JP2003230392A - 耐熱性ラッカーゼ、その遺伝子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 耐熱性ラッカーゼを遺伝子工学的に大量製造
することができる方法を提供すること。 【解決手段】 耐熱性ラッカーゼをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクター
を含む形質転換体および該形質転換体を培養することに
よる耐熱性ラッカーゼの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性ラッカー
ゼ、耐熱性ラッカーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する組換
えべクター、該組換えべクターを有する形質転換体、該
形質転換体を用いた耐熱性ラッカーゼの製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ラッカーゼは、ポリフェノールオキシダ
ーゼ、ウルシオールオキシダーゼとも呼ばれ、酸素の存
在下、フェノール性化合物を酸化する酵素である。さら
に、ラッカーゼは、リグニン分解作用、ウルシオールや
ラッコールなどのフェノール性化合物、ｐ−フェニレン
ジアミンなどの芳香族アミン、タンパク質などの酸化重
合作用を有するため、例えば、毒性の強いフェノール性
化合物や芳香族アミンを含む廃液の処理、環境汚染物質
の解毒化、パルプ製造処理等におけるリグニンの除去、
人工漆の製造、コンクリート混和剤の合成、ココア、コ
ーヒーおよび紅茶の褐変処理、化粧品用メラニン製造、
食品のゲル化剤、臨床検査試薬、漂白剤としての利用な
ど多くの産業分野への利用が期待されている（例えば、
非特許文献１、特許文献１参照）。

【０００３】ラッカーゼおよびポリフェノールオキシダ
ーゼは、一般に自然界に広く存在しており、微生物起源
のものも多く知られている。その生産菌としては、ピク
ノポラス・コクシネウス、コリオラス・ヴエルシカラ
ー、トラメテス・エスピーＨａｌなどの担子菌類、ボツ
チリス・シネレアなどの不完全菌類に属する糸状菌など
が知られている（例えば、非特許文献２および３参
照）。これらの菌は、培養時の生育速度が非常に遅く、
概して大量培養が困難である。また、これらの菌由来の
ラッカーゼの生産性を向上させるためには、遺伝子操作
や変異体の作製が必要となるが、菌類が有する複雑な生
活環や、イントロンの存在などの遺伝子構造の複雑さ、
糖タンパク質であるため生育速度が早い原核生物を宿主
とした発現が難しいなど、多大な労力を必要とする。こ
のような理由から、菌類より安定かつ安価にラッカーゼ
を大量生産することは非常に困難であった。また、これ
らの酵素は、概して熱安定性が低く（＜６０℃）、毒性
廃液の処理、パルプ製造処理におけるリグニンの除去な
ど夏期の屋外での使用には不適であった。

【０００４】以上の理由より、産業上において利用する
ためには、耐熱性に優れ、遺伝子操作や変異体の作製が
容易な原核生物由来のラッカーゼまたはポリフェノール
オキシダーゼが望まれていた。

【０００５】このような問題点を解決するために、本発
明者らは、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属
する土壌分離菌が、耐熱性の新規ラッカーゼを菌体内に
生産することを見出し、この耐熱性ラッカーゼおよびそ
の製造方法について既に特許を出願している（特許文献
２参照）。

【０００６】

【非特許文献１】Haglund C, Levin L, Forchiassin F,
Lopez M, Viale A.; Rev Argent Microbiol., 34(3):1
57-62(2002)

【非特許文献２】Gomez-Alarcon G, Lahoz R, Saiz-Jim
enez C.; Microbiologia. 1986., 2(2): 97-103

【非特許文献３】Hess J, Leitner C, Galhaup C, Kulb
e KD, Hinterstoisser B, Steinwender M, Haltrich
D.; Appl Biochem Biotechnol. 2002., 98-100: 229-41

【特許文献１】特開２００１−２４５６５４号公報

【特許文献２】特開２００２−１７１９６８号公報

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記の発明により、耐
熱性に優れ、遺伝子操作や変異体の作製の容易な原核生
物由来のラッカーゼが得られ、その精製も容易に行うこ
とが可能となった。しかしながら、本酵素が菌体内酵素
であり、産生が少量であるために、生産効率が非常に悪
く、ラッカーゼの大量生産が困難であるという問題点は
依然として未解決であった。本発明は、以上のとおりの
事情を鑑みてなされたものであり、上記の耐熱性ラッカ
ーゼを遺伝子工学的に大量製造するための遺伝子操作材
料と、この材料を用いた耐熱性ラッカーゼの製造方法を
提供することを目的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意研究の結果、放線菌の一種
であるストレプトミセス属に属する土壌分離菌が産生す
る耐熱性ラッカーゼの遺伝子を単離し、その遺伝子のＤ
ＮＡ塩基配列を解明することにより、本発明に到達し
た。

【０００９】すなわち、本発明は以下の通りである。 〔１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの蛋白質： （ａ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
る蛋白質、（ｂ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸
配列中アミノ酸番号２０〜６３１で示されるアミノ酸配
列からなる蛋白質、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のア
ミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠
損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列
からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質。 〔２〕 上記〔１〕の蛋白質をコードするＤＮＡ。 〔３〕 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ： （ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号
２６６〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号
３１１〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において１も
しくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修
飾された塩基配列からなり、かつラッカーゼ活性を有す
る蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）
上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコ
ードする塩基配列からなるＤＮＡ。 〔４〕 上記〔２〕または〔３〕のＤＮＡを含有する組
換えべクター。 〔５〕 上記〔４〕の組換えべクターを含む形質転換
体。 〔６〕 上記〔５〕の形質転換体を培地中で培養し、培
養物から上記〔１〕の蛋白質を採取することを特徴とす
る上記〔１〕の蛋白質の製造方法。 〔７〕 上記〔１〕の蛋白質を、変性剤および還元剤に
接触させることを含む、上記〔６〕記載の方法。 〔８〕 上記〔１〕の蛋白質を、変性剤および還元剤に
接触させることを含む、上記〔１〕の蛋白質の単離およ
び／または精製方法。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の耐熱性ラッカーゼは、熱
安定性に優れ、ラッカーゼ活性（すなわち、酸素の存在
下、フェノール性化合物を酸化する）を有する、配列表
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質であ
る。また、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中
アミノ酸番号１〜１９のアミノ酸配列は、天然型ラッカ
ーゼには存在しない。したがって、該ラッカーゼは、該
配列が切断されることにより成熟型となると考えられ
る。

【００１１】本発明における「耐熱性」とは、後述する
酵素電極法で活性を測定した場合、ｐＨ７．０の緩衝液
中で約７０℃までの温度で１０分間保持したとき、８０
％以上（好ましくは９０％以上）の残存活性（３０℃の
ときの活性を１００％とする）を示す性質をいう。

【００１２】本発明の耐熱性ラッカーゼは、熱安定性に
優れ、ラッカーゼ活性を有する限り、上記配列番号１で
示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミ
ノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミ
ノ酸配列を有するものであってもよい。このような変異
体は、自然または人工の突然変異により生じた突然変異
体の中からスクリーニングすることができ、或いは耐熱
性ラッカーゼ遺伝子を用いて部位特異的突然変異誘発を
導入することによって得ることができる。当業者であれ
ば、部位特異的突然変異誘発に際してラッカーゼ活性を
保持する変異を容易に予測することができる。例えば、
保存的置換（conservative substitution）として知ら
れるアミノ酸置換（例えば、アラニンからセリン、アル
ギニンからリシンへの置換等）等が挙げられる。また、
本発明の耐熱性ラッカーゼの場合、上述した配列表配列
番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜１９
のアミノ酸配列はラッカーゼ活性に必須ではないので、
この領域でのアミノ酸の欠損、置換、挿入、付加もしく
は修飾は、通常、ラッカーゼ活性に影響しないものと考
えられる。

【００１３】上記配列番号１に示されるアミノ酸配列に
おいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿
入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列としては、例
えば、（１）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列
中Ｎ末端のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が欠損したもの、
（２）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮま
たはＣ末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列が付加したもの、
（３）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末
端にＧＳＴ・ｔａｇ配列が付加したもの、などが挙げら
れる。

【００１４】本発明の耐熱性ラッカーゼは、そのアミノ
酸組成の違いにより異なる分子量を有していてもよい
が、好ましくは約６８．７ｋＤａの分子量（配列表配列
番号１からの推定）を有する。また、その成熟型は、約
６６．７ｋＤａの分子量（配列表配列番号１のアミノ酸
番号２０〜６３１からの推定）を有する。

【００１５】本発明の耐熱性ラッカーゼは、活性中心に
４つの銅イオン（Ｃｕ²⁺）を有する銅タンパク質であ
る。銅タンパク質中に含まれるＣｕ²⁺は、分光学的、Ｅ
ＳＲ的に大きく３種に区別される。すなわち、青色を呈
しＥＳＲで検出されるタイプＩＣｕ²⁺、フリーなＣｕ²⁺
と類似の挙動を示し、ＥＳＲで検出されるタイプIIＣｕ
²⁺、２つのＣｕ²⁺から構成され、反強磁性相互作用によ
りＥＳＲで検出されないタイプIIIＣｕ²⁺に区別され
る。耐熱性ラッカーゼが活性型となるには、それら全て
のタイプのＣｕ²⁺の配位が必要であると考えられる。該
Ｃｕ²⁺が配位する位置は、他のラッカーゼのアミノ酸配
列との比較により、配列表配列番号１に示されるアミノ
酸配列中、タイプＩＣｕ²⁺が５９０番目のシステイン残
基（Ｃｙｓ）、５１１、５９５番目のヒスチジン残基
（Ｈｉｓ）、タイプIIＣｕ²⁺が１４５、５１４番目のヒ
スチジン残基（Ｈｉｓ）、２つのタイプIIIＣｕ²⁺が１
４７、１８５、１８７、５１６、５８９、５９１番目の
ヒスチジン残基であると推定される。

【００１６】本発明の耐熱性ラッカーゼは、好ましくは
以下の酵素学的性質を有する。

【００１７】（ａ）作用 フェノール性化合物を酸化する。例えば、カテコール、
レゾルシノール、ハイドロキノン、ピロガロール、L-3,
4-ジヒドロキシフェニルアラニン、クレゾール、グアヤ
コール、L-チロシン、p-フェニレンジアミン、p-トルイ
ジンおよびL-アスコルビン酸を酸化することができる。

【００１８】（ｂ）至適反応ｐＨ ３０℃でカテコールを基質としたときの活性を指標とす
ると、本発明の酵素の反応に好適なｐＨは４．０〜６．
０であり、至適反応ｐＨは約４．５である。

【００１９】（ｃ）安定ｐＨ範囲 ３０℃で２０時間保持した後の残存活性を指標とする
と、本発明の酵素の安定ｐＨ範囲は６．５〜１０．５で
ある。すなわち、ｐＨ６．５〜１０．５、３０℃で２０
時間保持した場合、８０％以上の残存活性（ｐＨ８．０
のときの活性を１００％とする）を示す。

【００２０】（ｄ）至適反応温度 ｐＨ４．５の緩衝液中でカテコールを基質としたときの
活性を指標とすると、本発明の酵素の反応に好適な温度
は２５〜７０℃であり、至適反応温度は約５０℃であ
る。

【００２１】（ｅ）熱安定性 ｐＨ７．０の緩衝液中で１０分間保持した後の残存活性
を指標とすると、本発明の酵素は約７０℃まで安定であ
る。すなわち、ｐＨ７．０、約７０℃までの温度で１０
分間保持した場合、８０％以上の残存活性（３０℃のと
きの活性を１００％とする）を示す。

【００２２】（ｆ）７０℃での熱安定性 ｐＨ７．０の緩衝液中で７０℃にて保持した後の残存活
性を指標とすると、本発明の酵素は１時間まで安定であ
る。すなわち、７０℃の温度で１時間までの時間保持し
た場合、８０％以上の残存活性（７０℃で保持する前の
活性を１００％とする）を示す。

【００２３】（ｇ）基質特異性 ｐＨ４．５の緩衝液中で３０℃で反応させたときの活性
を指標とすると、本発明の酵素は、カテコール、レゾル
シノール、ハイドロキノン、ピロガロール、クレゾー
ル、グアヤコール、p-フェニレンジアミン、p-トルイジ
ン、L-チロシン、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニ
ン、L-アスコルビン酸を酸化する。

【００２４】本発明の耐熱性ラッカーゼは、上記の配列
的および酵素学的特徴を有する限り、その由来は特に限
定されない。したがって、天然に存在する生物起源のも
のの他、自然もしくは人工の突然変異体、あるいは異種
（すなわち、外来の）耐熱性ラッカーゼ遺伝子を導入し
て得られる形質転換体由来のものもすべて包含される。
好ましくは放線菌、より好ましくはストレプトミセス属
に属する細菌、特に好ましくはストレプトミセス・ラベ
ンデュラエ（Streptomyces lavendulae）、就中ストレ
プトミセス・ラベンデュラエ ＲＥＮ−７株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１８０２６）由来のもの（これらの細菌から単離
される耐熱性ラッカーゼ遺伝子が導入された形質転換体
由来のものも包含する）である。

【００２５】本発明の耐熱性ラッカーゼの好ましい起源
であるストレプトミセス・ラベンデュラエ ＲＥＮ−７
株は、本発明者らによって土壌から分離された細菌であ
り、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン
ター（旧称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所、住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）
に２０００年９月８日付で国内寄託され、受託番号とし
て、生命研菌寄第１８０２６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８０
２６）を付されている菌株である。また、１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子の塩基配列を基にした系統樹分析から、本菌
株は、ストレプトミセス・ラベンデュラエ・エスエスピ
ー・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae ssp. l
avendulae）と近縁であることがわかっている。

【００２６】人工的に突然変異体を作製する方法として
は、例えば、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。当
該方法を用いて配列表配列番号１に示される塩基配列に
任意の変異をもたらすことによって、上記特徴を具備す
る変異耐熱性ラッカーゼを得ることができる。

【００２７】本発明の耐熱性ラッカーゼは、（１）該酵
素を産生する組織または細胞を原料として抽出精製する
方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子
組換え技術により耐熱性ラッカーゼを発現するように操
作された細胞から精製する方法等を適宜用いることによ
って取得することができる。

【００２８】天然の耐熱性ラッカーゼ産生細胞からの耐
熱性ラッカーゼの単離および／または精製は、例えば以
下のようにして行うことができる。天然の耐熱性ラッカ
ーゼ産生菌（例えば、ストレプトミセス・ラベンデュラ
エ ＲＥＮ−７株）を、適当な培地、好ましくはポリペ
プトン−酵母エキス培地〔ポリペプトン０．５％、酵母
エキス０．１％、硫酸鉄０．００１％、硫酸銅０．００
０１％（ｐＨ７．０）〕中で培養し、対数増殖期にある
菌体の培養液からラッカーゼ活性画分（耐熱性ラッカー
ゼを分泌する細胞の場合は培養上清、ストレプトミセス
・ラベンデュラエ ＲＥＮ−７株のように耐熱性ラッカ
ーゼを菌体内に蓄積する細胞の場合は、細胞を適当な緩
衝液中、超音波処理や界面活性剤処理によって破砕した
後、遠心分離等を行うことにより得られる可溶性画分）
を分離回収して、該画分から蛋白質の分離精製に常套的
に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより、
耐熱性ラッカーゼを精製することができる。このような
分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶
解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、
アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性
を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなど
の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等
電点の差を利用する方法等が挙げられるが、これらに限
定されない。

【００２９】化学合成による本発明の耐熱性ラッカーゼ
の製造は、例えば、配列表配列番号１に示されるアミノ
酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合
成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条
件下で再生（renaturation）させることにより行うこと
ができる。

【００３０】本発明の好ましい実施態様においては、本
発明の耐熱性ラッカーゼは、該酵素をコードするＤＮＡ
をクローニングし、該ＤＮＡを担持する発現ベクターを
含む形質転換体の培養物から単離および／または精製す
ることにより製造することができる。

【００３１】耐熱性ラッカーゼ遺伝子のクローニング
は、以下の方法により行うことができる。まず、所望の
酵素を産生する細胞または組織より、上記のような手段
により該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミ
ノ酸配列をエドマン分解法を用いて決定する。あるいは
ペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物
質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのア
ミノ酸配列を同様にエドマン分解法により決定する。決
定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞ま
たは組織より調製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）また
はゲノムＤＮＡライブラリーから、コロニー（若しくは
プラーク）ハイブリダイゼーション法などによって該酵
素をコードするＤＮＡをクローニングする。

【００３２】また、完全または部分精製された酵素の全
部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法に
したがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織よ
り調製されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー
から、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードす
るＤＮＡをクローニングすることもできる。

【００３３】目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素
の遺伝子が公知である場合、ＥＭＢＬやＧｅｎＢａｎｋ
などの一般に利用可能なデータベース上に登録されたＥ
ＳＴ（Expressed Sequence Tag）クローンなどのＤＮＡ
断片の中から、該公知遺伝子の塩基配列とホモロジーを
有するクローンを検索し、抽出されたクローンの塩基配
列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニ
ー（若しくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によ
って該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすること
もできる。

【００３４】また、上記のストラテジーとは別に、本発
明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法
を用いて直接クローニングすることができる。すなわ
ち、該酵素活性を有する細胞または組織由来のゲノムＤ
ＮＡまたはｃＤＮＡ（若しくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、
増幅断片が耐熱性ラッカーゼのコード領域をカバーする
ような適当なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとし
て用いて、常法に従ってＰＣＲを行うことにより、耐熱
性ラッカーゼのコード領域を含むＤＮＡ断片を増幅する
ことができる。このような方法は、配列既知の耐熱性ラ
ッカーゼと分子進化上、同一の起源を有する耐熱性ラッ
カーゼ遺伝子のクローニングにおいて特に有用である。
例えば、ストレプトミセス・ラベンデュラエ ＲＥＮ−
７株由来の耐熱性ラッカーゼと分子進化上、同一の起源
を有すると推定される他の細菌由来の耐熱性ラッカーゼ
遺伝子をクローニングする場合、配列表配列番号２に示
される塩基配列中塩基番号２６６〜２１５８を含むＤＮ
Ａ断片と高度に相同性を有するＤＮＡ断片を増幅し得る
ようなセンスおよびアンチセンスプライマーを構築して
ＰＣＲ法を実施すればよい。

【００３５】また、目的の耐熱性ラッカーゼと高度な相
同性を有する耐熱性ラッカーゼのＤＮＡ配列が未知の場
合でも、例えば、５'上流領域の比較的保存されている
幾つかの配列をセンスプライマー、３'下流領域の比較
的保存されている幾つかの相補鎖配列をアンチセンスプ
ライマーとして、ＰＣＲを行うことにより、該耐熱性ラ
ッカーゼ遺伝子をクローニングすることができる。この
際、耐熱性ラッカーゼ遺伝子全部をコードするＤＮＡの
増幅断片ではなく、その一部を含むＤＮＡの増幅断片が
得られることもあるが、この場合、当該ラッカーゼ活性
を有する細胞または組織由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、該増幅断片をプ
ローブとして用いて、サザン法等のハイブリダイゼーシ
ョン法により、該酵素をコードするＤＮＡを直接クロー
ニングすることができる。

【００３６】上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配
列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法などの公
知のシークエンス技術を用いて決定することができる。

【００３７】本発明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤ
ＮＡとしては、（i）配列表配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、（ii）配
列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸配列
２０〜６３１からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、（ii
i）上記（i）または（ii）のいずれかのアミノ酸配列に
おいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿
入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、か
つラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡな
どが挙げられる。

【００３８】好ましくは、（ａ）配列表配列番号２に示
される塩基配列中塩基番号２６６〜２１５８で示される
塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列表配列番号２に示
される塩基配列中塩基番号３１１〜２１５８で示される
塩基配列からなるＤＮＡ、（ｃ）上記（ａ）または
（ｂ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠
損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列から
なり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードする
塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の
いずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつラ
ッカーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列から
なるＤＮＡである。

【００３９】本発明において、「ストリンジェントな条
件」とは、塩基配列において約６０％以上の同一性を有
するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリ
ンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の
際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調
節することができる。

【００４０】上記（ｃ）のＤＮＡとしては、例えば、
（i）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡの５'または３'
末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からな
るＤＮＡが付加したもの、（ii）上記（ａ）または
（ｂ）のＤＮＡの５'末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列をコー
ドする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、（ii
i）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡの５’または３’
末端にＴｒｘ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からな
るＤＮＡが付加したもの、などが挙げられる。

【００４１】上記（ｄ）のＤＮＡとしては、例えば、
（i）細菌由来のラッカーゼをコードする塩基配列から
なるＤＮＡ、（ii）放線菌由来のラッカーゼをコードす
る塩基配列からなるＤＮＡ、（iii）ストレプトミセス
属由来のラッカーゼをコードする塩基配列からなるＤＮ
Ａ、などが挙げられる。

【００４２】本発明の遺伝子はいかなる方法で得られる
ものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡから調製される
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーから調製されるゲ
ノムＤＮＡ、化学的に合成されるＤＮＡ、ＲＮＡまたは
ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られる
ＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築され
るＤＮＡ等が挙げられる。

【００４３】また、本発明の耐熱性ラッカーゼをコード
するＤＮＡは、配列表配列番号２に示される塩基配列を
基にして、化学的に合成されるＤＮＡであってもよい。

【００４４】本発明はまた、本発明の耐熱性ラッカーゼ
をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞
の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるもの
であれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイル
スベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡
便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニ
ングベクターまたは発現ベクターに、上記の耐熱性ラッ
カーゼをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガ
ーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはア
ダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製するこ
とができる。このようなベクターとしては、宿主が細菌
の場合、大腸菌由来のｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−
３２ａ（＋）等のｐＥＴ系ベクター、ｐＧＥＸ−６Ｐ−
１等のｐＧＥＸ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２
５等のｐＢＲ系ベクター、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の
ｐＵＣ系ベクター等、枯草菌由来のｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｐ５、ｐＣ１９４等、放線菌由来のｐＩＪ７０２、ｐＳ
Ｋ1、ｐＳＫ２、ＳＣＰ２、ＳＣＰ１．２、ｐＧＡ４８
２、ｐＭＣＸｐｒｅｓｓ、または酵母由来のｐＳＨ１
９、ｐＳＨ１５等が例示される。また、ウイルスベクタ
ーとしては、λファージなどのバクテリオファージや、
ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などのパ
ポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭ
ｕＬＶ）などのレトロウイルス、アデノウイルス（Ａｄ
Ｖ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイ
ルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイル
スが例示される。

【００４５】特に、本発明の組換えベクターは、耐熱性
ラッカーゼをコードする遺伝子を機能的に含む発現ベク
ターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに
適合する宿主細胞内で該遺伝子（ＤＮＡ）が転写され、
それにコードされる蛋白質が産生され得るように該遺伝
子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロ
モーター領域、開始コドン、耐熱性ラッカーゼまたはそ
の各サブユニットをコードする遺伝子、終止コドンおよ
びターミネーター領域が連続的に配列された発現カセッ
トを有するベクターである。使用されるベクターとして
は、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機
能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得
るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒ
ｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモ
ーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモータ
ー、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、
宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター
等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロ
モーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピー
ト、アデノウイルス由来初期プロモーターなどのウイル
スプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、す
なわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領
域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限
酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで
切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結さ
れたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択の
ための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピ
シリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノ
スリシンなどの薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、
栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有して
いることが好ましい。さらに、挿入される耐熱性ラッカ
ーゼをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドン
を含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴ
Ｇ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、
それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター
領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。

【００４６】宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に
発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネ
ーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製
可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域
は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびShine-Da
lgarno（ＳＤ）配列を包含する。

【００４７】宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞
を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、耐
熱性ラッカーゼ ｍＲＮＡの５'側および３'側の非翻訳
領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが
好ましい。

【００４８】また、形質転換体の培地中に耐熱性ラッカ
ーゼを分泌させる場合において、挿入される耐熱性ラッ
カーゼをコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード
配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに
続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベ
クターが好ましく使用される。取得を目的として耐熱性
ラッカーゼを培地中へ分泌させるためには本発明の発現
ベクターはシグナル配列を機能的に含有していることが
好ましい。当該シグナル配列は宿主細胞の蛋白質の分泌
機構が認識できるものであれば特に限定されないが、宿
主細胞が放線菌の場合、本発明の耐熱性ラッカーゼをコ
ードする遺伝子とその由来を同じくするストレプトマイ
セス属のものが好ましい。該シグナル配列は細胞内のプ
ロテアーゼにより切断除去されて成熟蛋白質が細胞外に
分泌される。

【００４９】本発明の形質転換体は、本発明の耐熱性ラ
ッカーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形
質転換された宿主細胞である。宿主細胞は使用する組換
えベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特
に限定されず、当分野で通常使用される天然に存在する
細胞あるいは人工的に作製された変異体細胞若しくは組
換え体細胞等種々の細胞が利用できる。本発明で用いら
れる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、
形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明
の技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは
人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞等種々の
細胞が利用できる。好ましくは細菌、特に大腸菌（例え
ばＢＬ２１、ＪＭ１０９、ＤＨ５、ＨＢ１０１等）、枯
草菌、シュードモナス属細菌（例えばシュードモナス・
フルオレセンス等）、ストレプトミセス属細菌（例えば
ストレプトミセス・リビダンス等）、シュードストレプ
トミセス属細菌、アセトバクター属細菌等が挙げられ
る。

【００５０】発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公
知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌の場
合は、Cohen らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
69,2110 (1972)）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Gen
et., 168、 111 (1979) ）、コンピテント法（J. Mol.
Biol., 56, 209 (1971) ）等によって、酵母の場合は、
Hinnenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1
927 (1978)）、リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163
(1983)）等によって、動物細胞の場合は、Grahamの方法
（Virology, 52, 456 (1973)）等によって、また昆虫細
胞の場合は、Summers らの方法（Mol. Cell. Biol.3, 2
156-2165 (1983)）等によって、それぞれ形質転換する
ことができる。

【００５１】本発明の耐熱性ラッカーゼは、好ましくは
上記のようにして調製される耐熱性ラッカーゼ発現ベク
ターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養
物から耐熱性ラッカーゼを回収することによって製造す
ることができる。

【００５２】使用される培地は、宿主細胞（形質転換
体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒
素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例
えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ
糖等が、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例え
ばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液等が例示される。また所望により
他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、
リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミ
ン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシ
ン、アンピシリン、カナマイシン等）等〕を含んでいて
もよい。

【００５３】培養は当分野において知られている方法に
より行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体
的な培地および培養条件を例示するが、本発明における
培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。

【００５４】宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌等であ
る場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当で
ある。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿
主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９
培地（Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, New York (1972)）等が例示さ
れる。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常
１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主
が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通
常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母の場合、培地として、例えばBurkholder最少
培地（Bostian. K.L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 4505 (1980)）が挙げられ、そのｐＨは５〜８
であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約
１４〜１４４時間行われ、必要により通気や攪拌を行う
こともできる。

【００５５】宿主が動物細胞の場合、培地として、例え
ば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（Ｍ
ＥＭ）（Science, 122, 501 (1952)）、ダルベッコ改変
最少必須培地（ＤＭＥＭ）（Virology, 8, 396 (1959)
）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am. Med. Assoc., 19
9、 519 (1967) ）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Bio
l. Med., 73, 1 (1950)）等を用いることができる。培
地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約
３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通
気や攪拌を行うこともできる。

【００５６】宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例え
ばウシ胎仔血清を含むGrace's 培地（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 82, 8404 (1985)）等が挙げられ、そのｐ
Ｈは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜
４０℃で１５〜１００時間行われ、必要により通気や攪
拌を行うこともできる。

【００５７】耐熱性ラッカーゼの単離および／または精
製は、ラッカーゼ活性の存在する画分に応じて、通常使
用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより
行うことができる。本発明の好ましい態様においては、
耐熱性ラッカーゼは細胞質と細胞外（すなわち、培地）
の両方に存在する。

【００５８】培養物の培地中に存在する耐熱性ラッカー
ゼは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を
得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、
限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロ
キシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー
など）、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に
選択して行うことにより得ることができる。なかでも、
収率の観点からは、イオン交換クロマトグラフィーを用
いることが好ましい。

【００５９】一方、細胞質に存在する耐熱性ラッカーゼ
は、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適
当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライ
トン−Ｘ１００などの界面活性剤処理等により、細胞お
よびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾
過等によりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶
性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離
および／または精製することができる。

【００６０】また、宿主として大腸菌などを用いた場
合、大腸菌由来のタンパク質と非特異的Ｓ−Ｓ結合が形
成されることがあり、性質が変化することがあるため、
このような宿主から耐熱性ラッカーゼを製造あるいは単
離および／または精製する際には、当該耐熱性ラッカー
ゼを変性剤および還元剤と接触させることが好ましい。
耐熱性ラッカーゼに変性剤および還元剤を接触させるこ
とで、上記非特異的Ｓ−Ｓ結合をはずすことができる。
また、変性剤および還元剤を接触させた後も本発明の耐
熱性ラッカーゼは活性を保持することができる。すなわ
ち、このような処理を施した後も後記活性測定方法によ
り活性が確認される。

【００６１】ここでいう「変性剤」とは、タンパク質の
変性を引き起こす物質をいい、例えば、尿素、塩酸グア
ニジンなどが挙げられ、好ましくは尿素が挙げられる。
上記方法における変性剤の使用濃度は、通常、２〜８Ｍ
である。変性剤の濃度が２Ｍ未満であると、非特異的Ｓ
−Ｓ結合を十分にはずすことができない可能性があり、
一方、８Ｍを超えると耐熱性ラッカーゼが過度に変性
し、失活してしまう可能性がある。

【００６２】ここでいう「還元剤」とは、タンパク質中
に存在するＳ−Ｓ結合をはずすことができる物質をい
い、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイ
トール、亜硫酸塩化合物、アスコルビン酸などが挙げら
れ、好ましくは２−メルカプトエタノール、ジチオスレ
イトールが挙げられる。上記方法における還元剤の使用
濃度は、通常、１〜１００ｍＭであり、好ましくは１０
〜５０ｍＭである。還元剤の濃度が１ｍＭ未満である
と、非特異的Ｓ−Ｓ結合を十分にはずすことができない
可能性があり、一方、１００ｍＭを超えると耐熱性ラッ
カーゼが過度に変性し、失活してしまう可能性がある。

【００６３】耐熱性ラッカーゼに変性剤および還元剤を
接触させる温度は、特に限定されないが、酵素の熱によ
る失活を防ぐという点から、通常０〜２０℃、好ましく
は０〜５℃である。また、接触時間も特に限定されない
が、Ｓ−Ｓ結合の切断に要するのに充分な時間をかける
という点から、通常１０分から２４時間、好ましくは３
０分〜２時間である。

【００６４】耐熱性ラッカーゼに変性剤および還元剤を
接触させる方法としては、例えば、変性剤および還元剤
を含む溶液中に耐熱性ラッカーゼを混合する方法、耐熱
性ラッカーゼを含む溶液に変性剤および還元剤を同時ま
たは別々に混合する方法、変性剤か還元剤の一方を含む
溶液に耐熱性ラッカーゼおよびもう一方を同時または別
々に混合する方法などが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。また、混合する際は、接触効率の点
からゆるやかに撹拌しながら行うことが好ましい。

【００６５】耐熱性ラッカーゼと変性剤および還元剤と
の接触は、特に限定されず、上記タンパク質の各種分離
方法を行う前後に行ってもよく、上記分離方法において
変性剤および還元剤を含む溶液を使用することによって
行ってもよい。好ましくは、Ｓ−Ｓ結合に起因するラッ
カーゼの性質の変化により、各種クロマトグラフィーへ
の悪影響が生じることがあることから、各種クロマトグ
ラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、逆相高速液体クロマトグラフィーなど）を行う前に
接触させるか、あるいは各種クロマトグラフィーにおい
て変性剤および還元剤を含む溶出液を使用して接触させ
ることが挙げられ、より好ましくはイオン交換クロマト
グラフィーを行う前に接触させることが好ましい。ま
た、当該接触は、上記分離方法の前後に複数回繰り返し
て行ってもよい。

【００６６】このように本発明の耐熱性ラッカーゼと変
性剤および還元剤を接触させることにより、本発明の耐
熱性ラッカーゼの性質を変化し得る非特異的Ｓ−Ｓ結合
をはずすことができ、宿主として大腸菌を用いた場合で
あってもストレプトミセス・ラベンデュラエＲＥＮ−７
株が生産するラッカーゼと同様の性質を有する耐熱性ラ
ッカーゼを製造または単離および／または精製すること
ができる。

【００６７】また、上述したように、本発明の耐熱性ラ
ッカーゼは、活性中心に４つの銅イオン（Ｃｕ²⁺）を有
する銅タンパク質であるので、宿主の培地や上記単離お
よび／または精製方法に使用する透析液、溶離液など
に、１μＭ〜１ｍＭの銅イオン（Ｃｕ²⁺）を含有させる
ようにしてもよい。

【００６８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは単なる例示であって何ら本発明の
範囲を限定するものではない。なお、実施例中、ラッカ
ーゼ活性は下記の酵素電極法または比色法で測定した。
また、塩基配列解析は以下の方法で行った。

【００６９】〔酸素電極法〕全容量が５ｍｌの基質溶液
（５ｍＭ カテコールを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４．５））を３０℃で１０分間保持して温度
を均一にした後、適当に希釈した酵素液（２０〜１００
μｌ）を加え反応を開始した。活性は、反応の進行に伴
う酵素消費量の初速度より求めた。溶存酸素量の測定
は、クラーク型酸素電極（YSI model 5300 biological
oxygen monitor）を用いた。３０℃で空気と平衡状態に
ある水中の溶存酸素量は２２８μＭとした。以上の条件
で１分間に１μｍｏｌの酸素を消費する酵素活性を１単
位とした。

【００７０】〔比色法〕全容量が５ｍｌの基質溶液（５
ｍＭカテコールを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４．５））を３０℃で１０分間保持して温度を均
一にした後、適当に希釈した酵素液（２０〜１００μ
ｌ）を加え、３０分間反応させた。活性は、反応の進行
に伴う基質カテコールの酸化により生成するｏ−ベンゾ
キノンの４７５ｎｍでの吸光度の増加より求めた。以上
の条件で１分間に基質溶液１ｌあたり吸光度を０．００
１増加させる酵素活性を１単位とした。

【００７１】〔塩基配列解析〕プラスミド０．２〜０．
５μｇを鋳型とし、BigDye Terminator Cycle Sequenci
ng FS（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて９
６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃２４０秒のＰＣＲ反応
を行った。上記反応物をABI PRISM 310 Genetic Analyz
er（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配
列を解析した。

【００７２】実施例１ 耐熱性ラッカーゼ遺伝子のクロ
ーニング （１）ストレプトミセス・ラベンデュラエ ＲＥＮ−７
株ゲノムＤＮＡの調製 ストレプトミセス・ラベンデュラエ ＲＥＮ−７株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１８０２６）を培養し、培養液からろ過に
よって菌体約１ｇ回収し、ゲノムＤＮＡを公知の方法
（D.A. Hopwood et al. Genetic manipulation of Stre
ptomyces: A Laboratory Manual, ppl0, The John Inne
s Foundation (1985)）により調製した。

【００７３】（２）ＰＣＲによる耐熱性ラッカーゼ遺伝
子の部分増幅 種々のラッカーゼ間で保存性の高いアミノ酸配列より、
表１に示すセンスプライマー（１Ｆ）、アンチセンスプ
ライマー（２Ｒ）を合成した。

【００７４】

【表１】

【００７５】ストレプトミセス・ラベンデュラエ ＲＥ
Ｎ−７株ゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを鋳型とし、表１
の１Ｆ（配列表配列番号３）、２Ｒ（配列表配列番号
４）およびKOD plus（東洋紡績株式会社製）を用いて、
９７℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃９０秒、３０サイ
クルのＰＣＲを行った。増幅された約１，０００ｂｐの
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ge
n Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社
製）を用いて抽出精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＵ
Ｃ１９（東洋紡績株式会社製）のＳｍａ Ｉサイトに挿
入し、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡績株式会社製）を形
質転換させた。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培
養した。アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製
し、塩基配列解析を行った結果、塩基配列より推測され
るアミノ酸配列が既知のラッカーゼと相同性を示した。
従って、増幅されたＤＮＡ断片が耐熱性ラッカーゼ遺伝
子の一部をコードすると推測された。

【００７６】（３）サザンブロット解析 （２）のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片１０ｎｇをAlkP
hos Direct Labellingand Detection（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社製）を用いて、アルカリフォスフ
ァターゼを直接ＤＮＡ断片に標識した。

【００７７】上記で調製したゲノムＤＮＡ３μｇを制限
酵素Ｓｍａ Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロー
スゲルで電気泳動した後、Hybond-Ｎ+（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社製）にVacuGene XL Vacuum Blott
ing System（アマシャムファルマシアバイオテク社製）
を用いて転写した。このメンブレンに、上述のアルカリ
フォスファターゼで標識したプローブを６０℃にて一晩
ハイブリダイズさせた後、６０℃で１０分の洗浄を３回
行い、さらに室温で５分の洗浄を２回行った。AlkPhos
Direct Labelling and Detection System（アマシャム
ファルマシアバイオテク社製）を用いたＣＤＰ−Ｓｔａ
ｒによる化学発光を検出した結果、約２．３ｋｂｐの陽
性バンドを得た。

【００７８】（４）Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲによる耐熱
性ラッカーゼ遺伝子全長の取得 上記で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍａ
Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで電気
泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマ
アルドリッチ社製）を用いて約２．３ｋｂｐ付近のＤＮ
Ａ断片を抽出精製した。これにLigation High（東洋紡
績社製）を加え、１６℃で一晩インキュベートした。セ
ルフライゲーションさせたＤＮＡ断片２０ｎｇを鋳型と
し、表１に示したプライマー（Ｉｎｖ Ｆ：配列表配列
番号５、Ｉｎｖ Ｒ：配列表配列番号６）およびＫＯＤ
ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、
６０℃３０秒、６８℃１５０秒、３０サイクルのＰＣＲ
を行った。

【００７９】得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａ
Ｉサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換さ
せた。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。
アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、塩基配
列解析を行った。既に配列解析済みの１ｋｂｐのＤＮＡ
断片と重ね合わせた結果、サザンブロット解析で陽性を
示したＳｍａ Ｉ消化の２．３ｋｂｐの断片は、２，３
１８ｂｐからなることが判明した（配列表配列番号
２）。該ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示す。ま
た、この配列中に１，８９６ｂｐ（配列表配列番号２の
塩基番号２６６番目から２，１６１番目）からなるオー
プンリーディングフレームが見出され、耐熱性ラッカー
ゼは６３１アミノ酸残基からなる（配列表配列番号１）
と推定された。また、該アミノ酸配列中アミノ酸番号２
０のＡｌａからアミノ酸番号３７のＶａｌまでが別途決
定した天然型耐熱性ラッカーゼのＮ末端アミノ酸配列
（特許文献２参照）と完全に一致したことから、得られ
たＤＮＡ断片はラッカーゼ遺伝子であることが判明し
た。

【００８０】実施例２ 耐熱性ラッカーゼ発現プラスミ
ドの構築 実施例１で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍ
ａ Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで
電気泳動した後、Gen Elute Gel PurificationKit（シ
グマアルドリッチ社製）を用いて約２．３ｋｂｐ付近の
ＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片１０ｎｇと
鋳型として、表１に示したプライマー（ｍａｔｕｒｅ
ＮＴ：配列表配列番号７、ｍａｔｕｒｅ ＣＴ：配列表
配列番号８）およびＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）
を用いて、９７℃１５秒、６２℃３０秒、６８℃１２０
秒、１５サイクル、９７℃１５秒、６８℃１５０秒、２
５サイクルのＰＣＲを行った。なお、ｍａｔｕｒｅ Ｎ
ＴはＥｃｏＲ Ｉ切断サイトを含み、ｍａｔｕｒｅ Ｃ
ＴはＸｈｏ Ｉ切断サイトを含む（表１参照）。

【００８１】得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａ
Ｉサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換さ
せた。形質転換させた大腸菌により、アルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドを調製した。このプラスミドを制限
酵素ＥｃｏＲ ＩとＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル
で電気泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit
（シグマアルドリッチ社製）を用いて約１．８ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を抽出精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＧ
ＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社
製）ＥｃｏＲ ＩとＸｈｏ Ｉサイトに挿入し、大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（宝酒造社製）を形質
転換させ、これをｐＧＥＸ−ＲＥＮ７ｍａｔｕｒｅ／Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳとした。

【００８２】実施例３ 大腸菌での耐熱性ラッカーゼの
製造および精製 （１）大腸菌の培養 実施例２で作成した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
を含むＬＢ培地６ｍｌに植菌後、３７℃で一晩前培養を
行った。前培養液から１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを
含むTerrific broth培地１００ｍｌに植菌後、２０℃で
２４時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収
し、３０ｍｌの１ｐｐｍ硫酸銅を含むＰＢＳに懸濁し、
超音波破砕した。遠心分離により菌体残渣を取り除き、
上清を粗酵素液とした。この粗酵素液中に含まれるラッ
カーゼ活性を上述の酵素電極法により測定したところ、
培養液１リットル当たり２００単位であった。

【００８３】（２）ラッカーゼの精製 上記（１）の粗酵素液をＰＢＳで平衡化したグルタチオ
ンセファロース４ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオ
テク社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、１０ｍＭ
還元型グルタチオンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出画分をＰＢＳに対して
一晩透析した。透析後の酵素液にジチオスレイトールを
１ｍＭとなるように加えた後、Prescission Protease
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、４
℃で一晩酵素反応した。これをグルタチオンセファロー
ス４ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、カラム素通りおよび洗
浄画分を回収した。得られた酵素溶液に硫酸アンモニウ
ムを加え塩析した。沈殿を遠心分離により回収し、２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、
同緩衝液で平衡化したHiload 26/60 Superdex 200 pg
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カラムクロ
マトグラフィーにかけることにより精製ラッカーゼを得
た。

【００８４】実施例４ 耐熱性ラッカーゼ発現プラスミ
ドの構築 実施例１で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍ
ａ Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで
電気泳動した後、Gen Elute Gel PurificationKit（シ
グマアルドリッチ社製）を用いて約２．３ｋｂｐ付近の
ＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片１０ｎｇを
鋳型として、表１に示したプライマー（ＯＲＦ ＮＴ：
配列表配列番号９、ＯＲＦ ＣＴ：配列表配列番号１
０）およびＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い
て、９４℃１２０秒、１サイクル、９４℃１５秒、６０
℃３０秒、６８℃１８０秒、３０サイクル、６８℃９０
秒、１サイクルのＰＣＲを行った。なお、ＯＲＦ ＮＴ
はＮｄｅ Ｉ切断サイトを含み、ＯＲＦ ＣＴはＢａｍ
ＨＩ切断サイトを含む（表１参照）。

【００８５】得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｄｅ Ｉ
とＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲルで電気泳動した
後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリ
ッチ社製）を用いて約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出
精製した。得られた断片をｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅ ＩとＢａｍＨＩサイトに挿
入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（宝酒造
社製）を形質転換させ、これをｐＥＴ−ＲＥＮ７ ＯＲ
Ｆ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳとした。

【００８６】実施例５ 大腸菌での耐熱性ラッカーゼの
製造および精製 （１）大腸菌の培養 実施例４で作成した形質転換体をｐＨ７．３に調整した
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地６ｍｌに
植菌後、３０℃で１５時間程度前培養を行った。前培養
液から１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むTe
rrific broth培地１００ｍｌに植菌後、２５℃、１００
ｒｐｍで２４時間培養した。培養後、遠心分離により菌
体を回収し、５０ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離に
より菌体残渣を取り除き、上清を１ｐｐｍの硫酸銅を含
む５Ｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して
４℃、一晩透析し、これを粗酵素液とした。この粗酵素
液中に含まれるラッカーゼ活性を上記の酸素電極法によ
り測定したところ、培養液１Ｌ当り２３０単位であっ
た。

【００８７】（２）ラッカーゼの精製 上記（１）で得られた粗酵素抽出液５０ｍｌを７０℃、
３０分間熱処理した。不溶物を遠心分離により取り除い
た後、得られた上清４５ｍｌに尿素を６Ｍ、２−メルカ
プトエタノールを２０ｍＭになるように加え、ｐＨ８．
５、総タンパク質量が１ｍｇ程度になるように調整し、
氷上で１時間緩やかに撹拌した。これを５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に透析して希釈すること
により、尿素と２−メルカプトエタノールを除去した。
透析後の酵素溶液を４℃で一晩空気酸化させた。得られ
た酵素液を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
５）で平衡化したＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５
（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフ
ィーにかけ、１〜５００ｍＭ塩化カリウムの直線的濃度
勾配で溶出して、ラッカーゼ活性画分を回収することに
より精製ラッカーゼを得た。この精製ラッカーゼの活性
を上述の酵素電極法により測定したところ、培養液１リ
ットル当たり６０単位であった。

【００８８】実施例６ 実施例５の（２）の工程において、２−メルカプトエタ
ノールの代わりにジチオスレイトールを用いた以外は同
様に行い、精製ラッカーゼを得た。この精製ラッカーゼ
の活性を上述の酵素電極法により測定したところ、培養
液１リットル当たり６０単位であった。

【００８９】実施例７ 実施例５で得られた精製ラッカーゼは、以下の性質を示
した。

【００９０】（１）至適反応ｐＨ 上記酵素の活性をｐＨ３．５〜７．０の種々の条件下
で、上記酸素電極法に準じて測定した。各ｐＨにおける
酵素の相対活性（最大活性値を１００％とした相対値）
を図２に示す。該酵素の反応に好適なｐＨは４．０〜
６．０であり、至適反応ｐＨは約４．５であった。

【００９１】（２）安定ｐＨ範囲 該酵素をｐＨ３．５〜１１．０の種々の条件下、３０℃
で２０時間保持した後、上記比色法に準じて活性を測定
した。各ｐＨにおける残存活性（ｐＨ８．０のときの活
性を１００％とする）を図３に示す。該酵素の安定ｐＨ
範囲は３０℃で６．５〜１０．５であった。すなわち、
ｐＨ６．５〜１０．５、３０℃で２０時間保持した場
合、８０％以上の残存活性を示した。

【００９２】（３）至適反応温度 該酵素の活性を、３０〜７５℃の種々の温度で、上記比
色法に準じて測定したところ、該酵素の反応に好適な温
度は２５〜７０℃であり、至適反応温度は約５０℃であ
った。

【００９３】（４）熱安定性 該酵素を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）中で２０〜９５℃の種々の温度にて１０分間保持し
た後、上記酵素電極法に準じて活性を測定した。各温度
における残存活性（３０℃のときの活性を１００％とす
る）を図４に示す。該酵素はｐＨ７．０で１０分間保持
した場合、７０℃まで安定であった。すなわち、ｐＨ
７．０、約７０℃までの温度で１０分間保持した場合、
８０％以上の残存活性を示した。

【００９４】（５）７０℃での熱安定性 該酵素を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）中で７０℃にて３０分〜４時間保持した後、上記酵
素電極法に準じて活性を測定した。各保持時間における
残存活性（７０℃で保持する前の活性を１００％とす
る）を図５に示す。該酵素は７０℃の温度で１時間まで
安定であった。すなわち、７０℃の温度で１時間までの
時間保持した場合、８０％以上の残存活性を示した。

【００９５】（６）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより該酵素の分子量を測定したとこ
ろ、分子量は約７３ｋＤａであった。

【００９６】（７）アミノ末端のアミノ酸配列 エドマン分解法により該酵素のアミノ末端のアミノ酸配
列を決定したところ、該アミノ酸配列は、Thr Asp Ile
Ile Gluであった。

【００９７】（８）基質特異性 上記酵素を用い、各基質（カテコール、レゾルシノー
ル、ハイドロキノン、ピロガロール、L-3,4-ジヒドロキ
シフェニルアラニン、クレゾール、グアヤコール、L-チ
ロシン、p-フェニレンジアミン、p-トルイジン、L-アス
コルビン酸）を５ｍＭの濃度（L-チロシンは１ｍＭとし
た）で含む溶液中での酵素活性を、上記酸素電極法に準
じて測定したところ、該酵素は全ての化合物を酸化し
た。なかでもピロガロールを最もよく酸化した。

【００９８】（９）阻害剤の影響 上記酵素の活性を上記比色法に準じて測定したところ、
該酵素の活性は１ｍＭの濃度のL-システイン塩酸塩、DL
-ジチオスレイトール、アジ化ナトリウムによって完全
に阻害された。また、１ｍＭの濃度のコウジ酸によって
７０％程度阻害された。

【００９９】（１０）金属塩の影響 各金属塩（CuCl₂、ZnCl₂、MgCl₂、MnCl₂、CaCl₂、KCl、
NaCl）０．２ｍＭを含む溶液中で上記酵素の活性を上記
比色法に準じて測定したところ、該酵素の活性は、いず
れの金属塩によっても大きな影響を受けないことがわか
った。

【０１００】

【発明の効果】本発明によれば、耐熱性ラッカーゼを遺
伝子工学的に大量製造することができる。

【０１０１】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：ＰＣＲ用プライ
マーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計
されたオリゴヌクレオチド。 配列番号５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計
されたオリゴヌクレオチド。 配列番号６：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計
されたオリゴヌクレオチド。 配列番号７：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計
されたオリゴヌクレオチド。 配列番号８：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計
されたオリゴヌクレオチド。 配列番号９：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計
されたオリゴヌクレオチド。 配列番号１０：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設
計されたオリゴヌクレオチド。

【０１０２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RENGO CO., LTD. <120> Thermostable laccase, gene thereof and method of producing thereo f <130> A5803 <150> JP 2001-369067 <151> 2001-12-03 <160> 10 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 631 <212> PRT <213> Streptomyces lavendulae REN-7 <400> 1 Met Thr Asp Ile Ile Glu Arg Ile Thr Asp Gly Leu Ala Gly Ala Ala 1 5 10 15 Arg Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Asp Gly Glu Leu Thr Pro Tyr Ala 20 25 30 Ala Pro Leu Thr Val Pro Pro Val Leu Arg Pro Asp Ser Thr Asp Val 35 40 45 Leu Arg Glu Thr Glu Ile Ala Leu Arg Pro Thr Trp Val Arg Leu His 50 55 60 Pro Gln Leu Pro Pro Thr Leu Met Trp Gly Tyr Gly Gly Ser Val Pro 65 70 75 80 Gly Pro Thr Val Glu Val Arg Arg Gly Gln Arg Val Arg Ile Ala Trp 85 90 95 Thr Asn Arg Ile Pro Lys Gly Ser Glu Tyr Pro Val Thr Ala Val Glu 100 105 110 Val Pro Ala Ala Asn Pro Asn Pro Ser Thr Glu Pro Gly Arg Gly Gly 115 120 125 Val Pro Pro Ile Ala Asp Val Ala Ala Leu Pro Ala Trp Thr Val Thr 130 135 140 His Leu His Gly Ala Gln Thr Gly Gly Gly Asn Asp Gly Trp Ala Asp 145 150 155 160 Asn Ala Val Gly Tyr Gly Asp Ala Gln Leu Ser Glu Tyr Pro Asn Asp 165 170 175 His Gln Ala Val Gln Trp Trp Tyr His Asp His Ala Met Asn Val Thr 180 185 190 Arg Trp Asn Val His Thr Gly Leu Tyr Gly Thr Tyr Leu Val Arg Asp 195 200 205 Asp Glu Glu Asp Ala Leu Gln Leu Pro Ser Gly Lys Arg Glu Ile Pro 210 215 220 Leu Leu Ile Ala Asp Arg Asn Leu Asp Thr Asp Glu Asp Gly Ala Leu 225 230 235 240 Asn Gly Arg Leu Leu His Lys Thr Val Ile Val Gln Glu Lys Asn Pro 245 250 255 Glu Thr Gly Lys Pro Val Ser Val Pro Phe Ala Gly Pro Tyr Thr Thr 260 265 270 Val Asn Gly Arg Ile Trp Pro Tyr Ala Glu Val Asp Ala Ala Trp His 275 280 285 Arg Phe Arg Leu Val Asn Ala Ser Asn Ala Arg Ile Tyr Asp Leu Val 290 295 300 Leu Ile Asp Glu Asp Asp Asn Pro Val Pro Gly Val Leu His Gln Ile 305 310 315 320 Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Pro Val Pro Val Asp Phe Asp 325 330 335 Glu Ala Leu Pro Thr Leu Thr Val Ala Pro Ala Glu Arg Met Asp Leu 340 345 350 Leu Ile Asp Phe Arg Ala Leu Ala Gly Arg Arg Leu Arg Leu Val Asn 355 360 365 Lys Gly Ala Gly Gln Ala Pro Gly Val Pro Asp Pro Ala Asn Asn Val 370 375 380 Arg Tyr Pro His Val Met Glu Phe Arg Val Gly Glu Cys Gly Thr Asp 385 390 395 400 Asp Pro Phe Glu Leu Pro Glu Val Leu Ser Gly Ser Phe Arg Arg Leu 405 410 415 Thr His Asp Ile Glu His Gly His Arg Leu Ile Val Leu Thr Pro Pro 420 425 430 Ala Thr Lys Gly Gly Gly Gly His Pro Glu Ile Trp Glu Met Thr Glu 435 440 445 Val Glu Asp Ala Glu Gln Val Glu Leu Pro Ala Asp Gly Val Ile Gln 450 455 460 Leu Met Ser Ser Glu Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Arg Arg Thr Ser Arg 465 470 475 480 Thr Phe Asn Asp Gly Leu Gly Phe Thr Val Ala Glu Gly Ser Tyr Glu 485 490 495 Gln Trp Ser Phe Leu Asn Leu Ala Val Asn Pro Pro Val Val His Pro 500 505 510 Met His Ile His Leu Ala Asp Phe Gln Ile Leu Gly Arg Asp Thr Tyr 515 520 525 Asp Val Ser Gly Phe Asp Val Thr Ala Gly Gly Thr Arg Ala Pro Leu 530 535 540 Ala Pro Asp Pro Ala Thr Pro Val Pro Leu Pro Pro Asn Glu Arg Gly 545 550 555 560 Tyr Lys Asp Val Phe Arg Ala Leu Pro Gly Gln Met Leu Arg Val Met 565 570 575 Gly Arg Phe Asp Gly Ala Tyr Gly Arg Phe Met Tyr His Cys His Leu 580 585 590 Leu Glu His Glu Asp Met Gly Met Met Arg Pro Phe Val Val Met Pro 595 600 605 Ala Glu Ala Met Lys Phe Asp His Gly Ala Gly His Gly Gly His Gly 610 615 620 Gly His Gly Gly His Gly Gly 625 630 <210> 2 <211> 2318 <212> DNA <213> Streptomyces lavendulae REN-7 <220> <221> CDS <222> (266)..(2158) <400> 2 gggcgaccat ggacggctat gtgctggagc tccagaactg gacggccgga atcctcaact 60 ggcaccggga ctgccgccgt tacggagccg ccgatctggc ccggcgcgcg catggcttcg 120 tgccggggca gttgccgaac cttttcagcc ggaataaggg attcgtggaa cccgcgtggg 180 gcgtggtgag tcctgtgggg tgaaggcggc cactgaccgg ccgcaccacg ggggacgcaa 240 cacggaacac gggggtgttc tcacc atg acc gac atc atc gag agg atc acg 292 Met Thr Asp Ile Ile Glu Arg Ile Thr 1 5 gac ggc ctg gcg ggc gcg gcg cgg gat gcc gcg ccc gcc gcg gcg gac 340 Asp Gly Leu Ala Gly Ala Ala Arg Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Asp 10 15 20 25 ggt gaa ctg acg ccg tac gcg gcg ccg ttg acc gtt cct ccc gtc ctg 388 Gly Glu Leu Thr Pro Tyr Ala Ala Pro Leu Thr Val Pro Pro Val Leu 30 35 40 cgt ccc gac tcc acg gac gtc ctg cgg gag acc gag atc gca ctg cgg 436 Arg Pro Asp Ser Thr Asp Val Leu Arg Glu Thr Glu Ile Ala Leu Arg 45 50 55 ccg acg tgg gtg cgg ctg cac ccg cag ctc ccg ccg aca ctc atg tgg 484 Pro Thr Trp Val Arg Leu His Pro Gln Leu Pro Pro Thr Leu Met Trp 60 65 70 ggg tac ggc gga tcg gtg ccg ggg ccg acc gtc gag gtc cgg cgc ggg 532 Gly Tyr Gly Gly Ser Val Pro Gly Pro Thr Val Glu Val Arg Arg Gly 75 80 85 cag cgc gtc cgc atc gcc tgg acc aac cgc atc ccg aag ggc agc gag 580 Gln Arg Val Arg Ile Ala Trp Thr Asn Arg Ile Pro Lys Gly Ser Glu 90 95 100 105 tac ccg gtc acc gcc gtc gag gtg ccc gcg gcg aac ccc aac ccg agc 628 Tyr Pro Val Thr Ala Val Glu Val Pro Ala Ala Asn Pro Asn Pro Ser 110 115 120 acc gaa ccg ggc cgc ggc ggc gtc ccg ccc atc gcg gac gtc gcc gcc 676 Thr Glu Pro Gly Arg Gly Gly Val Pro Pro Ile Ala Asp Val Ala Ala 125 130 135 ctg ccc gcc tgg acc gtc acc cac ctg cac ggc gcg cag acg ggc ggc 724 Leu Pro Ala Trp Thr Val Thr His Leu His Gly Ala Gln Thr Gly Gly 140 145 150 ggc aac gac ggc tgg gcg gac aac gcg gtg ggc tac ggc gac gcc cag 772 Gly Asn Asp Gly Trp Ala Asp Asn Ala Val Gly Tyr Gly Asp Ala Gln 155 160 165 ctc tcc gag tac ccg aac gac cac cag gcg gtc cag tgg tgg tac cac 820 Leu Ser Glu Tyr Pro Asn Asp His Gln Ala Val Gln Trp Trp Tyr His 170 175 180 185 gac cat gcc atg aac gtg acg cgg tgg aac gtc cac acg ggc ctc tac 868 Asp His Ala Met Asn Val Thr Arg Trp Asn Val His Thr Gly Leu Tyr 190 195 200 ggc acc tat ctc gtc cgc gac gac gag gag gac gcg ctc caa ctc ccc 916 Gly Thr Tyr Leu Val Arg Asp Asp Glu Glu Asp Ala Leu Gln Leu Pro 205 210 215 tcc ggg aaa agg gag atc ccg ctc ctc atc gcc gac cgc aac ctc gac 964 Ser Gly Lys Arg Glu Ile Pro Leu Leu Ile Ala Asp Arg Asn Leu Asp 220 225 230 acg gac gag gac ggc gcg ctc aac ggc cgg ctg ctg cac aag acc gtg 1012 Thr Asp Glu Asp Gly Ala Leu Asn Gly Arg Leu Leu His Lys Thr Val 235 240 245 atc gtc cag gag aag aac ccg gag acg ggc aag ccg gtc tcc gtg ccc 1060 Ile Val Gln Glu Lys Asn Pro Glu Thr Gly Lys Pro Val Ser Val Pro 250 255 260 265 ttc gcg ggc ccg tac acc acg gtc aac ggc cgt atc tgg ccc tac gcc 1108 Phe Ala Gly Pro Tyr Thr Thr Val Asn Gly Arg Ile Trp Pro Tyr Ala 270 275 280 gag gtg gac gcg gcc tgg cac cgc ttc cgc ctg gtc aac gcg tcg aac 1156 Glu Val Asp Ala Ala Trp His Arg Phe Arg Leu Val Asn Ala Ser Asn 285 290 295 gcc agg atc tac gac ctc gtc ctg atc gac gag gac gac aac ccg gtg 1204 Ala Arg Ile Tyr Asp Leu Val Leu Ile Asp Glu Asp Asp Asn Pro Val 300 305 310 ccg ggc gtc ctg cat cag atc ggc agc gac ggc ggc ctt ctc ccg cgc 1252 Pro Gly Val Leu His Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg 315 320 325 ccg gtg ccg gtc gac ttc gac gag gcg ctg ccc aca ctg acc gtc gcc 1300 Pro Val Pro Val Asp Phe Asp Glu Ala Leu Pro Thr Leu Thr Val Ala 330 335 340 345 ccg gcc gag cgc atg gac ctg ctc atc gac ttc cgc gcg ctc gcc gga 1348 Pro Ala Glu Arg Met Asp Leu Leu Ile Asp Phe Arg Ala Leu Ala Gly 350 355 360 cgc cgc cta cgc ctc gtc aac aag ggc gcg ggc cag gcg ccc ggc gtg 1396 Arg Arg Leu Arg Leu Val Asn Lys Gly Ala Gly Gln Ala Pro Gly Val 365 370 375 ccc gac ccg gcg aac aac gtg cgc tat ccg cac gtc atg gag ttc cgc 1444 Pro Asp Pro Ala Asn Asn Val Arg Tyr Pro His Val Met Glu Phe Arg 380 385 390 gtc ggt gag tgc ggc acg gac gac ccg ttc gag ctg ccc gag gtc ctc 1492 Val Gly Glu Cys Gly Thr Asp Asp Pro Phe Glu Leu Pro Glu Val Leu 395 400 405 tcg ggc tcc ttc cgc cgg ctg acg cac gac atc gag cac ggg cac cgc 1540 Ser Gly Ser Phe Arg Arg Leu Thr His Asp Ile Glu His Gly His Arg 410 415 420 425 ctc atc gtg ctg acc ccg ccg gcc acg aag ggc ggc ggc ggc cac ccc 1588 Leu Ile Val Leu Thr Pro Pro Ala Thr Lys Gly Gly Gly Gly His Pro 430 435 440 gag atc tgg gag atg acc gag gtc gag gac gcc gaa cag gtc gag ctg 1636 Glu Ile Trp Glu Met Thr Glu Val Glu Asp Ala Glu Gln Val Glu Leu 445 450 455 ccc gcg gac ggg gtc atc caa ctc atg agc tcc gaa ggc gcg ttg aag 1684 Pro Ala Asp Gly Val Ile Gln Leu Met Ser Ser Glu Gly Ala Leu Lys 460 465 470 acg tac cgc cgc acc tca cgc acc ttc aac gac ggc ctc ggc ttc acc 1732 Thr Tyr Arg Arg Thr Ser Arg Thr Phe Asn Asp Gly Leu Gly Phe Thr 475 480 485 gtc gcg gag ggc agt tac gag cag tgg agc ttc ttg aac ctc gcc gtg 1780 Val Ala Glu Gly Ser Tyr Glu Gln Trp Ser Phe Leu Asn Leu Ala Val 490 495 500 505 aac ccg ccc gtc gtg cac ccc atg cac atc cat ctc gcc gac ttc cag 1828 Asn Pro Pro Val Val His Pro Met His Ile His Leu Ala Asp Phe Gln 510 515 520 atc ctc ggc cgt gac acg tac gac gtg tcg ggg ttc gac gtg acg gcc 1876 Ile Leu Gly Arg Asp Thr Tyr Asp Val Ser Gly Phe Asp Val Thr Ala 525 530 535 ggc ggc acg cgc gcg ccg ctc gcg ccc gac ccg gcc acg ccg gtc ccg 1924 Gly Gly Thr Arg Ala Pro Leu Ala Pro Asp Pro Ala Thr Pro Val Pro 540 545 550 ctc ccg ccg aac gag cgc ggc tac aag gac gtc ttc agg gcg ctg cca 1972 Leu Pro Pro Asn Glu Arg Gly Tyr Lys Asp Val Phe Arg Ala Leu Pro 555 560 565 ggc cag atg ctg cgc gtc atg gga cgg ttc gac ggc gcc tac ggg cgc 2020 Gly Gln Met Leu Arg Val Met Gly Arg Phe Asp Gly Ala Tyr Gly Arg 570 575 580 585 ttc atg tac cac tgc cat ctg ctg gag cac gag gac atg ggc atg atg 2068 Phe Met Tyr His Cys His Leu Leu Glu His Glu Asp Met Gly Met Met 590 595 600 cgg ccg ttc gtg gtg atg ccc gcc gag gcg atg aag ttc gac cac ggg 2116 Arg Pro Phe Val Val Met Pro Ala Glu Ala Met Lys Phe Asp His Gly 605 610 615 gcg ggc cac ggc gga cat ggg gga cac gga ggg cac ggc ggc 2158 Ala Gly His Gly Gly His Gly Gly His Gly Gly His Gly Gly 620 625 630 tgaccggacg ccagaaatgc ccggttcagt ctcactcgtt cgggaatcgt cgcgccggac 2218 gcggacgggt agagctttgg ccggaggtgg gccatggaac agaccgcgtt gcgccccaag 2278 tcgatgcccg gagctccgcg tcgtgagggg gtggccgccc 2318 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tggtaycayg aycaygcsat g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 arrtgdatrt gcatsggrtg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 acaaggacgt cttcagggcg c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 atgaggagcg ggatctccct tt 22 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ccggaattcg caccggcagc agcggacggt gaactgac 38 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ctcgagtttc tggcgtccgg tcag 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ggtgttctcc atatgaccga catc 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cgtccggatc cacgattccc gaacga 26

【図面の簡単な説明】

【図１】耐熱性ラッカーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す
図である。

【図２】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの各ｐＨ
における活性を示す図である。

【図３】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの各ｐＨ
における安定性を示す図である。

【図４】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの各温度
における安定性を示す図である。

【図５】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの７０℃
における安定性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 伊東 昌章 大阪府大阪市福島区大開４丁目１番186号 レンゴー株式会社中央研究所内 (72)発明者 辻坊 裕 大阪府大阪狭山市大野台５丁目６番１号 (72)発明者 宮本 勝城 大阪府高槻市奈佐原２丁目８番 (72)発明者 稲森 善彦 兵庫県尼崎市神田中通７丁目237番 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA08 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 FF10 GG01 LL02 LL05 4B065 AA01X AA50Y AA57X AA90X AB01 BA01 CA28 CA41 CA54 CA60

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの蛋白
   質： （ａ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
   る蛋白質、（ｂ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸
   配列中アミノ酸番号２０〜６３１で示されるアミノ酸配
   列からなる蛋白質、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のア
   ミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠
   損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列
   からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮ
   Ａ： （ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号
   ２６６〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
   （ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号
   ３１１〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
   （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において１も
   しくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修
   飾された塩基配列からなり、かつラッカーゼ活性を有す
   る蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）
   上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列と相補的な塩
   基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
   ブリダイズし、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコ
   ードする塩基配列からなるＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２または３記載のＤＮＡを含有す
   る組換えべクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えべクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地中で培
   養し、培養物から請求項１記載の蛋白質を採取すること
   を特徴とする請求項１記載の蛋白質の製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１記載の蛋白質を、変性剤および
   還元剤に接触させることを含む、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載の蛋白質を、変性剤および
   還元剤に接触させることを含む、請求項１記載の蛋白質
   の単離および／または精製方法。