KR20110050752A

KR20110050752A - 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제

Info

Publication number: KR20110050752A
Application number: KR1020117009540A
Authority: KR
Inventors: 료코 다지마; 아츠시 이치야나기; 게이이치 이치카와; 다로 요시무라
Original assignee: 기꼬만 가부시키가이샤
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2011-05-16
Also published as: CN102292439B; JP4648993B2; US20110318810A1; CN102292439A; EP2348108A4; KR101086189B1; EP2348108B1; EP2348108A1; WO2010140431A1; JPWO2010140431A1; US8445246B2

Abstract

본 발명은 D-글루코오스에 대한 기질 특이성이 높은 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제를 제공한다. 본 발명은 무코르(Mucor)속에 속하는 미생물 유래의, 신규 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제에 관한 것이다. D-글루코오스에 대한 반응성에 비하여, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 대한 반응성이 낮아, 이들 당 화합물의 영향을 받기 어려운 것을 특징으로 한다. 용존 산소의 영향을 받기 어렵고, 시료 중에 글루코오스 이외의 당 화합물이 존재하는 경우에도, 글루코오스량을 정확하게 측정할 수 있다.

Description

플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제{FLAVIN-BOUND GLUCOSE DEHYDROGENASE}

본 발명은 플라빈 화합물을 보효소로 하는 신규 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제, 및 그의 제조법에 관한 것이다.

혈중 글루코오스 농도(혈당값)는 당뇨병의 중요한 마커이다. 당뇨병 환자가 자기의 혈당값을 관리하기 위한 장치로서는, 전기 화학적 바이오센서를 이용한 자기 혈당 측정(Self Monitoring of Blood Glucose: SMBG) 기기가 널리 이용되고 있다. SMBG 기기에 이용되는 바이오센서에는, 종래 글루코오스 옥시다아제(GOD) 등의 글루코오스를 기질로 하는 효소가 이용되고 있다. 그러나, GOD는 산소를 전자 수용체로 한다는 특성을 구비하고 있기 때문에, GOD를 이용한 SMBG 기기에서는, 측정 샘플 중의 용존 산소가 측정값에 영향을 주어, 정확한 측정값이 얻어지지 않는 경우가 발생할 수 있다.

한편, 글루코오스를 기질로 하지만, 산소를 전자 수용체로 하지 않는 별도의 효소로서, 각종 글루코오스 디히드로게나아제(이하, GDH)가 알려져 있다. 구체적으로는, 니코틴 아미드 디뉴클레오티드(NAD)나 니코틴 아미드 디뉴클레오티드인산(NADP)을 보효소로 하는 타입의 GDH(NAD(P)-GDH)나, 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 보효소로 하는 GDH(PQQ-GDH)가 발견되어 있고, SMBG 기기의 바이오센서에 사용되고 있다. 그러나, NAD(P)-GDH는 효소의 안정성이 부족하고, 또한 보효소의 첨가가 필요하다는 문제를 갖고, 또한 PQQ-GDH는 기질 특이성이 낮고, 측정 대상인 글루코오스 이외에도, 말토오스, D-갈락토오스 및 D-자일로오스 등의 당 화합물에 대해 작용하게 되기 때문에, 측정 샘플 중의 글루코오스 이외의 당 화합물이 측정값에 영향을 주어, 정확한 측정값이 얻어지지 않는다는 문제점이 존재한다.

최근 들어, PQQ-GDH를 바이오센서로서 이용한 SMBG 기기를 이용하여 수액 투여를 받고 있었던 당뇨병 환자의 혈당값을 측정할 때에, PQQ-GDH가 수액 내에 포함되는 말토오스에도 작용하여, 실제의 혈당값보다도 높은 측정값이 얻어져, 이 값에 기초하는 처치가 원인이 되어 환자가 저혈당 등을 발병한 예가 보고되어 있다. 또한, 동일한 사상은 갈락토오스 부하 시험 및 자일로오스 흡수 시험을 실시 중인 환자에게도 발생할 수 있는 것도 판명되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 이에 따라, 후생노동부 의약식품국은, 글루코오스 용액에 각 당류를 첨가한 경우에 있어서의 혈당 측정값에 대한 영향을 조사할 목적으로 교차 반응성 시험을 행한 바, 600 mg/dL의 말토오스, 300 mg/dL의 D-갈락토오스, 또는 200 mg/dL의 D-자일로오스 첨가를 행한 경우에는, PQQ-GDH법을 이용한 혈당 측정 키트의 측정값은 실제의 글루코오스 농도보다 2.5 내지 3배 정도 높은 값을 나타내었다. 즉, 측정 시료 중에 존재할 수 있는 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 의해 측정값이 부정확하게 되는 것이 판명되어, 이러한 측정 오차의 원인이 되는 당 화합물의 영향을 받지 않고, 글루코오스를 특이적으로 측정 가능한 기질 특이성이 높은 GDH의 개발이 절실하게 요망되고 있다.

상기한 바와 같은 배경 하에서, 상기 이외의 보효소를 이용하는 타입의 GDH가 주목되도록 되어와 있다. 예를 들면, 비특허문헌 2 내지 5에는, 기질 특이성에 관한 상세한 기재는 없지만, 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래의 GDH에 대한 보고가 있다. 특허문헌 1 내지 3에는 아스페르길루스(Aspergillus)속 유래의 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)를 보효소로 하는 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)가 개시되어 있고, 특허문헌 4에는 D-자일로오스에 대한 작용성을 감소시킨 아스페르길루스속 유래의 FAD-GDH가 개시되어 있다.

특허문헌 1 내지 4에는, D-글루코오스가 아닌 1종 또는 여러종의 당 화합물에 대하여 반응성이 낮은 FAD-GDH가 기재는 되어 있지만, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스 중 어느 것에 대해서도 반응성이 충분히 낮다는 특성을 갖는 플라빈 결합형 GDH는 알려져 있지 않다. 또한, D-글루코오스, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스가 존재하는 조건하에서, 이들의 당 화합물에 의한 영향을 받는 일 없이 글루코오스 농도를 정확하게 측정하는 것이 가능한 플라빈 결합형 GDH도 알려져 있지 않다.

일본 특허 공개 제2007-289148호 공보 국제 공개 제04/058958호 공보 국제 공개 제07/139013호 공보 일본 특허 공개 제2008-237210호 공보

의약품·의료용구 등 안전성 정보 206호(Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No.206), 2004년 10월, 후생노동부 의약식품국 Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).

본 발명에서는, D-글루코오스에 특이성이 높고, D-글루코오스 이외의 당 화합물의 공존 조건하에서도 D-글루코오스량을 정확하게 측정할 수 있는 신규 GDH를 제공하는 것을 과제로 한다.

상기한 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자 등은 예의 검토를 거듭하여, 글루코오스량의 정확한 측정을 가능하게 하는 신규 GDH를 생산하는 미생물의 스크리닝을 실시한 결과, 털곰팡이아문에 속하는 균주로부터, 글루코오스에 특이성이 높고, 글루코오스 이외의 당 화합물의 공존 조건하에서 측정을 행한 경우에도 글루코오스를 정확하게 측정할 수 있는 GDH 활성을 갖는 신규 GDH를 발견하였다. 그리고, 이들 신규 GDH를 정제하여 그의 여러 성질을 결정하고, 신규 플라빈 결합형 GDH인 것을 확인하고, 실제로 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스의 존재하에서의 D-글루코오스 측정을 실시함과 함께, 그의 신규 GDH의 아미노산 서열과 그것을 코딩하는 유전자 배열 정보를 취득하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 (i) 내지 (iii)의 성질:

(i) 작용: 전자 수용체 존재하에서 GDH 활성을 나타냄,

(ii) 분자량: 단백질의 폴리펩티드쇄 부분의 분자량이 약 80 kDa임,

(iii) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성에 비하여, 말토오스 및 D-갈락토오스 및 D-자일로오스에 대한 반응성이 낮음

을 구비하는 플라빈 결합형 GDH.

(2) D-글루코오스에 대한 반응성을 100％로 한 경우에, 말토오스, D-갈락토오스 및 D-자일로오스에 대한 반응성이 모두 2％ 이하인, 상기 (1)에 기재된 플라빈 결합형 GDH.

(3) 이하의 (a) 내지 (c)의 당 화합물:

(a) 말토오스

(b) D-갈락토오스

(c) D-자일로오스

중 1 이상이 존재하는 경우의 D-글루코오스에 대한 반응성이, 상기 (a) 내지 (c)가 존재하지 않는 경우의 D-글루코오스에 대한 반응성을 100％로 한 경우의 96％ 내지 104％인, 상기 (1) 내지 (2)에 기재된 플라빈 결합형 GDH.

(4) 최적 pH가 pH 6.5 내지 7.0이고, 최적 온도가 37 내지 40℃이고, 안정 pH 범위가 pH 3.5 내지 7.0이고, 40℃, 15분간의 열 처리 후에 80％ 이상의 잔존 활성을 갖는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 플라빈 결합형 GDH.

(5) 털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물에서 유래되는, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 플라빈 결합형 GDH.

(6) 무코르(Mucor)속으로 분류되는 미생물에서 유래되는, 상기 (5)에 기재된 플라빈 결합형 GDH.

(7) 무코르속으로 분류되는 미생물을 배지에 배양하고, 해당 미생물 균체로부터 플라빈 결합형 GDH를 채취하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 플라빈 결합형 GDH의 제조 방법.

(8) 미생물이 무코르 프라이니이(Mucor prainii), 무코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스(Mucor circinelloides f.circinelloides)로부터 선택되는 1 이상인, 상기 (7)에 기재된 플라빈 결합형 GDH의 제조 방법.

(9) 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80％ 이상 상동인 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 플라빈 결합형 GDH.

(10) 이하의 (A) 내지 (E)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 DNA로 이루어지는 플라빈 결합형 GDH 유전자:

(A) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;

(B) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;

(C) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;

(D) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;

(E) 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열과 80％ 이상 상동인 염기 서열을 갖고, 또한 플라빈 결합형 GDH 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.

(11) 상기 (10)에 기재된 플라빈 결합형 GDH 유전자를 벡터 DNA에 삽입한 것을 특징으로 하는 재조합체 DNA.

(12) 상기 (11)에 기재된 재조합체 DNA가 도입되어 있는 형질 전환체.

(13) 상기 (10)에 기재된 플라빈 결합형 GDH 유전자 또는 상기 (11)에 기재된 재조합체 DNA를 포함하며, 플라빈 결합형 GDH 생산능을 갖는 미생물을 배양하고, 해당 배양물로부터 플라빈 결합형 GDH를 채취하는 것을 특징으로 하는, D-글루코오스에 대한 반응성에 비하여, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 대한 반응성이 낮은 플라빈 결합형 GDH의 제조 방법.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH에 의해, 측정 시료에 포함되는 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스 등의 당 화합물의 영향을 받는 일 없이, 정확하게 D-글루코오스량을 측정하는 것이 가능해진다. 이에 따라, 말토오스를 포함하는 수액의 투여를 받고 있는 환자나, 갈락토오스 부하 시험 및 자일로오스 흡수 시험을 실시 중인 환자의 시료에 대해서도 정확하게 혈당값을 측정하는 것이 가능해진다.

도 1은 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 흡수 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 최적 pH를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 최적 온도를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 열 안정성을 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 pH 안정성을 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동 결과이다.
도 7은 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 이용하여 측정한 D-글루코오스량의 측정 결과를 도시한 도면이다.

(플라빈 결합형 GDH의 기질 특이성)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 기질 특이성이 우수하고, D-글루코오스에 대한 선택성이 매우 높은 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 대한 반응성이 매우 낮다. 구체적으로는, D-글루코오스에 대한 반응성을 100％로 한 경우에, 말토오스, D-갈락토오스 및 D-자일로오스에 대한 반응성이 모두 2％ 이하인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 이러한 높은 기질 특이성을 갖기 때문에, 말토오스를 포함하는 수액의 투여를 받고 있는 환자나, 갈락토오스 부하 시험 및 자일로오스 흡수 시험을 실시중인 환자의 시료에 대해서도, 측정 시료에 포함되는 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스 등의 당 화합물의 영향을 받는 일 없이, 정확하게 D-글루코오스량을 측정하는 것이 가능해진다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 상술한 바와 같이 D-글루코오스 대신에 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스 등의 당 화합물을 기질로서 측정을 행했을 때의 측정값이 매우 낮고, 또한 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스 등의 당 화합물이 협잡하는 조건하에서도 정확하게 글루코오스 측정값을 측정할 수 있는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 이들의 협잡 당 화합물이 존재하지 않는 조건에서의 D-글루코오스에 대한 반응성을 100％로 한 경우에, 협잡 당 화합물로서 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스로부터 선택되는 1 이상이 존재하는 경우의 측정값이 96％ 내지 103％이고, 협잡 당 화합물로서 말토오스, D-갈락토오스 및 D-자일로오스의 3종이 동시에 존재하는 경우에도, 측정값이 96％ 내지 104％인 것을 특징으로 한다. 이러한 특성을 갖는 플라빈 결합형 GDH를 이용한 경우에는, 측정 시료 중에 말토오스나 D-갈락토오스, D-자일로오스가 존재하고 있는 상황에서도, 글루코오스량을 정확하게 측정하는 것이 가능하여, 바람직하다.

(본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 효소 화학적 특징)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH로서 바람직한 효소의 예로서는, 이하의 효소 화학적 특징을 갖는 것을 들 수 있다.

(1) 작용: 전자 수용체 존재하에서 GDH 활성을 나타냄

(2) 분자량: 단백질의 폴리펩티드쇄 부분의 분자량이 약 80 kDa임

(3) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성과 비교하여, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 대한 반응성이 낮음

(4) 최적 pH: pH 6.5 내지 7.0

(5) 최적 온도: 37 내지 40℃

(6) 안정 pH 범위: pH 3.5 내지 7.0

(7) 열 안정성: 40℃, 15분간의 열 처리 후에 80％ 이상의 잔존 활성을 가짐

(8) 플라빈 화합물을 보효소로 함

(9) Km값: D-글루코오스에 대한 Km값이 26 내지 33 mM임

상기한 바와 같은 효소 화학적 특징을 갖는 GDH이면, 측정 시료에 포함되는 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스 등의 당 화합물의 영향을 받는 일 없이, 정확하게 D-글루코오스량을 측정하는 것이 가능해진다. 또한, 혈당값의 측정 등의 임상 진단에 응용하기 위해서 바람직한 pH 범위, 온도 범위에서 양호하게 작용하기 때문에, 진단용 측정 시약 등의 용도에 바람직하게 사용할 수 있다.

또한, 상기한 여러 성질 매개변수는 전형적인 예인데, 소정의 측정 조건에서 D-글루코오스의 측정을 행할 때에 본 발명의 효과를 달성 가능한 범위에서, 상기 매개변수 중에는, 허용 가능한 변동의 폭을 갖는 것이 있다. 예를 들면, 안정 pH 범위나 최적 pH 범위, 최적 온도 범위 등의 매개변수는, 소정의 측정 조건을 포함하는 범위에서, 상기한 전형적인 범위보다 약간 넓을 수도 있고, 반대로, 상기한 전형적인 범위보다 약간 좁은 경우에도, 측정 조건에 있어서 충분한 활성 및/또는 안정성이 확보되어 있으면 된다. Km값은 일반적으로는 작아질수록 기질 특이성이 좋아지는데, 본 발명의 효소로서는, 소정의 측정 조건에 있어서 실질적으로 충분한 기질의 선택이 실현되는 범위의 값을 갖고 있으면 된다.

상기한 각종 효소 화학적 성질은, 효소의 여러 성질을 특정하기 위한 공지된 수법, 예를 들면 이하의 실시예에 기재된 방법을 이용하여 조사할 수 있다. 효소의 여러 성질은, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 생산하는 미생물의 배양액이나, 정제 공정의 도중 단계에서 어느 정도 조사할 수도 있고, 보다 상세하게는 정제 효소를 이용하여 조사할 수 있다.

정제 효소란 해당 효소 이외의 성분, 특히 해당 효소 이외의 단백질(협잡 단백질)을 실질적으로 포함하지 않는 상태로 분리된 효소를 말한다. 구체적으로는, 예를 들면 협잡 단백질의 함유량이 중량 환산으로 전체의 약 20％ 미만, 바람직하게는 약 10％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 보다 한층 바람직하게는 약 1％ 미만이다. 또한, 본 명세서 중에 후술하는 「MpGDH」, 「MjGDH」 및 「McGDH」는, 특별한 언급이 없는 한, 정제 효소를 말한다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH가 이용하는 전자 수용체는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 혈당값 측정에 이용하기 위해서 바람직한 시약 성분으로서 공지된 임의의 전자 수용체를 사용할 수 있다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH가 이용하는 보효소는 플라빈 화합물인 것을 특징으로 한다. 플라빈 화합물에는, 예를 들면 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN) 등을 들 수 있다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH로서 바람직한 효소의 예로서는, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 측정했을 때에, 단백질의 폴리펩티드쇄 부분의 분자량이 약 80 kDa인 플라빈 결합형 GDH를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH에는 당쇄가 결합하고 있다고 생각되고, 당쇄를 제거하는 조작을 행하지 않은 경우, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 측정했을 때의 분자량은 이것보다 크게 측정되는 경향을 갖는다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH로서 바람직한 효소의 예로서는, D-글루코오스에 대한 Km값이 26 내지 33 mM인 플라빈 결합형 GDH를 들 수 있다.

(플라빈 결합형 GDH의 작용 원리 및 활성 측정법)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 전자 수용체 존재하에서 글루코오스의 수산기를 산화하여 글루코노-δ-락톤을 생성하는 반응을 촉매한다.

따라서, 이 원리를 이용하여, 예를 들면 전자 수용체로서 페나진메토술페이트(PMS) 및 2,6-디클로로인도페놀(DCIP)을 이용한 이하의 측정계에 의해 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 활성을 측정할 수 있다.

(반응 1) D-글루코오스+PMS(산화형)

→ D-글루코노-δ-락톤+PMS(환원형)

(반응 2) PMS(환원형)+DCIP(산화형)

→ PMS+DCIP(환원형)

우선, (반응 1)에서, 글루코오스가 산화하면서 PMS(환원형)가 생성된다. 계속해서 진행함(반응 2)으로써, PMS의 산화와 함께 DCIP가 환원되기 때문에, 산화형 DCIP의 소실을 600 nm의 파장의 흡광도 변화량으로부터 측정할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명에서, 플라빈 결합형 GDH의 활성은 이하의 절차에 따라서 측정한다. 100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 1.79 mL, 1.25 M D-글루코오스 용액 0.08 mL 및 20 mM DCIP 용액 0.01 mL를 혼합하고, 37℃에서 5분간 보온한다. 이어서, 20 mM PMS 용액 0.02 mL 및 효소 샘플 용액 0.1 mL를 첨가하고, 반응을 개시한다. 반응 개시시, 및 경시적인 흡광도를 측정하고, 효소 반응의 진행에 수반하는 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량(ΔA600)을 구하고, 다음 식에 따라서 플라빈 결합형 GDH 활성을 산출한다. 이 때, 플라빈 결합형 GDH 활성은 37℃에서 농도 50 mM의 D-글루코오스 존재하에서 1분간에 1 ㎛ol의 DCIP를 환원하는 효소량을 1 U로 정의한다.

또한, 식 중의 2.0은 반응 시약+효소 시약의 액량(mL), 16.3은 본 활성 측정 조건에 있어서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/㎛ol), 0.1은 효소 용액의 액량(mL), 1.0은 셀의 광로 길이(cm), ΔA600_블랭크는 10 mM 아세트산 완충액을 효소 샘플 용액 대신에 첨가하여 반응 개시한 경우의 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량, df는 희석 배수를 나타낸다.

(플라빈 결합형 GDH의 유래)

상기한 특징을 갖는 본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물로부터 얻을 수 있다. 털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물로서는, 예를 들면 무코르속, 아브시디아(Absidia)속, 아크티노무코르(Actinomucor)속 등을 들 수 있다. 무코르속으로 분류되는 미생물로서, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 생산하는 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는, 무코르 프라이니이, 무코르 자바니쿠스 또는 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 무코르 프라이니이 NISL0103, 무코르 자바니쿠스 NISL0111 또는 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스 NISL0117을 들 수 있다. 아브시디아속으로 분류되는 미생물로서, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 생산하는 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는, 아브시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora), 아브시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora)를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 아브시디아 실린드로스포라 NISL0211, 아브시디아 히알로스포라 NISL0218을 들 수 있다. 아크티노무코르속으로 분류되는 미생물로서, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 생산하는 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는, 아크티노무코르 엘레간스(Actinomucor elegans)를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 아크티노무코르 엘레간스 NISL9082를 들 수 있다. 또한, 상기한 균주는 NISL(자이단호우진 노다 산교 가가꾸 겐뀨쇼)의 보관 균주이고, 소정의 수속을 거침으로써 분양받을 수 있다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 상술한 바와 같이, 「털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물에 유래하여, 상술한 각종 성질을 구비하는 플라빈 결합형 GDH」이다. 또한, 이들의 플라빈 결합형 GDH 생산 미생물로부터 공지된 유전자 공학적 수법에 의해서 취득한 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자를 이용하여, 필요에 따라 그것을 일부 개변하고, 적당한 숙주 미생물에 각종 공지된 수법에 의해 도입하여 생산된 재조합 플라빈 결합형 GDH도 또한 본 발명의 「털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물에 유래하고, 상술한 각종 성질을 구비하는 플라빈 결합형 GDH」에 포함된다. 마찬가지로, 「무코르속으로 분류되는 미생물」, 또는 특정한 생산 미생물 균주명을 기재한 플라빈 결합형 GDH에 대해서도, 각각에서 유래되는 유전자 정보를 바탕으로 취득되는, 상술한 각종 성질을 구비하는 플라빈 결합형 GDH도 본 발명에 포함한다.

(플라빈 결합형 GDH의 아미노산 서열)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80％ 이상 상동인 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 플라빈 결합형 GDH는 상술한 각종 성질을 갖는다. 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 80％ 이상의 상동성, 바람직하게는 85％, 보다 바람직하게는 90％, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 플라빈 결합형 GDH와 마찬가지의 여러 성질을 갖는 GDH도 본 발명의 플라빈 결합형 GDH에 포함된다.

(플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자 배열)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자란 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80％ 이상 상동인 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 DNA를 말한다. 또는 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자란 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 말한다. 또는 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자란 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열과 80％ 이상의 상동성, 바람직하게는 85％, 보다 바람직하게는 90％, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖고, 또한 플라빈 결합형 GDH 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 말한다.

(플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자 배열을 포함하는 벡터, 형질 전환체)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자는 적당한 공지된 각종 벡터 중에 삽입할 수 있다. 또한, 이 벡터를 적당한 공지된 각 숙주에게 도입하여, 플라빈 결합형 GDH 유전자를 포함하는 재조합체 DNA가 도입되어 있는 형질 전환체를 제작할 수 있다. 이들 유전자의 취득 방법이나, 유전자 배열, 아미노산 서열 정보의 취득 방법, 각종 벡터의 제조 방법이나 형질 전환체의 제작 방법은 당업자에 있어서 공지이고, 일례를 후술한다.

플라빈 결합형 GDH를 생산하는 미생물로부터 플라빈 결합형 GDH 유전자를 취득하기 위해서는, 통상 일반적으로 이용되고 있는 유전자의 클로닝 방법이 이용된다. 예를 들면, 플라빈 결합형 GDH 생산능을 갖는 미생물 균체나 다양한 세포로부터 통상법, 예를 들면 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, WILEY Interscience, 1989]에 기재된 방법에 의해 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 또한 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 염색체 DNA 또는 cDNA를 이용하여, 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.

이어서, 플라빈 결합형 GDH의 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프로브 DNA를 합성하고, 이것을 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법, 또는 상기 아미노산 서열에 기초하여, 적당한 프라이머 DNA를 제작하고, 5' RACE법이나 3' RACE법 등의 적당한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR법)에 의해, 목적으로 하는 유전자 단편을 포함하는 DNA를 증폭시키고, 이들을 연결시켜 전장의 목적 유전자를 포함하는 DNA를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자의 바람직한 일례로서, 무코르속 유래의 플라빈 결합형 GDH 유전자를 들 수 있다. 이들 유전자는, 통상법대로 각종 벡터에 연결되어 있는 것이 취급 상 바람직하고, 예를 들면 단리한 무코르속 유래의 플라빈 결합형 GDH를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합체 플라스미드를 제작하고, 그것으로부터 예를 들면, QIAGEN(퀴아겐사 제조)를 이용함으로써, 추출, 정제하여 얻을 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 벡터 DNA로서는, 예를 들면 플라스미드 벡터 DNA, 박테리오파지 벡터 DNA 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 pBluescriptII SK+(STRATAGENE사 제조) 등이 바람직하다.

상기 방법에 의해 얻어진 플라빈 결합형 GDH 유전자의 염기 서열의 결정·확인은, 예를 들면 멀티 모세관 DNA 해석 시스템 CEQ2000(베크만·코울터사 제조) 등을 이용함으로써 행할 수 있다.

상술한 바와 같이 얻어진 플라빈 결합형 GDH 유전자를, 통상법에 의해, 박테리오파지, 코스미드, 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포의 형질 전환에 이용되는 플라스미드 등의 벡터에 조립하여, 각각의 벡터에 대응하는 숙주를 통상법에 의해 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있다. 숙주로서는, 예를 들면 에스체리치아(Escherichia)속에 속하는 미생물, 예를 들면 대장균 K-12, 바람직하게는 대장균 JM109, DH5α(모두 다카라 바이오사 제조) 등을 들 수 있으며, 이들 숙주를 형질 전환하고, 또는 이들에 형질 도입하여 각각의 균주를 얻는다. 이렇게 해서 얻어진 상기 형질 전환체를 배양함으로써 플라빈 결합형 GDH를 대량으로 생산할 수 있다.

(플라빈 결합형 GDH의 제조)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 각종 공지된 효소 생산 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상술한 플라빈 결합형 GDH 생산 미생물을 배지 중에서 배양하여 목적으로 하는 플라빈 결합형 GDH를 생산시키고, 배양물 또는 배양 균체 내부로부터 효소를 채취할 수 있다. 또한, 본 발명 발명의 플라빈 결합형 GDH 유전자 또는 상기 GDH 유전자를 포함하는 재조합체 DNA를 포함하고, 플라빈 결합형 GDH 생산능을 갖는 미생물을 배양하고, 해당 배양물로부터 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제를 채취할 수 있다.

미생물의 배양은, 통상의 고체 배양법으로 배양하여도 되지만, 가능한 한 액체 배양법을 채용하여 배양하는 것이 바람직하다. 배양에 이용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기물, 그 밖의 영양소를 적절하게 함유하는 것이면 되고, 또한 합성 배지, 천연 배지 중의 어느 것이어도 되고, 목적으로 하는 효소를 효율적으로 제조할 수 있는 배지이면 어떠한 배지이어도 된다.

배지에 사용하는 탄소원으로서는, 동화 가능한 탄소 화합물이면 되고, 예를 들면 글루코오스, 전분 가수분해물, 글리세린, 과당, 당밀 등을 들 수 있다. 질소원으로서는, 이용 가능한 질소 화합물이면 되고, 예를 들면 효모 엑기스, 펩톤, 육엑기스, 옥수수 침지액, 대두분, 맥아 추출물, 아미노산, 황산암모늄, 질산암모늄 등을 들 수 있다. 무기물로서는, 예를 들면 식염, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화망간, 황산제1철, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 탄산나트륨, 염화칼슘 등의 다양한 염을 들 수 있다. 그 외, 필요에 따라서 비타민류, 소포제 등을 첨가할 수도 있다.

그 외에도, 첨가함으로써 본 발명의 플라빈 결합형 GDH 제조량을 향상시킬 수 있는 영양원이나 성분이 있으면, 단독으로 또는 조합하여 이용할 수도 있다.

배양 조건은 배양하는 미생물에 따라 다르다. 예를 들면, 배지의 시초 pH는 pH 5 내지 10으로 조정하고, 배양 온도는, 20 내지 40℃, 배양 시간은, 10 내지 50시간, 15 내지 25시간, 또는 1 내지 2일간 등, 적절하게 설정할 수 있고, 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정지 배양 등에 의해 실시한다. 예를 들면, 털곰팡이아문의 미생물을 배양하는 경우의 배지 및 배양 조건의 일례로서, 이스트 엑기스 2.0％, 글루코오스 4％, pH 6.0의 배지를 이용한, 30℃, 130 rpm에서 2일간의 진탕을 들 수 있다. 또한, 대장균 등의 미생물을 배양하는 배지 및 배양 조건의 일례로서, 이스트 엑기스 0.1％, 맥아 추출물 0.1％, 인산이수소칼륨 0.1％, 황산마그네슘 0.05％, pH 7.3의 배지를 이용한, 25℃, 120 rpm에서 4일간의 진탕 배양을 들 수 있다.

효소 생산 미생물의 배양 종료 후, 상기 배양물 또는 배양 균체 내부에서 본 발명의 방법에 사용하는 플라빈 결합형 GDH를 채취하기 위해서는, 통상의 효소의 채취 수단을 사용할 수 있다. 상기 효소가 균체 내에 존재하는 경우에는, 배양물로부터, 예를 들면 여과, 원심 분리 등의 조작에 의해 균체를 분리하고, 이 균체로부터 효소를 채취하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 다이노밀 등의, 통상의 파괴 수단을 이용하여 균체를 파괴하는 방법, 리소자임 등의 세포벽 용해 효소를 이용하여 균체 세포벽을 용해하는 방법, 트리톤 X-100 등의 계면활성제를 이용하여 균체로부터 효소를 추출하는 방법 등을 단독 또는 조합하여 채용할 수 있다.

이어서, 여과 또는 원심 분리 등에 의해 불용물을 제거하여 효소 추출액을 얻는다. 얻어진 추출액으로부터 플라빈 결합형 GDH를 필요에 따라서 단리, 정제하기 위해서는, 필요에 따라 핵산을 제거한 후, 이것에 황산암모늄, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고, 침전물을 채취한다. 또한 정제도가 높은 효소 표품을 얻기 위해서는, 예를 들면 세파덱스, 울트라겔 또는 바이오겔 등을 이용하는 겔여과법, 이온 교환체, 히드록시인회석 등을 이용하는 흡착용출법, 친화성 크로마토그래피법, 분자체막 또는 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절하게 선택하고, 또한 이들을 조합하여 실시한다.

본 발명의 측정에 사용하는 플라빈 결합형 GDH는 공지된 유전자 재조합 수법을 이용하여 대량 생산할 수도 있다. 예를 들면, 상술한 각종 플라빈 결합형 GDH의 유전자 배열 및 아미노산 서열을 공지된 방법에 의해 해석하고, 그 정보에 기초하여 동일한 구조·특성을 갖는 플라빈 결합형 GDH를, 각종 숙주 미생물 중에서 대량 생산시킬 수 있다. 또한, 공지된 각종 기술을 이용하여 플라빈 결합형 GDH의 유전자 배열 및 아미노산 서열의 일부를 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입에 의해 개변하여 원하는 특성을 부여시킨 플라빈 결합형 GDH를 제조하는 것도 가능하다.

상기한 바와 같은 방법으로 제조된, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 협잡 당 화합물의 존재하에서도 정확하게 글루코오스량을 측정할 수 있기 때문에, 글루코오스 센서 등에의 응용·실용화에 바람직하게 사용할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명의 기술적 범위는 이들의 예에 의해 전혀 한정되지 않는다.

실시예 1

(본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 취득)

1. GDH 생산균의 스크리닝

자연계로부터 분리한 균주 및 미생물 보존 기관((재)노다 산교 가가꾸 겐뀨쇼)로부터 분배 공급된 보존균 약 500주로부터 GDH 생산균의 스크리닝을 행하였다. 맥아 추출물 배지(맥아 추출물 2.0％, D-글루코오스 2.0％, 폴리펩톤 0.1％, pH 6.0) 3 ml에 공시균주를 각각 접종하고, 3 내지 5일 30℃에서 진탕 배양하였다. 이 배양액을 800×g, 10분간 원심 분리하여 균체를 침전으로서 얻었다. 그 후, 이 균체를 10 mM 아세트산 완충액(pH 5.0) 중에 현탁하고, 비즈 쇼커(야쓰이 기까이(주) 제조)에 의해 균체를 파쇄(2,000 rpm, 60초, 16회)하고, 4℃, 20,000×g, 10분간의 원심에 의해서 회수된 상청을 조효소액으로 하였다.

2. GDH 활성의 확인

이하의 절차에 따라서 각 용액을 혼합하고, 흡광도를 측정하고, 조효소액 중의 GDH 활성을 조사하였다. 100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 1.79 mL, 1.25 M D-글루코오스 용액 0.08 mL 및 20 mM DCIP 용액 0.01 mL를 혼합하고, 37℃에서 5분간 보온한 후, 20 mM PMS 용액 0.02 mL 및 효소 샘플 용액 0.1 mL를 첨가하고, 반응을 개시하였다. 반응 개시시부터 효소 반응의 진행에 수반하는 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량(ΔA600)을 측정하고, 다음 식에 따라서 GDH 활성을 산출하였다. 이 때, GDH 활성은 37℃에서 농도 50 mM의 D-글루코오스 존재하에서 1분간에 1 ㎛ol의 DCIP를 환원하는 효소량을 1 U로 정의하였다.

각 균주의 조효소액에 대해서, 상기 활성 측정법에 기초하여 GDH 활성의 유무를 조사한 결과를 표 1에 나타내었다.

그 결과, 무코르 프라이니이 NISL0103, 무코르 자바니쿠스 NISL0107, 무코르 자바니쿠스 NISL0108, 무코르 자바니쿠스 NISL0111, 무코르 자바니쿠스 NISL0112, 무코르 자바니쿠스 NISL0115, 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스 NISL0116, 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스 NISL0117, 무코르 히에 말리스 f. 실바티쿠스 NISL0118, 아브시디아 실린드로스포라 NISL0211, 아브시디아 히알로스포라 NISL0218, 아크티노무코르 엘레간스 NISL9082 유래의 조효소액 내에 GDH 활성이 검출되었다.

실시예 2

(무코르속 유래의 플라빈 결합형 GDH의 정제)

전 배양용 배지(이스트 엑기스 2.0 ％, 글루코오스 4％, pH 6.0) 0.1 L을 0.5 L 용량 사까구찌 플라스크에 넣고, 미리 플레이트 배지 상에서 배양한 무코르 프라이니이 NISL0103, 무코르 자바니쿠스 NISL0111, 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스 NISL0117을, 약 1 cm²분 각각 접종하고, 30℃, 130 rpm에서 2일간 회전진탕 배양하였다. 이것을 종배양으로 하여, 30 L 용량 단지 발효기에 넣은 상기 배지 20 L에 0.2 L씩 접종하고(단지 발효기 2기), 30℃, 200 rpm, 0.5 vvm에서 3일간 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액 40 L를 여과포로 여과하여, 균체를 회수하였다. 이어서, 얻어진 균체를 10 mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 현탁하였다.

상기한 균체 현탁액을 다이노밀에 송액(150 ml/분)하여 파쇄하고, 6,000×g에서 30분 원심하여 상청을 회수하였다. 이 상청을 분획 분자량 6,000의 중공사막 AIP2013(아사히 가세이 케미컬즈사 제조)를 이용하여 농축하고, 농축 후의 효소액에 황산암모늄을 70％ 포화가 되도록 서서히 첨가하여 여분의 단백질을 침전시켰다. 밤새, 4℃에서 방치한 후, 원심 분리(200,000×g, 60분)에 의해 상청을 회수하였다.

이 상청을 완충액 A(10 mM 아세트산 완충액, 2 M 황산암모늄, pH 5.0)로 미리 평형화한 부틸도요펄 650C(도소사 제조) 칼럼(26φ×28.5 cm)에 걸고, 완충액 A부터 완충액 B(10 mM 아세트산 완충액, pH 5.0)의 선형 그래디언트에 의해서 용출시켰다. 용출된 활성 분획을 센트리콘 플러스-70(밀리포어사 제조)로 농축한 후, 완충액 C(10 mM 아세트산 완충액, pH4.5)로 투석하고, 미리 완충액 C로 평형화한 SP 세파로스 FastFlow(GE 헬스케어사 제조) 칼럼(26φ×28.5 cm)에 걸고, 완충액 C부터 완충액 D(10 mM 아세트산 완충액, 200 mM 염화칼륨, pH4.5)의 선형 그래디언트로 용출시켰다. 용출된 활성 분획을 농축하여, 정제 효소를 얻었다.

이후, 각 정제 효소에 대해서, 무코르 프라이니이 NISL0103 유래의 GDH를 MpGDH, 무코르 자바니쿠스 NISL0111 유래의 GDH를 MjGDH, 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스 NISL0117 유래의 GDH를 McGDH로 표기한다.

실시예 3

(무코르속 유래의 플라빈 결합형 GDH의 효소 화학적 성질의 검토)

실시예 2에 의해 얻어진 각 정제 GDH의 여러 성질을 조사하였다.

(a) 흡수 스펙트럼의 측정

MpGDH, MjGDH 및 McGDH를 10 mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 투석하고, 250-800 nm에서의 흡수 스펙트럼을 분광 광도계 U-3010(히다치 하이테크놀로지사 제조)에 의해 측정하였다. 측정 결과를 도 1에 도시하였다(도 1의 (A)는 MpGDH의 흡수 스펙트럼, 도 1의 (B)은 MjGDH의 흡수 스펙트럼, 도 1의 (C)은 McGDH의 흡수 스펙트럼을 나타냄). 어느 GDH에 대해서도, 파장 340 내지 350 nm 부근 및 파장 420 내지 430 nm 부근에 극대를 나타내는 2개의 피크가 확인되고, 이러한 흡수 스펙트럼의 형상이 플라빈 효소에 특유의 형상인 점에서, 본 발명의 GDH가 플라빈 결합형 단백질인 것이 강하게 시사되었다.

(b) GOD 활성의 측정

실시예 2에 의해 얻어진 MpGDH, MjGDH 및 McGDH와, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 시판되고 있는 글루코오스 옥시다아제(GOD, biozyme laboratories사 제조)를 이용하여, GDH 활성 및 GOD 활성을 측정하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

GDH 활성은 실시예 1의 방법에 준하여, GOD 활성은 4-아미노안티피린(4-AA), 및 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS)을 사용한 이하의 방법으로 측정하였다. 100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 30.0 mL, 833 mM D-글루코오스 용액 6.0 mL, 25 mM 4-AA 용액 0.3 mL, 40 mM TOOS 용액 0.3 mL 및 500 U/mL POD 용액 0.3 mL를 혼합한 후, 3.0 mL를 시험관에 옮기고, 37℃에서 5분간 보온한 후, 효소 샘플 용액 0.1 mL를 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소 반응의 진행에 수반하는 555 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 증가량(ΔA555)을 측정하고, 다음 식에 따라서 GOD 활성을 산출하였다. 이 때, GOD 활성은, 37℃에서 농도 131 mM의 D-글루코오스 존재하에서 1분간에 1 ㎛ol의 H₂O₂를 생성하는 효소량을 1 U로 정의하였다.

또한, 식 중의 3.1은 반응 시약+효소 시약의 액량(mL), 32.8은 본 활성 측정 조건에 있어서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/㎛ol), 0.5는 1분자의 H₂O₂가 환원될 때에 생기는 퀴논이민 염료의 분자수, 0.1은 효소 용액의 액량(mL), 1.0은 셀의 광로 길이(cm), ΔA555_블랭크는 10 mM 아세트산 완충액을 효소 샘플 용액 대신에 첨가하여 반응 개시한 경우의 555 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 증가량, df는 희석 배수를 나타낸다.

표 2에 나타낸 바와 같이, MpGDH, MjGDH 및 McGDH는 모두 전혀 GOD 활성을 나타내지 않고, 오로지 GDH 활성을 나타내었다. 한편, GOD는 주로 GOD 활성을 나타내지만, GDH 활성도 겸비하는 것이 판명되었다. 즉, 본 발명의 GDH는 산소를 전자 수용체로서 이용하지 않기 때문에, D-글루코오스를 정량할 때에 반응계의 용존 산소의 영향을 매우 받기 어렵다는 것이 나타났다.

(c) 최적 pH

상기한 본 발명의 플라빈 결합형 GDH에서의 최적 pH를 조사하였다. 결과를 도 2에 도시하였다(도 2의 (A)는 MpGDH, (B)는 MjGDH, (C)는 McGDH의 결과를 나타냄). 구체적으로는, 100 mM 아세트산칼륨 완충액(pH 5.0-5.5, 도면 중 △ 표시로 플롯), 100 mM MES-NaOH 완충액(pH 5.5-6.5, 도면 중 경사 사각 표시로 플롯), 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0-8.0, 도면 중 동그라미 표시로 플롯), 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5-9.0, 도면 중 × 표시로 플롯)을 이용하여, 각각의 pH에서, 온도 37℃에서 효소 반응을 행하고, 상대 활성을 비교하였다.

그 결과, 상기한 플라빈 결합형 GDH는 모두 pH 6.5 또는 pH 7.0에서 가장 높은 활성을 나타내고, pH 7.0 부근에 최적 pH를 갖고 있었다. 개별로 보면, MpGDH 및 McGDH의 상대 활성이 가장 높았던 것은 pH 7.0에서이고, 그 주변역으로서, pH 6.5-7.5의 범위에서 최대 상대 활성치의 80％ 이상을 나타내었기 때문에, 이 범위에서 바람직하게 사용할 수 있다고 생각되었다. 또한, MjGDH의 상대 활성이 가장 높았던것은 pH 6.5에서이고, 그 주변역으로서, pH 6.0-7.0의 범위에서 최대 상대 활성치의 80％ 이상을 나타내었기 때문에, 이 범위에서 바람직하게 사용할 수 있다고 생각되었다.

(d) 최적 온도 범위

실시예 2에 기재된 활성 측정법에 준하여, 다양한 온도에서 본 효소의 활성 측정을 행하였다. 구체적으로는, 100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 30.0 mL, 833 mM D-글루코오스 용액 6.0 mL, 25 mM 4-AA 용액 0.3 mL, 40 mM TOOS 용액 0.3 mL 및 500 U/mL POD 용액 0.3 mL를 혼합한 후, 3.0 mL를 시험관에 옮기고, 37℃에서 보온하는 대신에 각 온도에서 5분간 보온하고, 이어서 20 mM PMS 용액 0.02 mL 및 효소 샘플 용액 0.1 mL를 첨가하고, 각 온도에서 반응을 개시하였다. 반응 개시시, 및 2분 후의 흡광도를 측정하고, 효소 반응의 진행에 수반하는 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량을 구하였다. 결과를 도 3에 도시하였다(도 3의 (A)는 MpGDH, (B)는 MjGDH, (C)는 McGDH의 결과를 나타냄). 모두 37℃ 부근에서 최대의 활성을 나타내고, 최대 활성에 대하여 80％ 이상의 활성을 나타내는 온도 범위는 30 내지 40℃였다. 이상으로부터, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 최적 온도 범위는 30 내지 40℃, 가장 바람직한 온도는 37℃라고 생각되었다.

(e) D-글루코오스에 대한 Km값

상기 활성 측정법에 있어서, 기질인 D-글루코오스 농도를 변화시켜 활성 측정을 행하고, 라인웨버·버크 플롯으로부터 미카엘리스 상수(Km)를 구하였다. 이 결과, D-글루코오스에 대한 Km값은, MpGDH에서 31.1 mM, MjGDH에서 26.4 mM, McGDH에서 33.2 mM였다.

(f) 열 안정성

100 mM 아세트산칼륨 완충액(pH 5.0)을 이용하여, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 각 온도에서 15분간 처리했을 때의 열 안정성의 결과를 도 4에 도시하였다(도 4의 (A)는 MpGDH, (B)는 MjGDH, (C)는 McGDH의 결과를 나타냄). 본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 40℃, 15분간의 열 처리 후에 80％ 이상의 잔존 활성을 갖고 있고, 약 40℃까지 안정적인 것을 알았다.

(g) 안정 pH의 범위

본 발명의 플라빈 결합형 GDH에서의 안정 pH를 조사하였다. 결과를 도 5에 도시하였다(도 5의 (A)는 MpGDH, (B)는 MjGDH, (C)는 McGDH의 결과를 나타냄). 구체적으로는, 100 mM 글리신-HCl 완충액(pH 2.5-3.5, 도면 중 사각 표시로 플롯), 100 mM 아세트산칼륨 완충액(pH 3.5-5.5, 도면 중 △ 표시로 플롯), 100 mM MES-NaOH 완충액(pH 5.5-6.5, 도면 중 경사 사각 표시로 플롯), 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0-8.0, 도면 중 동그라미 표시로 플롯), 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5-9.0, 도면 중 × 표시로 플롯)을 이용하여, 각각의 pH에서 25℃에서 16시간 처리한 후, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 잔존 활성을 각각 측정하였다. 그 결과, 모두, 최대의 잔존 활성을 나타낸 pH 5.0 부근에서의 활성에 대하여 80％ 이상의 활성을 나타내는 pH 범위는 pH 3.5-7.0이었다. 이상으로부터, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 안정 pH 범위는 pH 3.5-7.0인 것을 알았다.

(h) 분자량

슈퍼세프 에이스 10-20％(와코 준야꾸 고교사 제조)를 이용한 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 MpGDH, MjGDH 및 McGDH의 분자량을 구하였다. 또한, 탈당쇄 키트(Enzymatic Deglycosylation Kit, PZM 제조)를 이용하여, 본 발명의 각 플라빈 결합형 GDH를 탈당쇄 처리하고, 마찬가지로 전기 영동에 제공하였다. 결과를 도 6에 도시하였다. 영동 샘플은 이하와 같다.

레인 1: 분자량 마커(New England Biolabs사 제조, Protein Ladder(10-250 kDa), 위로부터 250 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa)

레인 2: MpGDH

레인 3: 탈당쇄 처리 후의 MpGDH

레인 4: MjGDH

레인 5: 탈당쇄 처리 후의 MjGDH

레인 6: McGDH

레인 7: 탈당쇄 처리 후의 McGDH

레인 8: 탈당쇄 반응에 사용한 효소

도 6으로부터, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 분자량은 MpGDH에서 약 90 내지 130 kDa, MjGDH에서 약 100 내지 150 kDa, McGDH에서 약 130 내지 200 kDa이고, 탈당쇄 키트(Enzymatic Deglycosylation Kit, PZM 제조)에 의해 당쇄를 제거한 후의 분자량은 MpGDH, MjGDH 및 McGDH 모두 약 80 kDa였다.

(i) 기질 특이성

실시예 1의 효소 활성 측정 방법에 준하여, 기질로서는 D-글루코오스, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스, 만노오스, 수크로오스, 트레할로오스, 말토트리오스, 말토테트라오스를 각각 이용하여, 각 기질에 대한 본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 활성을 측정하였다. 기질 농도는 50 mM로 하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 D-글루코오스에 대한 활성을 100％로 한 경우에, 각종 당 화합물에 대하여, 모두 반응성이 매우 낮은 것이 판명되었다. 그리고, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 대한 활성은 모두 2％ 이하였다.

(j) 1,10-페난트롤린에 의한 저해 효과

본 발명의 플라빈 결합형 GDH의 활성에 대한 1,10-페난트롤린의 저해 효과를 이하의 방법으로 조사하였다. 실시예 1의 효소 활성의 측정 방법에 준하여, 다만, 종농도가 1 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM 및 50 mM이 되도록 1,10-페난트롤린을 첨가한 경우의 효소 활성을 구하고, 1,10-페난트롤린 무첨가의 저해율을 0％로 하여, 그 저해율을 계산하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH에 대한 1,10-페난트롤린의 저해 효과는 낮아, 1 mM의 1,10-페난트롤린 첨가에서는 2 내지 4％ 정도의 저해 효과가 나타나는 것에 지나지 않고, 5 mM의 첨가에서도 저해율은 10％ 정도였다.

실시예 4

(본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 이용한 글루코오스 농도의 정량성의 검증1)

본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 이용하여 글루코오스의 측정을 행하였다. 구체적으로는, 100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 1.79 mL, D-글루코오스 용액(250, 750, 1,250, 1,750, 2,500, 3,250, 4,000, 5,000 mg/dL) 0.08 mL 및 20 mM DCIP 용액 0.01 mL를 혼합하고, 37℃에서 5분간 보온한 후, 20 mM PMS 용액 0.02 mL 및 0.8 U/mL GDH 용액 0.1 mL를 첨가하고, 반응을 개시하였다. 효소 반응의 진행에 수반하는 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량(ΔA600)과 글루코오스의 종농도의 관계를 도 7에 도시하였다(도 7의 (A)는 MpGDH를 이용한 측정 결과, (B)는 MjGDH를 이용한 측정 결과, (C)는 McGDH를 이용한 측정 결과를 나타냄).

도 7에 도시한 바와 같이, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 이용함으로써, 종농도 200 mg/dL 이하의 글루코오스 농도이면, 측정 시료 중의 글루코오스 농도를 정밀도 좋게 측정할 수 있는 것이 확인되었다.

실시예 5

(본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 이용한 글루코오스 농도의 정량성의 검증2)

100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 1.77 mL, D-글루코오스 용액(10,000, 16,000 mg/dL) 0.02 mL 및 20 mM DCIP 용액 0.01 mL를 혼합하였다. 계속해서, 말토오스 용액(3,000, 6,000, 9,000, 12,000, 15,000 mg/dL) 또는 D-갈락토오스 용액(1,500, 3,000, 4,500, 6,000, 7,500 mg/dL) 또는 D-자일로오스 용액(1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000 mg/dL) 0.08 mL를 첨가하고 37℃에서 5분간 보온한 후, 20 mM PMS 용액 0.02 mL 및 2.0 U/mL GDH 용액 0.1 mL를 첨가하고, 반응을 개시하였다. 효소 반응의 진행에 수반하는 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량(ΔA600), 및 글루코오스의 종농도의 관계를 표 5 내지 7에 나타내었다.

표 5 내지 7로부터, 본 발명 GDH는 종농도 600 mg/dL 이하의 말토오스, 또는 종농도 300 mg/dL 이하의 D-갈락토오스, 또는 종농도 200 mg/dL 이하의 D-자일로오스를 함유하는 샘플의 글루코오스 농도를 정밀도 좋게 정량할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 6

(본 발명의 플라빈 결합형 GDH를 이용한 글루코오스 농도의 정량성의 검증3)

100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 1.61 mL, D-글루코오스 용액(10,000, 16,000 mg/dL) 0.02 mL 및 20 mM DCIP 용액 0.01 mL를 혼합하였다. 계속해서, 말토오스 용액(3,000, 6,000, 9,000, 12,000, 15,000 mg/dL), D-갈락토오스 용액(1,500, 3,000, 4,500, 6,000, 7,500 mg/dL) 및 D-자일로오스 용액(1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000 mg/dL) 을 각각 0.08 mL 첨가하고 37℃에서 5분간 보온한 후, 20 mM PMS 용액 0.02 mL 및 2.0 U/mL의 본 발명의 플라빈 결합형 GDH 용액 0.1 mL를 첨가하고, 반응을 개시하였다. 효소 반응의 진행에 수반하는 600 nm에서의 흡광도의 1분간 당의 감소량(ΔA600)과 글루코오스의 종농도의 관계를 표 8 내지 9에 나타내었다.

표 8 내지 9로부터, MpGDH 또는 MjGDH는 종농도 600 mg/dL 이하의 말토오스,종농도 300 mg/dL 이하의 D-갈락토오스 및 종농도 200 mg/dL 이하의 D-자일로오스를 함유하는 시료 중의 글루코오스 농도를, 매우 정밀도 좋게 정량할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 7

(무코르속 유래의 플라빈 결합형 GDH 유전자의 클로닝과 형질 전환체에 의한 발현)

(1) mRNA의 제조

무코르 프라이니이 NISL0103을 맥아 추출물 배지(맥아 추출물 2.0％, 글루코오스 4.0％, 폴리펩톤 0.1％, pH 6.0) 3 mL에 접종하고, 2일 30℃에서 진탕 배양하였다. 이 배양액을 여과지로 여과하여, 균사체를 회수하였다. 얻어진 균사를 액체질소 중에서 동결시키고, 유발을 이용하여 균사를 분쇄하였다. 이어서, ISOGEN(닛본 진사 제조)를 이용하여, 본 키트의 프로토콜에 따라서, 분쇄한 균체로부터 mRNA를 얻었다.

(2) GDH 부분 아미노산 서열의 결정

실시예 2로부터 얻어진 MpGDH를 슈퍼세프 에이스 10-20％(와코 준야꾸 고교사 제조)에 제공하고, 전기 영동을 행하였다. 전기 영동 후의 겔을 Quick-CBB(와코 준야꾸 고교사 제조)를 이용하여 염색하고, 해당 효소의 분자량에 상당하는 밴드 부분을 추출하였다. 추출한 겔 단편을 외부 기관에 위탁하고, 그 중에 포함되는 단백질의 내부 아미노산 서열 정보를 취득하였다. 그 결과, 얻어진 아미노산 서열은, LVENFTPPTPAQIE(서열번호 5) 및 IRNSTDEWANYY(서열번호 6)였다.

(3) GDH 유전자 배열의 결정

상기한 부분 아미노산 서열 정보에 기초하여, 믹스 염기를 함유하는 디제너레이트 프라이머(프라이머의 일례를 서열번호 7(정방향 프라이머), 서열번호 8(역방향 프라이머)에 나타냄)를 제작하였다. 또한, 서열번호 7 및 8에 기재된 1문자 표기에 있어서, 혼합 염기는 각각, h=a+c+t, r=a+g, y=c+t, d=a+g+t를 나타낸다. 상기 (1)에서 제조한 무코르 프라이니이 NISL0103의 mRNA를 주형으로 하여, PrimeScript RT-PCR Kit(다카라 바이오사 제조)를 이용하여, 본 키트의 프로토콜에 따라서 RT-PCR을 행하였다. 역전사 반응에는 본 키트 부속의 올리고 dT 프라이머를, PCR에 의한 cDNA 증폭에는 서열번호 7, 8에 나타내는 디제너레이트 프라이머를 이용하였다. 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하게 한 바, 800 bp 정도의 길이에 상당하는 단일 밴드가 확인되었다. 이 밴드에 포함되는 증폭 DNA 단편을 정제하여, Ligation Convenient Kit(닛본 진사 제조)를 이용하여, pT7Blue(노바젠사 제조)에 상기 증폭 DNA 단편을 라이게이션함으로써, 재조합 플라스미드 pTMGD-1을 구축하였다.

이어서, 얻어진 pTMGD-1을 이용하여, 공지된 히트쇼크법에 의해 대장균 JM109 콤페턴트 셀(닛본 진사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 GenElute Plasmid Miniprep Kit(시그마사 제조)를 이용하여 플라스미드를 추출·정제하고, 플라스미드 중에 포함되는 상기 증폭 DNA 단편의 염기 서열을 결정하였다(767 bp).

얻어진 상기 증폭 DNA 단편의 배열 정보를 바탕으로, 3'-Full RACE Core Set(다카라 바이오사 제조)를 이용하여 3'측의 GDH 유전자 미지 영역을, 또한 5'-Full RACE Core Set(다카라 바이오사 제조)를 이용하여 5'측의 GDH 유전자 미지 영역을 결정하였다. 모두 각 키트의 프로토콜에 따라서, 3'-Full RACE Core Set에서는 본 키트 부속의 3 사이트 어댑터 프라이머 및 서열번호 9에 나타내는 프라이머를 이용하고, 또한 5'-Full RACE Core Set에서는 서열번호 10, 11, 12, 13, 14에 나타내는 프라이머를 각각 이용하였다. 상기 방법에 따라서 얻어진 복수의 플라스미드 중에 포함되는 DNA 단편의 염기 서열 해석을 행한 결과, 서열번호 2 및 서열번호 4에 나타내는 전체 쇄 길이 1926 bp의 무코르 프라이니이 NISL0103 유래 GDH 유전자 배열이 분명해졌다. 해당 유전자 배열에 의해 예측한 해당 효소 유전자의 아미노산 서열을 서열번호 1 및 서열번호 3에 나타내었다.

(4) 대장균의 형질 전환과 GDH 활성의 확인

N 말단 영역의 프라이머(서열번호 15) 및 C 말단 영역의 프라이머(서열번호 16)를 제작하고, 이들 프라이머 및 상기 (1)에서 제조한 무코르 프라이니이 NISL0103의 mRNA를 이용하여, RT-PCR을 행하였다.

반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공한 바, 약 2 kbp 정도의 길이에 상당하는 싱글밴드가 확인되었다. 이 밴드에 포함되는 증폭 DNA 단편을 정제하여, 제한 효소 SmaI로 소화한 플라스미드 pUC19(다카라 바이오사 제조)와 라이게이션을 행하여, 재조합 플라스미드 puc-MGD를 구축하였다.

얻어진 재조합 플라스미드 puc-MGD를 이용하여, 공지된 히트쇼크법에 의해 대장균 JM109 콤페턴트 셀(닛본 진사 제조)을 형질 전환하였다. 이어서, 형질 전환한 대장균 JM109(puc-MGD) 균체를 100μg/mL의 암피실린을 포함하는 TY 배지(1％ 백토 트립톤, 0.5％ 백토 이스트 익스트랙트, 0.5％ NaCl, pH 7.0) 10 mL 중에서 37℃, 2시간 진탕 배양한 후, IPTG를 종농도 1 mM가 되도록 첨가하고, 30℃, 6시간 진탕 배양을 더 행하였다.

이 배양액을 얼음 상에서 냉각 하에서, 초음파 파쇄기(Ultrasonicgenerator, Nissei사 제조)를 이용하여 20초간, 4회 처리하여, 파쇄하였다. 파쇄액을 에펜도르프 튜브에 넣고, 미량 원심기를 이용하여, 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 상청 분획을 별도의 에펜도르프 튜브에 바꿔 옮겨, 조효소액으로 하였다. 상술한 효소 활성 측정법에 의해 이 조효소액 내의 GDH 활성을 측정한 바, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH 활성이 확인되었다.

(5) 누룩균의 형질 전환과 GDH 활성의 확인

Double-joint PCR(Fungal Genetics and Biology, 2004년, 제41권, p973-981)을 행하여, 5' 아암 영역 내지 PyrG 유전자(우라실 영양 요구성 마커) 내지 TEF1 프로모터 유전자 내지 플라빈 결합형 GDH 유전자 내지 3' 아암 영역으로 이루어지는 카세트를 구축하고, 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae) KK1-2주를 숙주로, 프로토플라스트 PEG법에 의해 형질 전환을 행하였다. 얻어진 균주 중에서 목적으로 하는 형질 전환체를 PCR로 확인하고 선발하였다.

0.8％ 살수한 밀기울을 150 mL 삼각 플라스크에 5 g 취하고, 면마개를 하고 121℃, 50분 오토클레이브 멸균하였다. 이에 비하여, 본 발명의 플라빈 결합형 GDH 유전자가 삽입된 상기한 형질 전환체, 또는 대조군주의 분생자 현탁액을, 1×10⁵/g 누룩이 되도록 식균하여, 30℃, 64시간 배양하였다. 대조군주로서는, 형질 전환을 하지 않은 숙주를 이용하였다.

배양 후의 기울 누룩 2 g에 대하여 5배량의 10 mM 아세트산 완충액(pH 5.0)을 가하고, 폴리트론 균질기 PT3000(키네마티카사 제조)로 30초×8회 파쇄를 행하였다. 파쇄 후, 14,000 rpm, 30분간 원심 분리를 행하고, 얻어진 상청 분획을 조효소액으로 하였다. 상술한 효소 활성 측정법에 의해, 이 조효소액 내의 GDH 활성을 측정한 바, 대조군주를 이용하여 얻어진 조효소액 내의 GDH 활성은 0.3 U/mL이었던 것에 비하여, 형질 전환체를 이용하여 얻어진 조효소액 내의 GDH 활성은 14.0 U/mL로서, 형질 전환체에 있어서 본 발명의 플라빈 결합형 GDH가 발현되어 있는 것이 확인되었다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH 유전자가 삽입된 상기한 형질 전환체를 이용하여, 각 기질에 대한 GDH 활성을 측정하였다. 실시예 1의 효소 활성 측정 방법에 준하여, 기질로서는 D-글루코오스, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스, 만노오스, 수크로오스, 트레할로오스를 각각 이용하여 측정하였다. 기질 농도는 50 mM로 하였다. 결과를 표 10에 나타내었다.

본 발명의 플라빈 결합형 GDH는 D-글루코오스에 대한 기질 특이성이 매우 높고, D-글루코오스 이외의 당 화합물(말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스)에의 반응성이 충분히 낮기 때문에, D-글루코오스 이외의 당 화합물을 함유하는 시료를 측정하는 경우에도 D-글루코오스 농도를 정밀도 좋게 정량할 수 있기 때문에, 혈당값의 측정이나 식품 중의 글루코오스 농도의 정량 등의 분야에서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> KIKKOMAN CORPORATION <120> FLAVIN-BINDING GLUCOSE DEHYDROGENASE, FLAVIN-BINDING GLUCOSE DEHYDROGENASE GENE AND METHOD FOR PRODUCING FLAVIN-BINDING GLUCOSE DEHYDROGENASE <130> P2569A <150> JP 2009-134623 <151> 2009-06-04 <150> JP 2009-261686 <151> 2009-11-17 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 641 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 1 Met Lys Ile Thr Ala Ala Ile Ile Thr Val Ala Thr Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ala Gln Gln Asp Thr Asn Ser Ser Ser Thr Asp Thr Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Thr Val Gly Gly Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser 35 40 45 Arg Ile Ser Glu Asn Lys Asp Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Pro Asn Ala Asn Asp Arg Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Ala Val Gly Thr Asp Leu Cys Pro Leu Ile Pro Thr Thr Pro Gln 85 90 95 Glu Asn Met Gly Asn Arg Ser Leu Thr Ile Ala Thr Gly Arg Leu Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Gly Leu 115 120 125 Lys Asp Tyr Asp Ala Trp Glu Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly 130 135 140 Ala Asn Leu Phe Lys Tyr Phe Lys Lys Val Glu Asn Phe Thr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Ile Glu Tyr Gly Ala Thr Tyr Gln Lys Ser Ala His 165 170 175 Gly Lys Lys Gly Pro Ile Asp Val Ser Phe Thr Asn Tyr Glu Phe Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Ser Trp Asn Ala Ser Leu Glu Thr Leu Asp Phe Thr Ala 195 200 205 Leu Pro Asp Ile Leu Asn Gly Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Thr Thr Pro 210 215 220 Asn Ile Leu Asp Pro Glu Thr Val Gln Arg Val Asp Ser Tyr Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Ala Pro Tyr Thr Ser Arg Asn Asn Leu Asn Val Leu Ala Asn 245 250 255 His Thr Val Ser Arg Ile Gln Phe Ala Pro Lys Asn Gly Ser Glu Pro 260 265 270 Leu Lys Ala Thr Gly Val Glu Trp Tyr Pro Thr Gly Asn Lys Asn Gln 275 280 285 Lys Gln Ile Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala 290 295 300 Ile Gly Ser Pro Lys Leu Leu Glu Ile Ser Gly Ile Gly Asn Lys Asp 305 310 315 320 Ile Val Ser Ala Ala Gly Val Glu Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val 325 330 335 Gly Ser Asn Met Gln Asp His Val His Ala Ile Thr Val Ser Thr Thr 340 345 350 Asn Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Asn Ser Val Phe Val Asn Glu Thr Leu 355 360 365 Ala Gln Glu Gln Arg Glu Glu Tyr Glu Ala Asn Lys Thr Gly Ile Trp 370 375 380 Ala Thr Thr Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400 Asn Gly Thr Glu Phe Val Ser Gly Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Arg 405 410 415 Asn Ser Thr Asp Glu Trp Ala Asn Tyr Tyr Ala Ser Thr Asn Ala Ser 420 425 430 Asn Val Glu Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ile Val Ala Ser Arg Tyr 435 440 445 Glu Glu Asn Tyr Leu Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr 450 455 460 Glu Gly Ser Gly Asn Val Asp Leu Gln Asn Asn Lys Tyr Gln Thr Val 465 470 475 480 Asn His Val Leu Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn 485 490 495 Ser Ser Asp Val Glu Asp His Ser Val Ile Asn Pro Gln Tyr Tyr Ser 500 505 510 His Pro Met Asp Ile Asp Val His Ile Ala Ser Thr Lys Leu Ala Arg 515 520 525 Glu Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ile Asn Ser Gly Glu 530 535 540 Ile Glu Pro Gly Met Asn Ile Thr Ser Glu Asp Asp Leu Arg Ser Trp 545 550 555 560 Leu Ser Asn Asn Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala 565 570 575 Met Leu Pro Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Ser Pro Ala Leu Met Val 580 585 590 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Ile Met Pro Leu 595 600 605 Glu Val Ser Ser His Leu Met Gln Pro Thr Tyr Gly Ile Ala Glu Lys 610 615 620 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Asn Phe Tyr Lys Thr Gln His Lys Asn Gln 625 630 635 640 Asn <210> 2 <211> 1926 <212> DNA <213> Mucor prainii <400> 2 atgaagatca cagctgccat tatcactgtt gccacagcat ttgcttcttt tgcttctgct 60 caacaagaca caaattcttc ctcaactgat acttatgatt atgttaccgt tggcggcggt 120 gtagctggtt tggctttggc tagtcgtatc tctgaaaaca aggatgtcac tgttgctgtt 180 ctcgagtccg gtcctaatgc caatgataga tttgttgttt atgctcctgg catgtatggc 240 caagctgttg gcactgatct ctgtcctctc attcctacta ctcctcaaga aaatatgggc 300 aacagaagtc tcacaatcgc tactggtaga ttgctcggtg gtggcagtgc tattaatggt 360 ctcgtttgga cccgtggtgg cttgaaggat tacgatgctt gggaggagct cggtaaccct 420 ggatggaacg gtgccaactt gttcaagtac tttaagaagg tcgaaaactt cactcctcct 480 actcctgcac aaattgaata cggcgctact tatcagaaaa gtgctcatgg caagaaggga 540 cctattgatg tctctttcac gaactacgag ttctctcaat ctgctagctg gaacgcctca 600 ctcgaaaccc ttgatttcac tgcacttcct gatatcttga acggtacttt ggccggttac 660 tctaccactc ccaacatttt ggaccctgag actgttcaac gtgttgattc ctatactggt 720 tacattgctc cttacactag ccgtaacaac ctcaatgttt tggccaacca taccgtctcc 780 cgcattcaat ttgctcccaa gaatggtagc gaacctctca aggctaccgg tgttgaatgg 840 tatcccactg gcaacaagaa tcaaaagcaa attatcaagg cccgttatga agttatcatc 900 tcatctggtg ccattggtag tcctaagctt ttggaaatct ctggtatcgg taataaggat 960 atcgtctctg ctgctggtgt cgagtccttg attgacttgc ctggcgttgg ttccaacatg 1020 caagatcacg ttcatgctat cactgtctct actaccaata ttactggcta tactaccaac 1080 agcgtctttg tcaatgaaac ccttgcccaa gaacaaagag aagaatatga agccaacaag 1140 actggtatct gggctactac tcccaacaac ctcggttatc ctacgcccga acaactcttc 1200 aatggcaccg aattcgtttc tggaaaggag tttgctgaca agattcgtaa ctctactgat 1260 gaatgggcca actattatgc ttccaccaac gcctccaatg tcgagttatt aaagaagcaa 1320 tatgctattg tcgcctctcg ttacgaagag aactacttgt ctcctattga aatcaacttc 1380 actcctggtt atgagggtag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440 aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500 gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560 atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620 aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg aagacgacct tagatcttgg 1680 ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740 gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800 gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860 attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920 aattag 1926 <210> 3 <211> 641 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 3 Met Lys Ile Thr Ala Ala Ile Ile Thr Val Ala Thr Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ala Gln Gln Asp Thr Asn Ser Ser Ser Thr Asp Thr Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser 35 40 45 Arg Ile Ser Glu Asn Lys Asp Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Pro Asn Ala Asn Asp Arg Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Ala Val Gly Thr Asp Leu Cys Pro Leu Ile Pro Thr Thr Pro Gln 85 90 95 Glu Asn Met Gly Asn Arg Ser Leu Thr Ile Ala Thr Gly Arg Leu Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Gly Leu 115 120 125 Lys Asp Tyr Asp Ala Trp Glu Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly 130 135 140 Ala Asn Leu Phe Lys Tyr Phe Lys Lys Val Glu Asn Phe Thr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Ile Glu Tyr Gly Ala Thr Tyr Gln Lys Ser Ala His 165 170 175 Gly Lys Lys Gly Pro Ile Asp Val Ser Phe Thr Asn Tyr Glu Phe Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Ser Trp Asn Ala Ser Leu Glu Thr Leu Asp Phe Thr Ala 195 200 205 Leu Pro Asp Ile Leu Asn Gly Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Thr Thr Pro 210 215 220 Asn Ile Leu Asp Pro Glu Thr Val Gln Arg Val Asp Ser Tyr Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Ala Pro Tyr Thr Ser Arg Asn Asn Leu Asn Val Leu Ala Asn 245 250 255 His Thr Val Ser Arg Ile Gln Phe Ala Pro Lys Asn Gly Ser Glu Pro 260 265 270 Leu Lys Ala Thr Gly Val Glu Trp Tyr Pro Thr Gly Asn Lys Asn Gln 275 280 285 Lys Gln Ile Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala 290 295 300 Ile Gly Ser Pro Lys Leu Leu Glu Ile Ser Gly Ile Gly Asn Lys Asp 305 310 315 320 Ile Val Ser Ala Ala Gly Val Glu Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val 325 330 335 Gly Ser Asn Met Gln Asp His Val His Ala Ile Thr Val Ser Thr Thr 340 345 350 Asn Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Asn Ser Val Phe Val Asn Glu Thr Leu 355 360 365 Ala Gln Glu Gln Arg Glu Glu Tyr Glu Ala Asn Lys Thr Gly Ile Trp 370 375 380 Ala Thr Thr Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400 Asn Gly Thr Glu Phe Val Ser Gly Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Arg 405 410 415 Asn Ser Thr Asp Glu Trp Ala Asn Tyr Tyr Ala Ser Thr Asn Ala Ser 420 425 430 Asn Val Glu Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ile Val Ala Ser Arg Tyr 435 440 445 Glu Glu Asn Tyr Leu Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr 450 455 460 Glu Gly Ser Gly Asn Val Asp Leu Gln Asn Asn Lys Tyr Gln Thr Val 465 470 475 480 Asn His Val Leu Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn 485 490 495 Ser Ser Asp Val Glu Asp His Ser Val Ile Asn Pro Gln Tyr Tyr Ser 500 505 510 His Pro Met Asp Ile Asp Val His Ile Ala Ser Thr Lys Leu Ala Arg 515 520 525 Glu Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ile Asn Ser Gly Glu 530 535 540 Ile Glu Pro Gly Met Asn Ile Thr Ser Glu Asp Asp Leu Arg Ser Trp 545 550 555 560 Leu Ser Asn Asn Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala 565 570 575 Met Leu Pro Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Ser Pro Ala Leu Met Val 580 585 590 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Ile Met Pro Leu 595 600 605 Glu Val Ser Ser His Leu Met Gln Pro Thr Tyr Gly Ile Ala Glu Lys 610 615 620 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Asn Phe Tyr Lys Thr Gln His Lys Asn Gln 625 630 635 640 Asn <210> 4 <211> 1926 <212> DNA <213> Mucor prainii <400> 4 atgaagatca cagctgccat tatcactgtt gccacagcat ttgcttcttt tgcttctgct 60 caacaagaca caaattcttc ctcaactgat acttatgatt atgttatcgt tggcggcggt 120 gtagctggtt tggctttggc tagtcgtatc tctgaaaaca aggatgtcac tgttgctgtt 180 ctcgagtccg gtcctaatgc caatgataga tttgttgttt atgctcctgg catgtatggc 240 caagctgttg gcactgatct ctgtcctctc attcctacta ctcctcaaga aaatatgggc 300 aacagaagtc tcacaatcgc tactggtaga ttgctcggtg gtggcagtgc tattaatggt 360 ctcgtttgga cccgtggtgg cttgaaggat tacgatgctt gggaggagct cggtaaccct 420 ggatggaacg gtgccaactt gttcaagtac tttaagaagg tcgaaaactt cactcctcct 480 actcctgccc aaattgaata cggcgctact tatcagaaaa gtgctcatgg caagaaggga 540 cctattgatg tctctttcac gaactacgag ttctctcaat ctgctagctg gaacgcctca 600 ctcgaaaccc ttgatttcac tgcacttcct gatatcttga acggtacttt ggccggttac 660 tctaccactc ccaacatttt ggaccctgag actgttcaac gtgttgattc ctatactggt 720 tacattgctc cttacactag ccgtaacaac ctcaatgttt tggccaacca taccgtctcc 780 cgcattcaat ttgctcccaa gaatggtagc gaacctctca aggctaccgg tgttgaatgg 840 tatcccactg gcaacaagaa tcaaaagcaa attatcaagg cccgttatga agttatcatc 900 tcatctggtg ccattggtag tcctaagctt ttggaaatct ctggtatcgg taataaggat 960 atcgtctctg ctgctggtgt cgagtccttg attgacttgc ctggcgttgg ttccaacatg 1020 caagatcacg ttcatgctat cactgtctct actaccaata ttactggcta tactaccaac 1080 agcgtctttg tcaatgaaac ccttgcccaa gaacaaagag aagaatatga agccaacaag 1140 actggtatct gggctactac tcccaacaac ctcggttatc ctacgcccga acaactcttc 1200 aatggcaccg aattcgtttc tggaaaggag tttgctgaca agattcgtaa ctctactgat 1260 gaatgggcca actattatgc ttccaccaac gcctccaatg tcgagttatt aaagaagcaa 1320 tatgctattg tcgcctctcg ttacgaagag aactacttgt ctcctattga aatcaacttc 1380 actcctggtt atgagggtag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440 aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500 gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560 atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620 aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg aagacgacct tagatcttgg 1680 ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740 gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800 gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860 attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920 aattag 1926 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 5 Leu Val Glu Asn Phe Thr Pro Pro Thr Pro Ala Gln Ile Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 6 Ile Arg Asn Ser Thr Asp Glu Trp Ala Asn Tyr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 1 (forward) <400> 7 cchachcchg chcaratyga r 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 2 (reverse) <400> 8 rtartarttd gcccaytcrt cdgt 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 3 for 3'-RACE <400> 9 cctacacctg cacaaattga atac 24 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 4 for 5'-RACE <400> 10 ggcgttccag ctag 14 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5 for 5'-RACE <400> 11 caagaaggga cctattgatg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 6 for 5'-RACE <400> 12 gagcactttt ctgataagta gc 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 7 for 5'-RACE <400> 13 cgaactacga gttctctcaa tc 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 8 for 5'-RACE <400> 14 cgtattcaat ttgtgcaggt g 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 9 (forward) <400> 15 atgaagatca cagctgcc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 10 (reverse) <400> 16 ctaattttgg ttcttgtg 18

Claims

이하의 (i) 내지 (iii)의 성질:
(i) 작용: 전자 수용체 존재하에서 글루코오스 탈수소 효소 활성을 나타냄,
(ii) 분자량: 단백질의 폴리펩티드쇄 부분의 분자량이 약 80 kDa임,
(iii) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성에 비하여, 말토오스 및 D-갈락토오스 및 D-자일로오스에 대한 반응성이 낮음
을 구비하는 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
제1항에 있어서, D-글루코오스에 대한 반응성을 100％로 한 경우에, 말토오스, D-갈락토오스 및 D-자일로오스에 대한 반응성이 모두 2％ 이하인 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 이하의 (a) 내지 (c)의 당 화합물:
(a) 말토오스
(b) D-갈락토오스
(c) D-자일로오스
중 1 이상이 존재하는 경우의 D-글루코오스에 대한 반응성이, 상기 (a) 내지 (c)가 존재하지 않는 경우의 D-글루코오스에 대한 반응성을 100％로 한 경우의 96％ 내지 104％인 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 최적 pH가 pH 6.5 내지 7.0이고, 최적 온도가 37 내지 40℃이고, 안정 pH 범위가 pH 3.5 내지 7.0이고, 40℃, 15분간의 열 처리 후에 80％ 이상의 잔존 활성을 갖는 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물에서 유래되는 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
제5항에 있어서, 무코르속으로 분류되는 미생물에서 유래되는 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
무코르속으로 분류되는 미생물을 배지에 배양하고, 해당 미생물 균체로부터 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제의 제조 방법.
제7항에 있어서, 미생물이 무코르 프라이니이, 무코르 자바니쿠스, 무코르 시르시넬로이데스 에프.시르시넬로이데스로부터 선택되는 1 이상인 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80％ 이상 상동인 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 것을 갖는 것을 특징으로 하는 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제.
이하의 (A) 내지 (E)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 DNA로 이루어지는 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제 유전자:
(A) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;
(B) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(C) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;
(D) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(E) 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열과 80％ 이상 상동인 염기 서열을 갖고, 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
제10항에 기재된 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제 유전자를 벡터 DNA에 삽입한 것을 특징으로 하는 재조합체 DNA.
제11항에 기재된 재조합체 DNA가 도입되어 있는 형질 전환체.
제10항에 기재된 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제 유전자 또는 제11항에 기재된 재조합체 DNA를 포함하며, 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제 생산능을 갖는 미생물을 배양하고, 해당 배양물로부터 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제를 채취하는 것을 특징으로 하는, D-글루코오스에 대한 반응성에 비하여, 말토오스, D-갈락토오스, D-자일로오스에 대한 반응성이 낮은 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제의 제조 방법.