KR101696754B1

KR101696754B1 - 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치

Info

Publication number: KR101696754B1
Application number: KR1020160054060A
Authority: KR
Inventors: 신동진
Original assignee: (주)큐브바이오
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2017-01-23

Abstract

본 발명은 소변에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단하는 암 진단 키트에 관한 것으로, 소변에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 질환 여부를 진단하며 이후 질환 여부가 검출되면 추가적으로 암 마커를 이용하여 발병한 암의 종류를 진단하는 질병 진단 장치에 관한 것이다.

Description

암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치{Diagnostic Device for Detecting Cancer Existence}

본 발명은 암 여부 및 암 종류를 진단하는 진단 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소변에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 암 여부를 진단하며 이후 암 여부가 검출되면 추가적으로 암 마커를 이용하여 발병한 암의 종류를 진단하는 질병 진단 장치에 관한 것이다.

암 마커는 악성 종양 세포 자체 내에서 생기거나 또는 암에 대한 정상조직의 반응으로 만들어져 혈액, 소변 또는 조직 내에서 비정상적으로 높은 농도를 나타내는 물질이며, 혈액, 소변 또는 조직 내의 암 마커 농도를 통해 암의 진행과 퇴화를 진단, 스크리닝, 추적할 수 있다.

일반적으로 암 마커의 농도 측정 또는 검출은 혈액을 통해 이루어지고 있으나, 혈액은 일반인이 스스로 채취하기 어렵다는 문제점이 있었다.

이에 채취하기 어려운 혈액, 조직 등의 생체물질이 아닌 입수가 용이한 소변을 이용하여 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 농도를 검출함으로써 암을 진단하는 방법에 대한 개발이 이루어져 왔다.

한편, 일반인과 비교해볼 때 암 환자의 경우 소변 내에 존재하는 티로신(Tyrosine)의 농도가 높아 상기 티로신을 암 바이오마커로서 사용할 수 있음이 알려졌다.

한국 등록특허 제10-0033547호는 암환자의 소변중에 공통적으로 존재하는 방향족 아민(Tyrosine)을 검출하여 암을 진단하는 혼합 시약에 관한 것으로서, 상기 혼합 시약은 수은과 니켈, 질산 및 증류수로 구성된 것으로 기재되어 있다.

그러나, 상기 혼합 시약은 수은을 포함하고 있어 환경 및 인체에 막대한 영향을 미치기 때문에 현재 사용 금지되어 있다.

따라서, 채취하기 어려운 생체물질이 아닌 입수가 용이한 소변을 이용함으로써, 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 친환경적으로 검출하여 암을 진단하기 위한 조성물에 대한 개발이 절실한 실정이다.

또한 한국 등록특허 제10-1323371호에는 면역크로마토그래피(Immunochromatography)법을 이용하여 소변에서 전체 전립선-특이 항원의 양을 키트 상에서 반 정량적으로 측정할 수 있는 전립선암 진단 키트가 개시되어 있다. 이 등록특허의 전립선암 진단 키트는 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해 효소인 전립선-특이항원(Prostate specific antigen;PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 육안으로 전립선 암을 진단할 수 있도록 한 것이다.

그러나 상기 등록특허의 전립선암 진단 키트는 전립선 암만 제한적으로 진단할 수 있으며, 전립선 암 이외의 다른 암이 존재하는지는 진단할 수 없는 문제가 있다.

그리고 이와 같은 기존의 진단 키트들은 특정암만을 검출하므로 암 발병 여부를 진단하기 위해서는 모든 진단 키트를 이용하여 진단을 실시해야 하는 번거로움이 있다.

한국 등록특허 제10-0033547호 한국 등록특허 제10-1323371호

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환하는데 있어 특성화된 효소들을 포함함으로써, 소변 내에 존재하는 티로신의 농도를 친환경적으로 검출하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단하고 암 발병이 확인되면 추가적인 마커를 통하여 암의 종류를 판별할 수 있는 암 진단장치를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 용이하게 채취 가능한 소변을 이용함으로써, 사용자들이 병원과 같은 전문기관을 방문하여 대사질환 및 암 진단을 받아야 하는 불편함 없이 간편하게 가정에서 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있는 암 진단장치를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 암 진단장치는, 소변이 수용되는 소변 수용부와; 상기 소변 수용부와 연통된 유로를 가지는 복수의 체결홈; 실린더 형태로 개방된 하단부가 상기 체결홈에 체결되어 상기 소변 수용부에 수용된 소변이 실린더 내부로 유입되고, 상기 실린더 내부에서 상하 슬라이딩 이동을 통해 상기 개방된 하단부를 개폐하는 슬라이딩 바 및 상기 슬라이딩 바 상단에 형성되어 상기 실린더 내부로 유입된 소변에 암 진단용 물질을 투입하는 진단물질 수용부를 포함하는 복수의 암 진단 키트;를 포함하며,

상기 복수의 암 진단 키트 중 어느 하나의 진단물질 수용부에는 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 상기 내부로 유입된 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 티로신 검출용 효소 조성물;이 수용되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 복수의 암 진단 키트 중 어느 하나에 포함된 티로신 검출용 효소 조성물이 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신과 반응하여 티로신 농도에 따라 소변색상이 갈색에서 검정색으로 변색되므로 육안으로 암의 발생 여부를 바로 확인할 수 있으며, 암 발병이 확인되면 추가적으로 구비된 개별 암 마커를 통해 암의 종류를 판별할 수 있는 효과가 있다.

따라서 사용자가 병원과 같은 전문기관이 아닌 가정에서도 용이하게 암 및 대사질환의 발생 여부 및 종류를 확인할 수 있는 효과가 있다.

그리고 티로신 검출용 효소 조성물이 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신과 반응하여 검정색으로 변색된 유멜라닌을 집중적으로 응집하여 검출할 수 있으므로 사용자의 식별력을 높일 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 질병 진단 장치의 구성을 나타낸 사시도이다.
도 2는 도 1의 질병 진단 장치의 결합 모습을 나타난 사시도이다.
도 3은 도 2의 질병 진단 장치에 소변이 유입되는 모습을 나타낸 단면도이다.
도 4는 도 2의 질병 진단 장치에 유입된 소변에 효소 조성물이 투입되는 모습을 나타낸 단면도이다.
도 5는 도 1의 질병 진단 장치에 포함된 질병 진단 키트의 구성을 나타낸 사시도이다.
도 6은 생성된 유멜라닌의 색상을 측정하기 위한 대조 색상표이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 암 진단 키트의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 질병 진단 장치를 나타낸 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 질병 진단 장치는 크게 소변 수용부(2)와 복수의 질병 진단 키트(3)를 포함한다.

먼저 소변 수용부(2)는 베이스 기판(6)에 사용자가 용이하게 소변을 수용할 수 있도록 용기 형태로 구성된다. 상기 용기에는 수용되는 소변의 양을 측정할 수 있도록 소변 측정 눈금(4)이 구비된다.

그리고 상기 용기의 하단부 일측에는 상기 질병 진단 키트(3)가 결합되는 복수의 결합홈(8) 형성된다. 상기 결합홈(8)은 다양한 형태로 구성될 수 있지만 소변이 외부로 유출되지 않도록 나사선 형태로 구비되는 것이 바람직하다.

다음으로 상기 결합홈(8)과 상기 용기(8)는 유로(9)는 통하여 서로 연통되도록 구성된다. 상기 결합홈(8)은 바람직하게는 질환 여부를 측정하기 위한 질병 진단 키트가 결합되는 홈과 질환의 종류를 측정하기 위한 질병 진단 키트가 결합되는 홈 두 개로 형성되지만 사용자의 선택에 따라서 두 개 이상으로 형성하여 줄 수 있다.

다음으로 질병 진단 키트(3)에 대하여 설명하면 질병 진단 키트(3)는 중공이 형성된 실린더 형태로 하부는 개방되되 결합홈(8)에 결합되도록 결합홈(8)에 형성된 나사선에 대응되는 나사선이 하단부 외측에 형성된다. 그리고 질병 진단 키트(3)의 외측에도 유입되는 소변의 양을 측정할 수 있는 측정 눈금(19)이 구비된다.

그리고 질병 진단 키트 내측에는 상하로 슬라이딩 이동 가능한 슬라이딩 바(13)가 구비된다. 슬라이딩 바(13)는 질병 진단 키트 내에서 상하로 슬라이딩 이동하며 질병 진단 키트의 개구된 하단부를 개폐하며 내부로 유입된 소변에 질병 진단용 물질을 투입한다.

이를 위해 상기 질병 진단 키트(3)의 개구된 하단부는 입구가 좁아지는 형상을 가지고 상기 슬라이딩 바(13)의 하단부에는 상기 질병 진단 키트(3)의 입구 크기에 대응되는 크기를 가지는 개폐링(20)이 구비된다.

다음으로 상기 슬라이딩 바(13)의 상단에는 상기 질병 진단 키트(3) 내부로 유입된 소변에 질병 진단용 물질을 투입하는 진단물질 수용부(21)가 구비된다.

상기 진단물질 수용부(21)는 상기 슬라이딩 바(13) 상단에 형성된 상하측 밀폐링(25, 24)과 상하측 밀폐링(25, 24) 사이에 형성된 진단 물질 수용홈(26)으로 이루어진다.

상기 진단 물질 수용홈(26)에는 상기 슬라이딩 바(13)가 상단으로 이동한 상태에서 진단 물질 주입홈(30)을 통하여 진단 물질(27)이 주입된다. 이와 같이 진단 물질 수용홈(26)에 진단 물질(27)이 수용된 상태에서 슬라이딩 바(13)가 질병 진단 키트(13) 하부로 이동하게 되면 상기 질병 진단 키트(13) 내측에 형성된 진단 물질 투입홈(28)을 통해 진단 물질(27)이 질병 진단 키트(3) 내부에 유입된 소변으로 투입된다.

다음으로 상기 질병 진단 키트(3)에는 내부로 소변이 원활하게 유입될 수 있도록 외부와 연통된 통공(18)이 형성되고 사용자의 슬라이딩 바(13) 작동을 제어하기 위한 안전핀(16)이 구비된다.

사용자는 안전핀(16)을 제거하고 손잡이(15)를 잡고 슬라이딩 바(13)를 질변 진단 키트(13)내에서 상하로 이동시킨다.

그리고 슬라이딩 바(13)에는 유멜라닌을 응집하기 위한 응집부(50)가 구비된다. 통상 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)이 티로신 검출용 효소 조성물을 통해 멜라닌으로 전환되면 서로 응집하여 침전물 형태(60)로 형성되는데 응집(50)는 질병 진단 키트(3) 하부로 유입되는 소변은 투과되되 슬라이딩 바(13) 상단에서 투입되는 티로신 검출 효소를 통해 내부에 유입된 소변의 상단부터 형성되는 유멜라닌(Eumelanin)이 질병 진단 키트(3) 하부 또는 외부로 유출되지 않도록 하며 침전물을 응집하여 사용자가 질환 발병 여부를 용이하게 판별할 수 있도록 한다.

이를 위해 응집부(50)는 도는 0.7~4.0 dtex, 섬유길이는 20~80 mm의 합성 고분자 단섬유로 구성되는 부직포이며 면밀도가 15~60 g/m2, 부피 밀도가0.05~0.10 g/cm3인 것을 특징으로 한다.

응집부(50)의 섬도(fineness)가 0.7 dtex 미만일 경우에는 섬유 간격이 너무 작아져서 소변의 통과가 원활해지지 않으며 4.0 dtex를 초과할 경우는 섬유끼리의 얽힘이 저하하고 강도가 약해져서 멜라닌 침전물이 응집부를 통과할 수 있다. 그리고 응집부(50)의 섬유길이가 20 mm미만이면 섬유끼리의 얽힘이 부족하고 강도가 저하되는 경향이 있으며 80 mm를 초과하면, 종방향으로 배향하는 섬유 성분이 부족해, 멜라닌 침전물이 응집부를 통과할 수 있다.

다음으로 응집부(50)의 부직포 면밀도가 15 g/m2 미만이면 강도가 저하되어 응집부(50)에 손상이 갈 수 있으며 60 g/m2를 초과하면 멜라닌 침전물의 포집 효과가 저하된다.

다음으로 응집부(50)는 도 4에 도시된 바와 같이 유멜라닌(Eumelanin)을 집중하여 포집하기 위하여 슬라이딩 바(13)를 중심으로 역삼각형 형태로 구비된다.

그리고 슬라이딩 바(13)는 질병 진단 키트(3)로부터 외부로 분리되게 구비되어 소변으로부터 형성된 유멜라닌(Eumelanin)만 외부로 추출가능하게 한다.

이와 같은 유멜라닌의 농도 및 색상을 사용자의 육안으로 관찰하는데 도움을 주기 위하여 투명한 재질로 이루어지는 질병 진단 키트(3) 외측에 도 5에 도시된 바와 같이 편광필름(70)을 부착하여 줄 수 있다.

상기와 같은 편광필름(70)은 여러 방향으로 진동하는 자연광을 특정방향으로만 진동하는 빛으로 바꾸어주는 필름으로서 질병 진단 키트(3) 투명재질에 반사된 빛 또는 액체성 물질로 이루어지는 소변과 진단 물질에 의한 빛의 반사를 막아주고 일방향으로만 검은색 빛이 반사되도록 하여 사용자의 시인성을 높여줄 수 있는 효과가 있다.

이하에서는 상기와 같은 복수의 질병 진단 키트(3)의 진단물질 수용부(21)에 수용되는 진단 물질에 대하여 설명하기로 한다.

본 발명은 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 암 바이오마커 티로신 검출용 효소 조성물을 진단 물질로 사용한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키고, 상기 멜라닌의 색상을 통해 농도를 측정함으로써 암을 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 효소 조성물을 이용하여 L-티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환하는데 있어서, 상기 멜라닌은 유멜라닌(Eumelanin)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 효소 조성물은 소변을 이용하여 암을 진단하기 위한 것이므로, 소변의 색상을 고려해볼 때 황갈색을 나타내는 페오멜라닌(Pheomelanin) 또는 갈색을 나타내는 혼합 멜라닌(Mixed melanins)을 통해 농도를 측정하는 경우, 소변의 색상과 비슷하여 농도 측정이 어려울 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 효소 조성물은 검정색을 나타내는 유멜라닌을 통해 농도를 측정하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 효소 조성물은 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1 효소를 추가함으로써, 유멜라닌 생합성 경로를 가속시킬 뿐만 아니라, 생성되는 유멜라닌의 색상을 보다 더 검정색을 띠는 경로로 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 티로신 검출 반응은 최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, pH 7.0 내지 8.5 조건 하에서 측정하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 조성물에 포함되는 인산완충용액은 200mM이고, 효소 조성물 500 ㎕과 소변 샘플 500 ㎕의 총 부피가 1000 ㎕인 경우, 티로신 검출 반응의 인산완충용액 최종 농도는 50mM에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 소변 내에 존재하는 티로신의 농도는 상기 효소 조성물과 반응하여 생성되는 유멜라닌의 색상을 통해 측정될 수 있다. 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상이 검정색에 가까울 경우, 일정한 소변 양에 티로신의 농도가 높다라는 것을 알 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 효소 조성물은 티로시나아제 40 unit을 1 중량비로 하고, 상기 티로시타아제 1 중량비 대비 DCT를 0.5 내지 2 중량비 및 Tyrp1을 0.5 내지 2 중량비로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 함량을 만족하지 않는 경우, 생성되는 멜라닌의 색상이 황갈색계통 색상이 나타날 수 있어 소변색과 혼합되므로 티로신의 농도를 측정하기 어려울 수 있다.

하기 반응식 1을 참조로, L-티로신은 티로시나아제에 의해 산화되어 L-도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 형성하고, 다시 티로시나아제에 의해 산화되어 DOPA 퀴논(Quinone)을 형성하며, 루코도파크롬(Leucodopachrome)을 거쳐 도파크롬(Dopachrome)을 형성한다.

상기 도파크롬은 멜라닌 전구체로서, DCT에 의해 토토머화(Tautomerization)되어 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산(5,6-Dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)을 형성한다.

상기 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산은 Tyrp 1에 의해 산화되어 인돌-5,6-퀴논 카르복실산을 형성하고 상기 인돌-5,6-퀴논 카르복실산은 중합되어 유멜라닌을 형성한다.

[반응식 1]

상기 티로시나아제(Tyrosinase)는 미생물 및 식물 및 유기체 조직에서 발견될 수 있는 티로시나아제 수산화효소 및 도파 산화효소 촉매적 활성을 갖는 구리-함유 효소이다. 특히, 상기 티로시나아제는 티로신과 같은 페놀의 산화에 의하여 멜라닌 및 다른 색소의 생성을 촉진한다.

상기 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT)는 티로시나아제-관련 단백질 2(Tyrp 2)로도 알려져 있으며, 티로시나아제 및 Tyrp 1과 결합하여 멜라닌 세포에서 L-티로신을 멜라닌으로 전환하는데 있어 특성화된 멜라닌세포 특이적 효소이다.

상기 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp 1)은 티로시나아제를 안정화시키는데 도움을 주는 역할을 한다.

본 발명에 따른 효소 조성물은 상기 도파크롬이 티로시나아제에 의해 5,6-디히드록시인돌(5,6-dihydroxyindole)을 거쳐 인돌-5,6-퀴논(Indole-5,6-quinone)을 형성하여 갈색에 가까운 멜라닌을 형성하는 과정이 아닌(하기 반응식 2 참조), DCT에 의해 토토머화되고 Tyrp 1에 의해 산화되어 검은색에 가까운 멜라닌을 형성하도록 하여 시료인 소변의 색상과 구분되게 함으로써 농도 측정을 효과적으로 수행할 수 있도록 한다.

[반응식 2]

본 발명의 일 실시형태에서, 생성된 유멜라닌의 색상을 통해 소변 내에 존재하는 티로신의 농도 측정시, 도 6의 대조 색상표와 상기 생성된 유멜라닌의 색상을 비교하여 소변 내의 티로신 농도를 확인 할 수 있다. 이를 통해, 암 및 대사질환의 발생 여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 효소 조성물은 티로시나아제, DCT 및 Tyrp1을 포함하고, 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액과 증류수를 추가하여 제조할 수 있다.

상기 티로시나아제, DCt 및 Tyrp1은 전술한 바와 같이, 티로시나아제 40 unit을 1 중량비로 하고, 상기 티로시타아제 1 중량비 대비 DCT를 0.5 내지 2 중량비 및 Tyrp1을 0.5 내지 2 중량비로 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

제조예 1: 효소 조성물 각 구성요소의 제조

티로시나아제 효소는 Sigma사로부터 구매하여 사용하였다.

DCT와 Tyrp1은 아래 단계를 참조로 생쥐 혈액으로부터 유전자를 확보하고 대장균에서 단백질 발현 후 정제하여 실험에 사용하였다.

(i) 생쥐 혈액으로부터 RNA 추출하는 단계

RNA 추출은 상용화된 추출키트를 사용하였으며, 본 실시예에서는 RiboEx RNA extraction solution키트 (진올 바이오테크놀로지, 한국)를 사용하였다. 과정은 아래와 같다.

a. 생쥐혈액으로부터 생쥐 혈액 300 ㎕와 RiboEx RNA extraction solution (진올 바이오테크놀로지, 한국) 600 ㎕를 넣고 강하게 섞고 5 ~ 10분간 상온 방치하여 세포막을 녹였다.

b. 클로로포름 200 ㎕를 넣고 강하게 섞고 원심분리기를 이용해 13000 rpm, 4도, 10분간 원심분리하여 상하층으로 분리하였다.

c. 상층만 회수한 후 동일한 양의 컬럼 결합buffer를 넣고 잘 섞은 후 키트에서 제공하는 컬럼에 투입하고 원심분리 (spin down) 하여 RNA 만 컬럼에 결합시켰다.

d. 컬럼에 키트에서 제공하는 세척버퍼를 투입한 후 원심분리 (spin down) 하여 RNA 이외 물질을 제거하였다. 추가 1분 정도 원심분리하여 잔존하는 세척버퍼를 제거하였다.

e. 컬럼에 결합된 RNA를 회수하는 elution buffer를 투입한 후 5분 후 원심분리 (spin down)하여 최종적으로 RNA를 회수하였다.

(ii) 확보한 RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계

1 ㎍ RNA, Reverse transcriptase(역전사효소) 5 unit, oligo dT - 50 pmol, 0.1 M DTT- 2 ㎕, 10x 반응버퍼(reaction buffer)- 2 ㎕, 물- 약 20 ㎕; 위 조성으로 혼합물을 제조하고 PCR 기기에서 45℃에서 10분, 38℃에서 3시간 이상 반응시켰다.

(iii) cDNA로부터 유전자 (DCT, Tyrp1) 확보 단계

a. 위의 단계에서 생성된 cDNA로부터 유전자를 증폭해 내기 위해 아래와 같은 조성으로 혼합물을 제조한 후 아래 조건 하에서 유전자증폭반응(PCR)을 수행하였다.

혼합물 조성: cDNA액 - 2 ㎕, pfu DNA증폭효소- 5 unit, 10mM dNTP- 2 ㎕, 10x 반응버퍼 4 ㎕, 각 2 pmol- 프라이머 쌍, 물- 약 40 ㎕.

증폭반응조건: 95℃ 4분- 1회; 95℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 1분 50초- 35회; 72℃ 10분- 1회; 4℃ 계속.

상기 반응에 사용된 프라이머쌍의 정보는 하기 표 1과 같다.

구분		염기서열
DCT 증폭용 프라이머	순방향 프라이머	Atgggccttgtgggatggg (서열번호 1)
DCT 증폭용 프라이머	역방향 프라이머	taggcttcctccgtgtatctcttgc (서열번호 2)
Tyrp1 증폭용 프라이머	순방향 프라이머	Atgaaatcttacaacgtcctccccct (서열번호 3)
Tyrp1 증폭용 프라이머	역방향 프라이머	cagaccatggagtggttaggattcg (서열번호 4)

DCT와 Tyrp1 효소는 상기 방법으로 확보된 유전자를 pET28a 벡터에 삽입하여 6x His 가 N-말단에 부착된 융합단백질 형태로 제작하였고, BL21(DE3) 대장균에 형질전환시켜 단백질을 제조하였다. 그 과정은 아래와 같다.

(i) 형질전환 대장균 배양단계

a. pET28a 벡터의 NdeI, XhoI 제한효소 site에 DCT 또는 Tyrp1 유전자를 삽입함으로써 6x His ~단백질을 생산하는 재조합DNA를 완성하였다.

b. BL21(DE3)대장균에 heat shock 형질전환법을 이용해 형질전환 대장균을 제조하였다.

c. 해당 대장균주를 3 L Luria broth액에서 37℃, 200 rpm 하에서 OD600 ~ 0.7까지 배양 후 0.1M IPTG 를 처리하여 단백질생산을 induction하였다.

d. 30℃, 4시간 추가배양 후 원심분리를 통해 대장균을 침전시켰다.

(ii) 대장균 파쇄 단계

a. 침전된 대장균을 1x PBS 200 ml을 투입하여 resuspend 시켰다가 원심분리기에서 침전시킴으로써 세척과정을 수행하였다.

b. 침전된 대장균을 40 ml- 0.5 M NaCl, 5mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9; 에 투입하였다.

c. 초음파 세포파쇄기에서 대장균을 Energy 38% max, total cell breaking time 4분(2초 sonic treatment/4초 pause) 조건 하에서 파쇄하였다. 대장균 샘플을 담은 병은 세포파쇄과정동안 얼음에 담긴 상태를 유지하였다.

d. 파쇄된 대장균은 13000 rpm, 30분, 4도 조건에서 원심분리하였다.

e. 상등액만 깨끗한 conical tube에 모아두었다.

(iii) Ni-NTA Agarose resin을 이용한 his tag-융합단백질 정제

a. 위의 단계에서 얻어진 수용성 단백질액을 Ni-NTA Agarose resin 과 혼합하고 30분간 4℃ 조건하에서 흔들어 주면서 his tag-융합단백질과 Ni-NTA Agarose resin이 서로 결합하도록 유도하였다.

b. 단백질액, resin 혼합액을 컬럼에 투입하고 컬럼 코크를 열어 액체를 뽑아 내었다.

c. Washing buffer (0.5 M NaCl, 60mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 400 ml을 통과시켜 불순물과 융합단백질 이외의 단백질을 제거하였다.

d. Elution buffer (0.25 M NaCl, 500mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 3 ml을 투입하고 10분간 방치한 후 코크를 열어 단백질을 회수하였다.

e. d 과정을 2회 반복하였다.

(iii) FPLC-size exclusion법을 이용한 단백질 정제

a. 회수된 단백질을 superdex S200 (GE healthcare) 컬럼이 장착된 FPLC에 투입하고 단백질을 크기에 따라 분리하였다.

b. 얻어진 fraction샘플들 가운데 his tag 융합단백질에 해당하는 fraction을 polyacrylamide gel electrophoresis 법으로 확인하고 최종적으로 원하는 his tag 융합단백질을 확보하였다.

c. Abs 280값을 측정하고 얻어진 값으로부터 단백질 농도를 환산하여 하기 표 2에 기재하였다.

구분	단백질 농도(OD₂₈₀nm)
1 mg DCT/ml	1.65
1 mg Tyrp1/ml	1.42

실시예 1: 효소 조성물의 제조

하기 표 3을 참조로, 활성이 1000 unit/ml인 티로시나아제 효소 40 ㎕에 상기 제조예 1에서 제조된 활성이 1000 unit/ml인 DCT 40㎕ 및 활성이 1000 unit/ml인 Tyrp1 40 ㎕, 200mM Tris buffer pH 8을 250 ㎕, 증류수(Distilled water) 130 ㎕를 넣어 효소 조성물(Stock solution)을 제조하였다.

Stock solution	Volumn(500 ㎕)
200 mM Tris buffer pH8	250 ㎕
Tyrosinase(>=1000 unit/ml)	40 ㎕
DCT(>=1000 unit/ml)	40 ㎕
TYRP1(>=1000 unit/ml)	40 ㎕
D.W	130 ㎕

실시예 2: 소변 시료 채취

정상인과 암환자의 소변 채취는 동일하며 다음과 같이 수행하였다.

아침 기상 후 첫 소변을 채취함에 있어 요도로부터 흘러나오는 처음 소변은 채취하지 않으며, 중간 소변에서 샘플을 30 ml 채취하였다.

실험예 1: 소변 내에 존재하는 티로신 농도의 측정

일정량 내에 존재하는 티로신의 농도를 측정하기 위해 실시예 2에서 채취된 정상인과 암환자의 소변 각각 500 ㎕ 동일한 양을 상기 실시예 1의 효소 조성물과 반응시켰다(각각 총 1000 ㎕). 그런 다음, 생성된 각 유멜라닌에 의한 소변의 색상을 도 6의 대조 색상표와 비교하고 하기 표 4에 기재하였다.

	유멜라닌에 의한 소변의 색상
정상인의 소변	황색~황갈색
암환자의 소변	검정색

상기 표 4에서 보듯이, 정상인의 소변이 본 발명의 효소 조성물과 반응하여 생성된 유멜라닌에 의한 소변 색상은 황색에서 황갈색인 반면, 암환자의 소변이 효소 조성물과 반응하여 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상은 검정색으로 나타났음을 확인하였다.

이를 통해, 암환자의 소변 내에 티로신이 다량으로 존재함을 알 수 있었다.

이상에서 본 발명은 실시예를 참조하여 상세히 설명되었으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기에서 설명된 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 부가 및 변형이 가능할 것임은 당연하며, 이와 같은 변형된 실시 형태들 역시 아래에 첨부한 특허청구범위에 의하여 정하여지는 본 발명의 보호 범위에 속하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

2: 소변 수용부 3 : 질병 진단 키트 6: 베이스 기판
8: 결합홈 9: 유로 13: 슬라이딩 바 21: 진단 물질 수용부
50: 응집부

Claims

소변이 수용되는 소변 수용부와;
상기 소변 수용부와 연통된 유로를 가지는 복수의 체결홈;
실린더 형태로 개방된 하단부가 상기 체결홈에 체결되어 상기 소변 수용부에 수용된 소변이 실린더 내부로 유입되고, 상기 실린더 내부에서 상하 슬라이딩 이동을 통해 상기 개방된 하단부를 개폐하는 슬라이딩 바 및 상기 슬라이딩 바 상단에 형성되어 상기 실린더 내부로 유입된 소변에 암 진단용 물질을 투입하는 진단물질 수용부를 포함하는 복수의 암 진단 키트;를 포함하며,
상기 복수의 암 진단 키트 중 어느 하나의 진단물질 수용부에는 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 상기 내부로 유입된 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 티로신 검출용 효소 조성물;이 수용되어 있는 것을 특징으로 하는 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.
제1항에 있어서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은 L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환시켜, 티로신의 농도가 증가함에 따라 유멜라닌에 의한 소변의 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되는 것을 특징으로 하는 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 슬라이딩 바의 하단부에는 상기 티로신 검출용 효소 조성물이 전환시킨 유멜라닌(Eumelanin)을 응집하기 위한 응집부가 구비된 것을 특징으로 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.
제3항에 있어서, 상기 응집부는 상기 실린더 하부로 유입되는 소변은 투과되되 상기 슬라이딩 바 상단에서 투입되는 티로신 검출 효소를 통해 실린더 내부에 유입된 소변의 상단부터 형성되는 유멜라닌(Eumelanin)이 실린더 하단 또는 외부로 유출되지 않도록 섬도는 0.7~4.0 dtex, 섬유길이는 20~80 mm의 합성 고분자 단섬유로 구성되는 부직포이며 면밀도가 15~60 g/m2, 부피 밀도가0.05~0.10 g/cm3인 것을 특징으로 하는 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.
제 4항에 있어서,
상기 응집부는 유멜라닌(Eumelanin)을 집중하여 응집하기 위하여 상기 슬라이딩 바를 중심으로 역삼각형 형태로 구비되는 것을 특징으로 하는 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.
제 5항에 있어서,
상기 슬라이딩 바는 상기 암 진단 키트로부터 외부로 분리되게 구비되어 소변으로부터 형성된 유멜라닌(Eumelanin)만 외부로 추출가능한 것을 특징으로 하는 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.
제 6항에 있어서, 상기 복수의 암 진단 키트 중 다른 하나의 암 진단 키트의 진단물질 수용부에는 소변에 있는 암 마커를 검출하기 위한 암 검출 물질이 수용되어 있는 것을 특징으로 하는 암 여부 및 암 종류의 측정이 가능한 티로신 검출 효소 이용 암 진단 장치.