中4℃透析12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物，离心分离的时间为100分钟，分离温度为4℃；
S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可，透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快，葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量5倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.5ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每2分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。
本发明一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其制备的葡萄糖脱氢酶可应用于生物能源、食品工业、生物化工、生物传感或分析检测中。
综上所述
本发明可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，从而确保了葡萄糖脱氢酶的正常使用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；
S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；
S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；
S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；
S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；
S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快。
3.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中培养瓶的培养基内含有45-50μl/ml的氨苄青霉素。
4.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中离心分离菌体的时间为8-10分钟，分离温度为2-4℃。
5.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为100-110MPa。
6.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中离心分离的时间为10-15分钟，分离温度为2-4℃。
7.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中离心分离的时间为80-100分钟，分离温度为2-4℃。
8.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量2-5倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.2-0.5ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每1-2分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：其制备的葡萄糖脱氢酶可应用于生物能源、食品工业、生物化工、生物传感或分析检测中。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1571841A (zh) * 2001-09-26 2005-01-26 早出广司 葡萄糖脱氢酶
CN101037677A (zh) * 2002-07-04 2007-09-19 究极酵素国际股份有限公司 葡萄糖脱氢酶

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1571841A (zh) * 2001-09-26 2005-01-26 早出广司 葡萄糖脱氢酶
CN101037677A (zh) * 2002-07-04 2007-09-19 究极酵素国际股份有限公司 葡萄糖脱氢酶

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG M等: "Coimmobilization of dehydrogenases and their cofactors in electrochemical bio-sensors", 《ANALYT CHEM》 *
唐江涛等: "葡萄糖脱氢酶高产工程菌的构建及融合蛋白的一步纯化", 《工业微生物》 *
戴锦程等: "葡萄糖脱氢酶融合表达载体的构建", 《检验医学与临床》 *

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