FI102812B - Menetelmä 2-antiplasmiinin monoklonaalisen vasta-aineen valmistamisek si - Google Patents

Description

1 102812

Menetelmä a2-antiplasmiinin monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää cc2-anitplasmiinin monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka sitoutuu merkittävästi fibriinin sidottuun a2-antiplasmiiniin mutta joka ei vähennä kiertävän a2-antiplasmiinin tasoa potilaassa. Kuvataan myös sydäninfarktin ja potilaassa-10 esiintyvien verihyytymien hoitamista ja erityisesti hoi toa, joka edistää hyytymän liuottamista käyttäen keksinnön mukaisesti saatua a2-antiplasmiiniin kohdistettua vasta-ainetta. Hyytymän liuottamista edistävässä hoidossa a2-an-tiplasmiinin vasta-ainetta voidaan käyttää myös yhdessä 15 trombolyyttisen aineen kanssa.

Keksinnön tausta

Useiden sydäninfarktien (sydänkohtausten) lähtökohtana on verenvuoto arterioskleroottisessa plakissa. Tällaisen verenvuodon seurauksena on usein trombin eli veri-20 tulpan (verihyytymän) syntyminen sepelvaltimoon, josta tulee infarktialue (s.o. verenkierron tukkeumasta johtuva hyytymänekroosin alue). Hyytymä on muodostunut fibriinin ja verihiutaleiden (trombosyyttien) yhdistelmästä. Fib-riiniverihiutalehyytymän muodostumisella on vakavat klii-* 25 niset seuraamukset. Fibriiniverihiutalehyytymän aiheutta man tukoksen aste ja kesto määräävät infarktialueen ja vaurion laajuuden.

A. Sydäninfarktin hoito

Nykyisen sydäninfarktihoidon ensimmäisenä tavoit-30 teenä on tukkivan veritulpan nopea liuottaminen ja veren kierron palauttaminen ("reperfuusio"). Onnistuneen hoidon tulee ollakseen tehokas pystyä tekemään ero fibriiniverihiutalehyytymän ja fibriinin esiasteen, fibrinogeenin välillä. Käytettäessä hoitoainetta, joka ei ole täten spesi-35 finen, voidaan lisätä potilaan yleisen verenvuodon vaaraa.

2 102812

Onnistuneen hoidon tulee käsittää kestävä vaikutus siten, ettei hoidon päätyttyä muodostu uudelleen hyytymää. Jos * fibriiniverihiutalehyytymä pystyy muodostumaan uudelleen, saattaa kysessä oleva valtimo tukkeutua uudelleen.

5 Fibriiniverihiutalehyytymien muodostuminen muissa verenkiertojärjestelmän osissa voidaan osittain torjua käyttämällä antikoagulantteja (esimerksi hepariinia). Valitettavasti hepariinin ei ole todettu olevan yleisesti tehokas torjumaan uudelleen tukkeutumista sellaisilla sy-10 däninfarktiuhreilla, joiden verisuonen tukkeuman aste ("stenoosiaste") on 70 % tai sitä suurempi, erityisesti sellaisilla potilailla, joilla on paha residuaalinen koro-naaristenoosi.

Jos potilaalle on muodostunut fibriiniverihiutale-15 hyytymä ennen kuin lääkärin apua on ollut käytettävissä, hyytymä voidaan liuottaa käyttäen trombolyyttisiä aineita. Trombolyyttinen aine on lääke, joka pystyy liuottamaan fibriiniverihiutaletrombin (tulpan), ja siten mahdollistaa veren virtaamisen vahingoittuneen verisuonen läpi. Näihin 20 aineisiin luetaan mm. streptokinaasi, prourokinaasi, uro- kinaasi ja kudostyyppinen plasminogeeniaktivaattori (Ganz, W. et ai., J. Amer. Coll. Cardiolol. 1. (1983) 1247 - 1253; Rentrop, K.P. et ai., Amer. J. Cardiol. 54 (1984) 29E - 31E; Gold, H.K. et ai., Amer. J. Cardiol. 53 (1984) 25 122C - 125C.

Hoito trombolyyttisellä aineella voi usein menetyk-sellisesti palauttaa sydänverenkierron riittävän nopeasti keskeyttääkseen sydäninfarktin muodostumisen. Valitettavasti huomattavan useilla potilailla on todettu liuotetun 30 fibriiniverihiutalehyytymän muodostuneen uudelleen sen jälkeen, kun trombolyyttinen hoito on lopetettu. Tämä uudelleen muodostuminen voi johtaa vahingoittuneiden verisuonien tukkeutumiseen uudelleen ja siihen on sen takia kiinnitettävä erityistä huomiota (Gold, H.K. et ai., Amer.

35 J. Cardiol. 53 (1984) 122C - 125C; Gold, H.K. et ai., Cir- 3 102812 culation 68 (1984) 1-50 - 1-54). Näin ollen, vaikka strep-tokinaasi on todettu onnistuneeksi liuottamaan fib-riinihyytymiä noin 85 %:ssa tutkituista tapauksista, on noin 25 %:lla tutkituista potilaista todettu uudelleen 5 tukkeutumista vahingoittuneissa verisuonissa (Gold, H.K.

et ai., Circulation 68 (1983) 150 - 154).

Kudostyyppistä plasminogeeniaktivaattoria annetaan infuusiona nopeudella, joka on 1 - 2 mg/potilaan paino kg:na/90 min. Koska suuremmat t-PA (kudos-PA) -pitoisuudet 10 pystyvät hajottamaan fibrinogeenia, liittyy korkeampiin annostuksiin lisääntynyt potentiaalinen yleinen verenvuoto. Suurempien t-PA-annosten ei ole havaittu tasaisesti lisäävän hyytymän liuottamisnopeutta.

t-PA:n käyttämisen edun merkittävänä haittapuolena 15 on akuutin uuden tukoksen spontaaninen syntymisnopeus, joka on seurauksena t-PA-hoidon keskeyttämisestä. Gold, H.K. apulaisineen totesi, että t-PA-hoidon keskeyttämisen seurauksena oli uusi tukos vaurioituneissa verisuonissa noin 45 %:lla tutkituista potilaista (Circulation, 73 20 (1986) 347 - 352) . Lisääntyneen t-PA-annostuksen ei ole todettu alentavan taipumusta sepelvaltimon uuteen tukokseen. Merkittävää on, että trombiinihyytymän muodostuminen uudelleen on läheisessä suhteessa residuaaliseen koronaa-ristenoosiasteeseen (s.o. verisuonten tukkeuman laajuu-25 teen). Näin uuden tukoksen syntyminen on todennäköisempää yksilöillä, joilla on esiintynyt korkea ahtautuma-aste (s.o. yli 70 %:n kvantitatiivinen stenoosi tai yli 80 %:n ei-kvantitatiivinen stenoosi). Verisuonien uudelleen tukkeutuminen on todettu voitavan estää jatkuvalla t-PA-in-30 fuusiolla (Gold, H.K. et ai., Circulation 73 (1986) 347 - 352). Suhteellisen lyhyt t-PA:n puoliintumisaika ja joillakin potilailla mahdollinen lisääntynyt taipumus runsaaseen vuotamiseen voivat valitettavasti tehdä jatkuvan t-PA-infuusion useille sydänkohtausuhreille soveltumatto-35 maksi.

4 102812

Yhteenvetona todetaan kliinisten tutkimusten osoittaneen, että liuotettu veritulppa usein muodostuu uudelleen t-PA-infuusion keskeyttämisen jälkeen (Gold, H.K. et ai., Circulation 73 (1986) 347 - 352), mutta uudelleen 5 muodostumisten esiintymistiheys voidaan minimoida ottamal la käyttöön toinen ("ylläpito"-) t-PA-infuusio, jossa on oleellisesti alempi annos mutta jota käytetään oleellisesti pidempi aika. Hepariinia pidetään yleisesti sopivana oheishoitona ylläpitoinfuusiota saaville potilaille. Se-10 pelvaltimon veritulpan (hyytymän) hoito t-PA:11a edellyt tää sen takia jatkuvaa infuusiota korkealla annostasolla, jotta saavutettaisiin nopea reperfuusio, ja ylläpi toinfuusiota alemmalla annostasolla uuden tukoksen estämiseksi potilailla, joilla on korkea resdidualisen stenoosin 15 aste.

B. Fibriinihyytymän muodostusmekanismi

Hyytymät koostuvat sekä fibriinistä että verihiutaleista eri suhteissa. Veren hyytymisen perusreaktio käsittää liukoisen plasmaproteiinin (fibrinogeenin) muuttumisen 20 liukenemattomaksi fibriiniksi. Fibrinogeenin muuttumista fibriiniksi katalysoi entsyymi, trombiini, joka on se-riiniproteaasi. Verihyytymän muodostumisen yleisen mekanismin esittää Ganong, W.F. (Review of Medical Physiology, 9. painos (1979) 411 - 414, Lange, Los Altos, CA, 25 USA). Verihiutaleet ovat veressä esiintyviä levymäisiä muodostelmia. Ne osallistuvat hyytymän muodostumiseen liittymällä fibriiniin liukenemattomaksi massaksi ja edistämällä fibrinogeenin muuttumisnopeutta fibriiniksi. Verihiutaleet osallistuvat hyytymän muodostumiseen sydänin-30 farktissa ja muodostavat niiden hyytymien pääosan, jotka tukkivat uudelleen trombolyyttisellä lääkehoidolla reper-fusoituja sydämen valtimoita. Verihiutaleaggregaatin muodostuminen riippuu fibrinogeenin (ja mahdollisesti Wille-brandin faktorin tai fibronektiinin) ja verihiutaleiden 35 pinnalla läsnä olevan reseptorimolekyylin vuorovaikutuk- 5 102812 sesta. Tämän verihiutaleiden fibrinogeenireseptorin on todettu olevan kahden membraaniglykoproteiinin kompleksi, joita kutsutaan GPIIb ja GPIIIa (Nachman, R.L. et ai., J. Clin. Invest. 69 (1982) 263 - 269; Coller, B.S. et ai., J.

5 Clin. Invest. 72 (1983) 325 - 338). GPIIb/GPIIIa-resepto- rikompleksin spesifisen roolin selvitti B.S. Coller apulaisineen eristämällä hiiren monoklonaalisen vasta-aineen (tunnetaan monoklonaalisena vasta-aineena 10E5), jonka he totesivat pystyvän sitoutumaan glykoproteiini Ilbrhen ja 10 Illathan ja täysin estämään fibrinogeenin sitoutumisen verihiutaleisiin. Välttääkseen siitä mahdollisuudesta johtuvia potentiaalisia komplikaatioita, että monoklonaalisen vasta-aineen Fc-fragmenttialue saattaisi epäspesifisesti inhiboida aggregaation, käytti Coller et ai. 10E5-vasta-15 aineen F (ab') 2-fragmenttia kokeissaan (Coller, B.S. et ai.

J.Clin. Invest. 72 (1983) 325 - 338.) Vasta-aineen F(ab')2-fragmentiksi luetaan vain ne vasta-aineen alueet, jotka ovat vastuussa vasta-aineen spesifisyydestä ja antigeenin sitomiskapasiteetista. Eisen, H.N. (Microbiology, 3. pai-20 nos (1980) 342-349, toim. Davis, B.D. et ai., Harper &

Row, N.Y.) on esittänyt F (ab') 2-fragmenttien luonteen ja niiden valmistusmenetelmät.

Toisenkin monoklonaalisen vasta-aineen (merkitään 7E3) on todettu estävän fibrinogeenin sitoutuminen veri-’ 25 hiutaleisiin ja sitoutuvan GPIIb/GPIIIa:han (Coller, B.S., J. Clin. Invest. 76 (1985) 101 - 108). Tämä mono- klonaalinen vasta-aine poikkesi vasta-aineesta 10E5 siten, että se sitoutui paljon nopeammin aktivoituihin verihiutaleisiin kuin aktivoimattomiin ja se pystyi sitoutumaan 30 yhtä hyvin koiran kuin ihmisen verihiutaleisiin (Coller, B.S., J. Clin. Invest. 76 (1985) 101 - 108; Coller, B.S. et ai., J. Lab. Clin. Med. 107 (1986) 384 - 392, jotka molemmat kirjallisuusviitteet on sisällytetty tähän viit-tamalla. Monoklonaalisen vasta-aineen 7E3 F (ab1) 2-frag-35 mentin todettiin pystyvän häiritsemään verihiutaleaggre- 6 102812 gaatin muodostusta, siten olevan potentiaalisesti terapeuttisesti käyttökelpoinen hyytymätautien hoidossa (Col-ler, B.S. et ai., Blood 66 (1985) 1456 - 1459). Mono- klonaalisen vasta-aineen 7E3 F (ab') 2-fragmentin todettiin 5 myöskin olevan pystyvä estämään verihiutaleiden keräänty misen monikerroksiseksi rykelmäksi tuottamatta sopimatonta verenvuodon riskiä, siten ehdottaen potentiaalista käyttöä, jolla vältetään verisuonien täydellinen tukkeuma, jota voi esiintyä sydäninfarktissa ja sydänkohtauksessa 10 (Coller,B.S. et ai., Blood 66 (1985) 1455 - 1459).

C. Hyytymän liuottamisen mekanismi ja sen luonnollinen inhibitio

Hyytymän liukenemisen in vivo saa aikaan plasmiini. Luonnon olosuhteissa kudosplasminogeeniaktivaattori (t-PA) 15 muuntaa plasminogeenin plasmiiniksi. Aktivointi tapahtuu fibriinin pinnalla täten rajoittaen proteolyyttisen aktiivisuuden sopivaan kohtaan. Kun plasmiini on päässyt verenkiertoon, se yhdistyy nopeasti luonnollisten inhibiittorien kanssa. Plasmiinin inaktivointi on viimeinen ja tar-20 peellinen prosessin vaihe suojauduttaessa epätoivotulta proteolyysiltä. Tällaisia plasmiinin inhibiittoreita ovat mm. oc2-antiplasmiini, o2-makroglobuliini ja al-anti-trypsiini, jotka kaikki ovat glykoproteiineja. a2-anti-plasmiinin aktiviteetti plasmiinia kohtaan on paljon suu-25 rempi kuin <x2-makroglobuliinin ja se sitoutuu spesifisesti plasmiiniin suhteessa 1:1. Suurempi a-makroglobuliiniva-rasto toimii inhibiittorilähteenä (Kane, K.K., Ann. Clin. Lab. Sei 14 (1984) 443 - 449). Täten t-PA:n käyttöä hyytymän liuottamiseksi rajoittaa nopea ja palautumaton plas-30 miinin inhibiittorien aiheuttama plasmiinin inaktivointi.

a2-antiplasmiinilla on kolme toimintakohtaa: plasmiinin reaktiokohta, plasmiinin (plasminogeenin) tai LBS:n sidoskohta [täydentäen plasmiinin (plasminogeenin) LBS:ää (lysine-binding site)] ja fibriinin silloituskohta (Mimu-35 ro, J. et ai., Blood 69 (1987) 446 - 453) . Mimuro et ai.

7 102812 toivat esiin α2-antiplasmiinin vasta-aineita, joista yksi (JPTI-1) oli a2-antiplasmiinin reaktiokohdalle spesifinen ja ehkäisi a2-antiplasmiini-plasmiinikompleksien muodostumisen ja täten inhihoi antiplasmiinin aktiivisuuden.

5 Mimuro apulaisineen ei kuitenkaan opeta JPTI-1-vasta-ai neen käyttöä edistämään hyytymän liuottamista. Muita a2-antiplasmiini-spesifisiä vasta-aineita esittävät Plow, E.F. et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2902 - 2906; Wimen, B. et ai., Scan$ J. Clin. Lab. Invest. 43 (1983) 27 - 33; 10 Hattey, E. et ai., Thromb. Res. 45 (1987) 485 -495; Col- len, US-patentti nro 4 346 029 (1980) ja Collen, US-pa- tentti 4 198 335 (1980).

D. Yhteenveto

Yhteenvetona sydäninfarktin hoitoon tarkoitettujen 15 hoitomuotojen keskeisenä päämääränä on kuolion rajoittami nen sallimalla aikainen reperfuusio ja ehkäisemällä uuden tukoksen syntyminen. Nykyisin tämä päämäärä saavutetaan osittain käyttämällä trombolyyttisiä aineita, jotka pystyvät liuottamaan potentiaalisesti hengenvaaralliset fibrii-20 niverihiutalehyytymät. Näiden aineiden potentiaalista etua vähentää kuitenkin se, että niiltä puuttuu fibriinispesi-fisyys (kuten streptokinaasin ja urokinaasin tapauksessa) tai niiden suhteellisen lyhyt plasmiini-inhibiittorien aiheuttama biologinen puoliintumisaika (joka voi johtaa fib-• 25 riinihyytymän uudelleen muodostumiseen ja sen seurauksena vaurioituneiden verisuonien uudelleen tukkeutumiseen). Siitä syystä on olemassa tarve parantaa trombolyyttistä hoitoa, joka edistää hyytymän liuottamista samalla kun se minimoi fibrinogeenin hajottamista ja estää uuden tukoksen 30 vaurioituneessa sepelivaltimossa.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee menetelmää a2-anitplasmiinin monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka sitoutuu merkittävästi fibriinin sidottuun cc2-antiplasmiiniin 35 mutta joka ei vähennä kiertävän a2-antiplasmiinin tasoa 3 102812 potilaassa. Käyttäen keksinnön mukaisesti valmistettavaa o2-antiplasmiinin monoklonaalista vasta-ainetta voidaan parantaa sydäninfarktin ja potilaiden muiden verihyytymien trombolyyttistä hoitoa.

5 Piirrosten kuvaus

Kuvio 1 kuvaa antiplasmiinin inhibitio-% RWR-pitoi-suudesta riippuen.

Kuvio 2 kuvaa plasmiinin hyytymän liuottamis-% RWR-pitoisuudesta riippuen.

10 Kuvio 3 kuvaa t-PA:n hyytymän liuottamis-% RWR-pi- toisuudesta riippuen.

Kuvio 4 kuvaa hyytymän liuottamis-% t-PA:n pitoisuudesta riippuen, kun RWR on lisätty ennen hyytymistä tai hyytymisen jälkeen.

15 Kuvio 5 kuvaa t-PA:n ja RWR:n synergistisen vaiku tuksen plasmahyytymän liuottamisessa.

Kuvio 6 kuvaa isobologrammia, joka esittää RWR:n ja t-PA:n yhdistelmien vaikutuksen plasmahyytymän liuottamisessa .

20 Edullisen suoritusmuodon kuvaus Tämä keksintö koskee siis menetelmää a2-anitplas-miinin monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka sitoutuu merkittävästi fibriinin sidottuun o2-antiplas-miiniin mutta joka ei vähennä kiertävän a2-antiplasmiinin : 25 tasoa potilaassa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että eläin, joka on muu kuin ihminen immunisoidaan fibriiniin sidotulla a2-antiplasmiinilla, joka pystyy estämään plasmiinin inhibition, fuusioidaan immunisoidun eläimen vasta-ainetta 30 tuottava solu myeloomasoluun kuolemattomien vasta-ainetta tuottavien hybridisolujen saamiseksi, kloonataan hybridisolut ja valitaan ja subk-loonataanne solut, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta, ja eristetään näin valmistettu vasta-aine.

9 102812

Keksinnön mukaisesti saatua a2-antiplasmiinin mono-klonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää sydäninfarktin ja verihyytymien hoitamiseksi. Keksinnön mukaisesti valmistetulla vasta-aineella hoidettuja verihyytymiä ovat 5 muun muassa keuhkoveritulppa, syvä laskimoveritulppa, ai voveritulppa, munuaislaskimon ja perifeeristen valtimoiden veritulpat ja vastaavat.

Vasta-ainetta voidaan antaa rinnakkain trombolyyt-tisen aineen kanssa. Näitä kahta ainetta voidaan tällöin 10 antaa samanaikaisesti tai perättäisesti. Vasta-aine on edullista antaa potilaalle ennen trombolyyttisen aineen antamista. On edullisinta antaa vasta-aine 45, edullisesti 30 minuuttia ennen trombolyyttisen aineen antamista.

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetelmiä 15 ovat esittäneet Kaprowski, H. et ai. (US-patentti 4 172 124) ja Kohler et ai., (Nature 256 (1975) 495 -497). Nimuro, J. et ai., Blood 69 (1987) 446 - 453, esittää plasmiinin inhiboinnin ehkäisevien monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksen, ja se esitetään tämän sovellutuksen 20 esimerkkiosassa.

Käsitteellä "trombolyyttinen aine" on tarkoitus viitata mihin tahansa aineeseen, joka pystyy joko liuottamaan fibriiniverihiutalehyytymän tai estämään sellaisen hyytymän muodostumisen. Esimerkkeinä trombolyyttisistä 25 aineista ovat mm. streptokinaasi, prourokinaasi, urokinaa- si ja kudostyyppinen plasminogeeniaktivaattori. Näihin tarkoituksiin t-PA:n käyttäminen on erityisen edullinen. Vaikka luonnollista t-PA:ta voidaan käyttää, on edullista käyttää yhdistelmä-t-PA:ta. Tämän lisäksi voidaan hyödyn-30 tää hybridejä, yllä esitettyjen trombolyyttisten aineiden fysiologisesti aktiivisia fragmentteja tai mutanttimuotoja. Ilmauksella "kudostyyppinen plasminogeeniaktivaattori", kuten sitä tässä käytetään, tarkoitetaan mm. tällaisia hybridejä, fragmentteja ja mutantteja, samoin 35 kuin luonnollista alkuperää olevaa sekä yhdistelmäteknii- kalla saatua kudostyyppistä plasminogeeniaktivaattoria.

10 102812

Yllättäen on todettu, että tämän keksinnön mukaisesti saadun vasta-aineen käytöllä yhdessä trombolyyttisen aineen kanssa on synergistinen vaikutus ja siten se edistää hyytymän liuottamista enemmäm kuin oli odotettavissa, 5 jos vasta-aineen vaikutus ja trombolyyttisen aineen vaiku tus olisi vain laskettu yhteen.

Yksinään käytettynä potilaalle annettuna kutsutaan "terapeuttisesti vaikuttavaksi" määräksi sitä vasta-aineen määrää, joka pystyy ehkäisemään plasmiinin inhibition ja 10 täten edistämään hyytymän liuottamista. Jotta edistetään hyytymän liuottamista ja ehkäistään hyytymän uudelleen muodostuminen, on tavoitteena antaa 3 -100 nmoolia vasta-ainetta potilaan painokiloa kohti. Yhden suoritusmuodon mukaisesti tämä annostus voidaan antaa 60 - 480 minuutin 15 ajanjakson kuluessa jatkuvana infuusiona laskimoon no peudella 0,10 - 1,0 mg/kg/min. Vaihtoehtoisesti on mahdollista antaa vasta-ainetta laskimonsisäisenä injektiona 3 -100 nmoolin, ja edullisimmin 3-6 nmoolin lääkeannoksena (vasta-ainetta) potilaan painokiloa kohti. Jos vasta-aine 20 annetaan tällä tavalla, riittää yksi lääkeannos eh käisemään potentiaalisen hyytymän uudelleen muodostumisen. Tämän keksinnön mukaisesti saatu vasta-aine voidaan liuottaa mihin tahansa fysiologisesti hyväksyttävään nesteeseen injisoitavan annoksen valmistamiseksi. On edullista val-25 mistaa tällainen annos liuottamalla vasta-aine normaaliin keittosuolaliuokseen.

Jos vasta-aine, joka pystyy ehkäisemään plasmiinin inhibition, annetaan yhdessä trombolyyttisen aineen kanssa, on tavoitteena antaa 3-6 nmoolia vasta-ainetta po- 30 tilaan painokiloa kohti. Erään suoritusmuodon mukaisesti tämä annostus annetaan 60 - 480 minuutin kuluessa jatkuvana laskimonsisäisenä infuusiona. Vaihtoehtoisesti on mahdollista antaa vasta-aine laskimonsisäisesti injisoitavana lääkeannoksena, joka on 1 - 6 nmoolia, edullisimmin 1-3 35 nmoolia potilaan painokiloa kohti. Trombolyyttisen aineen w 102812 määrä, joka täten pystyy liuottamaan hyytymän, on "terapeuttisesti vaikuttava" määrä. Trombolyyttinen aine annetaan edullisesti 0,5 - 1,0 mg:n annoksena potilaan painokiloa kohti. Eräässä suoritusmuodossa trombolyyttistä ai-5 netta annetaan pidemmän aikavälin kuluessa (s.o. noin 180 - 1 440 minuutin kuluessa). Edullisessa suoritusmuodossa trombolyyttinen aine annetaan laskimonsisäisesti injisoi-tuna 0,5 - 1,0 mg/kg:n, edullisimmin 0,5 - 0,75 mg/kg:n lääkeannoksena. Injisoitavan lääkeannoksen valmistamiseksi 10 trombolyyttinen aine voidaan liuottaa mihin tahansa fysio logisesti hyväksyttävään nesteeseen. Kuitenkin on edullista valmistaa tällainen lääkeannos liuottamalla trombolyyttinen aine normaaliin keittosuolaliuokseen.

Edullisen suoritusmuodon mukaan hoidettu potilas 15 saa siis laskimonsisäisesti injisoidun lääkeannoksen vas ta-ainetta yhdessä laskimonsisäisesti injisoidun trombo-lyyttisen aineen lääkeannoksen kanssa. Tämä edullinen hoito minimoi trombolyysiin tarvittavan t-PA:n määrän siten vähentäen fibrinogeenin hajoamisen laajuutta ja alentaen 20 mitä tahansa yleisen verenvuodon taipumusta. On tärkeätä, että edullisen hoidon seurauksena tukkiva veritulppa liuotetaan nopeudella, joka huomattavasti ylittää veritulpan liuottamisnopeuden, kun joko vasta-aine tai trombolyyttinen aine annetaan infuusiona. Lisäksi uudelleen tukkeutu-25 misen riski on merkittävästi vähentynyt.

Nämä odottamattomat havainnot ovat tärkeitä, koska aikaisemmin ei ollut mahdollista kiihdyttää hyytymän liuottamista lisäämättä taipumusta verenvuotoon. Siksi tässä tarjotaan hoitomenetelmä, jossa keksinnön mukaisesti saa-30 dun vasta-aineen lääkeannoksen antaminen yhdistettynä trombolyyttisen aineen lääkeannoksen antamiseen pystyvät nopeammin hajottamaan tukkivan veritulpan kuin mitä voidaan saavuttaa, jos kumpaakin yhdistettä annetaan yksin. Tämän lisäksi edullinen suoritusmuoto tavoittaa tämän pää-35 määrän minimoimalla sekä fibrinogeenin hajottamisen että uuden tukkeuman riskin.

12 102812

Kuten on ilmiselvää alan ammattimiehelle, vasta-aineen tai trombolyyttisen aineen edellyttämä annostus on riippuvainen potilaan tilan vakavuudesta ja kriteereistä, kuten potilaan pituus, paino, sukupuoli ja sairaskertomus.

5 Tämän keksinnön mukaisesti saatu vasta-aine tai trombolyyttinen aine voidaan formuloida tunnettujen menetelmien mukaisesti, joita käytetään valmistettaessa farmaseuttisesti käytettyjä koostumuksia, kuten esimerkiksi sekoittamalla farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajavehikke-10 Iin kanssa. Sopivia vehikkeleitä ja niiden formulointia esitetään esimerkiksi Remingtonin julkaisussa Pharmaceutical Siences (1980), toim. Osol, A., Mack, Easton, PA, USA. Muodostettaessa tehokkaaseen lääkekäyttöön sopiva farmaseuttisesti hyväksyttävä koostumus, tulevat nämä koostu-15 mukset sisältämään tehokkaan määrän vasta-ainetta tai trombolyyttistä ainetta joko yksin tai sopivan kantajave-hikkelimäärän kanssa.

Muita farmaseuttisia menetelmiä voidaan käyttää vaikutuksen keston kontrolloimiseksi. Kontrolloituja lääk-20 keen vapautumisvalmisteita voidaan aikaansaada käyttämällä polymeerejä kömpieksoimaan tai absorboimaan tämän keksinnön mukaisesti saatua vasta-ainetta tai trombolyyttisiä aineita. Kontrolloitua lääkeaineen vapautumista voidaan harjoitella valitsemalla sopivia makromolekyylejä (esimer-25 kiksi polyestereitä, polyaminohappoja, polyvinyylipyrro- lidonia, etyleenivinyyliasetaattia, metyyliselluloosaa, karboksimetyyliselluloosaa tai protamiinisulfaattia). Lääkkeen vapautumisnopeutta voidaan myöskin kontrolloida muuntelemalla näiden makromolekyylien pitoisuutta. Toinen 30 mahdollinen vaikutuksen keston kontrolloimismenetelmä kä sittää terapeuttisten aineiden sisällyttämisen polymeeri-ainepartikkeleihin, kuten polyestereihin, polyaminohappoi-hin, hydrogeeleihin, polylaktaatteihin tai etyleenivinyy-liasetaatti-kopolymeereihin. Vaihtoehtoisesti on myöskin 35 mahdollista piilottaa terapeuttiset aineet mikrokapselei- 13 102812 hin, jotka on valmistettu koaservaatiomenetelmillä tai interfasialisella polymerisaatiolla käyttäen esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosaa tai liivatemikrokapseleita tai polymetyylimetakrylaattimikrokapseleita tai vastaavasti, 5 jos lääke annetaan kolloidisena, esimerkiksi käyttäen li- posomeja, albumiinimikrosfeerejä, mikroemulsioita, nano-partikkeleita, nanokapseleita tai makroemulsioita. Nämä tekniikat esitetään Remingtonin Pharmaceutical Sciences -teoksessa (1980).

10 Trombolyyttinen aine tai vasta-aine voidaan antaa potilaalle tunnetun käytännön mukaisesti. Lääke voidaan antaa suun kautta, nenän kautta, ihon alle, lihakseen, laskimoon, valtimoon,tai parenteraalisesti. Sydäninfarktin hoidossa edullisin menetelmä on antaa potilaalle 0,5 - 1,0 15 mg/kg lääkeannos laskimoon injisoituna (i.v.).

Kun keksintö on nyt yleisesti kuvattu, on se paremmin ymmärrettävissä viittaamalla seuraaviin spesifisiin esimerkkeihin, joiden on tarkoitus ainoastaan havainnollistaa keksintöä, eikä rajata sitä, ellei toisin esitetä.

20 Esimerkki 1 a2-antiplasmiiniin kohdistetun vasta-aineen valmistaminen A. Materiaali

Aprotiniini ja Proteiini-A Sefaroosi ostettiin Sig-25 malta (St. Louis, MO). S2251 (H-D-valyyli-l-leusyyli-1- lysiini-p-nitroanilidi-dihyrokloridi hankittiin Helena Labs'ilta (Beaumont, TX). Ihmisen a2-antiplasmiini (α2ΑΡ) hankittiin American Diagnostica Incrsta (Greenwich, CT). PD-10 -pylväät ostettiin Pharmaciasta (Uppsala, Ruotsi). 30 Mikrotiitterilevyt hankittiin Becton Dickinson Labware'il- tä (Oxnard, CA) . Affinitettipuhdistettu vuohen anti-hiiri (Fab')2-IgG hankittiin Cappel Labs'ilta (Cochranville, PA) . Hiiren vasta-aine-isotyyppauskitti ostettiin Boehrin-ger Mannheim'iltä (Indianapolis, IN).

14 102812 B. a2-antiplasmiinispesifisten hiiren monoklonaa-listen vasta-aineiden valmistus A/J-hiiret immunisoitiin i.p. ja s.c. 10 μg:lla ihmisen a2AP:tä täydellisessä Freundin adjuvantissa. Kuu-5 kautta myöhemmen hiirille annettiin 2 μg proteiinia Freun din epätäydellisessä adjuvantissa. Kaksi kuukautta alkuperäisen immunisoinnin jälkeen laskettiin verta hiiren hän-täsuonesta ja määritettiin vasta-ainetiitterit. Hiiri, jolla oli korkein tiitteri, hyperimmunisoitiin 5 ^g:lla 10 i.v. (vesiliuoksessa) ja 10 ^glla i.p. a2AP:tä epätäydel lisessä Freundin adjuvantissa 4 päivää ennen ja 5 μg:lla (vesiliuoksessa) i.v. 3 päivää ennen fuusiota. Spleno-syytit ja hiiren SP2/0-solut fusioitiin kuten esitetty (Köhler et ai., supra). Hybridoomat valikoitiin a2AP:n 15 kiinteän faasin radioimmunologisella määrityksellä immobi- lisoituna polyvinyylikloridimikrotiitterilevyjen kuoppiin. Spesifisesti sitoutuneet vasta-aineet todettiin käyttämällä affiniteettipuhdistettua vuohen anti-hiiri-F (ab1) 2IgG: tä. Kaksikymmentäyksi hybridoomaa sitoi spesifi-20 sesti vasta-ainetta. Nämä hybridoomat subkloonattiin mono- klonaalisiksi rajoittavalla laimennuksella. Seitsemän hybridoomaa siirrettiin tavanomaisella menetelmällä askites-nesteeseen. Vasta-aineet eristettiin suodatetusta askites-nesteestä affiniteettikromatografisesti proteiini-A-sefa-25 roosin avulla.

Isotyypitys suoritettiin käyttäen peroksidaasiin liitettyjä kanin anti-hiiri, anti-idiotyyppisiä vasta-aineita .

Yksi tietty hybridooma tuotti isotyyppi IgGl-K:n 30 <x2-antiplasmiinille spesifistä vasta-ainetta (RWR).

Esimerkki 2 a2-antiplasmiinin inhibitio RWR:n avulla A. Materiaali ja menetelmät

Proteiinien joditus suoritettiin käyttäen Iodogen-35 menetelmää (Fraker, P.J. ja Speck, J.C., Biochem. Biophys.

is 102812

Res. Comm. 80 (1978) 849 - 857) . RWR:n spesifinen aktiivisuus oli 20,0 μCi/μg.

B. Inhibitiokokeet

Tehtiin erityyppisiä inhibitiokokeita. Ensinnä käy-5 tettiin kromogeenista substraattimääritystä testaamaan RWR.-n kyky inhiboida antiplasmiinin plasmiinin inaktivoin-tia. Käyttäen aikaisemmin kuvattua menetelmää (Viiman, B., Meth. Enzymol. 81 (1981) 1395 - 1403) laadittiin esitetyn mukainen antiplasmiinin aktiivisuuden standardikäyrä. An-10 tiplasmiini (0 - 25 nM) sekoitettiin 0,3 mM:n S2251 ja plasmiinin (100 nM) kanssa 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,3, ja täytettiin 1 000 μΐ^βΐ. Optisen tiheyden muutos 405 nm:ssä mitattiin automaattisesti joka 10. sekunti Hewlett-Packard 84451A -spektrofotometrillä. Laadittiin li-15 neaarinen standardikäyrä antiplasmiinin pitoisuuden suh teesta tuotteen muodostusnopeuteen (r = 0,98). Seuraavaksi antiplasmiini (25 nM) sekoitettiin RWR:n (0,875 - 350 nM) kanssa ja inkuboitiin 0,3 mM:n S2251 kanssa 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,3, 2 tuntia 25 °C:ssa. Plasmiini 20 (100 nM) lisättiin nopeasti ja optinen tiheys mitattiin.

Optisen tiheyden muutosnopeutta käytettiin laskettaessa antiplasmiinin aktiivisuuden inhibition määrää annetulla vasta-ainetasolla. Kuten kuviossa 1 näkyy, 55 %:n a2-antiplasmiinin inhibitio osui vasta-aineen pitoisuudelle 25 20 nmoolia. Immunoblottaus denaturoimattomissa olosuhteis sa osoitti, että RWR sitoo a2AP:n 70 000 Mr:n lajeja eikä 55 000 Mr:n lajeja, ei-plasminogeenia sitovaa muotoa. Lisäksi RWR ei huomattavasti sitoutunut a2AP:n denaturoituihin tai pelkistettyihin muotoihin.

30 Esimerkki 3

Hyytymän liuottamisen edistäminen RWR:llä tai t-PA:11a Käytettiin tuoreena pakastettua pooliplasmaa (kahdeksan satunnaista luovuttajaa). Hyytymien aikaansaamisek-35 si plasma sekoitettiin pienten Ibriini-määrien kanssa.

1β 102812 75 x 12 mmm koeputkissa sekoitettiin vorteksilla 25 μΐ plasmaa 25 μ1:η naudan trombiiniliuoksen (1 U/l) ja kal-siumkloridin (4 mM) kanssa 50 mM tris-puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, pH 7,4. Putket asetettiin ravistavaan 5 vesihauteeseen hyytymisen helpottamiseksi. Sitten putket laskettin gammalaskijassa hyytymään sisältyvän 125 Jilla leimatun fibriininin perustason määrittämiseksi. Vaihtele-vat määrät RWR:ää ja plasmiinia lisättiin kunkin putken hyytymään, ja kokonaistilavuus säädettiin 1 mliksi 50 mM 10 trispuskurilla, 0,11 MNaClillä ja 2 mM CaCl2:lla. Liukene- misprosentti määritettiin mittaamalla radioleimatun liukoisen fibriinipeptidin vapautuminen. Määrävälein superna-tantista otettiin näyte ilman, että sitä korvattiin, ja laskettiin. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena ja liuke-15 nemisen prosenttiosuus laskettiin seuraavaa kaavaa käyt täen: kumulatiivinen liukenemisen prosenttiosuus hetkenä i = LA = 100*(Si*TVi/SVi + So^co.i-uSi) jossa Si = supernatantin pulssiluku, TVi = putkeen 20 jäävä kokonaistilavuus hetkenä i ja ESVi edustaa aikaisem pien supernatanttinäytteiden summaa ilman tilavuuskorjaus-ta.

Kuvion 2 piirros esittää plasmahyytymän liukenemis-prosenttia RWR:n pitoisuuden funktiona. Kuten kuviosta 2 25 voidaan nähdä, RWR aiheuttaa annoksesta riippuvan merkit sevän plasmiinin aikaansaaman hyytymän liukenemisen lisääntymisen. Merkitsevää hyytymän liukenemista havaittiin myös alhaisessa 10 nM:n pitoisuudessa (molaarinen suhde Mab:a2AP = 0,4:1) 4 tunnin kuluessa. Siten a2AP:n osittai-30 sen inhibition seurauksena on plasmiinin aiheuttaman fib- rinolyysin merkittävä lisäys. Kun RWR:n pitoisuus kasvaa, havaittiin oleellisesti suurempi hyytymän liukeneminen.

« 102812 i

Esimerkki 4

Hyytymän KWR:llä ja t-PA:lla liuottamisen syner- giavaikutuksen määrittäminen t-PA:n ja RWR:n välistä synergiaa tutkittiin, kuten 5 aikaisemminin on selvitetty (Loewe, S., Pharmacol. Rev. 9 (1957) 237 - 242; Berenbaum, M.C., Adv. Cancer 35 (1981) 237 - 242) . Tämä analyysi vaatii laadittavaksi kummankin aineen annos-vastekäyrät. Näitä käyttäen valittiin t-PA-ja RWR-annokset·siten, että ne ovat samantehoiset. Kumman-10 kin aineen osa-annokset yhdistettiin sitten ja määritet tiin niiden yhteisvaikutus hyytymään liuottamiseksi. Laaditaan isoboli, joka osoittaa kummankin aineen sellaisen määrän yksin tai yhdistelmänä, joka tuottaa yhtä suuret liuotusmäärät annettuna ajanjaksona.

15 Vaihtoehtoisesti voidaan vuorovaikutuksen tyypit määritellä laskennallisesti. Annetut yhtä tehokkaat annokset kumpaakin erillistä ainetta A & B, yhtä tehokkaat kummankin aineen osa-annokset (a* ja bj , yhdistelmästä voi todeta: synergistinen, jos aA/A + bt/B < 1, yhteenlaskettu, 20 jos a^/A + bi/B = 1 tai vastakkainen, jos a^/A + b^/B > 1.

Tämän määrittämiseksi kokeellisesti vaihtelevat määrät t-PA:ta ja RWR:ää lisättiin erikseen ja yhdistelmänä koeputkiin, joissa oli leimattuja hyytymiä (kolme rinnak-kaiskoetta, kuten alla esitetty). Liukenemisprosentin kes-25 kiarvo määritettiin kuten esitetty.

Tuoreena pakastettua plasmaa sekoitettiin 125 J-lei-matun fibrinogeenin kanssa ja annettiin hyytyä. Putkiin, joissa oli 0 tai 1 yksikköä t-PA:ta, lisättiin vaihtelevat määrät RWR:ää (0 - 250 nmol lopussa) tai kontrollivasta-30 ainetta (anti-digoksiinia) (0 tai 250 nmol lopussa). Putket » inkuboitiin 37 °C:ssa ja liukenemisprosentti määritettiin vapautuneiden radioleimattujen f ibriinipeptidien perusteella. Annetussa ajassa kontrollihyytymissä RWR yksin käytettynä ei poikennut kontrollivasta-aineesta yksin käytettynä -35 anti-digoksiini Mab 40 - 160 (Mudgett-Hunter, M. et ai., 1β 102812

Mol. Immunol. 22 (1985) - verrattaessa ilman t-PA:ta indusoituihin liukenemismääriin. Kuitenkin t-PA:n läsnä ollessa RWR osoitti suurempaa hyytymän liuottamisen lisääntymisen annosriippuvuutta kuin kokeet, jotka tehtiin t-PA:lla yksin.

5 Kuviossa 3 nähdään t-PA:n ja RWR:n eri pitoisuuksien vaiku tus hyytymän liuottamiseen.

Noin 30 % antiplasmiinista on silloittunut fibriinin kanssa faktori 13 :n välityksellä. Jos silloittunut antiplas-miini ei ole vasta-aineen tavoitettavissa sitomiseen, alen-10 taisi tämä merkittävästi vasta-aineen vaikutusta hyytymän liuottamisnopeuteen. Näin tällaisten jo cc2AP:hen sidottujen vasta-aineiden kanssa muodostuneiden hyytymien tulisi liueta nopeammin kuin hyytymien, joihin vasta-aine on lisätty kloonaamisen jälkeen, s.o. a2AP:n fibriiniin silloittumisen jäl-15 keen. Tämän olettamuksen tarkistamiseksi verrattiin plasman RWR:n kanssa esi-inkubaation jälkeen muodostuneiden hyytymien liukenemista sellaisten hyytymien liukenemiseen, joihin RWR oli lisätty myöhemmin (kuvio 4).

Tuoreena pakastettu plasma sekoitettiin radioleimatun 20 f ibrinogeenin kanssa. Sitten RWR (2 5 nmol lopussa) sekoitet tiin plasman kanssa ja annettiin hyytyä. Muissa kokeissa RWR lisättiin jo muodostuneisiin plasmahyytymiin. Tämän jälkeen hyytymät inkuboitiin puskurissa 24 tuntia 4 °C:ssa. Sitten lisättiin t-PA:ta (0, 0,1 tai 1 U) ja hyytymät inkuboitiin 25 37 °C:ssa. Liukenemisnopeus määritettiin yllä kuvatun mukai sesti. Kuviosta 4 voi nähdä, että sellaisten hyytymien liukenemisnopeus, joihin RWR sai vaikuttaa ennen hyytymän muodostumista, on vain vähän lisääntynyt. Tämä viittaa siihen, että antiplasmiini on toiminnallisesti Mab:n tavoi-30 tettavissa silloittuneessa fibriinissä.

t-PA:n ja RWR:n yhdistelmien liuottamisvaikutuksen määrittämiseksi laadittiin isoboli, kuten aikaisemmissa tutkimuksissa oli ehdotettu (Loewe, 1957; Berenbaum, 1981). Ensin määritettiin t-PA:n ja RWR:n teholtaan yhtä suuret 35 annokset. Radioleimatut plasmahyytymät inkuboitiin 37 °C:ssa 19 102812 käyttäen vaihtelevia t-PA-määriä (O - 0,03 U) tai RWR-määriä (O - 500 nmol). Liukenemisprosentti 48 tunnin kuluttua määritettiin (kuvio 5) . Kontrollihyytymien (ilman kumpaakaan ainetta) liukeneminen tutkimuksen kestäessä oli 9,36 + 0,38 5 %. Tässä kokeessa 0,03 U t-PA:ta ja 500 nmol RWR:ää aiheut tivat yhtä suuren liukenemismäärän (35,5 + 3,1 ja 34,3 + 5,1; keskiarvo + kakv).

Samassa kokeessa testattiin myöskin erilaisia RWR:n ja t-PA:n empiirisiä osayhdistelmiä. Kuviossa 6 esitetään 10 (X) sellaisten molempien aineiden osa-annosten yhdistelmät, jotka aikaansaavat 500 nmoolia RWR tai 0,03 yksikköä t-PA vastaavan liukenemisen. RWR:n ja t-PA:n annosyhdistelmiä, jotka aikaansaivat yhtä suuren liukenemisen (34,2 %, 34,9 %) kuin nämä aineet erikseen, merkitään X:llä. Annosyh-15 distelmiä, joilla oli korkeampi liukenemiskeskiarvo, merki tään 0:11a. Koska t-PA:n ja RWR:n vastaavan tehokkaissa yhdistelmissä on pieni osa kumpaakin ainetta yksinään (s.o. ne ovat selvästi sen linjan alapuolella, joka esittää kuviossa 6 yhteenlaskettua vaikutusta) , on olemassa evidens-20 si näiden kahden aineen välisestä voimakkaasta synergias ta .

Kun tämä keksintö nyt on kokonaan esitetty, antavat alan ammattimiehet arvon sille, että sama voidaan suorittaa käyttäen laajasti koostumuksen, olosuhteiden ja suoritusta-25 pojen ekvivalentteja parametrejä keksinnön hengestä tai suoja-alasta tai mistään sen sovellutusmuodosta poikkeamatta .

Claims (2)

20 102812

1. Menetelmä o2-antiplasmiinin monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka sitoutuu merkittävästi fibrii- 5 niin sidottuun a2-antiplasmiiniin mutta joka ei vähennä kiertävän o2-antiplasmiinin tasoa potilaassa, tunnet-t u siitä, että eläin, joka on muu kuin ihminen, immunisoidaan fibriiniin sidotulla a2-antiplasmiinilla, joka pystyy 10 estämään plasmiinin inhibition, fuusioidaan immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottava solu myeloomasoluun kuolemattomien vasta-ainetta tuottavien hybridisolujen saamiseksi, kloonataan hybridisolut ja valitaan ja subkloonataan 15 ne solut, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta, ja eristetään näin valmistettu vasta-aine.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fibriiniin sidottu a2-antiplasmiini on sidottu silloituksella tai hyytymällä. 2i . 102812