CN113736815A - 一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法 - Google Patents
一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，本发明的方法是通过强化表达产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌功能膜微域中的脚手架蛋白FloA。本发明通过对已高产MK‑7的重组枯草芽孢杆菌BS20中的脚手架蛋白使用强启动子P43进行强化，增加FMMs在细胞质膜上的占比后，进一步提高了MK‑7的产量，与对照菌株BS20相比，强化FloA的重组枯草芽孢杆菌BSQ1产量最高，发酵6天后，BSQ1菌株产量达到417.08mg/L，较BS20菌株提升了16.57％。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，属于代谢技术领域。
背景技术
维生素K作为一类重要的脂溶性维生素，是人体不可缺少的重要维生素之一，在加速凝血、预防心血管硬化和治疗骨质疏松等方面起着关键作用。维生素K以2-甲基-1,4-萘醌为骨架，根据C3位支链结构的不同，可将维生素K分成不同的亚型。其中七烯甲萘醌(Menaquinone-7,MK-7)由于具有在人体中半衰期长、亲缘性高等特点，目前在功能性食品和医药等领域备受关注。发明人课题组前期申请的中国专利目CN110157749B已在枯草芽孢杆菌中达到了较高MK-7产量，但是在研究中发现常规的代谢改造，如强化合成途径、阻断副产物的形成等，很难进一步提高MK-7的产量。
功能膜微域(Functional Membrane Microdomains,FMMs)是细菌细胞脂膜上富含固醇类似物聚异戊二烯化合物的一类结构致密性微域，并且富含特殊的脚手架蛋白。这类脚手架蛋白作为一种膜结合伴侣蛋白，仅定位在FMMs上，可以招募需要定位在FMMs上的蛋白并促进这些蛋白的相互作用以及寡聚化，在组织和形成FMMs的过程中起到重要作用。目前还没有研究表明是否能够通过对枯草芽孢杆菌中的FMMs进行强化，增加FMMs在细胞质膜中的占比，增加MK-7在细胞质膜上的存储空间以提高MK-7的产量。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过对FMMs中的FloA、FloT蛋白进行强化，增加FMMs在细胞质膜上的占比后，进一步提高了MK-7的产量。
本发明的第一个目的是提供一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，所述方法是通过强化表达产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌功能膜微域中的脚手架蛋白FloA。
进一步地，所述的强化表达是通过使用强启动子进行强化表达。
进一步地，所述的强启动子为P43启动子。
本发明的第二个目的是提供一种产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌重组菌，所述的枯草芽孢杆菌重组菌是通过强化表达枯草芽孢杆菌宿主功能膜微域中的脚手架蛋白FloA获得。
进一步地，所述的强化表达是通过使用强启动子P43进行强化表达。
进一步地，所述的强启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌BS20。枯草芽孢杆菌BS20在专利CN110157749B中公开。
进一步地，所述的脚手架蛋白FloA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌重组菌在发酵生产七烯甲萘醌中的应用。
进一步地，所述应用具体是将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，进行发酵培养，获得七烯甲萘醌。
本发明的有益效果是：
本发明通过对已高产MK-7的重组枯草芽孢杆菌BS20中的脚手架蛋白使用强启动子P43进行强化，增加FMMs在细胞质膜上的占比后，进一步提高了MK-7的产量，与对照菌株BS20相比，强化FloA的重组枯草芽孢杆菌BSQ1产量最高，发酵6天后，BSQ1菌株产量达到417.08mg/L，较BS20菌株提升了16.57％。
附图说明：
图1为发酵6天后，BS20、BSQ1、BSQ2、BSQ12菌株发酵生产MK-7的产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
(1)培养基
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：50g/L葡萄糖、50g/L甘油、50g/L大豆蛋白胨、0.6g/L磷酸二氢钾。
(2)MK-7萃取剂：异丙醇和正已烷混合物(1:2,V/V)
(3)HPLC检测MK-7产量：采用Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18分离柱(5μm，250×4.6mm)，检测的温度在40℃，流动相使用甲醇：二氯甲烷(9:1,v/v)，流速为1mL/min，检测波长254nm，进样量10μL。
(4)菌株生长情况检测：使用紫外-可见分光光度计定时测定发酵液的吸光光度值OD600。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌BSQ1、BSQ2的构建
分别将P43启动子通过cre/loxp系统整合在重组枯草芽孢杆菌BS20基因组上floA(yuaG)和floT(yqfB)的上游，构建重组枯草芽孢杆菌BSQ1和BSQ2，具体构建过程如下。
通过重叠延伸PCR，对以下序列进行片段扩增，P43-floA整合框所需的扩增序列为floA上游序列(长度1000bp，序列如SEQ ID NO.1)、氯霉素抗性基因zeo序列(1309bp，序列如SEQ ID NO.2)、P43启动子(0.3bp，序列如SEQ ID NO.3)和floA序列(996bp，序列如SEQID NO.4)。P43-floT整合框所需的扩增序列为floT上游序列(长度1000bp，序列如SEQ IDNO.5)、氯霉素抗性基因zeo序列(1309bp)、P43启动子(0.3bp)和floT序列(1000bp，序列如SEQ ID NO.6)。引物序列见表1，其中floA-P7C6-1R和floA-P43-1F为两个整合框的通用引物。通过融合PCR获得floAup-lox71-zeo-lox66-p43-floA和floTup-lox71-zeo-lox66-p43-floT融合表达框。
表1
将获得的融合表达框片段通过化学转化的方式整合至重组枯草芽孢杆菌BS20基因组中，整合片段的添加量约为1000ng。通过添加氯霉素抗性的LB固体培养基进行筛选、挑取单菌落进行PCR验证、测序验证，确认整合成功。
对整合成功的重组枯草芽孢杆菌进行氯霉素抗性的消除，通过化学转化的方式将Cre质粒转入构建好的重组枯草芽孢杆菌中，经添加卡纳抗生素的LB固体培养基筛选后，通过IPTG诱导Cre质粒的表达，消除抗性基因。Cre质粒的消除通过挑取单菌落接种到LB液体培养基中，50℃摇床培养12h消除。通过点板无抗、添加氯霉素抗生素、添加卡纳抗生素的LB平板进行筛选，挑选成功消除氯霉素抗性和Cre质粒的单菌落，最后得到分别整合P43-floA和P43-floT的重组枯草芽孢杆菌，命名为BSQ1和BSQ2。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌BSQ12的构建
在实施例1得到的BSQ1的基础上采用与实施例1类似的方法，将P43启动子整合在BSQ1基因组上floT的上游，构建重组枯草芽孢杆菌BSQ12。
将实施例1构建好的floTup-lox71-zeo-lox66-p43-floT融合表达框通过化学转化的方式转入BSQ1中，经氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序、转入Cre质粒、卡纳抗性平板筛选、IPTG诱导表达、Cre质粒消除、点板验证，最后获得整合P43-floA和P43-floT表达框的重组枯草芽孢杆菌BSQ12。
实施例3：菌株发酵生产MK-7
(1)种子液制备
将重组枯草芽孢杆菌BS20、以及实施例1、2中构建的BSQ1、BSQ2、BSQ12挑取单菌落分别接种到15mL摇菌管中，每管含有2mL液体种子培养基，在37℃、220rpm条件下摇床培养10h。BS20作为对照，每株菌三个平行。
(2)发酵培养
将步骤(1)得到的种子液按照10％的接种量接种到250mL锥形瓶中，每瓶装有发酵培养基20mL，于41℃、220rpm条件下摇床培养3d，每隔24h取样进行OD600的检测和样品的制备。具体方法如下。
每天取发酵液1.2mL。取20μL发酵液，用无菌水稀释50倍，摇晃均匀，进行OD600的检测；取500μL发酵液加入到4倍体积的MK-7萃取剂中，涡旋振荡提取10min后，滤出提取液，8000r/min离心5min。收集上清液，HPLC检测全细胞组分MK-7的含量。检测结果见图1。发酵6天后，BSQ1菌株产量达到417.08mg/L，较BS20菌株提升了16.57％；BSQ2菌株在发酵前期MK-7含量略有增加，发酵后期产量明显降低；BSQ12菌株在发酵过程中MK-7含量均低于对照，后期下降幅度增大。结果表明强化FMMs脚手架蛋白合成基因floA、floT对MK-7产量的合成是有影响的，其中floA对MK-7的合成有一定的正向效果，达到了提升MK-7产量的效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
agatcacatt tatatggcgc ctggcggaaa aatgggagcc gccgcgattg ttgatggcca 60
aggcaatgcc gctgaccaaa aagctcaatc actttggctg gcagagatgg aagatgccgc 120
agtgaaaaat aaccgcgatc caaaatatgc gctcgcaatg gctgacccag atatagatgc 180
caaggaagtt ggcgcgccta agggagatct gctgacactt aacgcagaca aggcgattga 240
ggtaggctat tcagaaggca ctgctgacaa tttgtccacg ctcgtaaaga agcttgggtt 300
cgaaaaggcg cagatcagct atgcaaagga gagctttgcg gaaaagacgg caagatggct 360
gacgaatccg gtcattgtcc ctattctgct gacaatcgct tttttaggtc tgacggtaga 420
gcttttttcc ccgggtgtcg gcctccctgg aacggctgga ctcattgcgt tattgctgtt 480
cttttacggg catcttgcag ccggccttgc cgggtatgag acggttctcc tctttatagc 540
aggggtgatt ctcattctgc ttgagatttt tcttcccgga ggaatcattg gattactggg 600
cttgggagcg attattgcga gcctgttttt agccgcgggg agcttcactg tcatggcggt 660
ttctctcttg atcgcctcag ctgtttcgat tacagctttt attttactga caagggtgtt 720
gggaaagcgt atgaaattct ttaagaaatt gatattaaat gattctacaa acacggagag 780
cggctacgtt tcaaatcaaa cgcgcacgga cttaatggga aaagtgggta taacctttac 840
accgctgcgt ccttccggta ccgtgattat tgatgatgaa cgccttgacg ttgtatcgga 900
gggatcgttt acagaaaaag ataaaaaagt aaaagtgata aaagtagaag gctcacgcat 960
tgtcgtgaga gaaatttaaa tagaaacgag gagaagttat 1000
<210> 2
<211> 1309
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg 60
tacccgggga tcctctagag attgtaccgt tcgtatagca tacattatac gaagttatgc 120
catagtgact ggcgatgctg tcggaatgga cgacggcaat agttaccctt attatcaaga 180
taagaaagaa aaggattttt cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca 240
ttttttaatg tggtctttta ttcttcaact aaagcaccca ttagttcaac aaacgaaaat 300
tggataaagt gggatatttt taaaatatat atttatgtta cagtaatatt gacttttaaa 360
aaaggattga ttctaatgaa gaaagcagac aagtaagcct cctaaattca ctttagataa 420
aaatttagga ggcatatcaa atgaacttta ataaaattga tttagacaat tggaagagaa 480
aagagatatt taatcattat ttgaaccaac aaacgacttt tagtataacc acagaaattg 540
atattagtgt tttataccga aacataaaac aagaaggata taaattttac cctgcattta 600
ttttcttagt gacaagggtg ataaactcaa atacagcttt tagaactggt tacaatagcg 660
acggagagtt aggttattgg gataagttag agccacttta tacaattttt gatggtgtat 720
ctaaaacatt ctctggtatt tggactcctg taaagaatga cttcaaagag ttttatgatt 780
tatacctttc tgatgtagag aaatataatg gttcggggaa attgtttccc aaaacaccta 840
tacctgaaaa tgctttttct ctttctatta ttccatggac ttcatttact gggtttaact 900
taaatatcaa taataatagt aattaccttc tacccattat tacagcagga aaattcatta 960
ataaaggtaa ttcaatatat ttaccgctat ctttacaggt acatcattct gtttgtgatg 1020
gttatcatgc aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact 1080
ggcttttata atatgagata atgccgactg tactttttac agtcggtttt ctaacgatac 1140
attaataggt acgaaaaagc aacttttttt gcgcttaaaa ccagtcatac caataaataa 1200
cttcgtatag catacattat acgaacggta gaatcgtcga cctgcaggca tgcaagcttg 1260
gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgtta 1309
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
<210> 4
<211> 996
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
atggatccgt caacacttat gattctggca attgtcgcag tagcgatcat tgttttggca 60
gtatttttta catttgtgcc tgtaatgctt tggatttcag ctttggcagc cggagtgaaa 120
atcagcattt tcactctagt tgggatgagg cttcgccgcg tcattccgaa tcgggttgtt 180
aacccgctga ttaaagcgca taaagcggga cttaatgttg gaacaaacca gcttgaaagc 240
cactatctgg ctggaggtaa tgttgacaga gtcgtcaacg cgcttatcgc cgctcagcga 300
gctaacattg aactcacatt cgagcgctgt gctgccattg atcttgcagg ccgggacgtg 360
ttggaagctg ttcaaatgag cgttaatcct aaggtgattg aaacaccgtt cattgccggc 420
gtcgcaatgg acgggattga agtgaaagcg aaagcgagaa tcacagtaag agcgaatatc 480
gagcgcctcg tcgggggagc aggggaagaa accattgtag ctcgtgtagg tgagggaatc 540
gtttctacaa tcggttcatc tgataatcat aaaaaagtgc ttgaaaaccc tgacatgatt 600
tctcagacag tccttggaaa aggattggac tcaggaactg cgtttgaaat tctctcaatt 660
gatattgcag atgtagatat cggcaaaaac atcggggcaa ttttacaaac cgatcaggcc 720
gaggctgata aaaacatcgc gcaggcaaaa gcggaagaac gacgtgcgat ggctgtcgct 780
caagaacagg aaatgcgtgc ccgcgtagaa gaaatgcgcg cgaaagtagt agaagccgag 840
gcggaagtgc cgcttgcgat ggcagaagct ttgcgtgaag ggaatattgg cgtcatggat 900
tacatgaata tcaagaacat cgatgctgac acagaaatgc gtgattcatt cggcaagctg 960
acgaaagacc cttcggatga agaccgcaaa tcataa 996
<210> 5
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ttggctgcct gaaataaaat catgcgcagg ctcaagatga ctcggggctt tccgtttatt 60
atttctgtcc tgtgctactt caagcggttt ttcttcaatt tctttaatcg gagcgtcctt 120
tacacgttcc ttcaacattt tttgtgcggt catatcgatt tttttcaaat ggtcaagaac 180
ttcccgtatg ctccattctt cagcagaagg cttttgattc agcttttcgt cagaaagtcc 240
tttcaattcg ttccacgttt ctaatctggc ttcattaaag atactcatca tatctcctcc 300
taaaatgaca ttaccatata tataagcaat tatcatttat aaagcacttc aaatgggtta 360
tttgtcttaa aattttgaaa cttttcccga ggtgtctcgt ataaatggta acggcagccg 420
ttcatcaatg cattgatgaa gaaaggatga ggaagttgga gttatttgga gtacctatac 480
aaacaatgta tctttatacg cttattattg cgggcagcct tacgctgtta ttcctgtttt 540
tcggagatgt attttcaggg ctgtcagaag gcattccgtt tcttaatccg acattagtgc 600
tctcattttt tacatgtttt tcagcgggcg gatatatagg tgaacttgta ttgcctctgt 660
caagcttgct gattgcgctt ttatcttgca tcctttcgat catgctggtg gtattgcttc 720
acatctttgt actggtgcca ttatcatctg cagaagaatc attggcatat agagaagatg 780
atctcagagg aagactcggt aaagtgatta cagctgtgcc ggttgacggg tttggtgaag 840
tggtcataga agggataggc gggaccattt caaagtcagc ggtcagtttt gataatcagc 900
agatcagtta cgggacaacg gtgttagtcg tagatattaa caacggagtt ctttcggtta 960
ctccgcatga acccatttaa cataaaagga ggaatttgat 1000
<210> 6
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atgacaatgc cgattataat gatcatcgga gttgtattct ttttattaat tgcactaata 60
gctgtgttta ttacgaagta tcgtacagca gggcctgatg aagcgttaat tgtaacaggg 120
agctatctgg gtaataaaaa tgttcatgtc gatgaaggcg gcaaccgtat taaaatcgtc 180
cgcggcggag gaacctttgt ccttcccgtc ttccagcagg cagagccgct aagcctatta 240
tcaagcaaac tcgatgtttc gacacctgaa gtctatacag aacaaggagt gccagtaatg 300
gccgatggaa ctgcgattat taaaatcggc ggttctatag gagaaatcgc tacagcggcc 360
gaacaatttt tagggaaatc aaaagacgac cgtgagcagg aagcgcggga ggttttagaa 420
ggccaccttc gttccattct cggctcaatg acagtagaag aaatctataa aaacagagaa 480
aaattctctc aagaggtgca gcgtgtcgct tcacaggatc tcgcgaaaat gggacttgta 540
atcgtctcgt ttaccattaa agatgttcgt gataaaaacg gttatcttga atcattaggg 600
aaaccgagaa ttgcccaagt aaaacgcgat gctgatatcg caacagcaga ggctgataaa 660
gaaacccgaa ttaagcgggc agaagccgat aaagacgcaa aaaaatcaga acttgaacgg 720
gcgacggaaa tcgctgaagc tgaaaaaatc aatcagctca aaatggctga attccgcaga 780
gaacaagata cggcaaaagc gaatgccgac caagcatatg atttagagac tgcccgagcg 840
cgccagcaag tcacagagca ggaaatgcag gttaaaatta tcgaacgcca aaaacaaata 900
gaactagaag aaaaagaaat tcttcgccgt gaacgtcaat acgactcaga ggtaaagaaa 960
aaagccgatg cagaccgtta ttctgttgag cagtccgcag 1000
Claims (10)
1.一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，其特征在于，所述方法是通过强化表达产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌功能膜微域中的脚手架蛋白FloA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的强化表达是通过使用强启动子进行强化表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的强启动子为P43启动子。
4.一种产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌重组菌是通过强化表达枯草芽孢杆菌宿主功能膜微域中的脚手架蛋白FloA获得。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的强化表达是通过使用强启动子P43进行强化表达。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的强启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌BS20。
8.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的脚手架蛋白FloA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
9.权利要求4～8任一项所述的枯草芽孢杆菌重组菌在发酵生产七烯甲萘醌中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用具体是将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，进行发酵培养，获得七烯甲萘醌。
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