NO301374B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et <alfa>2-antiplasmin monoklonalt antistoff - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et <x2-antiplasmin monoklonalt antistoff med en k lett kjede som binder til den aminoterminale region av fibrin-tverrbundet eller koagelbundet a2-antiplasmin, som er istand til å forhindre inhiberingen av plasmin og som ikke reduserer sirkulerende nivåer av a2-antiplasmin.

Por en rekke hjerteinfarkt er en initierende hendelse blødningen i aterosklerotisk plaque. Slik blødning resulterer ofte i dannelse av en trombe (eller blodkoagel) i koronar-arterien som forsyner infarktsonen (dvs. et område med koagulasjonsnekrose som et resultat av en obstruksjon av blodsirkulasjonen). Denne trombe utgjøres av en kombinasjon av fibrin og blodplater. Dannelsen av et fibrin-platekoagel har alvorlige kliniske følger. Graden og varigheten av okklu-sjonen som er forårsaket av fibrin-platekoaglet bestemmer omfanget av infarktsonen og graden av ødeleggelse.

A. Behandling for hjerteinfarkt

Det primære mål for den nåværende behandling av hjerteinfarkt omfatter en hurtig oppløsning av den okkluderende trombe og gjenopprettelse av blodstrømmen ("reperfusjon"). For å være effektiv, må en vellykket terapi være i stand til å dis-kriminere mellom et fibrin-platekoagel og fibrin-forløperen, fibrinogen. Anvendelse av et middel som ikke utviser slik spesifisitet, kan øke risikoen for generell blødning hos pasienten. En vellykket terapi må være i stand til å gi en vedvarende virkning slik at gjendannelse av koaglet ikke skjer etter at terapi er opphørt. Dersom fibrin-platekoaglet er i stand til å gjendannes, kan den rammede arterie bli reokkludert.

Dannelsen av fibrin-platekoagler i andre deler av sirkula-sjonssystemet kan delvis forhindres gjennom anvendelse av anti-koagulasjonsmidler (som heparin). Dessverre er heparin ikke funnet til å være effektivt over alt med hensyn til å forhindre reokklusjon i individer som er rammet av hjerteinfarkt hvori graden av blodkarokklusjon (graden av"stenose") er større enn eller lik 70 %, særlig de pasienter med alvorlige residual koronarstenoser.

Dersom det i et individ er dannet et fibrin-platekoagel før medisinsk hjelp er tilgjengelig, kan koaglet oppløses gjennom anvendelse av trombolytiske midler. Et trombolytisk middel er et medikament som er i stand til lysis av fibrin-platetromben og som derved tillater at blodet igjen strømmer gjennom rammede de blodkar. Slike- midler omfatter streptokinase, prourokinase, urokinase og vevstypeplasminogen-aktivator (Ganz, W. et al, J. Amer. Coll. Cardiol. 1:1247 - 1253 (1983), Rentrop, K.P. et al, Amer. J. Cardiol. 54-.29E - 31E (1984), Gold, H.K. et al, Amer. J. Cardiol. 53:122C - 125C (1984)) .

Behandling med trombolytiske midler kan ofte på en vellykket måte gjenvinne den koronare blodstrøm raskt nok til å forhindre hjerteinfarkt. Det er dessverre funnet at det oppløste fibrin-platekoagel gjendanner etter at en slik trombolytisk terapi er opphørt i et stort antall pasienter. Denne gjendannelse kan resultere i reokklusjon av de rammede blodkar og er derfor til stor bekymring (Gold, H.K. et al, Amer. J. Cardiol. 53:122C - 125C (1984), Gold, H.K. et al, Circulation 68:1 - 50 - I - 54 (1983)). Skjønt streptokinasebehandling er funnet til å være vellykket i forbindelse med oppløsning av fibrin-koagler i omtrent 85 % av de undersøkte tilfeller, er det funnet at reokklusjon av de rammede blodkar skjer i omtrent 25 % av de undersøkte pasienter (Gold, H.K. et al, Circulation 68:150 - 154 (1983)).

Vevstypeplasminogen-aktivator (t-PA) betraktes til å være et mer ønskelig trombolytisk middel enn både streptokinase og urokinase fordi det utviser større (skjønt ikke absolutt) spesifisitet for fibrin enn noen av disse midler (Verstrate, M. et al, Lancet, 1:142 (1985)). Vevstypeplasminogen-aktivator (t-PA) er et koagelspesifikt trombolytisk middel som raskt fjernes fra plasma. Vevstypeplasminogen-aktivator (t-PA) er funnet til å være et effektivt trombolytisk middel i pasienter med akutt hjerteinfarkt, og gir koronar re- strømning (dvs. nedsatt stenose) i løpet av 45 - 75 minutter i omtrent 70 % av de undersøkte pasienter (Gold, H.K. et al, Circulation 73:347 - 352 (1986)).

Vevstypeplasminogen-aktivator tilføres ved en infusjons-hastighet på omtrent 1-2 mg/kg pasientvekt/90 minutter. Fordi t-PA ved høy konsentrasjon er i stand til å nedbryte fibrinogen, er anvendelse av større doser assosiert med en økt mulighet for generell blødning. Økte tr-PA-doser er ikke funnet til å gi en ensartet økning av graden av koagelopp-løsning.

Fordelen med anvendelse av t-PA er i betydelig grad oppveiet av den spontane grad av akutt reokklusjon etter opphør av t-PA terapi. Gold, H.K. og medarbeidere har funnet at opp-høret av t-PA-terapi ga reokklusjon i de rammede blodkar i omtrent 45 % av de undersøkte pasienter (Circulation 73:347 - 352 (1986)). Økte t-PA-doser er ikke funnet til å nedsette tendensen av koronar arterie-reokklusjon. Muligheten for trombinkoagel-gjendannelse er nær beslektet med graden av residual koronarstenose (dvs. omfanget av blodkarblokkering). Således er reokklusjon mer sannsynlig i individer hvor en høy grad av stenose (dvs. større enn 70 % kvantitativ stenose eller større enn 80 % ikke-kvantitativ stenose) har forekom-met. Reokklusjonen av blodkar er blitt funnet til å inhiberes ved kontinuerlig infusjon av t-PA (Gold, H.K. et al, Circulation 73:347 - 352 (1986)). Dessverre vil den relativt korte biologiske halveringstid for t-PA og muligheten for økning av tendensen med alvorlige blødning i enkelte pasienter gjøre kontinuerlig infusjon av t-PA uanvendelig for mange pasienter med hjerteinfarkt.

Kliniske undersøkelser har vist at den oppløste trombe ofte gjendannes etter opphør av t-PA-infusjon (Gold, H.K. et al, Circulation 73:347 - 352 (1986)), men at hyppigheten av slik reokklusjon kan minimaliseres ved å gi en annen ("bibehold-else") t-PA-infusjon av en i alt vesentlig mindre dose, men i en vesentlig lengre tidsperiode. Heparin er nå anerkjent som en passende ledsagende terapi for pasienter som mottar en slik opprettholdende infusjon. Behandlingen av koronar-arterietrombose (sammenklumping) med t-PA krever derfor en kontinuerlig infusjon ved høy hastighet for å oppnå rask reperfusjon, og en opprettholdende infusjon i en mindre dose for å forebygge reokklusjon i pasienter med en høy grad av residual stenose.

B . Mekanisme for fibrin- koageldannelse

Koagler utgjøres av både fibrin og blodplater i forskjellige forhold. Den grunnleggende reaksjon i blodkoagulasjon omfatter omdannelse av et oppløselig plasmaprotein (fibrinogen) til uoppløselig fibrin. Omdannelsen av fibrinogen til fibrin katalyseres av enzymet trombin, som er en serinprotease. Den generelle mekanisme for blodkoageldannelse er redegjort for avGanong, W.F. (In: Review of Medical Physiology, 9. utgave, Lange, Los Altos, CA, side 411 - 414 (1979)). Blodplater er platelignende strukturer som er tilstede i blod. De bidrar til koageldannelse med både deres inkorporering med fibrin til en oppløselig masse og ved deres økning av omdannelses-graden av fibrinogen til fibrin. Plater bidrar til koageldannelse ved hjerteinfarkt og er en hovedbestanddel av koagler som reokkluderer koronararterier som er reperfusert ved behandling med et trombolytisk middel. Dannelsen av platesammenklumpingen avhenger av en gjensidig virkning mellom fibrinogen (og kanskje von Willebrand's faktor eller fibronektin) og et reseptormolekyl som er tilstede på overflaten av platene. Denne platefibrinogenreseptor er funnet til å være et kompleks av to membran-glykoproteiner, betegnet GPIIb og GPIIIa (Nachman, R.L. et al, J. Clin. Invest. 69:263 - 269 (1982), Coiler, B.S. et al, J. Clin. Invest. 72:325 - 338 (1983)). Den spesifikke rolle til GPIIb/GPIIIa reseptorkomplekset ble forklart av Coiler, B.S. og medarbeidere gjennom isolasjonen av et murint monoklonalt antistoff (kjent som monoklonalt antistoff 10E5) som ble funnet til å være i stand til å binde til glykoproteinene Ilb og Illa, og til fullstendig å blokkere bindingen av fibrinogen til plater. For å unngå mulige komplikasjoner som skyldes den mulighet at Fc-fragmentområdet på det monoklonale antistoff kunne inhibere sammenklumpingen ikke-spesifikt,

anvendte Coiler et al F (ab*)2-fragmentet av 10E5-antistoffet i deres forsøk. (Coiler, B.S. et al, J. Clin. Invest. 72:325

- 338 (1983)). F (ab1 )2-fragmentet av et antistoff omfatter bare de områder av antistoffet som er ansvarlige for antistoffets spesifisitet og antigenbindingsevne. Naturen av F (ab 1 )2-fragmenter og fremgangsmåten for deres fremstilling er beskrevet av Eisen, H.N. (I: Microbiology, 3. utgave, Davis, B.D. et al, Harper & Row, N.Y., side 342 - 349

(1980)).

Et ytterligere monoklonalt antistoff (betegnet 7E3) ble funnet til å blokkere bindingen av fibrinogen til blodplater, og til å binde til GPIIb/GPIIIa (Coiler, B.S., J. Clin. Invest., 76:101 - 108 (1985)). Dette monoklonale antistoff skilte seg fra antistoff 10E5 ved at det bandt seg mye raskere til de aktiverte blodplater enn til ikke-aktiverte blodplater og var i stand til å binde til blodplater fra kanin så vel som fra mennesker (Coiler, B.S., J. Clin. Invest., 76:101 - 108 (1985), Coiler, B.S., J. Lab. Clin. Med., 107:384 - 392 (1986), som begge er angitt heri som referanse). F(ab')2-fragmentene av det monoklonale antistoff 7E3 ble funnet til å være i stand til å interferere med blodplateaggrering, og foreslår således en potensiell terapeutisk anvendelse i behandlingen av trombosesykdommer (Coiler, B.S. et al, Blood 66:1456 - 1459 (1985)). F(ab')2-fragmentet av det monoklonale antistoff 7E3 ble også funnet til å være effektivt med hensyn til blokkering av akkumule-ring av multiple lag av blodplater uten å gi en uaksepterbar risiko for blødning, noe som foreslår en eventuell anvendelse for å unngå total okklusjon av blodkar som kan forekomme ved hjerteinfarkt og slag (Coiler, B.S. et al, Blood 66:1456 - 1459 (1985)).

C. Mekanisme for koagel- lysis og naturlig inhibering derav Koagel-lysis formidles av plasmin in vivo. Under naturlige betingelser, omdannes plasminogen til plasmin ved hjelp av vevsplasminogen-aktivator (t-PA). Aktivering skjer på fibrin-overflaten og begrenser således proteolytisk aktivitet til det passende sted. Etterat plasmin er frigitt til sirku- lasjonen, kombineres det raskt med naturlige inhibitorer.Inaktivering av plasmin er det endelige og nødvendige trinn i prosedyren for beskyttelse mot uønsket proteolyse. Slike plasmininhibitorer omfatter a2-antiplasmin, <x2-makroglobulin og al-antitrypsin, som alle er glykoproteiner. a2-antiplasmin har en mye større affinitet for plasmin enn cc2-makroglobulin og binder spesifikt til plasmin i et forhold 1:1. Den større samling av a-makroglobulin virker som en reservoarinhibitor.

Kane, K.K., Ann. Clin. Lab. Sei. 14:443 - 4.49 (1984). Således vil koagel-lysis ved tilførsel av t-PA begrenses ved hjelp av den hurtige og irreversible inaktivering av plasmin ved hjelp av plasmininhibitorer.

a. 2 -antiplasmin har tre funksjonelle områder: det reaktive sted for plasmin, plasmin(ogen) eller LBS-bindingsstedet [komplementært til LBS (lysin-bindingssted) av plasmin-(ogen)], og tverrbindingsstedet for fibrin. Mimuro, J. et al, Blood 69:446 - 453 (1987). Mimuro et al beskriver antistoffer mot tx2-antiplasmin, hvor et (JPTI-1) var spesifikt for det reaktive sted til cc2-antiplasmin og hindret dannelse av cc2-antiplasmin-plasminkomplekser og inhiberte derved antiplasminaktivitet. Mimuro et al lærer imidlertid ikke tilførsel av JPTI-l-antistoff for å øke koagel-lysis. Andre antistoffer som er spesifikke for cc2-antiplasmin er beskrevet av Plow, E.F., et al, J. Biol. Chem. 255:2902 - 2906 (1980), Wimen, B. et al, Sean. J. Clin. Lab. Invest. 43:27 - 33

(1983), Hattey, E., et al, Thromb. Res. 45:485 - 495 (1987), Coilen, US-patent nr 4.346.029 (1980), og Coilen, US-patent nr 4.198.335 (1980) .

D. O pp s umme r i ng

Oppsummert, vil et vesentlig mål for terapi beregnet for behandling av hjerteinfarkt involvere begrensning av nekrose ved å tillate tidlig reperfusjon og ved forhindring av reokklusjon. Dette mål er nå delvis oppnådd gjennom tilførsel av trombolytiske midler som er i stand til å oppløse de potensielle livstruende fibrin-blodplatekoagler. Den eventuelle fordel med anvendelse av slik midler er imidlertid i alt vesentlig oppveid ved deres mangel på fibrinspesifisitet (som er tilfellet med streptokinase og urokinase), eller ved deres relativt korte biologiske halveringstider forårsaket av plasmininhibitorer (som kan resultere i gjendannelse av fibrin-koaglet, og den samtidige reokklusjon av de rammede blodkar). Det behøves således en forbedring innen trombolytisk terapi som øker koagel-lysis mens nedbrytning av fibrinogen minimaliseres og reokklusjon av den rammede koronar arterie forhindres.

Man har funnet at hjerteinfarkt og blodkoagler kan behandles ved tilførsel av et hapten-bindingsmolekyl.

Hjerteinfarkt kan behandles ved samtidig tilførsel, til en pasient som trenger slik behandling, av: (a) et hapten-bindingsmolekyl som er i stand til å forhindre inhiberingen av plasmin ved en plasmininhibitor, i en mengde som er tilstrekkelig til å forhindre slik

inhibering, og

(b) et trombolytisk middel, i en mengde som er tilstrekkelig til enten (i) å oppløse et fibrin-blodplatekoagel eller (ii) inhibere dannelsen av et fibrin-blodplatekoagel, hvori hapten-bindingsmolekylet (a) er forskjellig fra det trombolytiske middel (b).

Et kit kan anvendes for gjennomføring av den ovennevnte behandling og som er inndelt til å inneholde to eller flere beholdere i nær tilknytning til hverandre, og som omfatter: (1) en første beholder inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av hapten-bindingsmolekylet (a) , og (2) en andre beholder inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av det trombolytiske middel (b).

Beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser en kurve av prosentandelen inhibering av

antiplasmin som en funksjon av RWR-konsentrasjonen.

Fig. 2 viser en kurve av prosentandelen koagel-lysis ved hjelp av plasmin som en funksjon av RWR-konsentrasjonen. Fig.3viser en kurve av prosentandelen koagel-lysis ved hjelp av t-PA som en funksjon av RWR-konsentrasjonen. Fig.4viser en kurve av prosentandelen koagel-lysis, hvoriRWRtilsettes før eller etter sammenklumping, som en funksjon av t-PA-konsentrasjon. Fig. 5 viser en kurve som beskriver de synergistiske

virkninger av t-PA og RWR på plasma-koagel-lysis.

Fig. 6 viser et isobologram som beskriver virkningene av

kombinasjoner av RWR og t-PA på plasma-koagel-lysis.

Med et "hapten-bindingsmolekyl" menes et molekyl som er i stand til å binde til en plasmininhibitor. Slike molekyler kan omfatte antistoffer, antistoff-fragmenter (som f.eks. F(ab')2eller F(ab) molekyler), såvel som enhver ligand som er i stand til å binde til en plasmininhibitor.

Et hapten-bindingsmolekyl må være i stand til å binde til en plasmininhibitor og derved forhindre at en slik inhibitor danner inhibitor-plasminkomplekser.

Blodkoagler som kan behandles omfatter, men er ikke begrenset til, pulmonær tromboembolisme, dyp venøs trombose, cerebral embolisme, renal vene- og perifer arterietrombose og 1ignende.

Ved betegnelsen "samtidig tilførsel" menes at hvert av hapten-bindingsmolekylet og det trombolytiske middel vil tilføres i løpet av en tidsperiode hvori de respektive perio-der med farmakologisk aktivitet overlapper hverandre. De to midler kan tilføres samtidig eller påfølgende.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et cc2-antiplasmin monoklonalt antistoff med en k lett kjede som binder til den aminoterminale region av fibrin-tverrbundet eller koagelbundet a2-antiplasmin, som er i stand til å forhindre inhiberingen av plasmin og som ikke reduserer sirkulerende nivåer av a2-antiplasmin, som er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene med fusjon av myelomceller fra en ikke-human dyreart med miltceller fra en ikke-human dyreart som er blitt immunisert med cc2-antiplasmin for å tilveiebringe antistoffdannende hybridceller, kloning av hybridcellene, utvelging og subkloning av de av hybridcellene som danner antistoff som binder til den aminoterminale region av fibrin-tverrbundet eller koagelbundet cc2-antiplasmin, og isolering av det således dannede antistoff.

Et hapten-bindingsmolekyl som fremstilt i henhold til oppfinnelsen er følgelig et cc2-anti<p>lasmin,.monoklonalt antistoff, men kan være et fragment derav. Foretrukket anvendes F(ab')2-fragmentet av et slikt antistoff for å minimalisere enhver immunologisk reaksjon som forårsakes av Fc-delen av immunoglobulinet. Prosedyren for fremstilling av monoklonale antistoffer er nærmere beskrevet av Kaprowski, H. et al (US-patent nr 4.172.124) og Kohler et al (Nature 256:495 - 497 (1975)). Fremstillingen av monoklonale antistoff som er i stand til å forhindre inhiberingen av plasmin er nærmere beskrevet av Mimuro, J. et al, Blood 69:446 - 453 (1987) og er også beskrevet i de etterfølgende eksempler.

Et særlig foretrukket monoklonalt antistoff er antistoffet RWR som er beskrevet mer fullstendig i det etterfølgende.

Betegnelsen "trombolytisk middel" referer til ethvert middel som er i stand til enten å oppløse et fibrin-blodplatekoagel eller inhibere dannelsen av et slikt koagel. Eksempler på trombolytiske midler omfatter streptokinase, prourokinase, urokinase, og vevstype-plasminogenaktivator. Anvendelse av t-PA for disse formål er særlig foretrukket. Skjønt naturlig t-PA kan anvendes, anvendes foretrukket rekombinant t-PA. Man kan også anvende hybrider, fysiologisk aktive fragmenter eller mutante former av de ovennevnte trombolytiske midler. Betegnelsen "vevstype-plasminogenaktivator" som anvendt heri omfatter slike hybrider, fragmenter og mutanter, så vel som både naturlig avledet og rekombinant-avledet vevstype-plasminogenaktivator .

Det monoklonale antistoff og det trombolytiske middel kan tilføres samtidig til mottakeren. Foretrukket tilføres antistoffet til pasienten før tilførsel av trombolytisk middel. Mest foretrukket tilføres antistoffet 45 minutter, foretrukket 30 minutter før tilførsel av det trombolytiske middel.

Det monoklonale antistoff fremstilt i henhold til oppfinnelsen er følgelig tilveiebragt for det formål å forhindre inhibering av plasmin ved en plasmininhibitor. Man har også funnet at en samtidig tilførsel av antistoffet sammen med et trombolytisk middel vil gi en synergistisk virkning og derved vil koagel-lysis øke i en større grad enn det som kunne forventes dersom virkningene av tilførsel av antistoffet og tilførsel av det trombolytiske middel var utelukkende additive.

Når det anvendes alene er den mengde av antistoffet som er i stand til å forhindre inhibering av plasmin og derved øke koagel-lysis når det gis til en pasient, en "terapeutisk effektiv"mengde. For å øke koagel-lysis og forhindre koagel-gjendannelse, er det ønskelig å gi mellom 3 og 10 0 nmol antistoff pr. kg pasientvekt. Denne dose kan tilføres over en periode på mellom 60 og 480 minutter, ved kontinuerlig intravenøs fusjon i en hastighet på 0,10 - 1,0 mg/kg min. Alternativt er det mulig å gi antistoffet i en intravenøs injiserbar bolus i en dose på mellom 3 - 100 nmol/kg, mest foretrukket mellom 3 og 6 nmol (av antistoffet) pr. kg pasientvekt. Dersom antistoffet gis på denne måte, er en enkel bolus tilstrekkelig til å forhindre potensiell koagel-gjendannelse. Antistoffet fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan oppløses i enhver fysiologisk tålbar væske for fremstilling av en injiserbar bolus. Foretrukket fremstilles en slik bolus ved at antistoffet oppløses i normalt saltvann.

Når antistoffet som er i stand til å forhindre inhibering av plasmin tilføres samtidig med et trombolytisk middel, er det ønskelig å gi fra 3-6 nmol antistoff pr. kg pasientvekt. Denne dose kan, i en utførelsesform, tilføres over en periode fra 60 - 48 0 minutter ved kontinuerlig, intravenøs infusjon. Alternativt er det mulig å gi antistoffet i en intravenøs, injiserbar bolus i en dose på mellom 3 og 6 nmol/kg, mest foretrukket mellom 1 og 3 nmol/kg pasientvekt. En mengde trombolytisk middel som er i stand til å gi slik lysis, er en "terapeutisk effektiv" mengde. Det trombolytiske middel gis foretrukket i en dose mellom 0,5 og 1,0 mg pr. kg pasientvekt. I en utførelsesform, gis det trombolytiske middel over en utstrakt tidsperiode (fra 180 til 1.440 ..minutter) . I en foretrukket utførelsesform, gis det trombolytiske middel som en intravenøs, injisert bolus inneholdende mellom 0,5 til1,0mg/kg, og mest foretrukket mellom 0,5 og 0,75 mg/kg. Det trombolytiske middel kan oppløses i enhver fysiologisk, tålbar væske for fremstilling av en injiserbar bolus. Foretrukket fremstilles imidlertid en slik bolus ved at det trombolytiske middel oppløses i normalt saltvann.

En pasient som behandles vil derfor foretrukket motta en intravenøs injisert bolus av antistoffet sammen med en intravenøs injisert bolus av det trombolytiske middel. Denne foretrukne behandling minimaliserer mengden av t-PA som er nødvendig for trombolyse og reduserer således graden av fibrinogen-nedbrytning og reduserer enhver tendens til generell blødning. Det skal bemerkes at anvendelse av den foretrukne behandling resulterer i oppløsning av den okkluderende trombe i en hastighet som i stor grad overskrider hastigheten av trombeoppløsning når enten antistoffet eller det trombolytiske middel gis ved hjelp av infusjon. I tillegg er risikoen for re-okklusjon i alt vesentlig redusert.

Disse uventede funn er viktige fordi det tidligere ikke hadde vært mulig å akselerere hastigheten av koagel-lysis uten å øke tendensen til blødning. En slik foretrukket utførelses-form tilveiebringer derfor en metode for behandling hvori tilførsel av en bolus av antistoffet sammen med tilførsel av en bolus av et trombolytisk middel er i stand til å oppløse en okkluderende trombe ved en større hastighet enn det som kan oppnås når hver forbindelse tilføres alene. Dette kan gjennomføres mens både nedbrytning av fibrinogen og risikoen for re-okklusjon minimaliseres.

Det vil være klart for en fagkyndig på området at den på-krevde dose av antistoffet eller det trombolytiske middel vil avhenge av hvor alvorlig pasientens tilstand er, og av slike kriterier som pasientens høyde, vekt, kjønn, alder og medisinske historie.

Antistoffet eller det trombolytiske middel kan utformes i henhold til kjente metoder for fremstilling av farmasøytisk anvendbare preparater, som ved blanding med en farmasøytisk tålbar bærerløsning. Passende bærere og deres sammensetning er beskrevet i f.eks. Remington<1>s Pharmaceutical Sciences (16. utgave, Osol. A. (ed), Mack, Easton PA (1980)). For å danne et farmasøytisk tålbart preparat som er passende for effektiv tilførsel, vil slike preparater inneholde en effektiv mengde av antistoffet eller det trombolytiske middel, enten alene eller sammen med en passende mengde bærerløsning.

Ytterligere farmasøytiske metoder kan anvendes for å styre virkningsvarigheten. Preparater med kontrollert frigivelse kan oppnås ved anvendelse av polymerer for å kompleksdanne eller absorbere antistoffet eller de trombolytiske midler. Den kontrollerte frigivelse kan utøves ved utvelgelse av passende makromolekyler (f. eks. polyestere, polyaminosyrer, polyvinylpyrrolidon, etylenvinylacetat, metylcellulose, karboksymetylcellulose eller protaminsulfat). Hastigheten av medikamentfrigivelse kan også reguleres ved å endre konsentrajonen av slike makromolekyler. En annen passende metode for å styre virkningsvarigheten omfatter innlemmelse, av de terapeutiske midler, i partikler av en polymer substans som polyestere, polyaminosyrer, hydrogeler, polymelkesyre eller etylenvinylacetat-kopolymerer. Det er eventuelt mulig å innlemme de terapeutiske midler i mikrokapsler som f.eks. er fremstilt ved flokkdannelsesteknikker eller ved grenseflate-polymerisasjon, f.eks. ved anvendelse av henholdsvis hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler eller polymetakrylatmikrokapsler, eller i et kolloid medikament-tilførselssystem, f.eks. liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler, nanokapsler, eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er gitt i Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

Det trombolytiske middel eller antistoffet kan gis til en pasient på kjent måte. Slike metoder for tilførsel omfatter oral, intranasal, subkutan, intramuskulær, intravenøs, intraarteriell eller parenteral tilførsel. I den mest foretrukne metode for behandling av hjerteinfarkt, gis en pasient en bolus (injisert intravenøst) inneholdende mellom 0,5 - 1,0 mg/kg.

Etter at den foreliggende oppfinnelse nå er generelt beskrevet, vil oppfinnelsen forstås bedre med henvisning til bestemte spesifikke eksempler som er innlemmet heri for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av en antistoff rettet mot g2- antiplasmin

A. Materialer

Aprotinin og protein-A Sepharose ble skaffet til veie fra Sigma (St. Louis, MO). S2251 (H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid) ble oppnådd fra Helena Labs (Beaumont, TX). Humant a. 2-antiplasmin (a2AP) ble oppnådd fra Americal Dignostica, Inc. (Greenwich, CT). PD-10-kolonner ble tilveiebragt fra Pharmacia (Uppsala, Sverige). Mikrotiterplater ble oppnådd fra Becton Dickinson Labware (Oxnard, CA). Affinitetsrenset geit anti-mus (Fab')2IgG ble oppnådd fra Cappel Labs (Cochranville, PA). Et murint antistoff isotype-bestemmelseskit ble tilveiebragt fra Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).

B. Fremstilling av murine monoklonale antistoff som er

spesifikk for a . 2 - antiplasmin

A/J-mus ble immunisert intraperitonealt og subkutant med

10 fig humant a2AP i Freund's fullstendige adjuvans. Musen fikk en måned senere tilført 2 iig protein i Freund's ufullstendige adjuvans. To måneder etter initial immunisering, ble blodprøver tatt fra halevenen og antistoff-titer ble bestemt. Musen som viste det høyeste titer ble hyperimmunisert med 5^g a2AP intravenøst (vandig) og 10/xg a2AP intraperitonealt i Freund1s ufullstendige adjuvans fire dager før fusjon og med 5 ug (vandig) intravenøst tre dager før fusjon. Spleno-cytter og murine SP2/0-celler ble fusjonert som beskrevet (Kohler et al, supra). Hybridoma ble utvalgt ved hjelp av en fast-fase radioimmunoassay for a2AP immobilisert i brønner i polyvinylklorid-mikrotiterplater. Spesifikt bundet antistoff ble påvist ved anvendelse av affinitetsrenset, geit anti-mus F(ab')2IgG. 21 hybridoma bandt antigen spesifikt. Disse hybridoma ble subklonet til monoklonalitet ved begrensende fortynning. Syv hybridoma ble utviklet i ascites ved anvendelse av vanlige teknikker. Antistoff ble isolert fra filtrert ascites ved anvendelse av affinitetskromatografi med protein-A Sepharose.

Isotypebestemmelse ble gjennomført ved anvendelse av kanin-anti-mus, anti-idiotype antistoffer koblet til peroksydase.

Et spesielt hybridom dannet et antistoff (RWR) som var spesifikt for a2-antiplasmin av isotypen IgGl-K.

EKSEMPEL 2

Inhibering av cc2- antiplasmin ved RWR

A. Materialer og metoder

Jodering av proteiner ble gjennomført ved anvendelse av jodogenmetoden. Fraker, P.J. og Speck, J.C. Biochem. Biophys. Res. Comm. 80:849 - 857 (1978). Den spesifikke aktivitet av RWR var 2 0,0/iCi/ixg.

B. Inhiberingsstudier

Det ble anvendt flere typer inhiberingsstudier. Først ble en kromogen substrat-analyse anvendt for å teste RWR sin evne til å inhibere inaktiveringen av plasmin ved antiplasmin. Ved anvendelse av et tidligere beskrevet assayformat (Wiman, B. Meth. Enzymol. 80:1395 - 1403 (1981)), ble det satt opp en standardkurve for antiplasmin-aktivitet som beskrevet. Antiplasmin (0 - 25 nM) ble blandet med 0,3 mM S2251 og plasmin (100 nM) i 0,1 M, pH 7,3, fosfatbuffer til totalt 1.000/il. Graden av forandring med hensyn til optisk tetthet ved 4 05 nanometer ble målt automatisk hvert tiende sekund på et Hewlett-Packard 8451A spektrofotometer. Det ble satt opp en standardkurve som relaterte antiplasminkonsentrasjonen til mengden produktdannelse på lineær måte (r =. 0,98) . Deretter ble antiplasmin (25 nm) blandet med RWR (0,875 - 350 nM) og inkubert med 0,3 mM S2251 i 0,1 M, pH 7,3, fosfatbuffer i to timer ved 25°C. Plasmin (100 nM) ble raskt tilsatt og optisk tetthet ble målt. Forandring i optisk tetthet ble anvendt for å beregne omfanget av inhibering av antiplasminaktivitet ved et gitt antistoffnivå.

Som vist i fig. 1, forekom det en 55 % inhibering av cc2-antiplasmin ved en antistoffkonsentrasjon på 20 nmol. Immuno-blotting under ikke-denaturerende betingelser viste at RWR binder 70.000 Mr artene av a2AP og ikke 55.000 Mr ikke-plasminogen bindingsformen. I tillegg, binder RWR ikke merkbart til denaturerte eller reduserte former av a2AP.

EKSEMPEL 3

Økning i koagel- lysis med RWR eller t- PA

Nyfrosset, samlet (åtte tilfeldige givere), humant plasma ble anvendt. For dannelse av koagler, ble plasma blandet med små mengder Ibrin. I prøverør på 75 x 12 mm ble 2 5/il plasma vortexblandet med 25/il av en oppløsning av bovint trombin

(1 U/ml) og kalsiumklorid (4 mM) i 50 mM trisbufret salt-oppløsning, pH 7,4. Rørene ble plassert i et oscillerende vannbad på 3 7°C for å forenkle koagulering. Rørene ble deretter talt i en gammateller for å bestemme basismengden 125-1 merket fibrin som var innlemmet i koagelet. Forskjellig mengder RWR og plasmin ble tilsatt til koagelet i hvert rør og det totale volum ble bragt til 1 ml med 50 mMol Tris, 0,11 M NaCl og 2 mMol CaCl2. Prosentandelen lysis ble bestemt ved å måle frigivelse av radioaktiv merket, oppløselig fibrin-peptid. Ved indikerte tidsintervaller, ble det tatt ut prøver

av supernatanten, uten å erstatte denne, som ble talt. Tredoble forsøk ble gjennomført og prosentandel lysis ble beregnet ved anvendelse av følgende formel:

Kumulativ prosentandel lysis ved tid i =

L, = 100<*>(S,<*>TV,/SV, + S_ ....S.)

1 1 i' i Omaks(0,i-1) 1

hvori Sj^ = supernatanttellinger, TV±= totalt volum tilbake i røret ved tiden i, SVi= volum av. supernatant uttatt til prøve ved tiden i, og 2 Si representerer summen av tidligere supernatantprøver som er tatt ut uten erstatning.

Fig. 2 viser en kurve av prosentandel plasmakoagel-lysis som funksjon av RWR-konsentrasjonen. Som man ser fra fig. 2, gir RWR en doserelatert signifikant økning av koagel-lysis med plasmin. Signifikant koagel-lysis ble observert selv ved en lav konsentrasjon på 10 nmol (molforhold Mab: a2AP på 0,4:1) over fire timer. Således gir delvis inhibering av a2AP en signifikant økning i fibrinolyse ved hjelp av plasmin. Når konsentrasjonen av RWR økes, ble en vesentlig større koagel-lysis observert.

EKSEMPEL 4

Bestemmelse av den synergistiske virkning på koagel- lysis ved RWR og t- PA

Synergismen mellom t-PA og RWR ble studert som angitt i det foregående (Loewe, S., Pharmacol. Rev. 9:237 - 242 (1957), Berenbaum, M.C., Adv. Cancer 35:237 - 242 (1981)). Denne analyse krever at dose-respons kurver for begge midler fremstilles (Berenbaum, M.C., J. Theor. Biol. 114:413 - 421

(1975)). Ved anvendelse av dette, velges doser av t-PA og RWR som er isoeffektive. Fraksjonelle doser av de to midler kombineres deretter og deres kombinerte virkning på koagel-lysis bestemmes. En isobole konstrueres som viser mengden av hvert middel alene eller i kombinasjon som gir en ekvivalent mengde lysis i en gitt tidsperiode.

Disse typer interaksjoner kan eventuelt defineres ved alge-bra. Gitte isoeffektive doser av hvert separate middel A og

B, de isoeffektive fraksjonelle doser av hvert middel i kombinasjon (ai og b^ kan karakteriseres som: synergistisk dersom a^/A + bi/ B < 1, additive dersom ai/A + b^B = 1 eller antagonistiske dersom a±/ A + b±/ B > 1.

For å bestemme dette empirisk, ble forskjellige mengder t-PA og RWR tilsatt separat og sammen til testrør med merkede koagler (in triplo som beskrevet i det etterfølgende). Deretter ble den gjennomsnittlige- prosentandel lysis bestemt som indikert.

Nyfrosset plasma ble blandet med 125-I-merket fibrinogen og koagulert. De forskjellige mengder av RWR (0 - 250 mmol, endelig) eller et kontroll (anti-digoksin) antistoff (0 eller 250 nmol, endelig) ble tilsatt til rørene inneholdende 0 eller 1 enheter t-PA. Rørene ble inkubert ved 37°C og prosentandelen lysis ble bestemt ved frigivelse av radioaktivt merkete fibrinpeptider. I kontroll-koaglene, i den indikerte tidsperiode, var RWR alene ikke forskjellig fra et kontroll-antistoff alene, et anti-digoksin Mab 40 - 160 (Mudgett-Hunter, M. et al, Mol. Immunol. 22:477 - 488 (1985)), i mengden lysis indusert uten t-PA. I nærvær av t-PA viser imidlertid RWR en doserelatert økning av koagel-lysis som er større enn den som ses i koagler testet med t-PA alene. Fig. 3 viser virkningen av varierende konsentrasjoner av t-PA og RWR på koagel-lysis.

Omtrent 30 % antiplasmin er tverrbundet til fibrin ved faktor 13. Dersom tverrbundet antiplasmin ikke er tilgjengelig for antistoffet for binding, vil dette i betydelig grad nedsette antistoffets virkning på graden av koagel-lysis. Slike koagler dannet med antistoffer allerede bundet til a2AP skulle lyse raskere enn dem hvortil antistoffet var tilsatt etter kloning, dvs. etter tverrbinding av a2AP til fibrin. For å teste denne hypotese, ble tidsrelatert lysis i koagler dannet etter preinkubering av plasmaet med RWR sammenlignet med den for dannede koagler hvortil RWR var tilsatt etterpå (fig.4). Nyfrosset plasma ble blandet med radioaktivt merket fibrinogen. Deretter ble RWR (25 nmol, endelig) blandet med plasma og koagulert. I andre forsøk, ble RWR tilsatt til allerede dannede plasmakoagler. Koaglene ble deretter inkubert i en buffer i 24 timer ved 4°C. Deretter ble t-PA (0, 0,1 eller 1 enhet) tilsatt og koaglene ble inkubert ved 37°C. Graden av lysis ble bestemt som beskrevet over. Fra fig. 4 vil man se at der kun er en lett økning i graden av lysis for koagler som ble eksponert for RWR før dannelse. Dette foreslår at antiplasmin er funksjonelt tilgjengelig for MAb i tverrbundet fibrin.

For å bestemme virkningen av kombinasjonene av t-PA og RWR på lysis, ble en isobole konstruert som anbefalt i tidligere studier (Loewe, 1957, Berenbaum, 1981). Isoeffektive doser av t-PA og RWR ble først bestemt. Radioaktivt merkede plasmakoagler ble inkubert ved 37°C med varierende mengder t-PA

(0 - 0,03 enheter) eller RWR (0 - 500 nmol). Prosentandel lysis ved 48 timer ble bestemt (fig. 5). Kontroilkoagler (uten noen av midlene) hadde 9,36 + 0,38 % lysis under dette studium. I dette forsøk, ga 0,03 enheter av t-PA og 500 nmol RWR en ekvivalent mengde lysis (35,5 + 3,1 henholdsvis 34,3 + 5,1, gjennomsnitt +SEM).

I det samme forsøk, ble forskjellige empiriske, fraksjonelle kombinasjoner av RWR og t-PA også undersøkt. Fraksjonelle dosekombinasjoner av begge midler som viser ekvivalent lysis til 500 nmol RWR eller 0,03 U t-PA er plottet (X) på fig. 6. Dosekombinasjoner av RWR og t-PA som ga den samme mengden lysis (34,2 %, 34,9 %) som disse midler alene er indikert ved X. Dosekombinasjoner som viste høyere gjennomsnittlig lysis (41,3 % - 100 %) er betegnet med 0. Fordi de ekvipotente kombinasjoner av t-PA og RWR er en liten fraksjon av hvert middel alene (dvs. at de ligger langt under linjen for additivitet indikert ved den kontinuerlige linje i fig. 6), er der bevis for sterk synergisme mellom disse to midler.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et a. 2-antiplasmin monoklonalt antistoff med en k lett kjede som binder til den aminoterminale region av fibrin-tverrbundet eller koagelbundet a. 2-antiplasmin, som er i stand til å forhindre inhiberingen av plasmin og som ikke reduserer sirkulerende nivåer av a. 2-antiplasmin,karakterisert vedat den omfatter trinnene med fusjon av myelomceller fra en ikke-human dyreart med miltceller fra en ikke-human dyreart som er blitt immunisert med a. 2-antiplasmin for å tilveiebringe antistoff dannende hybridceller, kloning av hybridcellene, utvelging og subkloning av de av hybridcellene som danner antistoff som binder til den aminoterminale region av fibrin-tverrbundet eller koagelbundet a2-antiplasmin, og isolering av det således dannede antistoff.