PT1007089E - Anticorpos humanizados anticoagulantes contra o factor ix, para utilização no tratamento da trombose - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS HUMANIZADOS ANTICOAGULANTES CONTRA O FACTOR IX, PARA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DA TROMBOSE"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a anticorpos monoclonais humanizados (mAbs) que se ligam a um factor ou cofactor de coagulação humano e à sua utilização como inibidores auto-limitantes da trombose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em circunstâncias normais, uma lesão, seja esta menor ou maior, em células endoteliais vasculares que revestem um vaso sanguíneo, desencadeia uma resposta hemostática através de uma sequência de eventos normalmente designados como "cascata" da coagulação. A cascata culmina na conversão do fibrinogénio solúvel em fibrina insolúvel que, em conjunto com as plaquetas, forma o coágulo localizado, ou trombo, que impede o extravasamento de componentes sanguíneos. A cicatrização da ferida pode, então, ocorrer, seguida pela dissolução do coágulo e pela reposição da integridade do vaso e do fluxo do sanguíneo.

Os eventos que ocorrem entre a lesão e a formação do coágulo, constituem uma série de reacções cuidadosamente reguladas e ligadas. Resumidamente, circulam no sangue várias 1 proteínas de coagulação do plasma, sob as formas de proenzima inactiva e cofactores. Os complexos enzimáticos activos são montados num local de lesão e são, sequencialmente, activados em proteases de serina, com cada protease de serina sucessiva a catalisar a proenzima subsequente, para activação da protease. Esta cascata enzimática resulta em cada passo aumentar o efeito do passo que lhe sucede. Para uma perspectiva geral da cascata da coagulação, ver o primeiro capítulo de "Thombosis and Hemorrhage", J. Loscalzo e A. Schafer, eds., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra (1994).

Enquanto a coagulação eficiente limita a perda de sangue num local de lesão, a formação imprópria de trombos em veias ou em artérias é uma causa comum de incapacidade e morte. A actividade de coagulação anormal pode resultar em e/ou de patologias ou tratamentos, tais como, enfarte do miocárdio, angina instável, fibrilhação atrial, acidente vascular cerebral, lesão renal, angioplastia coronária transluminal percutânea, coagulação intravascular disseminada, sépsia, embolia pulmonar e trombose venosa profunda. A formação de coágulos em superfícies exógenas de orgãos artificiais, shunts e próteses, tais como, válvulas cardíacas artificiais é, igualmente, problemática.

Os agentes anticoagulantes actualmente aprovados, utilizados no tratamento destas patologias e de outros distúrbios trombóticos e embólicos, incluem heparina de heteropolissacáridos sulfatados e heparina de baixo peso molecular (LMW). Estes agentes são administrados parentericamente e podem causar uma inibição rápida e completa da coagulação pela activação do inibidor da trombina, antitrombina III e inactivação da totalidade dos factores de 2 coagulação.

No entanto, devido à sua potência, a heparina e a heparina LMW têm desvantagens. A principal complicação consiste em hemorragia descontrolada, como um resultado de simples stress de movimento e contactos com objectos fisicos associados ou em locais cirúrgicos e é observada em 1 a 7% dos doentes que recebem infusão continua e em 8 a 14% dos doentes a quem foram administradas doses intermitentes em bolus. Para minimizar este risco, são continuamente retiradas amostras para permitir a monitorização continua dos tempos de coagulação ex vivo, o que contribui, substancialmente para o custo da terapia e para o incómodo do doente.

Para além disso, a gama terapêutica alvo terapêutica para atingir o nivel de eficácia pretendido, sem colocar o doente em perigo de hemorragia, é estreita. A gama terapêutica é de aproximadamente, de 1 a menos de 3 pg de heparina/mL de plasma que resulta em tempos de ensaio do tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT) de cerca de 35 a cerca de 100 segundos. O aumento da concentração de heparina para 3 pg/mL excede a gama alvo e, em concentrações superiores a 4 pg/mL, a actividade de coagulação não é detectável. Deste modo, deve-se proceder com um grande cuidado, para manter as concentrações do plasma do doente dentro da gama terapêutica.

Outro anticoagulante aprovado, com efeito mais lento e prolongado é a varfarina, um derivado da cumarina. A varfarina actua por competição com a modificação pós-tradução dependente da vitamina K, da protrombina e de outros factores de coagulação dependentes da vitamina K. 3

Para a varfarina, assim como para a heparina e heparina LMW, é observado o padrão geral da acção anticoagulante, no qual o sangue é tornado não-coagulável em concentrações apenas ligeiramente mais elevadas do que a gama terapêutica.

Bessos et al. (Thrombosis Research) 40;863-867, 1985, divulgam anticorpos murinos contra o Factor IX. Esses referidos anticorpos murinos têm uma actividade de neutralização limitada contra o Factor IX.

Existe, evidentemente, uma necessidade para um agente anticoagulante que seja eficaz no controlo dos distúrbios trombóticos e embólicos, mas que não cause hemorragia descontrolada ou a sua possibilidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Desta forma, a invenção é um anticorpo monoclonal humanizado de factor anticoagulante, tendo actividade neutralizante auto-limitante contra o factor de coagulação, sendo o anticorpo monoclonal seleccionado do grupo consistindo em SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732.

Outro aspecto da invenção é um fragmento Fab ou um seu fragmento F(ab')2 neutralizante, produzido por eliminanção da região Fc dos anticorpos monoclonais da invenção.

Ainda outro aspecto da invenção é a utilização dos 4 anticorpos da invenção na produção de um medicamento para o tratamento de distúrbios associados a trombos e embolias.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um gráfico dos resultados experimentais, demonstrando a titulação do plasma humano normal com os mAbs BC1 e BC2 murinos anti-Factor IX A figura 2 é um gráfico dos resultados experimentais, demonstrando a titulação do plasma humano normal com os mAbs 9E4(2)F4 e 11G4(1)B9 murinos anti-Factor IX. A figura 3 é um gráfico dos resultados experimentais, demonstrando a titulação do plasma humano normal com os mAbs HFXHC e HFXLC murinos anti Factor X e o mAb HFXI murino anti-factor XI. A figura 4 é um histograma dos resultados experimentais, demonstrando o efeito da heparina, ácido acetilsalicilico e mabs murinos para o Factor IX, sobre o tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT) aos 60 minutos, num modelo da trombose da carótida do rato. A figura 5 é um histograma dos resultados experimentais, demonstrando o efeito da heparina, ácido acetilsalicilico e mabs murino para o Factor IX, sobre o tempo da protrombina aos 60 minutos, num modelo da trombose da carótida do rato. A figura 6 é um histograma dos resultados experimentais, 5 demonstrando o efeito da heparina, ácido acetilsalicilico e mabs murinos para o factor IX na oclusão do fluxo da artéria carótida, num modelo da trombose da carótida do rato. A figura 7 é um histograma dos resultados experimentais, demonstrando o efeito da heparina, ácido acetilsalicilico e mabs murinos para o factor IX sobre o peso do trombo, num modelo da trombose da carótida do rato. A figura 8 é um histograma dos resultados experimentais, demonstrando o efeito da heparina, mab BC2 murino para o

Factor IX, um mab quimérico para o Factor IX e mAbs humanizados para o factor IX, sobre o aPTT aos 60 minutos, num modelo da trombose da carótida do rato. A figura 9 é um histograma dos resultados experimentais, demonstrando o efeito da heparina, mab BC2 murino para o

Factor IX, um mab quimérico para o Factor IX e mAbs humanizados para o factor IX, sobre o peso do trombo, num modelo da trombose da carótida do rato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO monoclonais 249417, SB humano. É, SB 249417 A presente invenção proporciona anticorpos humanizados SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 257731 e SB 257732 dirigidos contra o Factor IX particularmente, preferido o anticorpo monoclonal anti-Factor IX humano. 6

Estes produtos são úteis em composições terapêuticas e farmacêuticas para distúrbios embólicos e trombóticos associados ao enfarte do miocárdio, angina instável, fibrilhação atrial, acidente vascular cerebral, lesão renal, embolia pulmonar, trombose venosa profunda, angioplastia coronária transluminal percutânea, coagulação intravascular disseminada, sépsia, orgãos artificiais, shunts ou próteses.

Como aqui utilizado, o termo "actividade neutralizadora auto-limitante" refere-se à actividade de um anticorpo que se liga ao factor de coagulação IX humano e inibe a trombose, de forma que seja produzida uma modulação limitada da coagulação. "Modulação limitada da coagulação" é definida como um aumento do tempo de coagulação, como medido pelo prolongamento do tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT), em que o plasma permanece coagulável, com o aPTT a atingir um valor máximo, apesar das concentrações crescentes de anticorpo monoclonal. Esta modulação limitada da coagulação contrasta com facto do plasma ser tornado não-coagulável e apresentar um aPTT infinito na presença de concentrações crescentes de heparina. De um modo preferido, o valor máximo do aPTT dos métodos da invenção encontra-se dentro da gama terapêutica da heparina. De um modo muito preferido, o aPTT máximo está dentro da gama de cerca de 35 segundos a cerca de 100 segundos, a qual corresponde de cerca de 1,5 vezes a cerca de 3,5 vezes o valor do aPTT do controlo normal. Numa forma de realização da invenção, o aPTT é prolongado sem significativo prolongamento do tempo da protrombina (PT). "Anticorpo alterado" refere-se a uma proteína codificada por região codificante alterada de uma imunoglobulina, a qual 7 célula hospedeira numa pode ser obtida por expressão seleccionada. Esses anticorpos alterados são anticorpos modificados (e. g., anticorpos quiméricos ou humanizados) ou fragmentos de anticorpo sem a totalidade ou parte de uma região constante de uma imunoglobulina, e. g., Fv, Fab, Fab' ou F(ab')2 e semelhantes. "Região codificante alterada de uma imunoglobulina" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo alterado da invenção. Quando o anticorpo alterado é um anticorpo ligado a uma CDR ou humanizado, as sequências que codificam as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de uma imunoglobulina não-humana são inseridas num primeiro parceiro da imunoglobulina, compreendendo sequências de estrutura variável humanas. Opcionalmente, o primeiro parceiro da imunoglobulina é ligado operativamente a um segundo parceiro da imunoglobulina. "Primeiro parceiro da imunoglobulina" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma estrutura humana ou uma região variável de uma imunoglobulina humana, na qual as regiões codificando CDR nativas (ou de ocorrência natural) são substituídas pelas regiões codificando CDR de um anticorpo dador. A região variável humana pode ser uma cadeia pesada de imunoglobulina, uma cadeia leve (ou ambas as cadeias), um análogo ou fragmentos funcionais. Essas regiões CDR, localizadas dentro da região variável de anticorpos (imunoglobulinas) podem ser determinadas por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, Kabat et al. em "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) divulga regras para localizar CDRs. Além disso, são conhecidos programas de computador que são úteis para a identificação de regiões/estruturas de CDR. "Segundo parceiro da imunoglobulina,, refere-se a uma outra sequência nucleotidica codificando uma proteína ou péptido, com a qual o primeiro parceiro da imunoglobulina é fundido na grelha de leitura correcta ou através de uma sequência de ligação convencional opcional (i. e., ligado operativamente). De um modo preferido, este é um gene para uma imunoglobulina. 0 segundo parceiro da imunoglobulina pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos codificando a região constante completa para o mesmo (i. e., homóloga, em que os primeiros e segundos anticorpos alterados são derivados da mesma fonte) ou um anticorpo adicional (i. e., heterólogo) de interesse. Este pode ser uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de uma imunoglobulina (ou ambas as cadeias como parte de um único polipéptido). 0 segundo parceiro da imunoglobulina não está limitado a uma classe ou isotipo particular de imunoglobulina. Para além disso, o segundo parceiro da imunoglobulina pode compreender parte de uma região constante de uma imunoglobulina, tal como encontrada num Fab ou num F(ab)2 (i. e., uma parte distinta de uma região constante ou região de estrutura humana apropriada). Esse segundo parceiro da imunoglobulina pode compreender, igualmente, uma sequência codificando uma proteína de membrana integral exposta na superfície externa de uma célula hospedeira, e. g., como parte de uma biblioteca de apresentação em fagos ou uma sequência codificando uma proteína para detecção analítica ou de diagnóstico, e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, etc.

Os termos Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' ou F(ab')2 são utilizados com os seus significados convencionais. Ver, e. g., Harlow, et 9 al. em "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).

Como aqui utilizado, um "anticorpo modificado" descreve um tipo de anticorpo alterado, i. e., um anticorpo sintético completo (e. g., um anticorpo quimérico ou humanizado em contraste com um fragmento de anticorpo), na qual uma porção dos domínios variáveis da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo aceitador seleccionado é substituída por partes análogas de um ou mais anticorpos dadores que têm a especificidade do epitopo seleccionado. Por exemplo, essas moléculas podem incluir anticorpos caracterizados por uma cadeia pesada humanizada associada com uma cadeia leve não modificada (ou cadeia leve quimérica) ou vice-versa. Os anticorpos modificados podem ser, igualmente, caracterizados pela alteração das sequências de ácidos nucleicos que codificam as regiões da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo aceitador, de forma a conservar a especificidade de ligação do anticorpo dador. Estes anticorpos podem compreender a substituição de uma ou mais CDRs (de um modo preferido todas) do anticorpo aceitador em CDRs de um anticorpo dador aqui descrito.

Um "anticorpo quimérico" refere-se a um tipo de anticorpo modificado que contém uma região variável de ocorrência natural que a (cadeia leve e cadeias pesadas), derivado de um anticorpo dador em associação com as regiões constantes da cadeia leve e pesada, derivadas de um anticorpo aceitador.

Um "anticorpo humanizado" refere-se a um tipo de anticorpo modificado tendo as suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina dadora não-humana, sendo as restantes partes da molécula 10 derivadas da imunoglobulina derivadas de um ou mais imunoglobulinas humanas. Além disso, os residuos de suporte da estrutura podem ser alterados, de forma a conservar a afinidade de ligação. Ver, e. g., Queen et al., Proc. Natl Acad Sei USA, 86, 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology. 9, 421 (1991) . O termo "anticorpo dador" refere-se a um anticorpo monoclonal ou recombinante que contribui com as sequências de ácidos nucleicos das suas regiões variáveis, CDRs ou de outros fragmentos funcionais ou seus análogos, para um primeiro parceiro da imunoglobulina, de forma a proporcionar a região codificante alterada de uma imunoglobulina e o resultante anticorpo alterado expresso com a especificidade antigénica e a actividade de neutralização caracteristica do anticorpo dador. Um anticorpo dador adequado para utilização nesta invenção é o anticorpo monoclonal neutralizante auto-limitante murino designado como BC2. Outros anticorpos dadores adequado incluem os anticorpos monoclonais neutralizantes auto-limitantes murinos designados como BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC e HFXI. O termo "anticorpo aceitador" refere-se a anticorpos monoclonais ou recombinantes, heterólogos em relação ao anticorpo dador, os quais contribuem com a totalidade ou com uma porção das sequências de ácidos nucleicos codificando as suas regiões de estrutura de cadeia pesada e/ou leve e/ou as suas regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve para o primeiro parceiro da imunoglobulina. De um modo preferido, o anticorpo aceitador é um anticorpo humano.

As "CDRs" são definidas como as sequências de aminoácidos 11 das regiões determinantes da complementaridade de um anticorpo, as quais são as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve da imunoglobulina. Ver, e. g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existem três CDRs de cadeia pesada e três de cadeia leve ou regiões CDR, na porção variável de uma imunoglobulina. Deste modo, "CDRs" como aqui utilizado refere-se à totalidade das três CDRs de cadeia pesada ou à totalidade das três CDRs de cadeia leve ou à totalidade das CDRs, tanto de cadeia pesada como de cadeia leve, se apropriado.

As CDRs proporcionam a maioria dos residuos de contacto para a ligação do anticorpo ao antigénio ou epitopo. As CDRs de interesse nesta invenção são derivadas das sequências variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo dador e incluem os análogos das CDRs de ocorrência natural, em que os análogos também partilham ou conservam, a mesma especificidade de ligação e/ou capacidade de neutralização do antigénio, tal como do anticorpo dador do qual estas foram obtidas.

Por "partilhar a especificidade de ligação ou capacidade neutralização do antigénio" entende-se, por exemplo, que, embora o mAb BC2 possa ser caracterizado por um determinado nivel de actividade de neutralização auto-limitante, uma CDR codificada por uma sequência de ácidos nucleicos do BC2 num ambiente estrutural apropriado, pode ter uma actividade mais baixa ou mais elevada. É esperado que as CDRs do BC2 nesses ambientes irão, contudo, reconhecer o(s) mesmo(s) epitopo(s) que o BC2.

Um "fragmento funcional" é uma sequência variável parcial 12 de cadeia pesada ou leve (e. g., eliminações menores no terminal amino ou carboxilo da região variável da imunoglobulina) que conserva a mesma especificidade de ligação e/ou capacidade de neutralização do antigénio, a partir do anticorpo do qual o fragmento foi obtido.

Um "análogo" é uma sequência de aminoácidos modificada em, pelo menos, um aminoácido, em que a referida modificação pode ser quimica ou uma substituição ou um rearranjo de alguns aminoácidos (i. e., não mais do que 10), em que a modificação permite que a sequência de aminoácidos conserve as caracteristicas biológicas, e. g., especificidade para o antigénio e afinidade elevada, da sequência não modificada. Os análogos caracteristicos incluem mutações silenciosas que podem ser construídas, através de substituições, de forma criar determinados locais de restrição de endonuclease, dentro ou na proximidade de regiões codificando CDR.

Os análogos podem, igualmente, surgir como variações alélicas. Uma "variação ou modificação alélica" é uma alteração na sequência de ácidos nucleicos codificando as sequências de aminoácidos ou peptídicas da invenção. Essas variações ou modificações podem ser devidas à degenerescência do código genético ou podem ser deliberadamente modificadas de forma a proporcionar as caracteristicas pretendidas. Estas variações ou modificações podem ou não resultar em alterações em qualquer sequência de aminoácidos codificada. O termo "agentes efectores" refere-se a moléculas veiculo não-proteicas, às quais os anticorpos alterados e/ou as cadeias leves ou pesadas naturais ou sintéticas do anticorpo dador ou 13 outros fragmentos do anticorpo dador podem associar-se por meios convencionais. Esses veículos não-proteicos podem incluir veiculos convencionais utilizados no campo diagnóstico, e. g., poliestireno ou outras esferas plásticas, polissacáridos, e. g., como utilizado no sistema BIAcore (Pharmacia) ou outras substâncias não-proteicas úteis no campo médico e seguras para administração a seres humanos e animais. Outros agentes efectores podem incluir um macrociclo, para quelar um átomo de um metal pesado ou isótopos radioactivos. Esses agentes efectores podem ser, igualmente, úteis no aumento do tempo de semi-vida dos anticorpos alterados, e. g., polietilenoglicol.

Um mAb neutralizante auto-limitante, exemplificativo, é o mAb BC2, um anticorpo murino que pode ser utilizado para o desenvolvimento de uma molécula quimérica ou humanizada. 0 mAb BC2 é caracterizado por uma actividade inibitória auto-limitante sobre o tempo de coagulação. Como medido pelo ensaio do aPTT, o efeito do mAb BC2 sobre o tempo de coagulação apresenta um valor máximo de cerca de 100 segundos. O mAb BC2 liga-se, igualmente, ao Factor IXa, inibe a conversão do Factor IX em IXa e inibe a actividade do Factor IXa. São necessários cofactores divalentes metálicos para a actividade, com o mAb a apresentar uma maior preferência pelo Ca2+ em relação ao Mn2+. O IC50 observado no ensaio do aPTT é, aproximadamente, 50 nM. O mAb BC2 apresenta uma reactividade cruzada de espécie com o rato e é do isotipo IgG2a.

Outros anticorpos dadores desejáveis são os mAbs murinos, BC1, 9E4(2)F4 e 11G4(1)B9. Estes mAbs são caracterizados por uma actividade inibitória auto-limitante sobre o tempo de coagulação. Como medido pelo ensaio do aPTT, o efeito destes 14 mAbs sobre o tempo de coagulação apresenta um valor máximo de cerca de 90 a 100 segundos para 9E4(2)F4 e cerca de 80 segundos para 11G4(1)B9. O mAb BC1 liga-se, igualmente, ao Factor IXa, inibe a actividade do Factor IXa mas não inibe a conversão do Factor IX em IXa. Não é necessário um cofactor metálico para a sua actividade. O IC5o observado para o BC1 no ensaio do aPTT é, aproximadamente, 35 nM. O mAb BCl é do isotipo IgGl.

Ainda um outro anticorpo dador desejável caracterizado por uma actividade inibitória auto-limitante sobre o tempo de coagulação é o mAb HFXLC murino. Como medido pelo ensaio do aPTT, o efeito do mAb HFXLC sobre o tempo de coagulação apresenta um máximo valor de cerca de 50 a 60 segundos. O mAb HFXLC liga-se à cadeia leve do Factor X e inibe a actividade do Factor X/Xa. O IC50 observado no ensaio do aPTT é de, aproximadamente, 20 nM.

Ainda outro anticorpo dador desejável caracterizado por uma actividade inibitória auto-limitante sobre o tempo de coagulação é o mAb murino, HFXI. Como medido pelo ensaio do aPTT, o efeito do mAb HFXI sobre o tempo de coagulação apresenta um valor máximo de cerca de 100 segundos. O mAb HFXLC liga-se ao Factor XI e inibe a actividade do Factor Xl/XIa. O IC50 observado no ensaio do aPTT é de, aproximadamente, 30 nM. Não pretendendo estar limitado a qualquer teoria particular, em termos de mecanismo da acção, estes mAbs parecem regular a coagulação através de um mecanismo não-competitivo ou alostérico, pelo que é apenas atingida inibição parcial. A presente invenção inclui, igualmente, a utilização de 15 fragmentos Fab de fragmentos F(ab')2 derivados dos mAbs da invenção dirigidos contra o factor ou cofactor de coagulação humano apropriado. Estes fragmentos são úteis como agentes tendo actividade auto-limitante e neutraliza contra o factor de coagulação IX. Um fragmento Fab contém a cadeia leve completa e a porção amino terminal da cadeia pesada. Um fragmento F(ab')2 é o fragmento formado por dois fragmentos Fab ligados por ligações persulfureto. Os fragmentos Fab e os fragmentos F(ab')2 podem ser obtidos por meios convencionais, e. g., quebra do mAb com as enzimas proteoliticas apropriadas, papaina e/ou pepsina ou por métodos recombinantes. 0 fragmento Fab e F(ab')2 dos MAbS da invenção são, em si, úteis como agentes terapêuticos, profilácticos ou de diagnóstico.

As sequências de ácidos nucleicos do mAb desta invenção ou seus fragmentos, codificando as sequências peptídicas variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada são, igualmente, úteis para a introdução mutagénica de modificações específicas dentro das sequências de ácido nucleico que codificam as regiões CDRs ou de estrutura e para incorporação da sequência de ácidos nucleicos modificada ou de fusão, resultante, num plasmídeo para expressão. Por exemplo, podem ser utilizadas substituições específicas na sequência nucleotídica das regiões de estrutura e codificando CDR, para criar locais de enzima de restrição que facilitem a inserção de regiões CDR e/ou de estrutura mutagenizadas.

As sequências nucleicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do BC2 estão listadas nas SEQ ID Nos. 5 e 7. As sequências CDR desta região estão listadas nas SEQ ID Nos. 8, 9 e 10 . 16

As sequências nucleicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve do BC2 estão listadas nas SEQ ID Nos. 6 e 11. As sequências CDR desta região encontram-se listadas nas SEQ ID Nos. 12, 13 e 14.

Tendo em consideração a degenerescência do código genético, podem ser construídas várias sequências codificantes que codificam as sequências de aminoácido das cadeias pesada e leve e as sequências CDR variáveis da invenção, assim como os fragmentos funcionais e os seus análogos que partilham a especificidade para o antigénio do anticorpo dador. As sequências de ácido nucleico isoladas desta invenção, ou seus fragmentos, codificando as sequências peptídicas ou as CDRs de cadeia variável, podem ser utilizadas para produzir, e. g., outros anticorpos modificados desta invenção quando operativamente combinadas com um segundo parceiro da imunoglobulina.

Deve ser salientado que, para além das sequências de ácidos nucleicos isoladas codificando porções do anticorpo alterado e dos anticorpos aqui descrito, são abrangidas pela presente invenção outras sequências de ácido nucleico, tais como as complementares às sequências codificando CDR nativas ou complementares às regiões de estrutura humanas modificadas na proximidade das regiões codificando CDR. As sequências de ADN úteis incluem as sequências que hibridam com as sequências de ADN, sob condições de hibridação rigorosas. Ver, T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pp. 387-389. Um exemplo de uma dessas condições de hibridação rigorosas é a hibridação em SSC 4X a 17 65°C, seguida por uma lavagem em SSC 0,1X a 65 °C, durante uma hora. Alternativamente, uma condição de hibridação rigorosa caracteristica é 50% formamida, SSC 4X a 42 °C. De um modo preferido, estas sequências de ADN hibridantes têm, pelo menos, cerca de 18 nucleótidos de comprimento, i. e., cerca do tamanho de uma CDR. É particularmente preferido o anticorpo humanizado SB 249413, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 31 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N° . 44. É,

igualmente, particularmente preferido o anticorpo humanizado SB 249415, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N° . 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N° . 57. É,

igualmente, particularmente preferido o anticorpo humanizado SB 249416, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 62. É,

igualmente, particularmente preferido o anticorpo humanizado SB 249417, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 74. É,

igualmente, particularmente preferido o anticorpo humanizado SB 257731, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 52 e a a cadeia leve tem a

sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 78. É, igualmente, particularmente preferido o anticorpo humanizado SB 257732, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N° . 89 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID N°. 99.

Será entendido pelos especialista na técnica que um 18 anticorpo manipulado pode ser adicionalmente modificado por alterações nos aminoácidos do domínio variável, sem, necessariamente, afectar a especificidade e a elevada afinidade do anticorpo dador (i. e., um análogo). É previsível que os aminoácidos das cadeias pesada e leve podem ser substituídos por quaisquer outros aminoácidos nas estruturas ou CDRs dos domínios variáveis ou em ambos. Estas substituições podem ser fornecidas pelo anticorpo dador ou por sequências de consenso de um subgrupo particular.

Além disso, a região constante pode ser alterada para aumentar ou diminuir as propriedades selectivas das moléculas desta invenção. Por exemplo, dimerização, ligação a receptores Fc ou a capacidade de ligação e activação do complemento (ver, e. g., Angal et al., Mol. Immunol, 30, 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269. 3469-3474 (1994), Winter et al., documento EP 307434-B).

Um anticorpo alterado que é um anticorpo quimérico, diferencia-se dos anticorpos humanizados acima descritos por fornecer as regiões variáveis completas de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo dador não-humano, incluindo regiões de estrutura, em associação com regiões constantes de imunoglobulinas humanas para ambas as cadeias. É previsível que os anticorpos quiméricos que conservem sequências não-humanas adicionais, em relação aos anticorpos humanizados desta invenção, possam promover uma resposta imunitária significativa em seres humanos.

Esses anticorpos são úteis na prevenção e no tratamento de distúrbios trombóticos e embólicos, como discutido abaixo. 19

Uma hibridoma produzindo um mAb dador seleccionado, o anticorpo murino BC2, é clonado de um modo convencional e o ADN das suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve, obtidas por técnicas conhecidas de um especialista na técnica, e. g., as técnicas descritas em Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) . As regiões pesadas e leves variáveis do BC2, contendo, pelo menos, as regiões codificando CDR e as porções das regiões estrutura de domínio variável leve e/ou pesada do mAb aceitador necessárias para conservar a especificidade de ligação do mAb dador, assim como as restantes partes derivadas da imunoglobulina da cadeia de anticorpo derivada de uma imunoglobulina humana, são obtidas utilizando iniciadores polinucleotídicos e transcritase reversa. As regiões codificando CDR são identificadas utilizando de uma base de dados conhecida e por comparação com outros anticorpos.

Pode então, ser preparado um anticorpo quimérico murganho/humano e ensaiado para a capacidade de ligação. Esse anticorpo quimérico contém as regiões VH e VL completas do anticorpo dador não-humano, em associação com as regiões constantes de Ig humanas para ambas as cadeias.

As regiões de estrutura homólogas de uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo humano são identificadas utilizando as bases de dados computadorizadas, e. g., KABAT® e é seleccionado um anticorpo humano tendo homologia com o BC2, como anticorpo aceitador. As sequências das regiões variáveis de cadeia pesada sintéticas contendo as regiões codificando CDR do BC2, dentro das estruturas dos anticorpos humanos são concebidas 20 com substituições opcionais de nucleótidos nas regiões da estrutura, de forma a incorporar locais de restrição. Esta sequência concebida é, então, sintetizada, utilizando oligómeros sintéticos longos. Alternativamente, a sequência concebida pode ser sintetizada com oligonucleótidos sobreponíveis, amplificada pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) e corrigida para erros. Pode ser concebida uma região de estrutura variável de cadeia leve adequada, de uma forma semelhante.

Pode ser obtido um anticorpo humanizado a partir do anticorpo quimérico ou, de um modo preferido, preparado sinteticamente inserindo, apropriadamente, as regiões do mAb dador, codificando CDR das cadeias pesadas e leves, dentro da estrutura de cadeia pesada e leve seleccionada. Alternativamente, pode ser preparado um anticorpo humanizado da invenção, utilizando técnicas padrão de mutagénese. Deste modo, o anticorpo humanizado resultante contém regiões de estrutura humanas e regiões codificando CDR do mAb dador. Pode ser realizada uma manipulação subsequente dos resíduos da estrutura. 0 anticorpo humanizado resultante pode ser expresso em células hospedeiras recombinantes, e. g., COS, CHO ou células de mieloma. Podem ser preparados outros anticorpos humanizados, utilizando esta técnica em outros anticorpos não-humanos auto-limitantes, neutralizantes, de elevada afinidade, adequados, específicos para o Factor IX ou específicos para outros factores de coagulação. É produzido um vector de expressão ou plasmídeo recombinante convencional, colocando estas sequências codificantes para o anticorpo alterado, em associação operativa com sequências de controlo, reguladoras, convencionais, capazes 21 de controlar a replicação e a expressão em, e/ou a secreção a partir de uma célula hospedeira. As sequências reguladoras incluem sequências promotoras, e. g., promotor do CMV, e sequências de sinal que podem ser derivadas de outros anticorpos conhecidos. De um modo semelhante, pode ser produzido um segundo vector de expressão, tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia complementar, leve ou pesada, de anticorpo. De um modo preferido, este segundo vector de expressão é idêntico ao primeiro, excepto no que respeita às sequências codificantes e aos marcadores seleccionáveis, de forma a assegurar, tanto quanto possivel, que cada cadeia de polipéptido é funcionalmente expressa. Alternativamente, as sequências codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo alterado podem estar presentes num único vector.

Uma célula hospedeira seleccionada é co-transfectada por técnicas convencionais, tanto com o primeiro como com o segundo vector (ou simplesmente transfectada por um único vector), de forma a criar a célula hospedeira transfectada da invenção compreendendo ambas as cadeias leves e pesadas, recombinantes ou sintéticas. A célula transfectada é, então, cultivada por técnicas convencionais, para produzir o anticorpo modificado da invenção. 0 anticorpo humanizado que inclui a associação da cadeia pesada e/ou da cadeia leve recombinante são rastreadas a partir da cultura por um ensaio apropriado tal como ELISA ou RIA. Podem ser utilizadas técnicas convencionais semelhantes para construir outros anticorpos e moléculas alteradas desta invenção.

Os vectores adequados para os passos de clonagem e subclonagem utilizados nos métodos e na construção das 22 composições desta invenção podem ser seleccionados por um especialista na técnica. Por exemplo, pode ser utilizada a série pUC de vectores de clonagem, tal como o pUC19, a qual se encontra comercialmente disponível a partir de fornecedores, tais como Amersham ou Pharmacia. Adicionalmente, pode ser utilizado para a clonagem qualquer vector que tenha capacidade de se replicar com facilidade, tenha uma abundância de locais clonagem e de genes seleccionáveis (e. g., resistência a antibiótico) e que seja facilmente manipulado. Deste modo, a selecção do vector de clonagem não é um factor limitante nesta invenção.

De um modo semelhante, os vectores utilizados para a expressão dos anticorpos modificados de acordo com esta invenção podem ser seleccionados por um especialista na técnica, a partir de qualquer vector convencional. Os vectores contêm, igualmente, sequências reguladoras seleccionadas (tais como promotores do CMV) que controlam a replicação e a expressão de sequências de ADN heterólogo nas células do hospedeiro seleccionado. Estes vectores contêm as acima descritas sequências de ADN, as quais codificam para o anticorpo modificado ou para a região codificante da imunoglobulina alterada. Para além disso, os vectores podem incorporar as sequências de imunoglobulina seleccionadas modificadas pela inserção de locais de restrição pretendidos para uma manipulação fácil.

Os vectores de expressão podem ser, igualmente, caracterizados por genes adequados para amplificar a expressão das sequências de ADN heterólogas, e. g., o gene da redutase do di-hidrofolato de mamifero (DHFR). Outras sequências de vector preferidas incluem uma sequência sinal poli A, tal como a da 23 hormona do crescimento bovino (BGH) e a sequência promotora Da betaglobina (betaglopro). Os vectores de expressão úteis aqui podem ser sintetizados por técnicas bem conhecidas dos especialistas nesta técnica.

Os componentes desses vectores, e. g., replicões, genes de selecção, intensificadores, promotores, sequências de sinal e semelhantes, podem ser obtidos a partir de fontes comerciais ou naturais ou sintetizados por processos conhecidos, para utilização no controlo da expressão e/ou secreção do produto do ADN recombinante num hospedeiro seleccionado. Podem ser, igualmente, seleccionados com esta finalidade, outros vectores de expressão apropriados, dos quais são conhecidos na técnica numerosos tipos para expressão em mamíferos, bacteriana, em insectos, em leveduras e em fungos. A presente invenção abrange, igualmente, uma linha celular transfectada com um plasmideo recombinante contendo as sequências codificantes dos anticorpos modificados ou das suas moléculas de imunoglobulina alteradas. As células hospedeiras úteis para a clonagem e outras manipulações destes vectores de clonagem são, igualmente, convencionais. No entanto, de um modo mais desejável, são utilizadas células de várias estirpes de E. coli, para a replicação dos vectores de clonagem e outros passos, na construção de anticorpos alterados desta invenção. Células hospedeiras ou as linhas celulares adequadas para a expressão do anticorpo modificado ou do anticorpo alterado da invenção são, de um modo preferido, células de mamífero tais como CHO, COS, uma célula de fibroblasto (e. g., 3T3) e células miéloides e, de um modo mais preferido, uma célula CHO ou 24 miéloide. Podem ser utilizadas células humanas permitindo, deste modo, que a molécula seja modificada com padrões de glicosilação humana. Alternativamente, podem ser utilizadas outras linhas celulares eucariotas. A selecção de células hospedeiras de mamifero adequadas e os métodos para a transformação, cultura, amplificação, rastreio e produção de produto e purificação são conhecidos na técnica. Ver, e. g., Sambrook et ai., supra.

As células bacterianas podem ser úteis como células hospedeiras adequadas para a expressão de Fabs recombinantes da presente a invenção (ver, e. g., Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130, 151-188 (1992)). No entanto, devido à tendência da proteínas expressas em células bacterianas se encontrarem sob uma forma não dobrada ou inadequadamente dobrada ou sob uma forma não-glicosilada, qualquer Fab recombinante produzido numa célula bacteriana deverá ser submetido a rastreio para a retenção da capacidade de ligação ao antigénio. Se a molécula expresso pela célula bacteriana foi produzida sob uma forma adequadamente dobrada, essa célula bacteriana será um hospedeiro desejável. Por exemplo, várias estirpes de E. coli, utilizadas para expressão, são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia. Podem ser, igualmente, utilizadas várias estirpes de B. subtilis, Streptomyces, outros bacilos e semelhantes.

Quando pretendido, encontram-se, igualmente disponíveis, estirpes de células de levedura conhecidas dos especialistas na técnica como células hospedeiras, assim como células de insecto, e. g. Drosophila e Lepidoptera e sistemas de expressão virais. Ver, e. g. Miller et al., Genetic Engineering, 8, 277-298, Plenum Press (1986) e referências ai citadas. 25

Os métodos gerais pelos quais os vectores da invenção podem ser construídos, os métodos de transfecção necessários para produzir as células hospedeiras da invenção e os métodos de cultura necessários para produzir o anticorpo alterado da invenção a partir dessa célula hospedeira são, na totalidade, técnicas convencionais. Do mesmo modo, uma vez produzidos, os anticorpos alterados da invenção podem ser purificados a partir dos conteúdos da cultura celular, de acordo com processos padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gel e semelhantes. Essas técnicas encontram-se dentro da especialidade da técnica e não limitam esta invenção.

Ainda um outro método de expressão dos anticorpos humanizados pode utilizar a expressão num animal transgénico, tal como descrito na Patente U.S. N° 4873316. Isto refere-se a um sistema de expressão que utiliza o promotor da caserna do animal, o qual, quando incorporado transgenicamente num mamífero, permite à fêmea produzir a proteína recombinante pretendida no seu leite.

Uma vez expresso pelo método pretendido, o anticorpo modificado é, então, examinado para a actividade in vitro, pela utilização de um ensaio apropriado. Presentemente, são utilizados formatos de ensaio de ELISA convencional para avaliar a ligação qualitativa e quantitativa do anticorpo modificado ao Factor IX. Adicionalmente, pode ser, igualmente, utilizado outro ensaio in vitro para verificar a eficácia de neutralização antes de estudos clínicos humanos subsequentes, realizados para avaliar a persistência do anticorpo modificado no corpo, apesar 26 dos mecanismos normais de depuração.

Podem ser implementadas modificações menores na estrutura da região variável para efectuar grandes aumentos na ligação do antigénio na ausência de uma imunogenicidade apreciável aumentada para o receptor. Esses anticorpos modificados podem tratar, efectivamente, um humano para estados mediados por factores de coagulação. Esses anticorpos podem ser, igualmente, úteis no diagnóstico desses estados.

Alternativamente, pode ser administrado ácido acetilsalicilico em combinação com o anticorpo monoclonal factor anti-coagulação da invenção. Em alguns casos, a terapia de combinação baixa a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal factor anti-coagulação. A resposta terapêutica induzida pela utilização das moléculas desta invenção é produzida pela ligação ao respectivo factor de coagulação e pela subsequente inibição auto-limitante da cascata de coagulação. Deste modo, as moléculas da presente invenção, quando em preparações e formulações apropriadas para a utilização terapêutica, são altamente desejáveis para pessoas susceptiveis a ou sofrendo de actividade de coagulação anormal associada com, mas não limitada a, enfarte do miocárdio, angina instável, fibrilhação atrial, acidente vascular cerebral, lesão renal, embolia pulmonar, trombose venosa profunda e implantes de orgãos artificiais e prostéticos.

Os anticorpos alterados, anticorpos e os seus fragmentos, desta invenção podem ser, igualmente, utilizados em conjunto com outros anticorpos, particularmente mAbs humanos reactivos com 27 outros marcadores (epitopos) responsáveis pelo estado contra o qual o anticorpo modificado da invenção é dirigido.

Acredita-se que os agentes terapêuticos desta invenção sejam desejáveis para o tratamento de estados de coagulação anormais, desde cerca de 1 dia a cerca de 3 semanas ou à medida das necessidades. Isto representa um avanço considerável em relação aos anticoagulantes heparina e varfarina actualmente utilizados. A dose e duração de tratamento referem-se à duração relativa das moléculas da presente invenção na circulação humana e podem ser ajustadas por um especialista na técnica, dependendo do estado a ser tratado e da saúde geral do doente. 0 modo de administração do agente terapêutico da invenção pode ser por qualquer via adequada que distribua o agente ao hospedeiro. Os anticorpos alterados, anticorpos, anticorpos modificados e seus fragmentos, e composições farmacêuticas da invenção são, particularmente, úteis para administração parentérica, i. e., subcutaneamente, intramuscularmente, intravenosamente ou intranasalmente.

Os agentes terapêuticos da invenção podem ser preparados como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do anticorpo modificado (humanizado) da invenção, como um ingrediente activo num veiculo farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção podem conter, igualmente, ácido acetilsalicílico. No agente profiláctico da invenção, é preferida uma suspensão aquosa ou solução contendo o anticorpo modificado, de um modo preferido, tamponado em pH fisiológico, sob uma forma pronta para injecção. As composições de administração parentérica irão, normalmente, 28 compreender uma solução do anticorpo modificado da invenção ou uma sua mistura dissolvida num veiculo farmaceuticamente aceitável, de um modo preferido, um veiculo aquoso. Podem ser utilizados vários veiculos aquosos, e. g., soro fisiológico a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções estão estéreis e, geralmente, sem matéria em suspensão. Estas soluções podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas (e. g., filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como necessário para as aproximar das condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste do pH e tamponantes, etc. A concentração do anticorpo da invenção nessas formulações farmacêuticas pode variar significativamente, i. e., de menos de cerca de 0,5%, normalmente a 1% ou inferior, a tanto como 15 ou 20% em peso e será seleccionada com base, principalmente, nos volumes dos fluidos, viscosidade, etc., de acordo com o modo particular de administração seleccionado.

Deste modo, uma composição farmacêutica da invenção para injecção intramuscular pode ser preparada de forma a conter 1 mL de água estéril tamponada e entre cerca de 1 ng a cerca de 100 mg, e. g., cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou, de um modo mais preferido, de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de um anticorpo modificado da invenção. De um modo semelhante, pode ser preparada uma composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa de forma a conter cerca de 250 mL de solução de Ringer estéril e de cerca de 1 mg a cerca de 30 mg e, de um modo preferido, 5 mg a cerca de 25 mg de um anticorpo modificado da invenção. São bem conhecidos ou serão evidentes para os especialista na técnica, métodos efectivos para a preparação de composições parentericamente administráveis e são descritos mais 29 detalhadamente em, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. É preferido que o agente terapêutico da invenção, quando numa preparação farmacêutica, se encontre presente sob formas de doses unitárias. A dose apropriada terapeuticamente eficaz pode ser facilmente determinada pelos da especialista na técnica. Para tratar, efectivamente, um distúrbio trombótico ou embólico num humano ou em outro animal, deve ser administrada parentericamente, de um modo preferido i.v. ou i.m, uma dose de, aproximadamente, 0,1 mg a, aproximadamente, 20 mg por kg de peso corporal, de uma proteína ou de um anticorpo desta invenção. Essa dose pode ser, se necessário, repetida em intervalos de tempo apropriados, seleccionados como apropriado por um médico, durante a resposta trombótica.

Os anticorpos, anticorpos alterados ou seus fragmentos aqui descritos podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo adequado, antes da utilização. Esta técnica demonstrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais e podem ser utilizadas técnicas de liofilização e de reconstituição conhecidas na técnica. A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos específicos, não-limitantes. 30

Exemplo 1

Preparação e Rastreio de Anticorpos Monoclonais Anti-factor IX

Foram injectados murganhos fêmea Balb/C com o factor IX humano purificado como descrito em Jenny, R. et al., Prep. Biochem. 16, 227-245 (1986). Tipicamente, cada murganho recebeu uma injecção inicial de 100 pg proteína dissolvida em 0,15 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e misturada com 0. 15 mL de adjuvante de Freund completo. Foram administradas imunizações de reforço de 50 pg de proteína em 0,15 mL de PBS com 0,15 mL de adjuvante de Freund incompleto, aproximadamente, quinsenalmente, durante um período de 2-3 meses. Após o reforço final, o murganho recebeu 50 pg do Factor IX em PBS três dias antes das fusões celulares baço/mieloma. As células do baço foram isoladas a partir de um murganho imunizado e fundidas com células de mieloma NS-1 (Kohler, G. et al., Eur. J. Immunol. 6, 292-295 (1976)) utilizando polietilenoglicol, como descrito por 01, V.T. et al. em "Selected Methods in Cellular Immunology," Mishell, B.B. e Shigii, S.M., eds., Freeman Press, São

Francisco. Após a fusão, as células foram ressuspensas em meio RPMI 1640 contendo soro fetal de vitela a 10% e foram colocadas alíquotas em cada poço de quatro placas de 24 poços contendo 0,5 mL de meio de lavagem peritoneal condicionado para as célula. No dia seguinte, cada um poço recebeu 1,0 mL de hipoxantina 2 x 10~4 M, aminopterina 8 x 10”7 M e timidina 3,2 x 10~5 M em meio RPMI 1640 contendo 10% soro fetal de vitela. As células foram nutridas cada 3-4 dias, removendo metade do meio e substituindo-os por meio fresco, contendo hipoxantina 1 x 10”4 M e timidina 1, 6 x 10"5 M. 31

Ao fim de, aproximadamente, duas semanas, foi removido de cada um poço 1,0 mL de meio de hibridoma, o qual foi testado para anticorpos anti-factor IX utilizando um ensaio ELISA como descrito por Jenny, R.J. et ai. em Meth. Enzymol. 222, 400-416 (1993). Resumidamente, o factor IX foi imobilizado em poços de plástico de placas de microtitulação de 96 poços. Foram, então, incubados nos poços, sobrenadantes de hibridoma ou diluições do anticorpo purificado. Os poços foram lavados e a presença de complexos anticorpo-antigénio foi detectada com segundo anticorpo de imunoglobulina de cabra anti-murina conjugado com peroxidase de rábano e o substrato cromogénico o-dianisidina.

Os poços contendo anticorpos anti-Factor IX foram subclonados por diluição limitante e cultivados em placas de 96 poços. Os sobrenadantes das culturas celulares de hibridomas clonados foram submetidos a rastreio para o anticorpo para o Factor IX pelo ensaio ELISA descrito acima e as células dos hibridomas positivos foram expandidas, congeladas, armazenadas em azoto liquido e, seguidamente, cultivadas sob a forma de tumores asciticos em murganhos.

Exemplo 2

Efeito Auto-limitante sobre a Coagulação de Anticorpos Anti Factor de Coagulação O efeito das concentrações crescentes de anticorpos anti factor de coagulação sobre o tempo da tromboplastina parcial 32 activada (aPTT) do plasma humano foi determinado num fibrómetro (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) utilizando o processo de referência LIB0293-J de Baxter, revisão 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey).

Antes do início da experiência, foram colocados 2 a 3 mL de CaCÍ2 0,02 M num tubo de 5 mL na câmara de aquecimento do fibrómetro. As amostras de plasma humano foram retiradas de novo e mantidas em gelo ou reconstituídas de acordo com a recomendação de fabricante do Hemostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut).

Foram preparados heparina de mucosa intestinal porcina não fraccionada (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), heparina de baixo peso molecular da mucosa intestinal porcina (Lovenox®, enoxaparina de sódio, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals,

Collegeville, Pennsylvania) ou anticoagulantes mAb, sob a forma de soluções de armazenamento a, aproximadamente, 50 μΜ e em diluídos em série directamente no plasma de teste. Foi incluído como uma referência um plasma de controlo não contendo anticoagulante.

Foram enchidos dois recipientes do fibrómetro fibroTube® com, respectivamente, 100 pL do plasma de teste ou 100 pL do plasma de teste com o anticoagulante e 125 pL de reagente cefaloplastina activada com actina (reagente de Actina, da cefalina do cérebro de coelho em ácido elágico, disponível de Baxter Scientific) e foram colocados nos poços do fibrómetro a 37 °C.

Após de um minuto, foram transferidos 100 pL do reagente de 33 actina para um recipiente contendo plasma e os conteúdos foram misturados várias vezes com uma pipeta. Após uma incubação de 3 minutos, foram adicionados 100 pL de CaCÍ2, pré-aquecido a 37 °C, à mistura plasma-reagente de actina, utilizando um Automátic Pipette/Timer-trigger (Becton-Dickinson). Os tempos de coagulação foram observados e os resultados na Fig. 1 são apresentados como os tempos de coagulação em função das concentrações finais do anticoagulante no volume total de ensaio de 300 pL. A concentração nominal do Factor IX no ensaio é de 30-40 nM.

Os resultados apresentados na Fig. 1 demonstram o efeito das concentrações crescentes dos mAbs BC1 e BC2 murinos anti-factor IX sobre os tempos de coagulação aPTT. Ambos os mAbs inibem a coagulação, prolongando o aPTT e ambos os mAbs atingem um efeito de saturação final sobre o aPTT. Os valores de IC5o são semelhantes a ~35 nM e ~50 nM, respectivamente, para BC1 e BC2, mas a diferença na resposta máxima dos dois anticorpos é significativa. Concentrações saturadas do BC1 aumentam o aPTT em cerca de 50% para ~40 seg. Por outro lado, o BC2, aumenta o aPTT em 3,5 vezes para cerca de 90 seg. A zona-alvo terapêutica utilizada na terapia anticoagulante com heparina encontra-se evidenciada. Os resultados indicam que os dois mAbs abrangem a gama terapêutica do aPTT da heparina.

As propriedades dos mAbs BC1 e BC2 encontram-se resumidas na Tabela I. Cada um dos mAbs BC reconhece tanto o zimogénio, o Factor IX, assim como a protease activa, Factor IXa, mas apenas a BC2 é capaz de bloquear tanto a activação do zimogénio como a actividade da protease. Foi verificado que BC1 e o BC2 apresentam reactividade cruzada com o Factor IX do macaco Cinomólogo. Adicionalmente, BC2 apresenta, igualmente, 34 reactividade cruzada com o Factor IX do rato.

Tabela I. Sumário das Anti-Factor IX Propriedades in vitro dos mAbs BC1 BC2 Liga-se ao Factor IX sim sim Liga-se ao Factor IXa sim sim Inibe a conversão IX em IXa não sim Inibe a actividade de IXa no complexo Xase sim sim Exigência de cofactores nenhuma metais divalentes Ca2+> Mn2+ aPTTmax x 100% 150 350 aPTT normal IC50, nM ~35 ~50 Reactividade cruzada de espécie macaco rato, macaco Isotipo IgGl IgG2a

Os resultados apresentados na Fig. 2 demonstram o efeito das concentrações crescentes dos mAbs 9E4(2)F4 e 11G4(1)B9 anti-Factor IX sobre os tempos de coagulação aPTT. O plasma para o ensaio foi diluído para metade da concentração normal, fornecendo um aPTT inicial de 45 segundos. Ambos os mAbs inibem a coagulação prolongando o aPTT e ambos os mAbs atingem um efeito de saturação final no aPTT. As concentrações saturantes do 9E4(2)F4 e 11G4(1)B9 aumentam o aPTT para de ~90 a 100 segundos para o 9E4(2)F4 e para ~80 segundos para o 11G4(1)B9. Os resultados indicam que os dois mAbs se encontram na extremidade superior da gama terapêutica do aPTT da heparina.

Os resultados apresentados na Fig. 3 demonstram o efeito 35 das concentrações crescentes dos mAbs HFXLC (vs. epitopo de cadeia leve), HFXHC (vs. epitopo de cadeia pesada anti-Factor X) e do mab HFXI anti-Factor XI sobre os tempos coagulação aPTT. Estes mAbs foram obtidos dos Enzyme Research Laboratories (ao South Bend, IN) . Os mAbs HFXLC e HFXI inibem a coagulação, prolongando o aPTT e ambos mAbs atingem um efeito de saturação final sobre o aPTT. 0 valor do IC50 para o HFXLC é ~40 nM; as concentrações saturantes aumentam o aPTT para -60 segundos. 0 valor do IC50 do HFXI é -20 nM; concentrações saturantes aumenta o aPTT para -100 segundos. Os resultados indicam que o HFXLC se encontra dentro da gama terapêutica aPTT da heparina enquanto que o HFXI se situa na extremidade superior da gama terapêutica da heparina. O mAb HFXHC não teve qualquer efeito sobre os tempos de coagulação aPTT. O prolongamento auto-limitante do aPTT foi, igualmente, observado com anticorpos para o Factor VIII, o cofactor para o Factor IXa. Por exemplo, o anticorpo SAF8C-IG anti-Factor VIII humano, adquirido de Affinity Biologicals, Inc., aumentou o aPTT para um máximo de cerca de 65 seg. A metade do prolongamento máximo do aPTT foi atingido com cerca de 100 nM de anticorpo.

Exemplo 3

Eficácia dos mAbs do Factor IX murino no Modelo de Trombos

Rato

Para avaliar a eficácia dos anticorpos anti-Factor IX na prevenção da trombose arterial, foi adaptado o modelo de trombose da artéria carótida do rato, como descrito por 36

Schumacher. em J. Cardio. Pharm. 22, 526-533 (1993). Este modelo consiste na lesão segmentai do endotélio da carótida por radicais de oxigénio produzidos por uma solução de FeCl3 aplicada sobre a superfície da artéria carótida.

Resumidamente, os ratos foram anestesiados com pentobarbitona de sódio, a veia jugular foi canulada para injecções intravenosas e a artéria femural esquerda foi canulada para monitorização da pressão sanguínea e da frequência cardíaca. A artéria carótida foi isolada por técnica asséptica através de uma incisão cirúrgica no pescoço e equipada com uma sonda de fluxo magnética para a medição do fluxo sanguíneo. Após um período da estabilização, foram estabelecidos parâmetros de linha de base para as seguintes variáveis: fluxo sanguíneo da carótida, pressão arterial, frequência cardíaca, tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT) e tempo da protrombina (PT) . Seguidamente, foi colocado um papel de filtro de Whatman calibrado embebido em solução de FeCl3 a 50%, na artéria carótida, durante 15 minutos para a lesão completa das células endoteliais subjacentes. Após a remoção do papel embebido em FeCl3, a experiência foi seguida até à finalização ao longo de 60 minutos. No final da experiência, o trombo da carótida foi extraído da artéria carótida e pesado. A totalidade dos agentes foi administrada 15 minutos antes do estabelecimento da lesão da carótida. Os tratamentos seguintes foram examinados e comparados com o mAb BC2 do Factor IX. 1. Heparina: bolus com 15, 30, 60 ou 120 U/kg, seguida por infusão de, respectivamente, 0,5, 1, 2 ou 4 U/kg/min ao 37 longo de 60 minutos 2. Ácido acetilsalicílico (ASA, aspirina): bolus com 5 mg/kg 3. mAb BC2 anti-Factor IX: bolus com 1, 3 ou 6 mg/kg, seguido por infusão de, respectivamente 0,3, 1 ou 2 pg/kg/min ao longo de 60 minutos 4. Heparina: bolus com 30 U/kg + lU/kg/min + ASA a 5 mg/kg 5. mAb BC2 anti-Factor IX: 1 mg/kg +0,3 pg/kg/min + ASA a 5 mg/kg.

As Figs. 4 e 5 demonstram a farmacologia comparativa dos regimes anticoagulantes/trombóticos, apresentando o efeito da heparina, ASA e do mAb BC2 do Factor IX sobre o aPTT (Fig. 4) e o PT (Fig. 5) .

Foi utilizado o indice-chave para a diátese hemorrágica, o aPTT, como critério pricipal para a avaliação da eficácia versus responsabilidades na hemorragia dos agentes anticoagulantes/trombóticos utilizados no estudo. Os resultados na Fig. 4 demonstram o prolongamento do aPTT dependente da dose, pela heparina, com um prolongamento máximo do tempo de coagulação, para além do limite do teste, nas duas doses mais elevadas. O ASA isoladamente não aumentou, significativamente, o aPTT mas, em combinação com a heparina, foi observado um efeito sinérgico significativo. Os mAbs do Factor IX apresentaram um efeito modesto sobre o aPTT, e mesmo na dose mais elevada, o aumento do tempo de coagulação não excedeu o limite de 3 vezes o anticoagulante padrão praticado clinicamente. Mais 38 significativamente, a dose mais baixa do mAb BC2 do factor IX em combinação com o ASA não modificou o aPTT.

Na Fig. 5, os dados indicam que o PT foi, igualmente, significativamente prolongado pela heparina, nas duas doses mais elevadas e pela combinação ASA + heparina, mas não por qualquer das doses de mAb do Factor IX, isoladamente ou em combinação com o ASA. 0 efeito da heparina, do ASA e mAb do Factor IX na oclusão da artéria carótida é apresentado na Fig. 6. Os resultados indicam que as artérias carótidas da totalidade dos animais tratados com veiculo se fecharam em resposta à lesão. A dose de heparina inibiu, de um modo dependente, a oclusão da artéria carótida. Na dose mais elevada, a heparina impediu, completamente, a oclusão da artéria carótida; nesta dose no entanto, nenhuma coagulação pode ser iniciada. 0 ASA, , apresentou isoladamente apenas um efeito menor sobre a oclusão da carótida. 0 ASA em combinação com a heparina, não conseguiu, igualmente, prevenir completamente a oclusão de carótida. 0 mAb do Factor IX bloqueou, completamente, a oclusão da carótida nas duas doses mais elevadas, as quais não prolongaram a coagulação para além do objectivo clinicamente pretendido. A dose mais baixa do mAb do Factor IX, que, significativamente, não conseguiu garantir a desobstrução isoladamente, demonstrou inibição completa da oclusão da carótida quando administrada em combinação com ASA. 0 efeito da heparina, ASA e mAb do Factor IX sobre peso do trombo é apresentado na Fig. 7. A heparina reduziu a massa do trombo na artéria carótida, de um modo dependente da dose. No 39 entanto, ainda foi possível encontrar algum trombo residual na artéria carótida apesar do bloqueio completo da coagulação. 0 ASA, isoladamente ou em combinação com a heparina (regime de 30 U/kg) apresentou apenas um efeito parcial sobre o peso do trombo. O mAb do Factor IX reduziu, de um modo dependente da dose, a massa do trombo e a dose elevada impediu praticamente de um modo completo, a formação de trombos. Para além disso, a combinação da baixa dose do mAb anti-Factor IX e do ASA, um regime que impediu, completamente, a oclusão da carótida sem afectar adversamente os índices de coagulação, impediu, completamente a formação de trombos.

Os estudos realizados no modelo da trombose da carótida do rato demonstram, claramente, a eficácia do mAb do Factor IX na prevenção da trombose num modelo de lesão arterial altamente trombogénico. De um modo mais significativo, foi demonstrada a eficácia do mAb do Factor IX, dentro do objectivo anticoagulante terapêutico pretendido definido pelo aPTT. Para além disso, a heparina, o actual anticoagulante padrão, atingiu uma eficácia comparável com do mAb do Factor IX, apenas em doses que comprometiam severamente a coagulação ao ponto de produzir sangue não-coagulável. De um modo interessante, a potenciação observada e sinergia adquirida pelo tratamento das articulações com ASA pela heparina foi, igualmente, demonstrada quando foi administrado a ASA com o mAb anti-Factor IX. No entanto, ao contrário da combinação entre a heparina e o ASA, que resultou na potenciação tanto dos efeitos anti-trombóticos como anticoagulantes, a combinação do mAb do Factor IX e do ASA resultou na potenciação da eficácia anti-trombóticos sem qualquer efeito consistente sobre os parâmetros de coagulação do sangue ex vivo. Considerados em conjunto, os dados mostram uma 40 capacidade antitrombótica superior do mAb do Factor IX, em comparação com a heparina, o ASA ou uma combinação da heparina e do ASA.

Exemplo 4

Microscopia Electrónica de Varrimento do Modelo de Trombose do Rato

Foram recolhidos segmentos da artéria carótida do rato a partir do controlo, cloreto férrico apenas e cloreto férrico + 6 mg/kg anticorpo do Factor IX, 3/grupo, 15 minutos após a aplicação do cloreto férrico. As artérias foram fixadas por perfusão com formaldeído e ligadas acima e abaixo da área lesionada. As artérias fixadas foram desidratadas, incubadas em hexametildisilazano e secado num dessecador. As artérias secas foram abertas longitudinalmente, colocadas em suportes para Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM) e revestidas com ouro. A SEM das artérias do controlo revelou um endotélio essencialmente normal com raras plaquetas espalhadas. Ocorreram algumas descontinuidades no endotélio, provavelmente em consequência de lesão mecânica durante a cirurgia e a membrana de base subjacente encontrava-se revestida por um tapete de plaquetas. Não foi observado qualquer indicio de formação de trombos nos ratos do controlo. A SEM das artérias tratadas com cloreto férrico revelou grandes trombos na parede, os quais ocupavam uma grande porção 41 do lúmen do vaso. Os trombos eram compostos de plaquetas agregadas, glóbulos vermelhos e material proteico amorfo e fibrilhar. O material proteico é compatível com fibrina. 0 endotélio das artérias encontrava-se, na sua maioria, obscurecido pelas grandes trombos. Quando visível, o endotélio que revestia a região tratada com cloreto férrico encontrava-se coberto por numerosas plaquetas aderentes e material proteico amorfo. A SEM das artérias tratadas com cloreto férrico de ratos, igualmente, tratados com anticorpo do Factor IX, revelaram o lúmen dos vasos basicamente isento de trombos. 0 endotélio que revestia a região tratada com cloreto férrico apresentava lesões extensas e algumas áreas encontravam-se revestidas por plaquetas aderentes e agregados de plaquetas, mas foi encontrado pouco ou nenhum material proteico.

Exemplo 5

Análise da Sequência do ADNc da Cadeia Pesada e Leve do mAb BC2 Anti-Factor IX 0 ARN total foi purificado utilizando TriReagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) de acordo com o protocolo do fabricante. 0 ARN foi precipitado com isopropanol e dissolvido em SDS a 0,5% e ajustado para NaCl 0,5 Μ. O ARN poli A+ foi isolado com Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal A.S., Lake Success, NY) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN poli A+ foi eluído das contas e ressuspenso em tampão TE. Foram reversamente transcritas doze alíquotas de 100 ng do ARN com um 42 kit de RT-PCR de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim N° de cat. 1483-188) utilizando um oligo dT para iniciação. Para a cadeia pesada, foram realizadas amplificações por PCR de 6 híbridos de ARN/ADN durante 25 ciclos, utilizando um iniciador de charneira para IgG2a murina (SEQ ID N°. 1) e um iniciador para a sequência sinal da cadeia pesada (SEQ ID N°. 2) . De um modo semelhante, para a cadeia leve, foram realizadas amplificações por PCR de 6 híbridos de ARN/ADN durante 25 ciclos utilizando um iniciador de kapa murina (SEQ ID N°. 3) e um iniciador degenerado para a sequência sinal da cadeia leve (SEQ ID N°. 4) . Os produtos de PCR de cada uma das 12 amplificações foram ligados num vector PCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01). As colónias dos clones recombinantes foram escolhidas aleatoriamente e foram preparadas mini preparações de ADN plasmídico utilizando um processo de extracção alcalino descrito por Birnboim e Doly em Nucl. Acids Res. 7, 1513 (1979) . 0 ADN plasmídico isolado foi digerido com EcoRI e analisado num gel de agarose a 0,8%. Foram sequenciadas as inserções de ADNc de cadeia dupla com o tamanho apropriado, i. e., -700 bp para a cadeia pesada e -700 bp para a cadeia leve, através de uma modificação do método de Sanger. A sequência da totalidade das 12 cadeias pesadas e leves foi comparada para produzir a sequência de consenso da região variável da cadeia pesada do BC2 (SEQ ID N°. 5) e a sequência de consenso da região variável da cadeia leve do BC2 (SEQ ID N°. 6) . A análise da sequência do ADNc da região variável da cadeia pesada do BC2 revelou uma grelha de leitura aberta com 363 nucleótidos, codificando uma sequência com 121 aminoácidos (SEQ ID N°. 7). As sequências das cadeias pesadas CDR1, 2 e 3 43 encontram-se listadas, respectivamente, na SEQ ID N°. 8, 9 e 10. A análise da sequência do ADNc da região variável da cadeia leve do BC2 revelou uma grelha de leitura aberta com 321 nucleótidos codificando uma sequência com 107 aminoácidos (SEQ ID N° . 11) . As sequências das cadeias leves CDR1, 2 e 3 encontram-se listadas, respectivamente, na SEQ ID N° . CM \—1 13 e 14, respectivamente.

Exemplo 6

Anticorpos Humanizados

Foram concebidos seis anticorpos humanizados designados SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB249417, SB 257731 e SB 257732 para conter as CDRs murinas descritas acima, numa estrutura de anticorpo humano. SB 249413 O SB 249413 contém a cadeia pesada F9HZHC 1-0 e a cadeia leve F9HZLC 1-0. A cadeia pesada humanizada da região variável sintética F9HZHC 1-0 foi concebida utilizando as três primeiras regiões de estrutura da cadeia pesada obtida a partir da imunoglobulina RF-TS3'CL (Capra, J.D. et al., J. Clin. Invest. 86, 1320-1328 (1990) identificada na base de dados Kabat como

Kabpro: Hhcl Ow) e as CDRs de cadeia pesada do BC2 descritas anteriormente. Não foram realizadas quaisquer substituições de aminoácidos da estrutura que pudessem influenciar a apresentação 44 das CDR. Foram produzidos quatro oligonucleótidos sintéticos sobreponiveis (SEQ ID N°. 15, 16, 17 e 18) os quais, quando emparelhados e extendidos, codificam para aminoácidos que representam a região variável da cadeia pesada através e incluindo CDR3 (SEQ ID N°. 19 e 20). Este gene sintético foi, então, amplificado utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID N°. 21 e 22) e ligado ao vector pCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01) e isolado a partir de uma digestão de restrição Spel, Kpnl. Foi produzido um segundo fragmento de ADN codificando para a sequência sinal do campath, incluindo os cinco primeiros aminoácidos da região variável (SEQ ID N°. 23 e 24), por amplificação por PCR da região apropriada de uma construção codificando a cadeia pesada anti-Virus Sincicial Respiratório humanizada (SEQ ID N°. 25), com dois iniciadores (SEQ ID N°. 26 e 27) e digestão com as enzimas de restrição

Fco-RI e Spel. Os dois fragmentos produzidos foram ligados num vector pFHZHC2-6pCD de expressão de células de mamifero digerido com EcoRl, Kpnl, o qual continha o remanescente de uma estrutura 4 de consenso humana e da região constante da IgGl. O vector continha uma mutação num único aminoácido do vector pFHZHC2-3pCD descrito no Pedido de Patente Internacional publicado N° WO94/05690. O residuo final da estrutura 2 (resíduo 49) foi mutado de Ser em Ala por digestão do pFHZHC2-3pCD com Xbal e EcoR5 e inserindo um adaptador produzido a partir de dois oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID N°. 28 e 29). A sequência da inserção F9HZHC 1-0 é apresentada nas SEQ ID N°. 30 e 31. A cadeia leve humanizada da região variável sintética F9HZLC 1-0 foi concebida utilizando as regiões de estrutura da cadeia leve humana obtidas da imunoglobulina LS8'CL (Carmack et al., J. Exp. Med. 169, 1631-1643 (1989), identificada na base de 45 dados Kabat como Kabpro:Hkl318) e as CDRs de cadeia leve do BC2 descritas anteriormente. Não foram realizadas quaisquer substituições de aminoácidos da estrutura que pudessem influenciar a apresentação das CDR. Foram produzidos dois oligonucleótidos sintéticos sobreponiveis (SEQ ID N°. 32 e 33), os quais, quando emparelhados e extendidos, codificam para aminoácidos que representam a região variável da cadeia leve (SEQ ID N°. 34 e 35). Este gene sintético foi, então, amplificado utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID N°. 36 e 37) e ligado no vector pCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01) e isolado a partir de uma digestão de restrição Seal, SacII. Foi produzido um segundo fragmento de ADN codificando para a sequência sinal do campath, incluindo os dois primeiros aminoácidos da região variável (SEQ ID N°. 38 e 39), por amplificação por PCR da região apropriada de uma construção codificando a cadeia pesada anti-Virus Sincicial Respiratório humanizada (SEQ ID N° . 25), com os dois iniciadores (SEQ ID N°. 26 e 40) e digestão com as enzimas de restrição EcoRI e Seal. Os dois fragmentos produzidos foram ligados num vector pFHzLCl-2pCN de expressão de células de mamífero digerido com EcoRI, SacII, o qual continha o remanescente de uma estrutura 4 humana da região constante de kapa. O vector continha uma única mutação num amino ácido do vector pFHZLCl-lpCN descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado N° W094/05690. Um resíduo da estrutura 2 foi transformado de Ser em Pro, digerindo o pFHZLCl-pCN com Smal e Kpnl e inserindo um adaptador produzido a partir de dois oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID N°. 41 e 42). A sequência da inserção F9HZLC 1-0 é apresentada nas SEQ ID N°. 43 e 44. 46 SB 249415 0 SB 249415 contém a cadeia pesada F9HZHC 1-1 e a cadeia leve F9HZLC 1-1. Estas construções da cadeia pesada e leve são baseadas, respectivamente, no F9HZHC 1-0 e no F9HZLC 1-0, no entanto, estes têm substituições na estrutura dos aminoácidos que podem influenciar a apresentação das CDR. O F9HZHC 1-1 tem três substituições de aminoácido da estrutura que podem influenciar a apresentação das CDR. Foram produzidos dois oligonucleótidos sintéticos sobreponíveis (SEQ ID N°. 45 e 46), que, quando emparelhados e extendidos, codificam para aminoácidos que representam a porção alterada da região variável da cadeia pesada alterada (SEQ ID N°. 47 e 48) .

Este gene sintético foi, então, amplificado, utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID N°. 49 e 50), ligado ao vector pCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01) e isolado a partir de uma digestão de restrição EcoNI, de ΚρηI. Este fragmento foi ligado no vector F9HZHC1-0 digerido com EcoNI, Kpnl (SEQ ID N°. 30). A sequência da inserção F9HZHC 1-1 é apresentada nas SEQ ID N°. 51 e 52. O F9HZLC 1-1 tem quatro substituições de aminoácidos da estrutura que podem influenciar a apresentação das CDR. Foram produzidos dois oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID N°. 53 e 54) , que, quando emparelhados, apresentam extremidades coesivas Kpnl e BamHI e codificam para aminoácidos que representam a porção alterada da região variável de cadeia leve (SEQ ID N°. 55) . O F9HZLC 1-0 (SEQ ID N°. 43) foi digerido com as enzimas de restrição Kpnl e BamHI e ligado ao ADN sintético. A sequência da inserção F9HZLC 1-1 é apresentada nas SEQ ID N°. 56 e 57. 47 SB 249416 0 SB 249416 contém a cadeia pesada F9HZHC 1-1 (descrita acima) (SEQ ID N°. 52) e a cadeia leve F9HZLC 1-2. A construção da cadeia leve é baseada no F9HZLC 1-1, no entanto, este tem uma substituição adicional num aminoácido da estrutura que pode influenciar a apresentação das CDR.

Foram produzidos dois oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID N°. 58 e 59), que quando emparelhados, têm extremidades coesivas Bam Hl e Xfoal e codificam para aminoácidos que representam a porção alterada da região de variável da cadeia leve (SEQ ID N°. 60). O vector F9HZLC 1-1 (SEQ ID N°. 56) foi digerido com as enzimas de restrição BamHl e Xfoal e ligado ao ADN sintético. A sequência da inserção F9HZLC 1-2 é apresentada nas SEQ ID N°. 61 e 62. SB 249417 O SB 249417 contém a cadeia pesada F9HZHC 1-1 (descrita acima) (SEQ ID N°. 52) e a cadeia leve F9HZLC 2-0. Foi concebida uma cadeia leve humanizada da região variável sintética F9HZLC 2-0, utilizando as regiões de estrutura de cadeia leve humana, obtidas da imunoglobulina REI (Palm e Hilschmann, Z. Physiol. Chem. 354, 1651-1654 (1973) , identificada na base de dados Kabat como Kabpro: HKL111) e as CDRs de cadeia leve do BC2 descrita anteriormente. Foram introduzidas cinco substituições de aminoácidos de consenso humano. Foram realizadas seis substituições murinas de aminoácidos de estrutura que podem 48 influenciar a apresentação das CDR. Foram produzidos dois oligonucleótidos sintéticos sobreponiveis (SEQ ID N°. 63 e 64) que, quando emparelhados e extendidos, codificam para aminoácidos que representam a região variável de cadeia leve (SEQ N° de ID: 65 e 66) . Este gene sintético foi, então, amplificado utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID N° . 67 e 68), ligado ao vector pCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01) e isolado a partir de uma digestão de restrição Seal, SacII. Foi produzido um segundo fragmento de ADN codificando para a sequência sinal do campath, incluindo os dois primeiros aminoácidos da região variável (SEQ ID N°. 38), por amplificação por PCR da região apropriada de uma construção codificando a cadeia pesada anti-Vírus Sincicial Respiratório humanizada (SEQ ID N°. 25) com dois iniciadores (SEQ ID N°. 26 e 69) e digestão com as enzimas de restrição EcoRI e Seal. Foi produzido um terceiro fragmento de ADN codificando o remanescente de uma estrutura 4 humana (SEQ ID N°. 70) e tendo SacII e tendo extremidades coesivas NarI, emparelhando dois oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID N° . 71 e 72). O F9HZLC 1-0 (SEQ ID N° . 43) foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e NarI e ligadas aos três fragmentos de ADN. A sequência da inserção F9HZLC 2-0 é apresentada na SEQ ID N°. 73 e 74. SB 257731 O SB 257731 contém a cadeia pesada F9HZHC 1-1 (SEQ ID N°.52) e a cadeia leve F9HZLC 1-3, uma única mutação num aminoácido de F9HZLC 1-2 (SEQ ID N° . 62). O F9HZLC 1-2 foi amplificado por PCR com dois iniciadores (SEQ ID Nos. 26 e 69) e digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Seal. Foi isolado 49 um fragmento com 94 bp (SEQ ID N°. 75 e 76) . O fragmento foi ligado ao vector F9HZLC 1-2 digerido com EcoRI, Seal, para produzir a construção F9HZLC 1-3 da cadeia leve. A sequência da inserção F9HZLC 1-3 é apresentada nas SEQ ID Nos. 77 e 78. SB 257732 0 SB 257732 contém a cadeia pesada F9HZHC 3-0 e a cadeia leve F9HZLC 3-0 da região variável sintética humanizada. Foram produzidos quatro oligonucleótidos sintéticos sobreponiveis (SEQ ID Nos. 79, 80, 81 e 82) que, quando emparelhados e extendidos, codificam para os aminoácidos que representam a região variável da cadeia pesada a ser alterada (SEQ ID Nos. 83 e 84) . Este gene sintético foi, então, amplificado utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID N°. 85 e 86), ligado ao vector pCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01) e isolado a partir de uma digestão de restrição StuI, ΚρηI. O fragmento isolado foi ligado ao vector F9HZHC1-1 digerido com StuI, Kpnl (SEQ ID N°. 52). Este vector foi, então, digerido com EcóRI, SpeI para remover a sequência de sinal. Foi produzido um fragmento de ADN codificando para a sequência de sinal do campath (SEQ ID N°. 23) , incluindo cinco primeiros aminoácidos da região variável, por amplificação por PCR do F9HZHC1-0 com dois iniciadores (SEQ ID Nos. 26 e 87) e digestão com as enzimas de restrição FcoRI e SpeI. O fragmento produzido foi ligado ao vector. A sequência da inserção F9HZHC3-0 é apresentada nas SEQ ID Nos. 88 e 89.

Foram produzidos quatro oligonucleótidos sintéticos sobreponiveis (SEQ ID Nos. 90, 91, 92 e 93) que, quando emparelhados e extendidos, codificam para aminoácidos que 50 representam a região de variável de cadeia leve (SEQ ID N°. 94 e 95). Este gene sintético foi, então, amplificado utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID Nos. 96 e 97) e ligado ao vector pCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, N° de cat. K2000-01) e isolado a partir de uma digestão de restrição com Seal, NarI. 0 fragmento isolado foi ligado ao vector F9HZLC1-3 digerido com Seal, NarI (SEQ ID N°. 77) . A sequência da inserção F9HZLC3-0 é apresentada nas SEQ ID N° . 98 e 99.

Os mAbs humanizados anti-Factor IX foram expressos em células CHO. Foi cultivada uma linha celular DG-44 adaptada para crescimento em suspensão em meio isento de soro, em 100 mL de meio isento de proteínas, contendo nucleósidos 1 X e F68 a 0,05% em balões erlenmeyer de 250 mL, estéreis, descartáveis (Corning), num agitador de plataforma Innova 2100 (New Brunswick Scientific), a 150 rpm, a 37 °C, numa incubadora de CO2 a 5%, de ar humedecido a 95%. Estas células foram transferidas a 4 X 105 células/mL, duas vezes semanalmente. Foram linearizados 15 pg de cada um dos vectores pCN-Lc-Light Chain e pCD-Hc-heavy chain, por digestão com Not1, foram co-precipitados sob condições de esterilidade e ressuspensos em 50 pL de tampão de TE IX (Tris 10 mM, EDTA 1 mm, pH 7,5). O ADN foi sujeito electroporação utilizando um Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) nas células Acc-098, utilizando a técnica de Hensley. em J. Biol. Chem. 269, 23949-23958 (1994). Foram lavadas 1,2 X 107 células, uma vez, em 12,5 mL PBSacarose gelado (PBS, sacarose 272 mM, fosfato de sódio 7 mM, pH 7,4, MgCl2 1 mM) , ressuspensas em 0,8 mL de PBS, adicionadas a 50 pL de solução de ADN e incubadas em gelo durante 15 minutos. As células foram sujeitas a um pulso de 380 V e 25 microfarads e, seguidamente, incubadas em gelo durante 10 min. As células foram plaqueadas em placas de cultura 51 de 96 poços a 5 X 105 células/placa, em meio de manutenção, 24 h antes da selecção. As células foram seleccionadas para a resistência a 400 pg/mL G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) em meio de manutenção, 24 h antes do ensaio, as células foram nutridas com 150 pL de meio de manutenção. O meio condicionado das colónias individuais foi ensaiado, utilizando um método de detecção de electroquimioluminescência (ECL) num analisador Origen (IGEN, Inc.) . Ver Yang et al., Biotechnology 12, 193-194 (1994).

Todas as soluções necessárias para a realização dos ensaios (tampão de ensaio) e para a operação do analisador (limpador da célula) foram obtidas de IGEN. Os anticorpos (IgG anti-humana (especifica para a cadeia g), Sigma Chemicals e Fragmento F(ab')2 para IgG Humana (H+L), Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.) foram marcados com TAG-NHS-éster (IGEN, Inc.) numa proporção molar 7:1 TAG:proteína, enquanto que a Proteína A (Sigma) foi marcada com Biotina-LC-Sulfo-NHS-éster (IGEN, Inc.) numa proporção molar 20:1 Biotina:proteína, ambos de acordo com as recomendações IGEN. As esferas magnéticas revestidas com Estreptavidina (M 280) foram obtidas de Dynal.

Os imunoensaios foram realizados utilizando o protocolo seguinte: por amostra, 50 pL de esferas revestidas com

Estreptavidina (concentração final de 600 pg/mL diluídas em PBS, pH 7,8, com Tween a 1,25%) foram misturados com 50 pL de Biotina-proteína A (concentração final espalhada/diluída em PBS, pH 7,8, com Tween a 1,25%) e incubados à temperatura ambiente durante 15 min com agitação, foram adicionados 50 pL de anticorpos TAG (uma mistura com uma concentração final de 1,25 52 pg/mL de Fragmento F(ab')2 para IgG Humana (H+L) e 0,25 pg/mL de IgG Anti-humana (específica para a cadeia g), diluída em PBS, pH 7,8, com Tween a 1,25%), a solução foi, seguidamente, adicionada a 50 pL de meio condicionado e incubada sob agitação. à temperatura ambiente, durante 1 hora. Foram adicionados 200 pL de tampão de ensaio à mistura de reacção e a amostra foi analisada no analisador Origen I para medir a ECL. Os resultados indicaram que, aproximadamente, 20-37% das colónias ensaiadas segregam mais de 15 ng/mL do anticorpo com uma expressão média de cerca de 150 ng/mL.

Os mAbs humanizados anti-factor IX foram purificados a partir dos meios condicionados, utilizando um passo de captura

Procep A, seguido por cromatografia de permura iónica, para reduzir a carga de ADN. Foi utilizado o material absorvente

Procep A (Bioprocessing Ltd., Durham, Inglaterra), para preparar uma coluna com uma proporção de 1:1 entre o diâmetro e a altura. Os meios condicionados clarificados foram aplicados na coluna a cerca de 150 cm/h. A coluna foi lavada sequencialmente com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), PBS contendo NaCl 1 M e, finalmente, com PBS. O material ligado foi recuperado com uma eluição com ácido acético 0,1 M. O eluído foi ajustado para pH 5,5 e diluído (1:4) com água. A solução diluída foi aplicada numa coluna S-Sepharose (2,5 x 13 cm), a qual foi pré- equilibrada com acetato de sódio 20 mM, pH 5,5 a 80 cm/h. A coluna foi lavada com tampão acetato até ser obtida uma linha de base constante e a proteína ligada foi eluída com fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25 cm/h. O material eluído foi filtrado com uma membrana de 0,4 mícron e armazenado a 4 °C. 53

Exemplo 7

Anticorpo Quimérico Murganho-Humano

Foram reversamente transcritos 100 ng de ARN do BC2 com um kit de RT-PCR, de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim N° de cat. 1483-188) utilizando um oligo dT para a iniciação e foram amplificados por PCR com iniciadores sintéticos Seal (SEQ ID N° . 100) e Narl (SEQ ID N° . 101), para produzir a região variável da cadeia leve do BC2 com extremidades Seal, Narl (SEQ ID Nos. 102 e 103). Este ADN foi ligado em F9HZHC1-3 digerido com Seal, Narl (SEQ ID 77) e digerido com Seal, Narl para produzir uma cadeia leve quimérica murganho-humana F9CHLC (SEQ ID Nos. 104 e 105) .

Foram reversamente transcritos 100 ng de ARN do BC2 com um kit de RT-PCR de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim N° de cat. 1483-188) utilizando um oligo dT para a iniciação e foram amplificados por PCR com iniciadores sintéticos Spel (SEQ ID N°. 106) e NheI (SEQ ID N°. 107)

iniciadores para produzir a região variável da cadeia pesada do BC2 com extremidades Spel, Nhel (SEQ ID Nos. 108 e 109). A

sequência sinal do campath foi amplificada por PCR a partir da cadeia pesada RSVHZ19 (SEQ ID N°. 25) com os iniciadores FcoRI (SEQ ID 26) e Spel (SEQ ID 87) . Estes dois fragmentos de ADN foram ligado num vector IL4CHHCpcd digerido com EcoRI, NheI descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado n° WO95/07301, substituindo a Região variável IL4 pela região variável do Factor IX de murganho do BC2, para produzir uma cadeia pesada quimérica murganho-humana F9CHHC (SEQ ID N°. 110 e 111) . 54 A co-transfecção e a purificação do anticorpo quimérico murganho-humano ch FIX foram realizadas como descrito acima para a construção humanizada.

Exemplo 8

Eficácia dos mAbs humanizados do Factor IX no Modelo de Trombo de Rato

Para avaliar a eficácia dos anticorpos humanizados anti-factor IX na prevenção da trombose arterial, foi utilizado o modelo da trombose de artéria carótida do rato, como descrito acima no Exemplo 3. Os parâmetros de linha de base foram estabelecidos para fluxo de sangue da carótida, pressão arterial, frequência cardíaca, desobstrução dos vasos e tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT). Aos quinze minutos, foi realizada uma lesão da carótida durante 10 minutos. Os parâmetros foram determinados 60 minutos após o estabelecimento da lesão da carótida. Foram, igualmente extraídos e pesados os trombos da carótida, a partir da artéria carótida. A totalidade dos agentes foi administrada intravenosamente 15 minutos antes do estabelecimento da lesão da carótida. Os seguintees tratamentos foram examinados e comparados com o mAb anti-factor IX do BC2. 1. Veículo 2. chaFIX: bolus com 3 mg/kg 55 3. SB 249413: bolus com 3 mg/kg 4. SB 249415: bolus com 3 mg/kg 5. SB 249416: bolus com 3 mg/kg 6. SB 249417: bolus com 3 mg/kg 7. SB 257731: bolus com 3 mg/kg 8. Heparina: bolus com 60 unidades/kg + infusão de 2 unidades/kg/minuto O aPTT foi utilizado como o principal critério para a avaliação da eficácia versus responsabilidade na hemorragia dos agentes anticoagulantes/trombóticos utilizados no estudo. Os resultados na Fig. 8 demonstram que os mAbs humanizados SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 e SB 257731 do Factor IX apresentavam um efeito moderado sobre o aPTT a 3,0 mg/kg, o que se encontra dentro da gama clinica aceitável.

Na Fig. 9, é apresentado o efeito dos mAbs do Factor IX sobre a massa do trombo. Os resultados indicam que totalidade dos mAbs humanizado é igualmente eficaz na redução da massa do trombo.

Os estudos realizados no modelo da trombose da carótida do rato demonstram, claramente, a eficácia dos mAbs humanizados do Factor IX na prevenção da trombose no modelo da lesão arterial altamente trombogénica. Mais significativamente, foi demonstrada 56 a eficácia da totalidade dos mAbs humanizados do Factor IX dentro do alvo terapêutico anticoagulante pretendido, definido pelo aPTT.

Exemplo 9

Propriedades Bioquímicas e Biofísicas do Anticorpo A massa molecular do SB 249417 foi determinada por MALD-MS como sendo 148000 Da. A ultracentrifugação analítica do SB 249417 originou um valor idêntico. Na presença do Factor IX mais Ca2+, os anticorpos derivados do BC2 sedimentaram com uma massa de 248000 Da correspondendo à massa combinada do mAb e de duas moléculas de Factor IX. Não foi observado qualquer indício de agregados organizados mais elevados na presença ou na ausência do Factor IX. A cinética da ligação do Factor IX a SB 249417 foi avaliada por análise BIAcore com o anticorpo ligado a uma superfície de proteína A imobilizada. Foi utilizado Factor IX humano recombinante (rhFIX, Genetics Institute) a 49 nM e foram realizadas medições na presença de Ca2+ 5 mM. A interacção foi caracterizada por associação rápida, kass = 2,0 x 105 m_1s_1 e uma velocidade de dissociação relativamente lenta, kdiss = 4,1 x 10”4 s”1. O Kd calculado para a ligação do Factor IX foi de 1,9 nM. A tabela 1 resume as propriedades biofísicas do SB 249417. 57

Tabela 1 Sumário das Propriedades Biofisicas do SB 249417

Isotipo

Pureza por SDS-PAGE Peso Molecular

Espectrofotometria de Missa

Ultracentrifugação

Analítica

Estequiometria da Ligação do Factor IX

Calorimetria de Titulação Isotérmica IX: 1 mole mAb Afinidade de ligação do Factor IX

Calorimetria de Titulação Isotérmica

Biossensor

Cinética de ligação do Factor IX

Biossensor

IgGl, kapa >95% (sob condições de redução) 148000 Da 148000 Da

Factor de 1,5 moles

Kd = 4 nM a 25 °C Kd = 2 nM kass = 2.0 x 105 m-1 s-1 kdiss = 4 X 10“4 s-1 A tabela 2 resume as propriedades de ligação dos mAbs do factor IX da presente invenção. As constantes dissociação calculadas foram, essencialmente, idênticas dentro do erro experimental. 58

Tabela 2 Cinética da Ligação do Factor IX aos mAbs Anti-Factor IX mAbs kass (M~1s~1) kdiss (s-1) cale. KD (nM) SB 249417 2, 0 X 10b 4,1 X 1 o \—1 1,9 BC2 4, 8 X 105 9,1 X 1 O \—1 1,9 Chf 9 2, 4 X 105 3, 0 X 10"4 1,3 SB 249413 6, 5 X 105 2,8 X 10"3 3,7-5,1 SB 249415 7, 5 X 105 1,8 X 1 o \—1 1,1-2,3 SB 249416 5, 2 X 105 4,1 X 1 o \—1 0,8 SB 257731 9, 2 X 105 9, 9 X 10"4 1,1 SB 257732 1, 1 X o \—1 1,2 X IO"3 1,5

As interacções entre rhFIX e SB 249417, BC2 e outras construções humanizadas foram caracterizadas por titulação por microcalorimetria, a qual mede as interacções de ligação em solução a partir do calor intrínseco de ligação. Foram realizadas nove injecções de FIX 106 μΜ no calorimetro contendo o mAb SB 249417 2 μΜ. A ligação foi detectada nas primeiras 4 injecções sob a forma de aquecimento exotérmico. Nas últimas 5 injecções os locais ligação do mAb foram saturados com FIX e apenas foi observado aquecimento de fundo da mistura. Os resultados indicaram que o ponto de equivalência ocorreu numa proporção molar de ligação próxima de 2 FIX por mAb, como esperado. A análise não linear dos mínimos quadrados dos dados originou a afinidade de ligação.

As afinidades rhFIX dos mAbs foram medidas ao longo de uma gama de temperaturas de 34-44 °C em HEPES 10 mM, CaCl2 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Estes dados permitem que seja determinada 59 directamente a afinidade a 37 °C e que a afinidade a 25 °C seja calculada a partir da equação de van't Hoff. Os dados na Tabela 3 indicam que as afinidades do SB 249417, BC2 e das suas outras construções humanizadas se encontram dentro do erro (um factor de 2) do mesmo.

Tabela 3 Resultados de Titulação por Calorimetria para mAbs Anti-FIX mAb Kd, nM a 25 °C Kd, nM a 37 °C Proporção da Ligação Molar FIX/mAb BC2 10 20 1,4 SB 249413 6 12 1,9 SB 249415 3 7 1,7 SB 249417 4 12 1,5 SB 257732 4 9 1,8 A totalidade dos mAbs SB 249413, SB 249415, SB 249417 e SB 257732 apresentou estabilidades térmicas muito semelhantes por rastreio de calorimetria diferencial. As suas Tms de desemolamento situaram-se em 70-75 °C, indicando uma estabilidade elevada contra a desnaturação termicamente induzida.

Exemplo 10

Mecanismo de Inibição do Factor IX Mediada por Anticorpo

Foi construida uma biblioteca de construções quiméricas composta por sequências do Factor IX ligadas na estrutura da 60 proteína homóloga do Factor VII e foi utilizada para mapear o epitopo para o mAb BC2 do Factor IX. Ver Cheung et al., Thromb. Res. 80, 419-427 (1995). A ligação foi medida utilizando o dispositivo de ressonância plasmon de superfície BiaCore 2000. O anticorpo BC2 foi ligado directamente ao chip utilizando a reacção NHS/EDC. A ligação foi medida por 2 min de tempo de contacto a 20 pL/min com 200 nM de cada um das referidas construções em MOPS 25 mM, PH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM. A dissociação foi controlada durante 3 min, utilizando o mesmo tampão sem proteína. Não foi detectada ligação à construção de tipo selvagem na presença de EDTA 50 mM. Os dados são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4 Sumário da Ligação de Construções do Factor IX ao Anticorpo BC2

Construção Grau de Ligação Plasma Ixa Liga-se r-IX Liga-se Plasma VII Não se Liga IX LC/VII HC Liga-se IX-A/VII Liga-se VII gla/IX Não se Liga VII-A/IX Não se Liga VII gla (IX 3-11)/IX Liga-se VII gla (IX 3-6)/IX Ligação Muito Baixa VII gla (IX 9-11)/IX Ligação Muito Baixa IX K5A Liga-se 61

Estes dados indicam que as construções contendo a cadeia

leve do Factor IX e a cadeia pesada do Factor VII (IX LC/VII HC) ; os dominios gla e de empilhamento aromático do Factor IX (IX-A/VII); os resíduos 3-11 do domínio gla do Factor IX dentro do domínio gla do Factor VII (VII gla (IX 3-11)/IX); e o Factor IX tendo uma substituição de lisina por alanina no resíduo 5 (IX K5A) apresentam ligação ao BC2. A construção VII gla (IX

3-11)/IX apresentou uma ligação ao BC2 equivalente ao Factor IX de tipo selvagem (plasma IXa e r-IX). Deste modo, o anticorpo

BC2 liga-se a um epitopo contido dentro dos resíduos 3-11 do domínio gla do Factor IX 62

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTES: Blackburn, Michael Church, William Gross, Mitchell Feuerstein, Giora Nichols, Andrew Padlan, Eduardo Patel, Arunbhai Sylvester, Daniel

(ii)TÍTULO DA INVENÇÃO: AGENTES ANTICOAGULANTES ÚTEIS NO TRATAMENTO DA TROMBOSE (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 111 (iv) MORADA DE CORRESPONDÊNCIA:_ (A) DESTINATÁRIO: SmithKline Beecham Corporation (B) RUA: 709 Swedeland Road (C) CIDADE: King of Prussia

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 19406 (v) FORMATO PARA COMPUTADOR:_ (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM Compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) PROGRAMA: FastSEQ Version 1.5 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 16-JAN-1997 63 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: 60/029,119 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 24-OUT-1996 (viii) INFORMAÇÃO DE ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Baumeister, Kirk (B) NÚMERO DE REGISTO: 33833 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/REGISTO: P50438 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 610-270-5096 (B) TELEFAX: (C) TELEX: (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 1:

CATCCTAGAG TCACCGAGGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 2: 21

AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 3: 65 36

CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 4: GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 363 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO 66 (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 5: CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60 TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120 CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 180 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT 240 TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG 300 AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT 360 GCA 363 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 6: CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA 120 TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180 TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA 240 GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC 300 ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321 67 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 7:

Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin. Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120 68 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 8

Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 9 69

Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 10:

Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 70 HIPOTÉTICA: NÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO TIPO DE FRAGMENTO: interno (iii) (iv) (v) (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 11:

Gin Ile Vai Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 71 (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 12

Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His 15 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 13 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 72 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 14: Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 15: CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC 60 AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT 104 73 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 16: TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG 60 AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG 108 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 17: 74 60 107

GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 91 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples. (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 18:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 337 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: 75 (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 2...337 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 19: A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 49

Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys 15 10 15 GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC 97 Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 20 25 30 TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA 145 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile 35 40 45 AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGG CGG 193 Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys Gly Arg 50 55 60 TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC 241 Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile 65 70 75 80 AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAA 289 Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu 85 90 95 GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 337 Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 76 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 112 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) (vi) (x) TIPO DE FRAGMENTO: interno ORIGEM: DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 20:

Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys 15 10 15

Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 20 25 · 30

Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile 35 40 45

Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys Gly Arg 50 55 60

Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu 85 90 95

Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 21: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases 77 (i) (ii) (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 21: GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 22: TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG 30 78 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 97 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 27...95 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 23: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTA GT 97

Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly Vai His Ser Gin Vai Gin Leu 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 79 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 24:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Xle Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Vai His Ser Gin Vai Gin Leu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 25: GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC 60 TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG 110 80 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 26: 21

GGAGACGCCA TCGAATTCTG A (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 27: 30

GATTGCACTA GTTGGACCTG GGAGTGGACA 81 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 77 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 28: CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG 60 ACGGGCCGGT TCACGAT 77 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: 82 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 29: ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC 60 TCTGCGACCC ACT 73 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 363 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...363 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZHC 1-0 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 30: 83 48 48 CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser 1 5 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro 35 40 GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys 50 55 AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp 65 70 CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp 85 GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 10 15 GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 30 GCG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr 100 105 CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG 144

Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45 TCA ACA ΤΑΓ GTT GAT GAC TTC 192

Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 60 ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 240

Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr 75 80 GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT 288 Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336

Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 110 363 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 31: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 84 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 31:

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 6 5 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 165 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 85 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 32: AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC 60 CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC 120 TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT 165 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 146 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 33: CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT 60 GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC 120 AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CATAGA 146 86 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 280 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 2...280 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 34: 87 49 A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 15 10 15 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACT 145 Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT 241 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 GCG GTT ‘ TAT 1 TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG 280 Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 93 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: 88 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 35:

Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 15 10 15 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 50 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) (iii) (iv) (v) (vi) (xi)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc HIPOTÉTICA: NÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO TIPO DE FRAGMENTO: ORIGEM: DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 36:

TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27 89 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 37: GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 94 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora 90 (B) LOCALIZAÇÃO: 27...92 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 38: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA AC A GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT 94

Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly Vai His Ser Glu Ile Vai 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácido; (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Vai His Ser Glu Ile Vai 20 91 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 40: GACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 41: GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC 55 92 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 42: CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: 93 (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...321 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZLC1-0 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 43: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48 Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT 144 Kis Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA 321 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 94 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DÃ SEQUÊNCIA: SEQ.

Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Glr. Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 134 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 95 ΑΝΤΙ-SENTIDO: ΝΑΟ (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 45: CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATAT 120 CTACAGATCA GCAG 134 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 134 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 46: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60 GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATC CCGTGCTGAC 120 AGAGGAGTCT AGAG 134 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 225 pares de bases 96 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...225 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 47: CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA 48 Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly 1 5 10 15 AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA 96 Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu 20 25 30 GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT 144 Asp Ser Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala 35 40 45 GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT 192 Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly 50 55 60 TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 225 Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 97 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xr) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°:

Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly 15 10 15

Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu 20 25 30

Asp Ser Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala 35 40 45

Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly 50 55 60

Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 98 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 49: TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 50: TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 363 pares de bases 99 (ϋ) (iii) (iv) (V) (vi) (ix) (Xi) (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: ADNc HIPOTÉTICA: NÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO TIPO DE FRAGMENTO: ORIGEM: CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...363 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZHC 1-1 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 51: 100 48 CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 50 55 60 AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Ser Ser Vai Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 96 144 192 240 288 336 363 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 101

(ii) (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Ser Ser Vai Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 82 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 102 ΑΝΤΙ-SENTIDO: ΝΑΟ (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 53: CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC 60 GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 90 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 54: GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC 60 TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC 90 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 103 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 55:

Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser 15 10 15

Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO; 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...321 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZLC 1-1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 56: 104 48 GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT HÍS Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 96 144 192 240 288 321 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 105

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 57:

Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 His Trp Tyr Gin Gin Arg Pr o Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. 106 41

GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 59: CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G 41

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO 107 TIPO DE FRAGMENTO: interno (v) (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 60:

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...321 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZLC 1-2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 61: 108 48 GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA Cy Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 96 144 192 240 288 321 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 109 (iii) (iv) (V) (vi) (xi)

HIPOTÉTICA: NÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO TIPO DE FRAGMENTO: interno ORIGEM: DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 62:

Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 165 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) (iii) (iv)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc HIPOTÉTICA: NÃO

ΑΝΤΙ-SENTIDO: NAO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: 110 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 63: 60 120 165

AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 64: 60 120 161 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 161 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 64:

CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 280 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 111

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 2...280 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 65: A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49

Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 15 10 15 GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC GCC ACT 145 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC GGT AGC 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAT ATC 241 Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG 280 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 112 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 93 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°:

Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 1 5 10 15 Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 113 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (11) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 67: TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 68: (D CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (11) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 68: TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG 27 114 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 69: CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N- terminal (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 70: 115

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala 15 10 15

Ala (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 71: GGACGTTCGG CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 48

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO 116 (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 72: CGCCGCCACA GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC 52 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...321 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZLC 2-0 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 73: 117 48 CAG ATA GTA CTC ACC CAG AGC CCA Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15 GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC 144 HÍS Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGT AGC GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80 GAT ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 ASp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG 321 Phe Gly Gin Gly 100 Thr Lys Vai Glu Ile 105 Lys Arg . (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 118 (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO : interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 74 : Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 94 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: 119 (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 27...94 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 75: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 S TTG GTA gca aca gct aca ggt gtc cac tcc cag ata GTA CT 94

Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly Vai His Ser Gin Xle Vai Leu 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Vai His Ser Gin Ile Vai Leu 20 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 401 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 27...401 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZLC 1-3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 77: 53 GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CA C TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly Vai His Ser Gin Ile Vai Leu Thr Gin 10 15 20 25 TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 30 35 40 101 149 121 197 197 TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AGA Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met Kis Trp Tyr Gin Glr. Arg 45 50 55 CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala 60 65 70 AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 75 80 85 ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCG GTT TAT TAC Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr 90 95 100 105 TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 110 115 120 245 293 341 389 GTG GAG ATC AAA 401 Vai Glu Ile Lys 125 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 125 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 122 (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: , SEQ. ID. N° : : 78 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai His Ser Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai 35 40 45 Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro 50 55 60 Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 85 90 95 Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn 100 105 110 Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu ile Lys 115 120 125 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 81 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 79: 123 60 60 81

AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 99 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 80: TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC 60 TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 87 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO 124 (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 81:

GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 86 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 82:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 278 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 3...278 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. , ID . N° : 83: AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 47 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg 1 5 10 15 CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA' TGG ATA . AAC ACC AGA 95 Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp 11- Asn Thr Arg 2 C 25 30 AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 143 Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe 35 40 45 TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 191 Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu 50 55 60 AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 239 Lys Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met 65 70 75 GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 278 Asp on Gly Tyr Phe Pro Phe oc Thr Tyr Trp Gly Gin η n Gly Thr 126 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 92 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 84:

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin 1 5 10 15 Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn 20 25 30 Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser 35 40 45 Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys 50 55 60 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp 65 70 75 80 Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 85 90 127 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 85: AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 86: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG 2 6 128 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 87: CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG 37 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 446 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 27...446 129 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZHC 3-0 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 88: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 5 TCC CAG ATC CAA CTA GTG CAA 101 Ser Gin Ile Gin Leu Vai Gin 20 25 GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC 149 Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys 35 40 TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 197 Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg 55 ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA 245 Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg 70 TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 293 Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe 85 TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 341 Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu 100 105 TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 389 Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met 115 120 GGC CAG GGT ACC CTG GTC ACC 437 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 135 1

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC

Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly Vai His 10 15 TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly 30 AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 45 50 CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 60 65 AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp 75 80 TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala 90 95 AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC Lys Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe 110 GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp 125 130 GTC TCC TCT Vai Ser Ser 140 130 446 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 89: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 140 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (ii) (iii) (iv) (V) (vi) (Xi)

(D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína HIPOTÉTICA: NÃO

ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO TIPO DE FRAGMENTO: interno ORIGEM: DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 89:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai His Ser Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr 115 120 125 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 13 0 135 140 131 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 90 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 90: AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC 60 TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT 90 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 91: 132 60 108

CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 92: TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC 60 TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG 108

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 102 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO 133 (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 93: GGCGCCGCCA ATACTCCACT CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG CGCCGAACGT CCGCGGGTTA GT 60 102 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 330 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 2...328 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 94: 134 49 A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 15 10 15 GTC ACC - ATC ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp 20 25 '· 30 TAC CAA CAG AAA CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG 145 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT 241 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 GCG ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC 289 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly 85 90 95 GGA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCG GCG CC 330 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 135 (iii) (iv)

HIPOTÉTICA: NÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) (xi) ORIGEM: DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 95:

Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 15 10 15 Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) (iii) (iv)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc HIPOTÉTICA: NÃO

ΑΝΤΙ-SENTIDO: NAO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: 136 (x4-)DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 96: CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 97: AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC 26

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 412 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO 137

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 27...412 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: F9HZLC 3-0 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 98: 53

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 101

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG

Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly Vai His Ser Gin Ile Vai Leu Thr Gin 10 15 20 25 138 149 TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr 30 35 40 TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys 45 50 55 CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala 60 65 70 AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 75 80 85 ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 90 95 100 105 TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 110 115 120 197 245 293 341 389 CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GC Leu Glu Ile Lys 125 Arg Thr Vai Vai 412 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 129 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 139 (iii) (iv) (v) (vi) (xi)

HIPOTÉTICA: NÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO TIPO DE FRAGMENTO: interno ORIGEM: DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 99:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Vai His Ser Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30

Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai 35 40 45

Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 50 55 60

Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 85 90 95

Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn 100 105 110

Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai 115 120 125

Vai (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) (iii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc HIPOTÉTICA: NÃO 140 (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 100: CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 101: GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 335 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 141 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...335 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 102: CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG Gin Ile Vai Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu 65 70 75 80 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT GTT GCG GCG CC 335 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 100 105 110 142 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 112 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 103:

Gin Ile Vai Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 100 105 110 143 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 318 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...318 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 104: 144 48 CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG Gin Ile Vai Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CG C TTC AGT GGC AGT Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu 65 70 75 80 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 96 144 192 240 288 318 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 106 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 145 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO : interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 105: Gin Ile Vai Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Vai GlU Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: 146 (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 106: CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) iHIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 107: TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N° : 108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 369 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 147

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Coding-_Sequence (B) LOCALIZAÇÃO: 1...369 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 108: GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 48 Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 10 15 GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 30 GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG 144 Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 45 TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 60 AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT 240 Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 75 80 GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT 288 Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 90 95 TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 335 Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 110 GCT AGC 369 Ala Ser CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro 1 5

ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT

Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA

Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro 35 40

GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG

Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys 50 55

AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu 65 70 TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu 85 ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr 100 105 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120 148 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 109:

Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr .Tyr Vai Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala Ala Ser 115 120 149 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 363 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) ORIGEM: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência codificadora (B) LOCALIZAÇÃO: 1...363 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N°: 110: CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG Gin Ile 'Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 48 96 144 150 192 240 AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn €5 70 75 80 TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120 288 336 363 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. N°: 111: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID. N° : 1H: 151

Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Vai Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120

Lisboa, 20 de Outubro de 2006 152

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES Utilização de um anticorpo monoclonal anti-factor IX seleccionado do grupo que consiste em; SB249413, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 31 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 44; SB249415, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 57; SB249416, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 62; SB249417, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 74; SB257731, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 78; 1 SB257732, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 89 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 99, cujo anticorpo tem actividade neutralizante, auto-limitante, contra o factor IX na produção de um medicamento para o tratamento de distúrbios associados a trombos e embolias.
2. 2. Utilização da reivindicação 1 em que o distúrbio associado é seleccionado do grupo que consiste em ; enfarte de do miocárdio, angina instável, fibrilhação atrial, acidente vascular cerebral, lesão renal, embolia pulmonar, trombose venosa profunda, angioplastia coronária transluminal percutânea, coagulação intravascular disseminada, sépsia, orgãos artificiais, shunts ou próteses.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o anticorpo é quimérico ou humanizado.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo é um fragmento seleccionado do grupo que consiste em ; Fv, Fab, Fab', F(ab')2·
5. 5. Utilização de um ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal seleccionado do grupo que consiste em SB249413, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 31 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 2 44; SB249415, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada 57; na SEQ. ID. N°: SB249416, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada 62; na SEQ. ID. N°: SB249417, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada 74; na SEQ. ID. N°: SB257731, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 52 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada 78; na SEQ. ID. N°: SB257732, em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 8 9 e a cadeia leve tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID. N°: 99, na preparação de um medicamento para o tratamento de distúrbios associados a trombos e embolias das reivindicações de 1 a 4. de qualquer uma Lisboa, 20 de Outubro de 2006 3