PL187274B1 - Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, hybrydoma, neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego, region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie, zmienione przeciwciało, przeciwciało chimeryczne i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1 . Zastosowanie przeciwciala monoklonalnego skierowanego przeciwko czynni- kom krzepniecia pochodzacym z ukladu wewnatrzpochodnego lub czesci wspólnej ka- skady krzepniecia posiadajacego samoograniczajaca sie aktywnosc neutralizowania do wytwarzania leku do hamowania zakrzepicy u ludzi i zwierzat. 11. Przeciwcialo monoklonalne stanowiace srodek przeciwkrzepliwy o samoogra- niczajacej sie aktywnosci w stosunku do czynnika krzepniecia skierowane przeciwko czynni- kom krzepniecia pochodzacym z ukladu wewnatrzpochodnego lub czesci wspólnej kaskady krzepniecia. 18. Hybrydoma, znamienna tym, ze ma charakterystyke identyfikujaca linii ko- mórkowej 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9. 20. Neutralizujacy fragment Fab lub fragment F(ab’ )2, znamienny tym, ze jest wy- tworzony na drodze przegrupowania lancuchów, prowadzacego do ekspresji lancucha ciez- kiego Fd przeciwciala monoklonalnego w reprodukcyjnej bibliotece Fab lekkiego lancu- cha faga wlóknistego myszy. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne stanowiące środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia.

Przeciwciało monoklonalne według wynalazku charakteryzuje się tym, że korzystnie jest skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va. Przeciwciało według wynalazku może być skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina.

Bardziej korzystnie monoklonalnym przeciwciałem stanowiącym środek przeciwkrzepliwy jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX, a najbardziej korzystnie przeciwciało monoklonalne według wynalazku ma charakterystykę identyfikującą SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732, lub również korzystnie ma charakterystykę identyfikującą: 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9, ewentualnie ma charakterystykę identyfikującą SB 249417.

Przedmiotem wynalazku jest hybrydoma, charakteryzująca się tym, że ma charakterystykę identyfikującą linii komórkowej 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9.

Przedmiotem wynalazku jest neutralizujący fragment Fab, lub fragment F(ab% delecyjnie pozbawiony regionu Fc przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia.

Przedmiotem wynalazku jest również neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab% który jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, prowadzącego do ekspresji łańcucha ciężkiego Fd przeciwciała monoklonalnego w reprodukcyjnej bibliotece Fab lekkiego łańcucha faga włóknistego myszy.

Przedmiotem wynalazku jest także neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, który jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, w wyniku którego łańcuch lekki przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, ulega ekspresji w reprodukcyjnej bibliotece Fab ciężkiego łańcucha faga włóknistego myszy.

Przedmiotem wynalazku jest region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i 10.

187 274

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i 10.

Następnym przedmiotem wynalazku jest region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NONO: 12, 13 i 14.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NO NO: 12, 13 i 14.

Przedmiotem wynalazku jest zmienione przeciwciało, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z powyżej zdefiniowanego przeciwciała monoklonalnego. Korzystną postacią zmienionego przeciwciała jest przeciwciało humanizowane.

Korzystnie to humanizowane przeciwciało charakteryzuje się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, 52 lub 89 lub humanizowane przeciwciało według wynalazku ma łańuch lekki o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 lub 99.

Jeszcze inną korzystną odmianą zmienionego przeciwciała jest humanizowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 44.

Następną korzystną odmianą zmienionego przeciwciała jest humanizowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przestawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawiona w SEQ ID NO: 57.

Kolejną odmianą zmienionego przeciwciała jest humanizowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencją aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w sEQ ID NO: 62.

Następną odmianą korzystną zmienionego przeciwciała może być humanizowane przeciwciało, w którym łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID' NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 74, lub też łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 78. Możliwa jest też taka korzystna odmiana humanizowanego przeciwciała, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 89, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 99. '

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało chimeryczne zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, charakteryzujące się tym, że hamuje działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczający się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i które skierowane jest przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia.

Korzystnie w przeciwciele według wynalazku regiony stałe wybrane są spośród immunoglobulin ludzkich.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera humanizowane przeciwciało stanowiące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z powyżej zdefiniowanego przeciwciała monoklonalnego oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycja ta może zawierać ponadto kwas acetylosalicylowy.

187 274

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało chimerycznie obejmujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, hamujące działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczający się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, przy czym sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i jest skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, regiony stałe mogą być wybrane spośród immunoglobulin ludzkich. Również korzystnie kompozycje te mogą zawierać dodatkowo kwas acetylosalicylowy.

Krótki opis rysunków.

Figura 1 stanowi wykres wyników doświadczalnych, przedstawiający miareczkowanie prawidłowego osocza ludzkiego mysimi PM BC1, i BC2, skierowanymi przeciwko czynnikowi IX.

Figura 2 stanowi wykres wyników doświadczalnych, przedstawiający miareczkowanie prawidłowego osocza ludzkiego mysimi PM 9E4(2)F4 i 11 G4(1)B9, skierowanymi przeciwko czynnikowi IX.

Figura 3 stanowi wykres wyników doświadczalnych, przedstawiający miareczkowanie prawidłowego osocza ludzkiego mysimi PM HFXHC i HFXLC, skierowanymi przeciwko czynnikowi X, i mysimi PM HFXI, skierowanymi przeciwko czynnikowi XI.

Figura 4 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) po 60 minutach w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura.

Figura 5 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na czas protrombinowy po 60 minutach w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura.

Figura 6 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na zamknięcie przepływu w tętnicy szyjnej w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura.

Figura 7 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na ciężar skrzepliny w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura.

Figura 8 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, mysiego PM BC2 skierowanego przeciwko czynnikowi IX, chimerycznego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX i humanizowanego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX na czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) po 60 minutach w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura.

Figura 9 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, mysiego PM BC2 skierowanego przeciwko czynnikowi IX, chimerycznego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX i humanizowanego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX na ciężar skrzepliny w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego, zmienione przeciwciała i fragmenty przeciwciał, skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia, cechujące się samoograniczającą aktywnością neutralizującą. Korzystnie, czynnik krzepnięcia należy do układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Najkorzystniej, przeciwciała skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia stanowią przeciwciała skierowane przeciwko następującym czynnikom: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik VIIIa, czynnik V, czynnik Va, czynnik VII, czynnik VIIa oraz przeciwko trombinie. Szczególnie korzystne są przeciwciała skierowane przeciwko czynnikowi IX. Przykład przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikom krzepnięcia stanowią humanizowane korzystnie, należącym do wewnątrzpochodnego układu krzepnięcia lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, w tym z czynnikami IX/IXa, X/Xa,

187 274

XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oraz z trombiną i hamującego zakrzepicę w taki sposób, że zapewnia się ograniczoną modulację krzepnięcia.

„Ograniczona modulacja krzepnięcia” oznacza wydłużenie czasu krzepnięcia, którego miarą jest wydłużenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) , przy czym osocze zachowuje zdolność do krzepnięcia przy maksymalnej wartości aPTT mimo zwiększania stężenia przeciwciała monoklonalnego. Ta ograniczona modulacja krzepnięcia różni się zasadniczo od działania nadmiernego stężenia heparyny na osocze, w wyniku którego osocze traci zdolność do krzepnięcia i wykazuje nieskończone wartości aPTT. Korzystnie, maksymalna wartość aPTT w sposobach według niniejszego wynalazku pozostaje w zakresie terapeutycznym heparyny. Najkorzystniej, maksymalny aPTT pozostaje w zakresie od około 35 sek. do około 100 sek., co odpowiada wydłużeniu aPTT od około 1,5 do około 3,5 raza w porównaniu z prawidłową próbką kontrolną. W jednym z wykonań niniejszego wynalazku dochodzi do wydłużenia aPTT bez istotnego wydłużenia czasu protrombinowego (PT).

„Zmienione przeciwciało” oznacza białko kodowane przez zmieniony region kodujący immunoglobuliny, który można uzyskać poprzez ekspresję w dobranej komórce gospodarza. Do takich zmienionych przeciwciał należą przeciwciała wytwarzane technikami inżynierii genetycznej (na przykład przeciwciała chimeryczne lub humanizowane), lub fragmenty przeciwciał, w których brak jest całości lub fragmentu części stałej immunoglobuliny, na przykład Fv, Fab, Fab' lub F(ab')2, lub tym podobne.

„Zmieniony region kodujący immunoglobuliny” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą zmienione przeciwciało według niniejszego wynalazku. Kiedy zmienione przeciwciało stanowi przeciwciało przeszczepione przez CDR lub humanizowane, sekwencje kodujące regiony determinujące dopasowanie (CDR), z immunoglobulin nie pochodzących od człowieka, wprowadza się do pierwszego partnera immunoglobuliny, zawierającego ludzkie zmienne sekwencje ramek odczytu. Ewentualnie, pierwszy partner immunoglobuliny jest połączony, w sposób umożliwiający działanie, z drugim partnerem immunoglobuliny.

„Pierwszy partner immunoglobuliny” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzką ramkę odczytu lub ludzką część zmienną immunoglobuliny, w których natywne (to znaczy występujące w naturze) regiony kodujące CDR zastąpiono regionami kodującymi CDR przeciwciała-dawcy. Ludzka część zmienna może stanowić łańcuch ciężki immunoglobuliny, łańcuch lekki (lub oba łańcuchy), ich analog lub funkcjonalne fragmenty. Takie regiony CDR, umiejscowione w części zmiennej przeciwciał (immunoglobulin), można oznaczać sposobami znanymi ze stanu techniki. Na przykład Kabat i wsp., w „Seąuences of Proteins of Immunological Interest”, wyd. IV, US Department of Health and Humań Services, National Institutes of Health (1987) opisał zasady lokalizowania CDR. Ponadto znane są programy komputerowe, za pomocą których można identyfikować regiony/struktury CDR.

„Drugi partner immunoglobuliny” oznacza inną sekwencję nukleotydową kodującą białko lub peptyd, w którym pierwszy partner immunoglobuliny uległ fuzji w ramce lub poprzez konwencjonalną sekwencję łącznikową (to znaczy, z którym jest on związany w sposób umożliwiający działanie). Korzystnie, stanowi go gen immunoglobuliny. Drugi partner immunoglobuliny może stanowić sekwencja kwasu nukleinowego, kodująca całą część stałą dla tego samego (to znaczy homologicznego, przy czym zmienione przeciwciała pierwsze i drugie pochodzą z tego samego źródła) lub dodatkowego (to znaczy heterologicznego) przeciwciała. Może nim być łańcuch ciężki lub lekki immunoglobuliny (lub oba łańcuchy jako część jednego polipeptydu). Drugi partner immunoglobuliny nie jest ograniczony do konkretnej klasy lub izotypu immunoglobulin. Ponadto, drugi partner immunoglobuliny może zawierać fragment części stałej immunoglobuliny, taki na przykład jak znajduje się w Fab lub F(ab')2 (to znaczy, fragment odpowiedniej ludzkiej części stałej lub ramki odczytu). Taki drugi partner immunoglobuliny może również zawierać sekwencję kodującą, integralne białko błony komórkowej, znajdujące się na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, na przykład jako część biblioteki faga, lub sekwencję kodującą białko do wykrywania diagnostycznego lub analitycznego, na przykład peroksydazę chrzanową β-galaktozydazę itd.

187 274

Terminów Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' i F(ab')2 używa się w ich konwencjonalnym znaczeniu. Por. na przykład Harlow i wsp., „Antibodies - A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

W rozumieniu niniejszego opisu „przeciwciało wytworzone technikami inżynierii genetycznej” oznacza rodzaj zmienionego przeciwciała, to znaczy przeciwciała syntetycznego o pełnej długości (na przykład, przeciwciało chimeryczne lub humanizowane, w przeciwieństwie do fragmentu przeciwciała), w którym fragmenty części zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała-biorcy zastąpiono analogicznymi częściami jedynego lub więcej przeciwciał-dawców, swoistych względem dobranego epitopu. Do takich cząsteczek należą na przykład przeciwciała cechujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim, połączonym z niezmienionym łańcuchem lekkim (lub chimerycznym łańcuchem lekkim), lub odwrotnie. Przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej charakteryzują się również zmianą sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących ramki odczytu części zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała-biorcy w celu zachowania swoistości wiązania przeciwciała-dawcy. Przeciwciała takie mogą zawierać podstawienie jednego lub kilku CDR (korzystnie, wszystkich) z przeciwciał-biorców przez CDR pochodzące z opisanych przeciwciał-dawców. „Przeciwciało chimeryczne” oznacza rodzaj przeciwciała wytworzonego technikami inżynierii genetycznej, zawierającego naturalnie występującą część zmienną (łańcuch lekki i łańcuchy ciężkie) pochodzącą z przeciwciała-dawcy, w połączeniu z częściami stałymi łańcuchów lekkich i ciężkich, pochodzących z przeciwciał-biorców.

„Przeciwciało humanizowane” oznacza rodzaj przeciwciała wytworzonego technikami inżynierii genetycznej, którego CDR pochodzą z immunoglobuliny-dawcy, nie pochodzącej od człowieka, przy czym pozostałe fragmenty cząsteczki, pochodzące z immunoglobulin, pochodzą z jednej lub więcej immunoglobulin ludzkich. Ponadto, pozostałe, wspierające części ramek odczytu są zmienione dla zachowania powinowactwa wiązania. Por. na przykład Queen i wsp., Proc. Natl Acad Sci USA, 86,10029-10032 (1989), Hodgson i wsp., Bio/Technology, 9,421 (1991).

Termin „przeciwciało-dawca” oznacza przeciwciało monoklonalne lub rekombinacyjne, dostarczające sekwencji kwasu nukleinowego swych części zmiennych, CDR lub innych fragmentów czynnościowych, lub ich analogów, dla pierwszego partnera immunoglobuliny, tak aby zapewnić zmieniony region kodujący immunoglobuliny i w wyniku tego ekspresję zmienionego przeciwciała o swoistości antygenowej i swoistości neutralizującej charakterystycznej dla przeciwciała-dawcy. Jednym z przeciwciał-dawców, korzystnych w zastosowaniu według mniejszego wynalazku, jest samoograniczające się neutralizujące mysie przeciwciało monoklonalne, oznaczone jako BC2. Do innych korzystnych przeciwciał-dawców należą samoograniczające się neutralizujące mysie przeciwciała monoklonalne, oznaczone jako BC1, 9E4(2)F4, 11 G4(1)B9, HFKLC i HFXI.

Termin „przeciwciało-biorca” oznacza przeciwciało monoklonalne lub rekombinacyjne, heterologiczne w stosunku do przeciwciała-dawcy, dostarczające całości lub fragmentu sekwencji kwasu nukleinowego, kodującego jego ramki odczytu łańcuchów ciężkich i/lub lekkich i/lub jego części stałych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich dla pierwszego partnera immunoglobuliny. Korzystnie, przeciwciało-biorcę stanowi przeciwciało ludzkie. „CDR” oznacza sekwencje aminokwasowe regionu determinującego dopasowanie przeciwciała, stanowiące regiony hiperzmienne łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Por. na przykład Kabat i wsp., w „Seąuences of Proteins of Immunological Interest”, wyd. IV, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). W części zmiennej immunoglobuliny znajdują się trzy CDR, czyli regiony CDR łańcuchów ciężkich i trzy CDR łańcuchów lekkich. Tak więc, termin „CDR” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza wszystkie trzy CDR łańcucha ciężkiego lub wszystkie trzy CDR łańcucha lekkiego, lub zarówno wszystkie CDR łańcuchów ciężkich, jak i wszystkie CDR łańcuchów lekkich, jeżeli jest to odpowiednie.

CDR dostarcza większości reszt kontaktowych dla wiązania się przeciwciała z antygenem lub epitopem. CDR według niniejszego wynalazku pochodzą z sekwencji zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała-dawcy, i należą do nich analogi naturalnie występujących cDr, przy czym analogi te mają, lub zachowują, tę samą swoistość wiązania antygenu i/lub zdolność do neutralizacji, co przeciwciało-dawca, z którego pochodzą.

187 274

Poprzez „posiadanie takiej samej swoistości wiązania antygenu lub zdolności do neutralizacji” rozumie się, na przykład, że jakkolwiek PM BC2 cechuje się w pewnym stopniu samoograniczającą aktywnością neutralizującą, CDR kodowane przez sekwencję kwasu nukleinowego BC2 w odpowiednim środowisku strukturalnym może wykazywać niższą lub wyższą aktywność. Oczekuje się, że CDR BC2 w takim środowisku będzie jednak rozpoznawać ten sam epitop, lub epitopy, co BC2.

„Fragment czynnościowy” oznacza część sekwencji zmiennej łańcucha ciężkiego lub lekkiego (na przykład, po delecji niewielkiego fragmentu na końcu aminowym lub karboksylowym regionu zmiennego immunoglobuliny), zachowującą tę samą swoistość wiązania antygenu i/lub zdolność do neutralizacji, co przeciwciało, z którego fragment pochodzi.

„Analog” stanowi sekwencję aminokwasową zmodyfikowaną co najmniej jednym aminokwasem, przy czym ta modyfikacja może być chemiczna lub może stanowić substytucję lub przegrupowanie kilku aminokwasów (to znaczy, nie więcej niż 10), przy czym modyfikacja ta umożliwia zachowanie przez tę sekwencję aminokwasową jej charakterystyki biologicznej, na przykład swoistości antygenowej lub wysokiego powinowactwa, sekwencji niezmodyfikowanej. Do przykładów takich analogów należą ciche mutacje, które można wytworzyć poprzez substytucję, tak aby wytworzyć pewne miejsca restrykcyjne endonukleaz wewnątrz lub w sąsiedztwie regionów kodujących CDR.

Analogi mogą również stanowić wariacje alleliczne. „Wariacja lub modyfikacja alleliczna” oznacza zmianę sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej sekwencje aminokwasowe lub peptydowe według niniejszego wynalazku. Takie wariacje lub modyfikacje mogą być związane z degeneracją kodu genetycznego lub mogą być celowo wytworzone technikami inżynierii genetycznej dla zapewnienia odpowiedniej korzystnej charakteiy styki. Takie wariacje lub modyfikacje mogą być, lub nie, wynikiem zmian w dowolnej kodowanej sekwencji aminokwasowej. Termin „środki efektorowe” oznacza niebiałkowe cząsteczki nośnikowe, z którymi zmienione przeciwciała i/lub naturalne lub syntetyczne łańcuchy lekkie lub ciężkie przeciwciał-dawców lub inne fragmenty przeciwciał-dawców można związać środkami konwencjonalnymi. Do takich nośników niebiałkowych należą konwencjonalne nośniki stosowane w diagnostyce, na przykład kulki z polistyrenu lub innego tworzywa sztucznego, polisacharydy, na przykład takie, jak zastosowane w systemie BIAcore (Pharmacia), lub inne substancje niebiałkowe, korzystne w zastosowaniu w medycynie i takie, które można bezpiecznie podawać ludziom i zwierzętom. Do innych czynników efektorowych należą makrocykle, do chelatowania atomów metali ciężkich, lub radioizotopy. Takie środki efektorowe mogą być również korzystne dla zwiększenia czasu półtrwania zmienionych przeciwciał, na przykład glikol polietylenowy. W celu wytworzenia przeciwciał, zmienionych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał według niniejszego wynalazku, można stosować przeciwciała gatunków innych niż człowiek, na przykład przeciwciała bydlęce, baranie, małpie, kurze, przeciwciała gryzoni (na przykład mysie i szczurze) w celu wytworzenia korzystnych immunoglobulin po prezentacji ludzkiego czynnika krzepnięcia, korzystnie czynnika IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombiny, lub epitopu peptydowego jednego z tych czynników. Stosuje się konwencjonalne techniki hybrydoma w celu wytworzenia linii komórkowej hybrydoma, wydzielającej PM inne niż ludzkie, skierowane przeciwko odpowiedniemu czynnikowi krzepnięcia. Hybrydoma takie następnie bada się przesiewowo pod kątem wiązania czynnika IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombiny, opłaszczonych na 96-zagłębieniowych płytkach, jak to opisano w Przykładach, lub zamiast tego wiązania biotynylowanego czynnika IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombiny, związanych z płytką opłaszczoną streptawidyną. Zamiast tego można wytwarzać całkowicie ludzkie PM technikami znanymi specjalistom, stosowanymi w niniejszym wynalazku.

Przykładem samoogranicząjącego się, neutralizującego PM według niniejszego wynalazku jest PM BC2, przeciwciało mysie, które można stosować do wytwarzania cząsteczki chimerycznej lub humanizowanej. PM BC2 cechuje się samoogranicząjącym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia. Działanie PM BC2, mierzone jako aPTT, wykazuje wartość maksymalną około 100 sekund. PM BC2 wiąże również czynnik IXa, hamuje przejście czynnika IX do IXa i hamuje aktywność czynnika IXa. Dla jego aktywności niezbędne są kofaktory

187 274 metali dwuwartościowych, przy czym PM wykazuje większą preferencję wobec Ca²⁺, niż wobec MN²⁺. Obserwowany IC50 w teście aPTT wynosi około 50 nM. PM BC2 wykazuje krzyżową reaktywność międzygatunkową z czynnikami krzepnięcia szczura i należy do izotypu IgG2a.

Inne korzystne przeciwciała-dawców stanowią mysie PM BC1, 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9. Te PM cechują się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia. Działanie tych PM, mierzone jako aPTT, wykazuje wartość maksymalną około 90-100 sekund dla 9E4(2)F4 i około 80 sekund dla 11G4(1)B9.PM BC1 wiąże się również z czynnikiem IXa, hamuje aktywność czynnika IXa, jednak nie hamuje przejścia czynnika IX w IXa. Do tego działania nie jest niezbędny metal jako kofaktor. Obserwowane IC50 dla BC1 w teście aPTT wynosi około 35 nM. PM BC1 należy do izotypu IgG1.

Kolejnym korzystnym przeciwciałem-dawcą, cechującym się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia, jest mysie PM HFXLC. Wpływ PM HFXLC na czas krzepnięcia, mierzony jako aPTT, wykazuje wartość maksymalną około 50-60 sekund. PM HFXLC wiąże się z łańcuchem lekkim czynnika X i hamuje aktywność czynników X/Xa. Obserwowane IC50 w teście aPTT wynosi około 20 nM.

Kolejnym korzystnym przeciwciałem-dawcą, cechującym się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia, jest mysie PM HFXI. Wpływ PM HFXI na czas krzepnięcia, mierzony jako aPTT, wykazuje wartość maksymalną około 100 sekund. PM HFXLC wiąże się z czynnikiem XI i hamuje aktywność czynników XI/XIa. Obserwowane IC50 w teście aPTT wynosi około 30 nM. Jakkolwiek nie opowiadamy się za żadną konkretną teorią odnośnie mechanizmu działania, jak się wydaje, te PM regulują krzepnięcie w mechanizmie niekompetycyjnym, lub allosterycznym, w którym do tylko częściowego hamowania. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do zastosowania BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI lub ich sekwencji hiperzmiennych (to znaczy CDR) Zamiast nich można stosować jakiekolwiek odpowiednie przeciwciała o wysokim powinowactwie, cechujące się samoograniczającą się aktywnością neutralizującą, i odpowiednie CDR. Identyfikację przeciwciał-dawców wponiższym opisie jako BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFKLC lub HFXI przedstawiono jedynie dla ilustracji i uproszczenia opisu. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie fragmentów Fab lub fragmentów F(ab')₂, pochodzących z PM, skierowanych przeciwko odpowiednim ludzkim czynnikom lub kofaktorom krzepnięcia. Fragmenty te są korzystne do stosowania jako środki o samoograniczającej się aktywności neutralizującej przeciwko czynnikom krzepnięcia, korzystnie, przeciwko czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, Vn/VIIa lub trombinie. Fragment Fab zawiera cały łańcuch lekki i końcową część aminową łańcucha ciężkiego. Fragment F(ab')₂ stanowi fragment utworzony przez dwa fragmenty Fab, związane mostkami dwusiarczkowymi. PM BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11 G4(1)B9, HFXLC i HFXI oraz inne podobne przeciwciała o wysokim powinowactwie stanowią źródło fragmentów Fab i F(ab')₂, które można wytwarzać konwencjonalnymi sposobami, na przykład poprzez rozcięcie PM odpowiednimi enzymami proteolitycznymi, papainą i/lub pepsyną, lub technikami rekombinacyjnymi. Te fragmenty Fab i F(ab')2 są same w sobie korzystne jako środki lecznicze, zapobiegawcze lub diagnostyczne, jak również jako dawcy sekwencji, włączając w to części zmienne i sekwencje CDR korzystne do wytwarzania rekombinacyjnych lub humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku. Fragmenty Fab i F(ab')2 można wytwarzać poprzez kombinatoryczną bibliotekę faga (por. na przykład Winter i wsp., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994), lub poprzez przegrupowywanie łańcuchów immunoglobulin (por. np. Marks i wsp., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); obie te publikacje w całości włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie, przy czym umożliwia się wiązanie Fd lub immunoglobuliny v_H z dobranego przeciwciała (na przykład BC2) z łańcuchami lekkimi lub ciężkimi rozmaitych immunoglobulinami, V_L (lub v_K) w celu wytworzenia nowych Fab. Przeciwnie, umożliwia się wiązanie lekkich łańcuchów immunoglobuliny (dobranego przeciwciała) z ciężkimi łańcuchami rozmaitych immunoglobulin, vh (lub Fd), dla wytworzenia nowych Fab. Samoograniczające się, neutralizujące Fab, skierowane przeciwko czynnikowi IX, można wytworzyć poprzez umożliwienie wiązania Fd przeciwciała monoklonalnego BC2 z lekkimi łańcuchami rozmaitych immunoglobulin. Tak

187 274 więc można wytworzyć neutralizujące Fab o unikalnych sekwencjach (nukleotydowych i aminokwasowych), stosując technikę przegrupowywania łańcuchów.

PM BC2 lub inne wyżej opisane przeciwciała mogą dostarczać sekwencji, na przykład zmiennych sekwencji peptydowych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich, sekwencji ramek odczytu, sekwencji CDR, ich fragmentów czynnościowych i analogów, oraz kodujących sekwencji kwasu nukleinowego, korzystnych w projektowaniu i wytwarzaniu rozmaitych zmienionych przeciwciał, cechujących się swoistością wiązania antygenu taką samą, jak przeciwciało-dawca. Sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku lub jej fragmenty, kodujące zmienne sekwencje peptydowe łańcuchów lekkich i ciężkich, są również korzystne do mutagennego wprowadzania swoistych zmian w obrębie sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących regiony CDR lub regiony ramek odczytu, oraz do wprowadzania powstałych zmodyfikowanych sekwencji kwasu nukleinowego, lub takich sekwencji, które uległy fuzji, do plazmidu w celu uzyskania ekspresji. Na przykład, można stosować ciche podstawienia sekwencji nukleinowej regionów kodujących ramkę odczytu i CDR, w celu wytwarzania miejsc enzymów restrykcyjnych, ułatwiających insercję zmutowanych regionów CDR i/lub ramki odczytu. Te regiony kodujące CDR można stosować do wytwarzania humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku.

Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego BC2 wymieniono w SEQ ID nr 5 i 7. Sekwencje CDR z tego regionu wymieniono w SEQ ID nr 8, 9 i 10. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego BC2 wymieniono w SEQ ID nr 6 i 11. Sekwencje CDR z tego regionu wymieniono w SEQ ID nr 12,13 i 14. Biorąc pod uwagę degenerację kodu genetycznego, można wytwarzać rozmaite sekwencje, kodujące zmienne sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich i sekwencje CDR według niniejszego wynalazku, jak również ich czynnościowe fragmenty lub analogi, posiadające tę samą swoistość antygenową, co przeciwciało-dawca. Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, lub jego fragmenty, kodujące zmienne sekwencje peptydowe łańcucha lub CDR, można stosować do wytwarzania zmienionych przeciwciał, na przykład przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych, lub innych przeciwciał wytwarzanych technikami inżynierii genetycznej według niniejszego wynalazku, po połączeniu w sposób umożliwiający działanie z drugim partnerem immunoglobuliny.

Należy zauważyć, że oprócz izolowanych sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących części zmienionego przeciwciała i przeciwciał według niniejszego wynalazku, inne takie sekwencje kwasu nukleinowego są objęte zakresem niniejszego wynalazku: na przykład sekwencje komplementarne do natywnych sekwencji kodujących CDR lub komplementarne do zmodyfikowanych ludzkich regionów ramki odczytu, otaczających regiony kodujące CDR. Do korzystnych sekwencji DNA należą sekwencje hybrydyzujące w ścisłych warunkach hybrydyzacji do sekwencji DNA. Por. T. Maniatis i wsp., Molecular Cloning (A Laboratory Manuał), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387-389. Przykładem takich ścisłych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 4XSSC, w temperaturze 65°C, i następnie płukanie w O,1XSSC w temperaturze 65°C, przez godzinę. Zamiast tego, innym przykładem ścisłych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 50% formamidzie, 4XSSC, w temperaturze 42°C. Korzystnie, te hybrydyzujące sekwencje DNA mają długość co najmniej około 18 nukleotydów, to znaczy są mniej więcej długości CDR.

Zmienione cząsteczki immunoglobulin mogą kodować zmienione przeciwciała, do których należą przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej, na przykład przeciwciała chimeryczne i humanizowane. Korzystny region kodujący zmienionej immunoglobuliny zawiera regiony kodujące CDR, które kodują peptydy posiadające swoistość antygenową przeciwko czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombinie, korzystnie, przeciwciała o wysokim powinowactwie według niniejszego wynalazku, które poddaje się insercji do pierwszego partnera immunoglobuliny, na przykład do ludzkiej ramki odczytu lub ludzkiego regionu zmiennego immunoglobuliny. Korzystnie, pierwszy partner immunoglobuliny łączy się w sposób umożliwiający działanie z drugim partnerem immunoglobuliny. Drugi partner immunoglobuliny jest taki, jak to zdefiniowano powyżej, i może obejmować sekwencję kodującą drugi region przeciwciał, na przykład region Fc. Do drugich partnerów immuno14

187 274 globulin należą również sekwencje kodujące inną immunoglobulinę, która uległa fuzji z regionem stałym łańcucha lekkiego lub ciężkiego w ramce odczytu lub za pomocą sekwencji łączącej. Technikami inżynierii genetycznej można wytworzyć przeciwciała skierowane przeciwko czynnościowym fragmentom lub analogom czynników krzepnięcia w celu uzyskania zwiększonego wiązania z tym samym przeciwciałem.

Drugi partner immunoglobuliny może również być związany ze środkami efektorowymi, zdefiniowanymi powyżej, w tym z niebiałkowymi cząsteczkami nośnikowymi, z którymi drugi partner immunoglobuliny jest związany konwencjonalnymi sposobami w sposób umożliwiający działanie.

Fuzji lub łączenia pomiędzy drugimi partnerami immunoglobuliny, na przykład sekwencjami przeciwciał, a środkiem efektorowym można dokonać dowolnymi odpowiednimi sposobami, na przykład z zastosowaniem konwencjonalnych wiązań kowalentnych lub jonowych, fuzji białek lub linkerów krzyżowych hetero-dwufunkcyjnych, na przykład karbodiimidu, aldehydu glutarowego i tym podobnych. Sposoby takie są znane ze stanu techniki i opisane w konwencjonalnych podręcznikach chemii i biochemii.

Ponadto, do regionu kodującego zmienioną immunoglobulinę można również wprowadzić konwencjonalne sekwencje łączące, zapewniające po prostu korzystną odległość między drugim partnerem immunoglobuliny a środkiem efektorowym. Takie sekwencje łączące (linkery) są dobrze znane specjalistom. ,

Ponadto, sekwencje sygnałowe cząsteczek według niniejszego wynalazku można modyfikować sposobami znanymi specjalistom w celu zwiększenie ekspresji.

Korzystne zmienione przeciwciało zawiera zmienną sekwencję peptydową lub białkową łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego o swoistości antygenowej PM BC2, na przykład łańcucha Vh i v_L. Inne korzystne zmienione przeciwciało według niniejszego wynalazku cechuje się sekwencją aminokwasową, zawierającą co najmniej jeden, a korzystnie, wszystkie CDR regionu zmiennego łańcuchów ciężkich i/lub lekkich cząsteczki mysiego przeciwciała BC2, przy czym pozostałe sekwencje pochodzą od człowieka, lub jej czynnościowym fragmentem lub analogiem. W innym wykonaniu, do zmienionego przeciwciała według niniejszego wynalazku może być przyłączony dodatkowy środek. Na przykład, można z zastosowaniem rekombinacyjnej technologii DNA wytworzyć zmienione przeciwciało według niniejszego wynalazku, w którym fragment Fc lub domenę CH2 CH3 pełnej cząsteczki przeciwciała zastąpiono enzymem lub inną wykrywalną cząsteczką (na przykład, polipeptydową cząsteczką efektorową lub reporterową). Drugi partner immunoglobuliny może również być połączony w sposób umożliwiający działanie z nieimmunoglobulinowym peptydem, białkiem lub jego fragmentem, heterologicznym w stosunku do sekwencji zawierającej CDR, o swoistości antygenowej przeciwko czynnikowi krzepnięcia, korzystnie, przeciwko czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombinie. Powstałe w wyniku tego białko może wykazywać zarówno swoistość antygenową, jak i charakterystykę nieimmunoglobuliny po ekspresji. Charakterystyka tego partnera fuzji może być na przykład charakterystyką czynnościową, tak jak w przypadku innej domeny wiązani lub receptora, lub charakterystyką terapeutyczną, jeżeli partner fuzji sam w sobie jest białkiem o działaniu terapeutycznym lub ma dodatkową charakterystykę antygenową.

Inne pożądane białko według niniejszego wynalazku może zawierać cząsteczkę kompletnego przeciwciała, zawierającą ciężkie i lekkie łańcuchy o pełnej długości lub jakikolwiek osobny ich fragment, takie jak fragmenty Fab lub F(ab')2, dimer łańcucha ciężkiego lub jakiekolwiek minimalne ich fragmenty, takie jak Fv lub przeciwciała o pojedynczym łańcuchu (SCA), albo jakąkolwiek inną cząsteczkę o swoistości takiej samej jaką ma wybrane monoklonalne przeciwciało-dawca, na przykład PM BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC lub HFXI. Białko takie można stosować w postaci przeciwciała zmienionego, albo w postaci niesprzężonej.

Ilekroć drugi partner immunoglobuliny pochodzi od przeciwciała innego niż przeciwciało-dawca, na przykład izotyp lub klasa ramki odczytu immunoglobuliny lub stałe regiony, powstaje przeciwciało wytworzone technikami inżynierii genetycznej. Przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej mogą zawierać stałe regiony immunoglobuliny (Ig) i zmienne regiony ramki odczytu pochodzące z jednego źródła, na przykład przeciwciałobiorcę, albo jeden lub większą ilość (korzystnie wszystkie) regiony determinujące dopasowa187 274 nie (CDR) z przeeiwciała-dawcy, na przykład skierowane przeciw czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub przeciwciała trombinowe opisane w niniejszym opisie. Poza tym, w celu zachowania swoistości wiązania antygenu przez przeciwciało-dawcę, można dokonać zmian (na przykład delecji, podstawień lub addycji) regionu ramki odczytu lekkiej i/lub ciężkiej zmiennej domeny monoklonalnego przeciwciała-dawcy na poziomie kwasu nukleinowego lub aminokwasu, albo regionów CDR-dawcy.

Takie wytworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała przeznaczone są do wykorzystywania jednego, lub obu zmiennych ciężkich i/lub lekkich łańcuchów omawianego PM (ewentualnie zmodyfikowanego, jak to opisano w niniejszym opisie), albo jednego, lub większej ilości CDR o ciężkich lub lekkich łańcuchach. Przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej według wynalazku wykazują samoograniczającą się aktywność neutralizacji.

Tego rodzaju wytworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała mogą obejmować humanizowane przeciwciało, zawierające regiony ramki odczytu wybranej ludzkiej immunoglobuliny łub podtypu albo przeciwciała chimerycznego zawierającego ludzkie regiony stałe łańcuchów ciężkich i lekkich, które uległy fuzji z czynnościowymi fagmentami przeciwciała czynnika krzepnięcia. Odpowiednim ludzkim (lub zwierzęcym) przeciwciałembiorcą może być jakiekolwiek przeciwciało wybrane z typowej bazy danych, na przykład z bazy danych KABAR®, bazy danych Los Alamos i bazy danych Swiss Protein, na podstawie homologii z sekwencjami nukleotydów i aminokwasów przeciwciała-dawcy. Do dostarczania zmiennego regionu ramki odczytu o ciężkim łańcuchu, w celu insercji CDR-dawców, może okazać się właściwe przeciwciało ludzkie charakteryzujące się homologią regionu ramki odczytu (na podstawie aminokwasów). W podobny sposób można dobrać odpowiednie przeciwciało-biorcę, zdolne do dostarczania zmiennych regionów ramki odczytu o łańcuchach lekkich. Należy zauważyć, że nie jest tu wymagane pochodzenie ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała-biorcy od tego samego przeciwciała-biorcy.

Korzystnie, heterologiczną ramkę odczytu i regiony stałe dobiera się spośród klas i izotypów immunoglobulin ludzkich, takich jak IgG (podtypy 1 do 4), IgM, IgA i IgE. Jednakże, przeciwciało-biorca nie musi obejmować jedynie sekwencji białkowych immunoglobuliny ludzkiej. I tak, na przykład, można skonstruować taki gen, w którym sekwencja DNA kodująca część łańcucha immunoglobuliny ludzkiej uległa fuzji z sekwencją DNA kodującą nieimmunoglobulinową sekwencję aminokwasów, taką jak polipeptydowa cząsteczka efektorowa lub reporterowa.

Szczególnie korzystne przeciwciało humanizowane zawiera CDR z BC2 wbudowane w regiony ramki odczytu wybranej sekwencji przeciwciała ludzkiego. W celu neutralizacji humanizowanych przeciwciał, dokonuje się insercji jednego, dwóch lub trzech CDR ze zmiennych regionów łańcuchów ciężkich i/lub lekkich przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi IX, do regionów ramki odczytu wybranej sekwencji ludzkiego przeciwciała, z zastąpieniem jego natywnych CDR.

Korzystnie, w humanizowanym przeciwciele dokonuje się technikami inżynierii genetycznej przekształceń zmiennych domen w ludzkich ciężkich i lekkich łańcuchach, na drodze jednego, lub większej ilości podstawień CDR. Można wykorzystać wszystkie sześć CDR albo rozmaite kombinacje mniejszej (niż sześć) ich ilości. Korzystnie, dokonuje się podstawienia wszystkich sześciu CDR. Możliwe jest tu podstawienie CDR jedynie w ludzkim łańcuchu ciężkim, przy użyciu, jako łańcucha lekkiego, niemodyfikowanego łańcucha lekkiego z ludzkiego przeciwciała-biorcy. W dalszym ciągu alternatywnie, zgodny łańcuch lekki można wybrać spośród innego przeciwciała ludzkiego, przez wykorzystanie typowych baz danych dla przeciwciał. Pozostała część wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała może pochodzić z jakiejkolwiek stosownej ludzkiej immunoglobuliny-biorcy.

Tak więc, humanizowane przeciwciało wytworzone techniką inżynierii genetycznej korzystnie ma budowę naturalnego ludzkiego przeciwciała, lub jego fragmentu, i odznacza się kombinacją właściwości potrzebnych do skutecznych zastosowań terapeutycznych, na przykład do leczenia chorób zakrzepowych i zatorowych u człowieka.

Najkorzystniej, humanizowane przeciwciała posiadają sekwencję aminokwasów łańcucha ciężkiego taką jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 31, 52 lub 89. Także, najkorzystniejsze

187 274 są humanizowane przeciwciała posiadające sekwencje aminokwasów łańcucha lekkiego taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 i 99.

Szczególnie korzystne jest przeciwciało humanizowane SB 249413, w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 31, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 44. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB 249415, w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 57. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB 249416, w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 62. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB 249417, w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 74. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB 257731, w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 78. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB 257732, w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 89, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 99.

Specjaliści w tej dziedzinie techniki rozumieją, że wytworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało można modyfikować w dalszym ciągu, przez dokonywanie zmian aminokwasów w zmiennej domenie, z uniknięciem niezbędnego w takim przypadku wpływu na swoistość i wysokie powinowactwo przeciwciała-dawcy (to znaczy analoga). Przewiduje się, że aminokwasy łańcuchów ciężkich i lekkich można zastępować innymi aminokwasami, albo w zmiennych domenach ramek odczytu lub w CDR, albo i w jednych i w drugich. Te podstawienia mogą być zapewnione przez przeciwciało-dawcę lub sekwencje największej zgodności z konkretnej podgrupy.

Oprócz tego, region stały można zmienić w taki sposób, aby wzmóc lub osłabić selekcyjne właściwości cząsteczek według niniejszego wynalazku. Na przykład, dotyczy to dimeryzacji, wiązania się z receptorami Fc lub zdolności do wiązania się i aktywowania dopełniacza [patrz, na przykład: Angal i in., Mol. Immunol., 30, 105 - 108 (1933); Xu i in., J. Biol. Chem., 269, 3469 - 3474 (1994); Winter i in., EP 307434-B) .

Zmienione przeciwciało, stanowiące przeciwciało chimeryczne, różni się do humanizowanych przeciwciał powyżej opisanych tym, że dostarcza całkowite zmienne regiony łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego innego niż ludzkie przeciwciała-dawcy, włącznie z regionami ramki odczytu, razem ze stałymi regionami immunoglobuliny ludzkiej dla obu łańcuchów. Przypuszcza się, że chimeryczne przeciwciała zachowujące dodatkową, inną niż ludzka, sekwencję, pokrewne humanizowanym przeciwciałom według niniejszego wynalazku, mogą wywoływać u ludzi znaczącą odpowiedź immunologiczną.

Przwciwciała takie są użyteczne pod względem zapobiegania i leczenia zaburzeń zakrzepowych i zatorowych, jak to omówiono w poniższej części niniejszego opisu.

Korzystnie, zmienne sekwencje łańcuchów lekkich i/lub ciężkich oraz CDR z PM BC2, lub inne odpowiednie PM-dawcy, na przykład BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI i ich kodujące sekwencje kwasów nukleinowych, wykorzystuje się w konstruowaniu zmienionych przeciwciał, korzystnie przeciwciał humanizowanych, według niniejszego wynalazku, z zastosowaniem następującego sposobu postępowania. Takich samych lub podobnych metod można użyć także do zrealizowania innych wykonań niniejszego wynalazku.

Hybrydomę wytwarzającą wybranego PM-dawcę, na przykład mysie przeciwciało BC2, poddaje się, dogodnie, klonowaniu i otrzymuje się DNA łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich jego regionów zmiennych, z wykorzystaniem sposobów postępowania znanych specjalistom w tej dziedzinie techniki, na przykład metod opisanych w: Sambrook i in., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, wyd. II, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Zmienne ciężkie i · lekkie regiony BC2, zawierające co najmniej regiony kodujące CDR i te części re187 274 gionów lekkiej i/lub ciężkiej zmiennej domeny ramki odczytu PM-biorcy, które są potrzebne do utrzymania swoistości wiązania PM-dawcy, jak również pozostałe, wywodzące się z immunoglobuliny części łańcucha przeciwciała pochodzącego z immunoglobuliny ludzkiej, otrzymuje się z zastosowaniem starterów polinukleotydowych i odwrotnej transkryptazy. Regiony kodujące CDR identyfikuje się z wykorzystaniem znanej bazy danych i przez porównania z innymi przeciwciałami.

Następnie można otrzymać przeciwciało chimeryczne „mysz-człowiek” i poddać je badaniu pod względem zdolności wiązania. Chimeryczne przeciwciało tego rodzaju zawiera całość regionów V_H i Vl innego niż ludzkie przeciwciała-dawcy, łącznie z regionami stałymi ludzkiej Ig dla obu łańcuchów.

Homologiczne regiony ramki odczytu łańcucha ciężkiego regionu zmiennego pochodzącego z ludzkiego przeciwciała identyfikuje się z zastosowaniem skomputeryzowanej bazy danych, na przykład KABAT®, a jako przeciwciało-biorcę wybiera się ludzkie przeciwciało wykazujące homologię z BC2. Sekwencje syntetycznych regionów zmienych ciężkich łańcuchów zawierające regiony kodujące CDR BC2 w obrębie ramki odczytu przeciwciała ludzkiego, zaprojektowane są, z ewentualnymi podstawieniami nukleotydów w regionach ramki odczytu, do włączania miejsc restrykcji. Następnie, przeprowadza się syntezę tej zaprojektowanej sekwencji przy użyciu długich oligomerów syntetycznych. Alternatywnie, zaprojektowaną sekwencję można zsyntetyzować przez doprowadzenie do zachodzenia na siebie oligonukleotydów, amplifikowania metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i skorygowania błędów. W podobny sposób można zaprojektować odpowiedni łańcuch lekki zmiennego regionu ramki odczytu.

Humanizowane przeciwciało można wyprowadzić z przeciwciała chimerycznego albo, korzystnie, może być wytworzone na drodze syntezy za pomocą insercji regionów kodujących CDR PM-dawcy z łańcuchów, odpowiednio, ciężkiego i lekkiego w obrębie wybranej ramki odczytu o łańcuchu ciężkim lub lekkim. Alternatywnie, humanizowane przeciwciało według wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem typowych metod dokonywania metagenezy. W rezultacie, wytworzone humanizowane przeciwciało zawiera ludzkie regiony ramki odczytu i regiony kodujące CDR PM-dawcy. Można też poddać następnie manipulacjom pozostałości ramki odczytu. Następnie, można przeprowadzić ekspresję otrzymanego tak humanizowanego przeciwciała w rekombinantowych komórkach-gospodarzach, na przykład w komórkach COS lub CHO albo w komórkach szpiczaka. Inne humanizowane przeciwciała można wytworzyć przy użyciu wspomnianej techniki z zastosowaniem innych odpowiednich przeciwciał, nie pochodzących od człowieka, swoistych względem czynnika IX lub innych czynników krzepnięcia krwi, samoograniczających się, neutralizujących i o wysokim powinowactwie.

Typowy wektor ekspresyjny lub plazmid rekombinantowy wytwarza się za pomocą usytuowania tych sekwencji kodujących dla zmienionego przeciwciała, w umożliwiające działanie połączenie z typowymi regulatorowymi sekwencjami kontrolnymi, zdolnymi do kontroli replikacji i ekspresji w komórce-gospodarzu i/lub w jej wydzielinie. Do sekwencji regulatorowych należą sekwencje promotorowe, na przykład promotor CMV, oraz sekwencje sygnałowe, które mogą wywodzić się z innych znanych przeciwciał. Podobnie, można wytworzyć drugi wektor ekspresyjny o sekwencji DNA, kodującej lekki lub ciężki łańcuch komplementarnego przeciwciała. Korzystnie, ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym, z różnicą odnoszącą się do sekwencji kodujących i dobieralnych znaczników, w celu zapewnienia, jak tylko jest to możliwe, czynnościowej ekspresji każdego łańcucha polipeptydowego. Alternatywnie, sekwencje kodujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki dla zmienionego przeciwciała mogą występować w pojedynczym wektorze.

Dokonuje się kotransfekcji wyselekcjonowanej tak komórki-gospodarza z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, z udziałem zarówno pierwszego jak i drugiego wektora (albo pojedynczej transfekcji z udziałem pojedynczego wektora), w wyniku czego otrzymuje się transfekowaną komórkę-gospodarza według wynalazku, zawierającą tak rekombinantowe jak i syntetyczne łańcuchy lekkie i łańcuchy ciężkie. Następnie przeprowadza się hodowlę transfekowanej komórki z wykorzystaniem typowych sposobów postępowania, w wyniku czego otrzymuje się wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało we18

187 274 dług wynalazku. Humanizowane przeciwciało, które obejmuje połączenie obu łańcuchów rekombinantowych, ciężkiego i/lub lekkiego, poddaje się skriningowi z hodowli, z wykorzystaniem stosownej metody, takiej jak ELISA lub RIA. Podobnych typowych metod można użyć do skonstruowania innych zmienionych przeciwciał i cząsteczek według niniejszego wynalazku.

Doboru wektorów nadających się do przeprowadzenia etapów klonowania i subklonowania, stosowanych w omawianych metodach i przy konstruowaniu kompozycji według niniejszego wynalazku, dokonać może specjalista w tej dziedzinie techniki. I tak, na przykład, można zastosować wektory klonujące serii pUC, na przykład pUC19, które są handlowo dostępne w odpowiednich firmach zaopatrujących, takich jak Amersham czy Pharmacia. Poza tym, do klonowania wykorzystać można jakikolwiek wektor zdolny do łatwego replikowania, posiadający znaczną ilość miejsc klonowania i dobieralnych genów (na przykład genów oporności na antybiotyki) i łatwy w manipulowaniu. Stąd też, selekcja wektora klonującego nie jest czynnikiem ograniczającym wykonanie niniejszego wynalazku.

Podobnie, wektory stosowane do ekspresji wywarzanych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał według niniejszego wynalazku specjalista w tej dziedzinie techniki może wybrać spośród dowolnych typowych wektorów. Wektory zawierają także wybrane sekwencje regulatorowe (takie jak promotory CMV) kierujące replikacją i ekspresją sekwencji heterologicznego DNA w wybranych komórkach-gospodarzach. Wektory te zawierają powyżej opisane sekwencje DNA, kodujące wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało lub zmieniony region kodujący immunoglobulinę. Oprócz tego, wektory mogą włączać wybrane sekwencje immunoglobulinowe zmodyfikowane w wyniku insercji pożądanych miejsc restrykcyjnych dla ułatwienia manipulacji.

Wektory ekspresyjne można także scharakteryzować przez geny nadające się do wzmożenia ekspresji sekwencji heterologicznego DNA, na przykład gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) ssaków. Do innych korzystnych sekwencji wektorowych należy sekwencja sygnałowa poli A, taka jak pochodząca z bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) oraz sekwencja promotora betaglobiny (betaglopro). Wektory ekspresyjne użyteczne w sposobie według niniejszego wynalazku można zsyntetyzować sposobami dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie techniki.

Składniki wektorów tego rodzaju, a mianowicie replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory, sekwencje sygnałowe itp., można otrzymać ze źródeł handlowych lub naturalnych, albo też można zsyntetyzować znanymi sposobami z przeznaczeniem do kierowania ekspresją i/lub wydzielaniem produktu rekombinantowego DNA w organizmie wybranego gospodarza. W omawianym przeznaczeniu można dobrać inne odpowiednie wektory ekspresyjne, których liczne typy znane są w dziedzinie wiedzy dotyczącej ekspresji u ssaków, bakterii, owadów, drożdżaków i grzybów.

Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem linię komórek transfekowanych plazmidem rekombinantowym zawierającym sekwencje kodujące wytworzonych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał lub ich zmienione cząsteczki immunoglobuliny. Typowe są również komórki-gospodarze użyteczne przy klonowaniu i innych manipulacjach z udziałem tych wektorów klonujących. Jednakże, i jest to najbardziej pożądane, do replikacji wektorów klonujących i do realizacji innych etapów konstruowania zmienionych przeciwciał według niniejszego wynalazku, używa się komórek pochodzących z rozmaitych szczepów E. coli.

Korzystnymi komórkami-gospodarzami lub liniami komórek nadającymi się do ekspresji inżynieryjnego przeciwciała lub zmienionego przeciwciała według wynalazku, są komórki ssaków, takie jak CHO, COS, fibroblast (na przykład 3T3) i komórki szpikowe, korzystniejszymi zaś są CHO i komórka szpikowa. Stosować można komórki ludzkie, umożliwiając w ten sposób modyfikację cząsteczki ludzkimi wzorcami glikozylacji.

Alternatywnie, posłużyć się tu można także i innymi liniami komórek eukariotycznych. Sposoby dokonywania selekcji odpowiednich komórek-gospodarzy ssaków i sposoby przeprowadzania transformacji, hodowli, amplifikacji, badania przesiewowego oraz otrzymywania produktu i oczyszczania, są znane w tej dziedzinie wiedzy. Patrz, na przykład: Sambrook i in. (wyżej).

Komórki bakteryjne mogą okazać się użyteczne jako komórki-gospodarze nadające się do ekspresji rekombinantowych Fab według niniejszego wynalazku [patrz, na przykład: A. Pluckthun,

187 274

Immunol. Rev., 130, 151 - 188 (1992)]. Jednakże, w wyniku przejawiania przez białka, których ekspresja odbywa się w komórkach bakteryjnych, tendencji do występowania w formie niesfałdowanej lub niewłaściwie sfałdowanej, albo w postaci nieglikozylowanej, każdy rekombinantowy Fab utworzony w komórce bakteryjnej należy poddać badaniu przesiewowemu pod względem zachowania zdolności wiązania antygenu. W przypadku, gdy cząsteczka, której ekspresja dokonała się w danej komórce bakteryjnej, została wytworzona w formie poprawnie sfałdowanej, tę komórkę bakteryjną należy uznać za pożądanego gospodarza. I tak, na przykład, rozmaite szczepy E. coli stosowane do przeprowadzania ekspresji są dobrze znane w biotechnologii jako komórki-gospodarze. Stosować tu można także rozmaite szczepy B. subtilis, Streptomyces, innych bakterii itp.

Tam, gdzie jest to pożądane, komórki drożdżaków ze szczepów znanych specjalistom w tej dziedzinie techniki, także są dostępne jako komórki-gospodarze. Dotyczy to również komórek owadzich, na przykład Drosophila i Lepidoptera, a także wirusowych systemów ekspresyjnych. Patrz, na przykład: Miller i in., Genetic Engineering, 8, 277 - 298, Plenum Press (1986) i przytoczone tam odnośniki.

Ogólne sposoby umożliwiające konstruowanie wektorów według wynalazku, sposoby dokonywania transfekcji niezbędne do wytwarzania komórek-gospodarzy według wynalazku i sposoby prowadzenia hodowli potrzebne do wytworzenia zmienionego przeciwiała według wynalazku z takich komórek-gospodarzy, są to metody typowe. Podobnie, zmienione przeciwciała według wynalazku, po ich wytworzeniu można poddać wyodrębnianiu z hodowli komórkowej i oczyszczaniu zgodnie z typowymi sposobami postępowania, włącznie z wysalaniem przy użyciu siarczanu amonu, zastosowaniem kolumn powinowactwa, chromatografii kolumnowej, elektroforezy żelowej itp.Techniki te są znane w tej dziedzinie wiedzy i nie stanowią ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku.

Jeszcze inny sposób dokonywania ekspresji humanizowanych przeciwciał może obejmować ekspresję w zwierzęciu transgenicznym tak, jak to opisano w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873316. Odnosi się to do systemu ekspresyjnego wykorzystującego promotor kazeiny zwierzęcia, który po transgenicznym włączeniu w organizm ssaka pozwala samicy wytwarzać pożądane rekombinantowe białko w jej mleku.

Po dokonaniu ekspresji w pożądany sposób, wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało poddaje się następnie badaniu pod względem jego in vitro aktywności, z zastosowaniem odpowiedniego testu. Obecnie, do oceny jakościowej i ilościowej wiązania się wytworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała z czynnikiem IX, lub innymi odpowiednimi czynnikami krzepnięcia, stosuje się typowe formaty testu ELISA. Oprócz tego, można posłużyć się także innymi próbami in vitro w celu sprawdzenia skuteczności neutralizacji, jeszcze przed przeprowadzeniem następujących później klinicznych badań na ludziach, przeprowadzanych w celu dokonania oceny trwałości utrzymywania się, wytworzonego technikami inżynierii genetycznej, przeciwciała w organizmie człowieka, pomimo istnienia zwykłych mechanizmów usuwania.

Postępując zgodnie ze sposobami opisanymi odnośnie do humanizowanych przeciwciał wytworzonych z BC2, specjalista w tej dziedzinie techniki może także skonstruować humanizowane przeciwciała z innych przeciwciał-dawców, sekwencji zmiennych regionów i peptydów CDR opisanych w niniejszym opisie. Wytwarzane technikami inżynierii genetycznej przeciwciała można otrzymywać z udziałem regionów zmiennych ramek odczytu potencjalnie rozpoznanych jako „własne” przez biorców przeciwciała wytworzonego techniką inżynierii genetycznej. Można wprowadzić nieznaczne modyfikacje regionów zmiennych ramek odczytu w celu spowodowania dużego wzmożenia wiązania antygenu i to bez poważniejszego zwiększenia immunogenności u biorcy. Tego rodzaju wytwarzane technikami inżynierii genetycznej przeciwciała mogą skutecznie leczyć ludzi w stanach, w których pośredniczy czynnik krzepnięcia krwi. Przeciwciała te mogą także być użyteczne w diagnostyce takich stanów.

Wynalazek niniejszy dotyczy także sposobu hamowania zakrzepicy u zwierząt i, zwłaszcza, u ludzi, polegającego na podawaniu skutecznej dawki monoklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw czynnikom krzepnięcia i odznaczającego się samoograniczającą się aktywnością neutralizującą. Korzystnie, czynnik krzepnięcia pochodzi z układu wewnątrzpochodnego

187 274 lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Najkorzystniej, monoklonalne przeciwciało będące czynnikiem przeciwkrzepliwym stanowi czynnik skierowany przeciw następującym czynnikom: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik VIIIa, czynnik V, czynnik Va, czynnik VII, czynnik VIIa lub przeciw trombinie. PM mogą obejmować jeden, lub większą ilość przeciwciał wytworzonych technikami inżynierii genetycznej lub przeciwciał zmienionych, opisanych w niniejszym opisie, albo ich fragmentów.

Alternatywnie, łącznie z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw czynnikowi krzepnięcia można podawać kwas acetylosalicylowy. W niektórych przypadkach, leczenie skojarzone pozwala obniżyć terapeutycznie skuteczną dawkę monoklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia.

Odpowiedź terapeutyczna wywołana zastosowaniem cząsteczek według niniejszego wynalazku powstaje w wyniku wiązania się ich z odpowiednim czynnikiem krzepnięcia krwi, z następującym potem samoograniczającym się zahamowaniem kaskady krzepnięcia. I tak, cząsteczki według niniejszego wynalazku, występujące w postaci preparatów odpowiednich do zastosowań farmaceutycznych, są wysoce pożądane dla osób wrażliwych na nienormalną aktywność krzepnięcia (lub doświadczających jej) związaną ale bez ograniczania się tylko do tego, z zawałem mięśnia serca, niestabilną dusznicą bolesną migotaniem przedsionków, udarem mózgu, uszkodzeniem nerek, zakrzepem tętnicy płucnej, zakrzepicą żył głębokich oraz obecnością sztucznych narządów i implantów protezowych.

Zmienionych przeciwciał, przeciwciał i ich fragmentów według niniejszego wynalazku można także używać łącznie z innymi przeciwciałami, w szczególności z ludzkimi PM reagującymi z innymi markerami (epitopami) odpowiedzialnymi za stan, przeciw któremu skierowane jest inżynieryjne przeciwciało według wynalazku.

Sądzi się, że użycie środków terapeutycznych według niniejszego wynalazku pożądane jest w przypadku leczenia nieprawidłowych stanów związanych z krzepnięciem w okresie od około 1 dnia do około 3 tygodni. Stanowi to znaczący postęp w porównaniu z obecnie stosowanymi środkami przeciwkrzepliwymi, a mianowicie heparyną i warfaryną. Dawka i długość czasu leczenia związana jest z względnym czasem trwania cząsteczek według niniejszego wynalazku w krążeniu człowieka i fachowiec w tej dziedzinie techniki może je ustalić w zależności od rodzaju poddawanego leczeniu stanu chorobowego i od ogólnego stanu zdrowia pacjenta.

Można przyjąć dowolny sposób podawania środka terapeutycznego według wynalazku i dowolną drogę podawania, zapewniającą uwalnianie środka w organizmie przyjmującego. Zmienione przeciwciała, przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej i ich fragmenty, oraz kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są szczególnie przydatne do podawania pozajelitowego, to znaczy podskórnego, domięśniowego, dożylnego i donosowego.

Środki terapeutyczne według wynalazku można wytwarzać w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających, jako składnik aktywny, skuteczną ilość wytworzonego techniką inżynierii genetycznej (na przykład humanizowanego) przeciwciała według wynalazku w farmaceutycznie dozwolonym nośniku. Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą także zawierać kwas acetylosalicylowy. W przypadku profilaktycznego środka według wynalazku, korzystna jest wodna zawiesina lub wodny roztwór, zawierający wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało, korzystnie zbuforowane na poziomie fizjologicznego pH, w postaci gotowej do wstrzyknięcia. Kompozycje przeznaczone do podawania drogą pozajelitową zawierają, na ogół, roztwór wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku, lub jego koktajl, rozpuszczony w farmaceutycznie dozwolonym nośniku, korzystnie w nośniku wodnym. Można tu zastosować cały szereg różnych nośników wodnych, takich jak, na przykład, 0,4% wodny roztwór chlorku sodu, 0,3% glicyna itp. Roztwory te są jałowe i ogólnie nie zawierają substancji drobnoziarnistych. Roztwory te można wyjaławiać z zastosowaniem typowych, dobrze znanych metod sterylizacji (takich jak, na przykład, sączenie). Kompozycje mogą także zawierać farmaceutycznie dozwolone substancje pomocnicze, odpowiednio do potrzeby przybliżenia warunków fizjologicznych, a mianowicie takich, jak środki służące ustalaniu wartości pH, środki buforujące itd. Stężenie przeciwciała według wynalazku w tego rodzaju preparacie farmaceutycznym może wahać się w bardzo szerokich granicach, to znaczy w zakresie od mniej niż około 0,5% wag,

187 274 zazwyczaj około 1% wag lub co najmniej około 1% wag, do nawet 15 lub 20% wag. Stężenie to dobiera się przede wszystkim w oparciu o wielkość objętości cieczy, poziom lepkości itd., stosownie do przyjętego konkretnego sposobu podawania leku.

I tak, na przykład, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku przenaczoną do wstrzykiwań domięśniowych można sporządzić tak, aby zawierała 1 ml jałowej zbuforowanej wody i od około 1 ng do około 100 mg, na przykład od około 50 ng .do około 30 mg lub więcej, korzystnie od około 5 mg do około 25 mg, wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Podobnie, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku przeznaczoną do wlewów dożylnych można sporządzić tak, aby zawierała około 250 ml jałowego roztworu Ringera i od około 1 mg do około 30 mg, korzystnie od 5 mg do około 25 mg wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Obecnie stosowane sposoby wytwrzania kompozycji nadających się do podawania drogą pozajelitową są dobrze znane i będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie techniki. Są one opisane bardziej szczegółowo, na przykład, w: „Remington's Pharmaceutical Science”, wyd. XV, Mack Publishing Company, Easton, Pennsykania.

Korzystnie, środek terapeutyczny według wynalazku jako preparat farmaceutyczny występuje w postaci dawek jednostkowych. Odpowiednią dawkę terapeutycznie skuteczną może łatwo ustalić specjalista w tej dziedzinie wiedzy. W celu skutecznego leczenia zaburzeń zakrzepowych lub zatorowych u człowieka lub zwierzęcia, podać należy pozajelitowo, korzystnie i.v. łub i.m., jedną dawkę wynoszącą od około 0,1 mg do około 20 mg białka lub przeciwciała według wynalazku/kg masy ciała. Jeżeli jest to konieczne, dawkę tę można powtórzyć z zachowaniem stosownych odstępów czasu, dobranych jako odpowiednie przez lekarza w trakcie odpowiedzi trombotycznej.

Przeciwciała, zmienione przeciwciała lub ich fragmenty opisane w mniejszym opisie można zliofdizować w celu przechowywania i odtworzenia postaci pierwotnej, w odpowiednim nośniku, przed użyciem. Wykazano, że ten sposób postępowania jest skuteczny dla typowych immunoglobulin i można tu posłużyć się znanymi w tej dziedzinie techniki metodami liofilizacji i odtwarzania postaci pierwotnej.

Wynalazek objaśniają następujące konkretne przykłady, nie ograniczające zakresu wynalazku w żaden sposób.

Przykład 1

Wytwarzanie i badanie przesiewowe przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw czynnikowi IX.

Myszom, samicom Balb/C, wstrzyknięto ludzki czynnik IX, jak to opisali R. Jenny i in. [Prep. Biochem., 16, 227 - 245 (1986)]. Typowo, każda mysz otrzymała początkowe wstrzyknięcie 100 pg białka rozpuszczonego w 0,15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zmieszanej z 0,15 ml kompletnego adiuwanta Freunda. Mniej więcej co dwa tygodnie, w okresie 2-3 miesięcy, wykonywano uodpornianie przypominające z użyciem 50 pg białka w 0,15 ml PBS z 0,15 niekompletnego adiuwanta Freunda. Po ostatnim podaniu dawki przypominającej, mysz otrzymała 50 pg czynnika IX w PBS, na trzy dni przed fuzją komórek śledziony i szpiczaka. Komórki śledziony wyodrębniono z uodpornionej myszy i dokonano ich fuzji z komórkami szpiczaka NS-1 [G Kohler i in., Eur. J. Immunol., 6, 292 - 295 (1976)] z użyciem poli (glikolu etylenowego), jak to opisali V.T. Oi i in. w „Selected methods in Cellular Immunology”, red. B.B. Mishel i S.M. Shigii, Freeman Press, San Francisco. Po fuzji, komórki ponownie zawieszono w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% płodowych surowic cielęcych i podwielokrotne porcje umieszczono w dołkach czterech 24-dołkowych płytek zawierających w dołkach po 0,5 ml podłoża z płynem z płukania otrzewnowego kondycjonowanego komórkami. Następnego dnia, do każdego dołka wprowadzono 1,0 ml 2 χ 10⁴ M hipoksantyny, 8 χ 10'⁷ M aminopteryny i 3,2 x 10‘⁵ M płodowych surowic cielęcych. Komórki dokarmiano co 3 - 4 dni przez usunięcie połowy podłoża i zastąpienia jej świeżym podłożem zawierającym 1 χ 10⁴ M hipoksantyny i 1,6 χ 10’⁵ M tymidyny.

Po upływie około dwóch tygodni, z każdego dołka pobrano 1,0 ml podłoża hybrydomowego i poddano badaniu pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi IX, z zastosowaniem testu ELISA, jak to opisali R.J. Jenny i in. [Meth. Enzy22

187 274 mol., 222, 400 - 416 (1993)]. Mówiąc krótko, czynnik IX unieruchamiano na dołkach z tworzywa sztucznego w 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania. Hybrydomowe supernatanty lub rozcieńczenia oczyszczonego przeciwciała inkubowano następnie w dołkach. Dołki przemyto i obecność kompleksów przeciwciało-antygen wykrywano drugim, kozim przeciwciałem przeciw mysiej immunoglobulinie, sprzężonym z peroksydazą chrzanową i chromogennym substratem odianizydyną.

Dołki zawierające przeciwciała skierowane przeciw czynnikowi IX subklonowano za pomocą ograniczenia rozcieńczenia i hodowli w 96-dołkowych płytkach. Supernatant z klonowanych hodowli komórek hybrydomowych poddano badaniu przesiewowemu na obecność przeciwciała przeciw czynnikowi IX z zastosowaniem testu ELISA powyżej opisanego i komórki z hybrydomów pozytywnych ekspandowano i zamrażano, po czym przetrzymywano w ciekłym azocie, a następnie prowadzono ich wzrost jako guzów puchlinowych u myszy. Przykład 2

Samoograniczające się działanie przeciwciał, stanowiących czynnik przeciwkrzepliwy, w procesie krzepnięcia krwi.

Wpływ wzrostu stężenia przeciwciał stanowiących czynnik przeciwkrzepliwy na czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) osocza ludzkiego określano przy użyciu fibrometru (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) przy użyciu metody odniesieniowej Baxtera LIB0293-J, nowelizacja 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey).

Przed rozpoczęciem eksperymentu, do 5 ml probówki wprowadzono 2 do 3 ml 0,02 M CaC-k i probówkę umieszczono w ogrzewanej komorze fibrometru. Próbki osocza ludzkiej krwi albo pobierano na świeżo i przetrzymywano na lodzie, albo rekonstytuowano zgodnie z zaleceniami wytwórcy z Hemostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut).

Nie rozfrakcjonowaną heparynę z błon śluzowych świńskiego jelita (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), heparynę o małej masie cząsteczkowej z błon śluzowych świńskiego jelita (Lovenox®, sól sodowa enoksaparyny, Rhóne-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) lub środki przeciwkrzepliwe PM, wytworzono jako mniej więcej 50 pM roztwory macierzyste, kolejno rozcieńczane bezpośrednio do badanego osocza. Jako materiał odniesieniowy do badań włączono ślepą próbę zawierającą osocze bez środka przeciwkrzepliwego.

Dwa naczynka fibrometru fibroTube® wypełniono, odpowiednio, 100 pl badanej plazmy lub 100 pl badanej plazmy ze środkiem przeciwkrzepliwym i 125 pl aktywowanego aktyną odczynnika cefaloplastynowego (odczynnik aktynowy z kefaliny mózgu królika w kwasie elaginowym, dostępny z firmy Baxter Scientific) i umieszczono w dołkach fibrometru, w temperaturze 37°C.

Po upływie minuty, 100 pl odczynnika aktynowego przeniesiono do naczynka zawierającego osocze i zawartość wymieszano kilkakrotnie pipetą. Po upływie trzech minut inkubacji, do mieszaniny plazmy i odczynnika aktynowego wprowadzono 100 pl CaCh, uprzednio ogrzanego do temperatury 37°C, przy użyciu wyzwalacza Automatic Pipette/Timer (BectonDickinson). Czas skrzepnięcia rejestrowano i otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 1 jako czas krzepnięcia w funkcji końcowego stężenia antykoagulanta w całkowitej objętości testowej wynoszącej 300 pl. Stężenie nominalne czynnika IX w próbie wynosiło 30 - 40 nM.

Wyniki przedstawione na fig. 1 uwidaczniają wpływ wzrostu stężenia mysich PM BC1 i BC2 skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na czas krzepnięcia aPTT. Oba PM hamują krzepnięcie przez przedłużenie aPTT i oba PM osiągają poziom wpływu końcowego nasycenia na aPTT. Wartości IB50 są podobne do siebie przy ~35 nM i ~50 nM dla, odpowiednio, BC1 i BC2, ale różnica w maksimum odpowiedzi dla dwu przeciwciał jest wyraźna. Stężenie nasycające BC1 wydłuża aPTT o około 50% do ~40 sekund. Z drugiej strony, BC2 wydłuża aPTT 3,5-krotnie do około ~90 sekund. Docelowy zakres terapeutyczny przyjmowany w terapii przeciwkrzepliwej przy użyciu heparyny został uwydatniony. Wyniki wykazują, że dwa PM ograniczają terapeutyczny zakres aPTT heparyny.

Właściwości PM BC1 i BC2 zestawionono w poniższej tabeli I. Każdy PM BC rozpoznaje zarówno zymogen, czynnik krzepnięcia IX, jak i aktywną proteazę, czynnik krzepnięcia

187 274

IXa, ale tylko BC2 jest zdolny do blokowania tak aktywowania zymogenu jak i aktywności proteazy. Stwierdzono, że BC1 i BC2 krzyżowo reagują z czynnikiem krzepnięcia IV małpy Cynomologous. Oprócz tego, BC2 także reaguje krzyżowo z czynnikiem krzepnięcia IX szczura.

Tabela 1

Zestawienie in vitro właściwości PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX

	BC1	BC2
Wiąże czynnik IX	tak	tak
Wiąże czynnik IXa	tak	tak
Hamuje przekształcenie IX w IXa	nie	tak
Hamuje aktywność IXa w kompleksie Xazy	tak	tak
Zapotrzebowanie na kofaktora	nie ma	metale dwuwartościowe
aPTTmax x 100	150	Ca2+ > Mn2+ 350
aPTT normalny IC50, nM	~35	~50
Reaktywność krzyżowa gatunkowa	małpa	szczur,
Izotyp	IgGl	małpa. IgG2a

Wyniki przedstawione na fig. 2 pokazują wpływ wzrostu stężenia PM 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9 skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na czas krzepnięcia aPTT. Osocze do badania rozcieńczono do połowy normalnego stężenia, w wyniku czego otrzymano wyjściowy aPTT wynoszący 45 sekund. Oba PM hamowały krzepnięcie przez przedłużenie aPTT, i oba PM osiągały poziom wpływu końcowego nasycenia na aPTT. Stężenia nasycające 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9 wydłuża aPTT do ~90 -100 sekund w przypadku 9E4(2)F4 i do -80 sekund w przypadku 11G4(1)B9. Otrzymane wyniki wskazują na to, że dwa PM znajdują się na górnym końcu terapeutycznego zakresu aPTT heparyny.

Wyniki przedstawione na fig. 3 pokazują wpływ wrostu stężenia PM HFXLC skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia X (w funkcji epitopu o lekkim łańcuchu), PM HFXHC skierowanego przeciw czynnikowi X (w funkcji epitopu o ciężkim łańcuchu) oraz PM HFXI skierowanego przeciw czynnikowi XI, na czas krzepnięcia aPTT. Wspomniane PM otrzymano z firmy Enzyme Laboratories (South Bend, IN). PM HFXLC i HFXI hamują krzepnięcie przez przedłużenie aPTT, i oba PM osiągają poziom wpływu końcowego nasycenia na aPTT. Wartość IC50 dla HFXLC wynosi -40 nM; stężenie nasycające wydłuża aPTT do -60 sekund. Wartość IC50 dla HFXI wynosi -20 nM; stężenie nasycające wydłuża aPTT do -100 sekund. Otrzymane wyniki wskazują na to, że HFXLC znajduje się wewnątrz terapeutycznego zakresu aPTT heparyny, podczas gdy HFXI znajduje się na górnym końcu terapeutycznego zakresu heparyny. HFXHC nie wywiera żadnego wpływu na czas krzepnięcia aPTT.

Samoograniczające się wydłużenie aPTT zaobserwowano także w przypadku przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia VIH, kofaktorowi dla czynnika krzepnięcia Xa. I tak, na przykład, przeciwciało przeciw ludzkiemu czynnikowi VIII, SAF8C-IQ dostarczone przez firmę Affinity Biologicals Inc., powodowało wydłużenie aPTT do najwyżej -65 sekund. Półmaksymalne wydłużenie aPTTT uzyskiwano przy zastosowaniu około 100 nM przeciwciała.

187 274

Przkład 3

Skuteczność PM skierowanych przeciw mysiemu czynnikowi krzepnięcia IX w szczurzym modelu skrzepimy.

Do dokonania oceny skuteczności działania przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi IX w zapobieganiu zakrzepicy tętniczej zaadaptowano szczurzy model zakrzepicy tętnicy szyjnej opisany przez Schumachera i in. [J. Cardiac Pharm., 22, 526 - 533 (1993)]. Model ten obejmuje odcinkowe uszkodzenie śródbłonka szyjnego tlenem rodhikowym wytwarzanym przez FeCh, przy czym roztwór nanoszono na powierzchnię tętnicy szyjnej.

Mówiąc krótko, szczury znieczulono solą sodową pentobarbitalu, po czym w żyłę szyjną wprowadzono kaniulę w celu umożliwienia wstrzyknięć dożylnych, a w lewą arterię udową wprowadzono kaniulę w celu monitorowania ciśnienia krwi i częstości akcji serca. Tętnicę szyjną wyizolowano metodą aseptyczną przez chirurgiczne nacięcie karku i wyposażono w magnetyczny zgłębnik do mierzenia przepływu w celu dokonywania pomiarów przepływu krwi. Po okresie stabilizowania, ustalono parametry linii odniesienia dla następujących zmiennych: przepływ szyjny krwi, ciśnienie tętnicze, częstość akcji serca, czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) i czas protrombinowy (PT). Następnie, na tętnicę nałożono, na okres 15 minut, wstępnie zmierzony kawałek bibuły filtracyjnej Whatman nasączonej 50% roztworem FeCf w celu całkowitego uszkodzenia znajdujących się pod bibułą komórek śródbłonka. Po usunięciu bibuły nasączonej FeCf eksperyment prowadzono w ciągu 60 minut, aż do zakończenia. Po zakończeniu eksperymentu, skrzeplinę szyjną wycięto z tętnicy szyjnej i zważono.

Wszystkie środki podawano na 15 minut przed rozpoczęciem uszkadzania śródbłonka szyjnego. Badano wpływ następujących zabiegów i porównywano z działaniem PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX.

1. Heparyna: 15, 30, 60 lub 120 jedn/kg bolus, a następnie wlew, odpowiednio, 0,5, 1, 2 lub 4 jedn/kg/min, w ciągu 60 minut.

2. Kwas acetylosalicylowy (ASA, aspiryna): 5 mg/kg bolus.

3. PM BC2 skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX: 1, 3 lub 6 mg/kg bolus, a następnie wlew, odpowiednio, 0,3, 1 lub 2pk/kg/min, w ciągu 60 minut.

4. Heparyna: 30 jedn/kg bolus + 1 jedn/kg/min + ASA w dawce 5 mg/kg.

5. PM BC2 skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX: 1 mg/kg + 0,3 (pg/kg/min + ASA w dawce 5 mg/kg.

Figury 4 i 5 przedstawiają porównawczą farmakologię reżymu przeciwkrzepliwego/trombotycznego za pomocą uwidocznienia wpływu heparyny, ASA i PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na aPTT (fig. 4) i PT (fig. 5).

Jako podstawowe kryterium oceny skuteczności w funkcji odpowiedzialności środków przeciwkrzepliwych/trombotycznych za krwawienie przyjęto w niniejszym badaniu kluczowy wskaźnik skłonności do krwawienia, a mianowicie aPTT. Wyniki przedstawione na fig. 4 wykazują zależne od dawki wydłużenie aPTT przez działanie heparyny w dwu wyższych dawkach, z maksymalną wartością tego wydłużenia czasu krzepnięcia znajdującą się już poza granicą testu. Sam ASA nie powoduje znaczniejszego wydłużenia aPTT, ale w przypadku kombinacji z heparyną obserwuje się wyraźnie zaznaczony efekt synergistyczny. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX wywierały niewielki wpływ na aPTT i nawet w najwyższych dawkach wydłużenie czasu krzepnięcia nie przekraczało 3-krotnego zakresu skutków działania typowych środków przeciwkrzepliwych stosowanych w praktyce klinicznej. Najbardziej znaczące jest to, że niskie dawki PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w kombinacji z ASA nie powodowały żadnej zmiany aPTT.

Na figurze 5 przedstawiono dane wskazujące na to, że PT także ulegał znacznemu wydłużeniu w wyniku działania heparyny, użytej w dwu wyższych dawkach, i kombinacji ASA + heparyna, ale nie w wyniku podawania dawek PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX samego lub podawanego łącznie z ASA.

Wpływ działania heparyny, ASA i PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na zamknięcie tętnicy szyjnej przedstawiono na fig. 6. Pokazane wyniki wskazują na to, że tętnice szyjne wszystkich zwierząt potraktowanych vehiculum zwierają się w odpowiedzi na uszkodzenie. Dawka heparyny w uzależniający sposób hamowała zatykanie się tętnicy

187 274 się tętnicy szyjnej. W przypadku dawki najwyższej, heparyna całkowicie zapobiegała zamknięciu się tętnicy szyjnej. Jednakże, dla tej dawki wcale nie można było zapoczątkować koagulacji. Sam ASA wywierał jednynie niewielki wpływ na zamykanie tętnicy szyjnej. Także w połączeniu z heparyną, ASA w żadnej mierze nie zabezpieczał arterii szyjnej przed zamknięciem. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, w dwu wyższych dawkach, całkowicie blokowało zamknięcie tętnicy szyjnej, bez przedłużenia koagulacji poza klinicznie pożądany zakres docelowy. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w niższej dawce, samo zupełnie nie chroniące drożności tętnicy, wykazywało całkowite zahamowanie zamkykania się tętnicy szyjnej przy podawaniu łącznie z ASA.

Wpływ działania heparyny, ASA i omawianego PM na masę skrzepimy przedstawiono na fig. 7. Heparyna w sposób zależny od dawki powodowała zmniejszenie masy skrzepliny w tętnicy szyjnej. Jednakże, pomimo całkowitej blokady krzepnięcia, w tętnicy szyjnej ciągle jeszcze można było znaleźć pewną resztkową ilość skrzepliny. ASA sam, lub w kombinacji z heparyną (reżym przewidujący 30 jedn/kg), wywierał jedynie częściowy wpływ na masę skrzepliny. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX powodowało w sposób zależny od dawki zmniejszenie masy skrzepliny, a w dawce wysokiej rzeczywiście całkowicie zapobiegało tworzeniu się skrzepliny. Ponadto, kombinacja PM skierwanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w niskiej dawce i ASA, a więc reżym pozwalający na całkowite zapobieżenie zamknięciu się arterii szyjnej bez szkodliwego wpływu na wskaźniki krzepnięcia, w zupełności zapobiegał powstawaniu skrzepliny.

Badania przeprowadzone na szczurzym modelu zakrzepicy szyjnej wyraźnie wykazują skuteczność działania omawianego PM w zapobieganiu zakrzepicy w modelu poważnego, tworzącego skrzepliny, uszkodzenia tętniczego. Najbardziej znacząca jest skuteczność PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX wykazana w obrębie zakresu pożądanego tearpeutycznego docelowego działania przeciwkrzepliwego, zdefiniowanego wartością aPTT. Poza tym, heparyna będąca aktualnie typowym środkiem przeciwkrzepliwym, osiągała skuteczność porównywalną ze skutecznością PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX jedynie w przypadku dawek poważnie upośledzających krzepnięcie, aż do poziomu, przy którym dochodzi do powstawania krwi niezdolnej do skrzepnięcia. Jest rzeczą interesującą, że zaobserwowane wzajemne wzmożenie działania i synergizm nabyty przez leczenie skojarzone ASA i heparyną, wykazano także wtedy, gdy ASA podawano razem z PM skierowanym przeciw czynnikowi krzepnięcia IX. Jednakże, inaczej niż ma to miejsce w przypadku kombinacji heparyny z ASA, prowadzącej do wzajemnego wzmożenia zarówno działania przeciwzakrzepowego jak i przeciwkrzepliwego, kombinacja PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX i ASA powodowała wzajemne wzmożenie działania przeciwzakrzepowego, ale bez zgodnego z nim wpływu na parametry krzepnięcia krwi ex vivo. W ujęciu łącznym, dane te wykazują przewagę zdolności omawianego PM do działania przeciwzakrzepowego nad zdolnością heparyny, ASA lub kombinacji heparyny i ASA.

Przykład 4

Mikroskopia elektronowa skaningowa szczurzego modelu zakrzepicy.

Odcinki tętnicy szyjnej szczura pobrano z kontroli, samego chlorku żelaza (ΠΙ) i chlorku żelaza (III) + 6 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, 3/grupę, po upływie 15 minut od zastosowania chlorku żelaza (ΙΠ). Tętnice utrwalono za pomocą perfimdowania formaldehydem i podwiązano ponad i pod strefą uszkodzoną. Utrwalone tętnice odwodniono i po inkubacji w heksametylodisilazanie wysuszono w eksykatorze. Wysuszone tętnice otwarto wzdłużnie i po odpowienim umieszczeniu w króćcach poddano badaniu metodą mikroskopii elektronowej skaningowej (SEM) z powleczeniem, przez napylenie, złotem.

SEM tętnic kontrolnych wykazała obecność zasadniczo normalnego śródbłonka z rzadkimi, rozsianymi płytkami. Zaobserwowano kilka pęknięć śródbłonka, przypuszczalnie powstałych w wyniku uszkodzenia mechanicznego podczas zabiegu chirurgicznego. Leżąca poniżej błona podstawna pokryta była dywanem płytek. U szczurów kontrolnych nie zaobserwowano oznak obecności skrzepliny.

SEM tętnic potraktowanych chlorkiem żelaza(III) potwierdziła obecność dużych skrzeplin ściennych, zajmujących dużą część światła naczynia. Skrzepliny złożone były z zagrego26

187 274 wanych płytek, krwinek czerwonych oraz bezpostaciowej i włóknistej substancji białkopodobnej. Wspomniana substancja białkopodobna wykazuje zgodność z fibryną. Śródbłonek tętnic był w większości zakryty dużymi skrzeplinami. Tam, gdzie było to widzialne, śródbłonek pokrywający obszar potraktowany chlorkiem żelaza(III) obłożony był licznymi przywartymi płytkami i bezpostaciową substancją białkopodobną.

SEM szczurzych tętnic potraktowanych chlorkiem żelaza (III), a także przeciwciałem czynnika krzepnięcia IX, wykazała, że w świetle naczynia w większości nie było skrzepimy. Śródbłonek pokrywający obszar potraktowany chlorkiem żelaza (III) wykazywał ekstensywne uszkodzenie, a pewna ilość powierzchni obłożona była przywartymi płytkami i agregatami płytek, jednakże stwierdzono tam tylko niewielką ilość substancji białkopodobnej, względnie nie było jej tam wcale.

Przykład 5

Analiza sekwencyjna ciężkiego i lekkiego łańcucha cDNA PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX.

Całkowity RNA oczyszczono przy użyciu TriReagent (Molecuar Researc Center, Inc., Cincinnati, OH) zgodnie z protokołem wytwórcy RNA wytrącono izopropanolem i rozpuszczono w 0,5% SDS, po czym doprowadzono do 0,5 M NaCl. RNA Poli A⁺ wyodrębniono z zastosowaniem Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal A.S., Lakę Success, NY) zgodnie z protokołem wytwórcy. RNA w formie Poli A⁺ wyeluowano z kuleczek i zawieszono w buforze TE. Dwanaście porcji podwielokrotnych po 100 ng RNA poddano odwróconej transkrypcji przy użyciu zestawu RT-PCR zgodnie z instrukcją wytwórcy (Boehringer Mannheim nr kat. 1483-188) z zastosowaniem oligo-dT do napiętnowania. W przypadku łańcucha ciężkiego, amplifikowanie PCR 6 hybryd RNA/DNA przeprowadzono w 25 cyklach przy użyciu mysiego startera zawiasowego IgG2a (SEQ ID NO: 1) i startera sekwencji sygnałowej łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 2).

Podobnie, w przypadku łańcucha lekkiego, amplifikowanie metodą PGR 6 hybryd RNA/DNA przeprowadzono w 25 cyklach przy użyciu mysiego startera kappa (SEQ ID NO: 3) i startera degenerowanej sekwencji sygnałowej łańcucha lekkiego (SEQ ED NO: 4). Produkty PCR uzyskane z każdej z 12 amplifikacji ligowano do wektora PCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K2000-01). Kolonie rekombinantowych klonów pobrano w sposób losowy i sporządzono minipreparaty plazmidowego DNA z zastosowaniem metody ekstrakcji alkalicznej, opisanej przez Bimboima i Doly'ego [Nuci. Acids Res., 7, 1513 (1979)].

Wyizolowany plazmidowy DNA poddano trawieniu z udziałem EcoRI i zanalizowano na 0,8% żelu agarozowym. Dwuniciowe inserty DNA o odpowiedniej wielkości, to znaczy -700 pz w przypadku łańcucha ciężkiego i -700 pz w przypadku łańcucha lekkiego poddano sekwencjonowaniu z zastosowaniem zmodyfikowanej metody Sangera. Porównano sekwencję wszystkich 12 łańcuchów ciężkich i lekkich w celu utworzenia sekwencji największej zgodności zmiennego regionu łańcucha ciężkiego BC2 (SEQ ID NO: 5) i sekwencji największej zgodności zmiennego regionu łańcucha lekkiego BC2 (SEQ ID NO: 6).

Analiza sekwencyjna cDNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego BC2 potwierdziła obecność otwartej ramki odczytu o 363 nukleotydach, kodującej sekwencję 121 aminokwasów (SEQ ID NO: 7). Sekwencje łańcucha ciężkiego CDR1, 2 i 3 są wyszczególnione w SEQ ID NO NO: odpowiednio 8, 9 i 10.

Analiza sekwencyjna cDNA zmiennego regionu łańcucha lekkiego BC2 potwierdziła obecność otwartej ramki odczytu o 321 nukleotydach, kodującej sekwencję 107 aminokwasów (SEQ ID NO: 11). Sekwencje łańcucha lekkiego CDR1, 2 i 3 wyszczególniono wSEQ ID NO NO: odpowiednio 12, 13 i 14.

Przykład 6

Przeciwciała humanizowane.

Sześć humanizowanych przeciwciał oznaczonych SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 i SB 257732 tak zaprojektowano, aby zawierały powyżej opisane mysie CDR w ramce odczytu przeciwciała ludzkiego.

187 274

SB 249413

SB 249413 zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-0 i łańcuch lekki F9HZLC 1-0. Syntetyczny zmienny region humanizowanego łańcucha ciężkiego F9HZHC 1-0 był zaprojektowany z zastosowaniem trzech pierwszych regionów ramki odczytu łańcucha ciężkiego otrzymanego z immunoglobuliny RF-TS3'CL [J.D. Capra i in., J. Clin. Invest. 86, 1320 - 1328 (1990), zidentyfikowanej w bazie danych KABAT jako Kabpro:Hhcl0w| i CDR łańcucha ciężkiego BC2 poprzednio opisanego. Nie przeprowadzono żadnych podstawień aminokwasów ramki odczytu, które by mogły wywrzeć wpływ na prezentację CDR. Utworzono cztery zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 15, 16, 17 i 18) które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą region zmienny łańcucha ciężkiego, i obejmujące CDR3 (SEQ ID NO NO: 19 i 20). Następnie, ten syntetyczny gen amplifikowano z zastosowaniem starterów PCR (SEQ ID NO NO: 21 i 22) i ligowano do wektora pCR2000 (TA cloning Kit, Intvitrogen, nr kat. K2000-01), po czym izolowano z produktu restrykcyjnego trawienia Spel, KpnI. Drugi fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath obejmujący pięć pierwszych aminokwasów regionu zmiennego (SEQ ID NO NO: 23 i 24) utworzono na drodze amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu konstrukcji kodującej humanizowany ciężki łańcuch antywirusa oskrzelowego (SEQ ID NO: 25) z udziałem dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 27), a następnie trawienia z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Spel. Utworzone tak dwa fragmenty ligowano do EcoRl, wektora ekspresyjnego z komórek ssaka pFHZHC2-6pCD trawionego KpnI, zawierającego pozostałą część ludzkiej ramki odczytu o wysokiej zgodności 4 i region stały IgGl. Wektor zawierał pojedynczą mutację aminokwasową wektora pFHZHC2-3pCD, jak opisano w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr W094/05690. Końcową pozostałość struktury 2 (reszta 49) zmutowano od Ser do Ala za pomocą trawienia pFHZHC2-3pCD z udziałem Xbal i EcoR5 i wbudowania łącznika utworzonego z dwóch syntetycznych oligonukleotydów (SEQ ID NO NO: 28 i 29). Sekwencję insertu F9HZHC 1-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 30 i 31.

Syntetyczny zmienny region zhumanizowanego łańcucha lekkiego F9HZLC 1-0 był zaprojektowany z zastosowaniem regionów ramki odczytu ludzkiego łańcucha lekkiego otrzymanego z immunoglobuliny LS8'CL [Carmack i in., J. Exp. Med., 169, 1631 - 1643 (1989)], zidentyfikowanej w bazie danych KABAT jako Kabpro:Hkl318] i CDR łańcucha lekkiego BC2 poprzednio opisanych. Nie przeprowadzono żadnych podstawień aminokwasów struktury, które by mogły wywrzeć wływ na prezentację CDR. Utworzono dwa zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 32 i 33) które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą region zmienny łańcucha lekkiego (SEQ ID NO NO: 34 i 35). Następnie, ten syntetyczny gen amplifikowano przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 36 i 37) i ligowano do wektora pCR2000 (TA cloning Kit, Intvitrogen, nr kat. K2000-01), po czym izolowano z produktu restrykcyjnego trawienia Scal, SacII. Drugi fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath, obejmujący dwa pierwsze aminokwasy zmiennego regionu (SEQ ID NO NO: 38 i 39) utworzono na drodze amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu konstrukcji kodującego humanizowany łańcuch ciężki antywirusa oskrzelowego (SEQ ID NO: 25) z udziałem dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 40), a następnie trawienia z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Scal. Utworzone tak dwa fragmenty ligowano do EcoRI, wektora eksresyjnego z komórek ssaka pFHzLCl-2pCN trawionego SacII, zawierającego pozostałą część zgodnej ludzkiej ramki odczytu 4 i stały region kappa. Wektor zawierał pojedynczą mutację aminokwasową wektora pFHZLCl-lpCN, opisaną w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr W094/05690. Końcową pozostałość ramki odczytu 2 zmutowano od Ser do Ala za pomocą trawienia pFHZLCl-pCN z udziałem Smal i KpnI i wbudowania łącznika utworzonego z dwóch syntetycznych oligonukleotydów (SEQ ID NO NO: 41 i 42). Sekwencję insertu F9HZLC 1-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 43 i 44.

SB 249415.

SB 249415 zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 i łańcuch lekki F9HZLC 1-1. Te konstrukcje łańcucha ciężkiego i lekkiego oparte są na, odpowiednio, F9HZHC 1 -0 i F9HZLC 1 -0,

187 274 jednakże zawierają podstawienia aminokwasów ramki odczytu, co może wpływać na prezentację CDR.

F9HZHC 1-1 posiada trzy podstawienia aminokwasów ramki odczytu, co może wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 45 i 46), które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienioną część zmienionego zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO NO: 47 i 48). Ten gen syntetyczny amplifikowano następnie przy użyciu starterów PGR (SEQ ID NO NO: 49 i 50), ligowano do wektora pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K2000-01) i izolowano z produktu trawienia EcoNI, KpnI. Fragment ten ligowano do wektora F9HZHC1-0 (SEQ ID NO: 30) trawionego EcoNI, KpnI. Sekwencja insertu F9HZHC 1-1 jest przedstawiona w SEQ ID NO NO: 51 i 52.

F9HZLC 1-1 posiada cztery podstawienia aminokwasów ramki odczytu, które mogą wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 53 i 54), które sprzęgnięte zawierają lepkie końce KpnI iBamHI i kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienioną część zmiennego regionu łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 55). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych KpnI iBamHI i ligowano do syntetycznego DNA. Sekwencję insertu F9HZLC 1-1 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 56 i 57.

SB 249416

SB 249416 zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 (powyżej opisany) (SEQ ID NO: 52) i łańcuch lekki F9HZLC 1-2. Produkt konstrukcji łańcucha lekkiego oparty jest na F9HZLC 1-1, jednakże zawiera on jedno dodatkowe podstawienie aminokwasów konstrukcji, które może wpływać na prezentację CDR.

Utworzono dwa syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 58 i 59), które sprzęgnięte zawierają lepkie końce BamHI i Xbal i kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienioną część zmiennego regionu łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 60). Wektor F9HZLC 1-1 (SEQ ID NO: 56) poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych Bam HI i Xbal i ligowano do syntetycznego DNA. Sekwencję insertu F9HZLC 1-2 przedstawiono w SEQ' ID NO NO: 61 i 62. SB 249417

SB 249417 zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 (powyżej opisany) (SEQ ID NO: 52) i łańcuch lekki F9HZLC 2-0. Syntetyczny zmienny region humanizowanego łańcucha lekkiego F9HZLC 2-0 zaprojektowano z zastosowanim regionów ramki odczytu ludzkiego łańcucha lekkiego otrzymanego z immunoglobuliny REI [Palm i Hilschmann, Z. Physiol. Chem., 354, 1651 - 1654 (1973)], zidentyfikowanej z bazie danych KABAT jako Kabpro: HKL111) i CDR lekkiego łańcucha BC2 poprzednio opisanego. Wprowadzono pięć ludzkich zgodnych podstawień aminokwasów. Dokonano sześciu mysich podstawień aminokwasów ramki odczytu, które mogą wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 63 i 64), które sprzęgnięte i przedłużone, kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienny region lekkiego łańcucha (SEQ ID NO NO: 65 i 66). Ten syntetyczny gen amplifikowano następnie przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 67 i 68), ligowano do wektora pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K2000-01) i wyodrębniano z produktu trawienia Scal, SacII. Drugi fragment DNA kodujący sekwencję sygnałowa campath obejmujący dwa pierwsze aminokwasy regionu zmiennego (SEQ ID NO: 38) wytworzono na drodze amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu konstrukcji kodującej humanizowany łańcuch ciężki antywirusa oskrzelowego (SEQ ID NO: 25) przy użyciu dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 69) i za pomocą trawienia przy udziale dwóch enzymów restrykcyjnych EcoRI i Scal. Trzeci fragment DNA kodujący pozostałość ludzkiej ramki odczytu 4 (SEQ ID NO: 70) i zawierający lepkie końce SacII i Narl, utworzono za pomocą sprzęgnięcia dwóch syntetycznych oligonukleotydów (SEQ ID NO NO: 71 i 72). F9HZLC 1-0 (SeQ ID NO: 43) poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Narl i ligowano do trzech fragmentów DNA. Sekwencję insertu F9HZLC 2-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 73 i 74).

187 274

SB 257731

SB 257731 zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) i łańcuch lekki F9HZLC 1-3, pojedynczą mutację aminkwasową F9HZLC 1-2 (SEQ ID NO 62). F9HZLC 1-2 amplifikowano metodą PCR przy użyciu dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 69) i poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Scal. Wyodrębniono fragment 94 pz (SEQ ED NO NO: 75 i 76). Fragment ten ligowano do wektora F9HZLC 1-2 trawionego EcoRI, Scal, w wyniku czego otrzymano konstrukcję w postaci łańcucha lekkiego F9HZLC 1-3. Sekwencję insertu F9HZLC 1-3 przedstawiono w SEQ ED NO NO: 77 i 78).

SB 257732

SB 257732 zawiera syntetyczny region zmienny humanizowanego łańcucha ciężkiego F9HZHC 3-0 i łańcuch lekki F9HZLC 3-0. Utworzono cztery zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 79, 80, 81 i 82), które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmieniony zmienny region łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO NO: 83 i 84). Ten gen syntetyczny amplifikowano następnie przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 85 i 86), ligowano do wektora pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K2000-01) i izolowano z produktu restrykcyjnego trawienia Stul, KpnI). Wyodrębniony fragment ligowano do wektora F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) trawionego Stul, KpnI. Wektor ten poddano następnie trawieniu z udziałem EcoEI, Spel w celu usunięcia sekwencji sygnałowej. Fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath (SEQ ID NO: 23) obejmujący pięć pierwszych aminokwasów regionu zmiennego utworzono na drodze amplifikacji, metodą PCR, F9HZHC 2-0 przy użyciu dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 87) i trawienia z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Spel. Utworzony fragment ligowano do wektora. Sekwencję insertu F9HZHC 3-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 88 i 89.

Utworzono cztery zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 90, 91, 92 i 93), które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą region zmienny łańcucha lekkiego (SEQ ID NO NO: 94 i 95). Ten gen syntetyczny amplifikowano następnie przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 96 i 97) i ligowano do wektora pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K2000-01), po czym wyodrębniono z produktu restrykcyjnego trawienia Scial, Narl. Wyodrębniony fragment ligowano do wektora F9HZLC 1-3 (SEQ ID NO: 77) trawionego Scal, Narl. Sekwencję insertu F9HZLC 3-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 98 i 99.

Dokonano ekspresji humanizowanego PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w komórkach CHO. Przeprowadzono hodowlę linii komórek DG-44, przystosowanych do wzrostu zawiesinowego w podłożu nie zawierającym surowicy, w 100 ml podłoża nie zawierającego białka, zawierającego IX nukleozydów i 0,05% F68, w 250 ml jednorazowych jałowych kolbach Erlenmeyera (Corning), na wstrząsarce płytowej Innova 2100 (New Brunswick Scientific), przy 150 obr/min, w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% C02/95% powietrza, w nawilżanym inkubatorze. Komórki te pasażowano przy 4 χ 10⁵ komórek/ml dwa razy tygodniowo, 15 pg każdego z wektorów pCN-Lc-lekki łańcuch i pCD-Hc-ciężki łańcuch przeprowadzono w postać liniową za pomocą trawienia z udziałem Notl, po czym współwytrącono w warunkach jałowych i ponownie zawieszono w 50 μΐ buforu 1X TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5). Przeprowadzono elektroporację DNA z zastosowaniem Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) do komórek Acc-098 z zastosowaniem metody Hensley'a i in. [J. Biol. Chem., 269, 23949 - 23958 (1994)]. 1,2 χ 10⁷ komórek przemyto jeden raz w 12,5 ml lodowato zimnego buforu PBSucrose (PBS, 272 mM sacharozy, 7 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 2 mM MgCl₂) , ponownie zawieszono w 0,8 ml PBS, wprowadzono do 50 μΐ roztworu DNA i inkubowano na lodzie w ciągu 15 minut. Komórki poddano pulsowaniu przy 380 V i 25 mikro faradach, po czym inkubowano na lodzie w ciągu 10 minut. Następnie komórki wprowadzono na 96-dołkowe płytki do hodowli w ilości 5 χ 10⁵ komórek/płytkę, w podłożu podtrzymującym, w ciągu 24 godzin przed dokonaniem selekcji. Selekcję komórek przeprowadzono pod względem oporności na G418 (400 pg/ml) (Geneticin, Life Technologies, Inc.), w podłożu podtrzymującym. Na 24 godziny przed wykonaniem badania, komórki odżywiono dodaniem 150 μΐ podłoża podtrzymującego.

187 274

Kondycjonowane podłoże z pojedynczych kolonii poddano badaniu z zastosowaniem elektrochemiluminiscencyjnej metody wykrywania (ECL), przy użyciu analizatora Rigen (IGEN, Inc.). Patrz: Yang i in. [(Biotechnology, 12, 193 - 194 (1994)].

Wszystkie roztwory potrzebne do realizacji badania (bufor do badań) i do pracy analizatora (środek do czyszczenia komórek) otrzymano z IGEN. Przeciwciała [Anti-Human IgG (g-chain specific), Sigma Chemicals] oraz F(ab')2 Fragment to Humań IgG (H+L) (Kirkekaard & Perry Laboratories Inc.) były znakowane przy użyciu TAG-NHS-ester (IGEN, Inc.) przy stosunku molowym TAG: białko wynoszącym 7:1, podczas gdy odczynnik Protein A (Sigma) był znakowany przy użyciu Biotin-LC-Sulfo-NHS-ester (IGEN, Inc.) przy stosunku molowym Biotyn: białko wynoszącym 20 : 1, w obu przypadkach zgodnie z zaleceniami firmy IGEN. Magnetyczne kuleczki opłaszczone streptawidyną (M-280) otrzymano z firmy Dynal.

Testy immunologiczne przeprowadzono przy użyciu następującego protokołu. Na jedną próbkę używano 50 μί kuleczek opłaszczonych streptawidyną (końcowe stężenie 600 pg/ml, rozcieńczenie w PBS, pH 7,8, z 1,25% Tween) i mieszano z 50 μί Biotin-Protein A (końcowe stężenie wynosiło 1 pg/rozcieńczenie w PBS, pH 7,8, z 1,25% Tween), po czym inkubowano w temperaturze pokojowej wciągu 15 minut, przy mieszaniu. Następnie dodano 50 μί przeciwciał TAG (mieszanina o końcowym stężeniu wynoszącym 1,25 pg/ml F(ab')2 Fragment to Humań IgG (H+L) i 0,25 pg/ml Anti-Human IgG (g-chain specific), rozcieńczenie w PBS, pH 7,8, z 1,25% Tween) i roztwór wprowadzono do 50 pl kondycjonowanego podłoża, po czym inkubowano, przy mieszaniu, w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 200 pl buforu do badań i próbkę poddano analizie w analizatorze Origen I, w celu wykonania pomiaru poziomu ECL. Otrzymane wyniki wykazały, że około 20 - 37% poddanych badaniu kolonii wydzielało ponad 15 ng/ml przeciwciała przy średnim poziomie ekspresji wynoszącym około 150 ng/ml.

Humanizowane PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX poddano oczyszczaniu z kondycjonowanych podłoży przy użyciu Procep A w etapie wychwytywania, z następującą potem chromatografią jonowymienną w celu zredukowania ilości obciążenia DNA. Do przygotowania kolumny (o stosunku średnicy do wysokości wynoszącym 1 : 1) użyto materiału sorbującego Procep A (Bioprocessing Ltd., Durham, Anglia). Sklarowane, kondycjonowane podłoża wprowadzano do kolumny z szybkością około 150 cm/godzinę. Kolumnę przemyto kolejno solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), PBS zawierającą 1 M NaCl i w końcu PBS. Substancje związane odzyskano za pomocą elucji przy użyciu 0,1 M kwasu octowego. Eluat doprowadzono do pH 5,5 i rozcieńczono wodą (1 : 4). Rozcieńczony roztwór wprowadzono na kolumnę S-Sepharose (2,5 x 13 cm), którą wstępnie zrównoważono 20 mM octanem sodu, pH 5,5, przy 80 cm/godzinę. Kolumnę przemywano buforem octanowym, aż do otrzymania stałego poziomu wartości odniesienia, po czym związane białko wyeluowano przy użyciu 20 mM fosforanu sodu, pH 7,4, przy 25 cm/godzinę. Produkt elucji przesączono przez 0,4 mikrometrową membranę i przechowywano w temperaturze 4°C.

Przykład 7

Chimeryczne przeciwciało „mysz-czlowiek”.

100 ng RNA BC2 poddano odwróconej transkrypcji przy stosowaniu zestawu RT-PCR zgodnie z instrukcjami wytwórcy (Boehringer Mannheim nr kat. 1483-188) przy użyciu do napiętnowania oligo-dT, po czym amplifikowano metodą PCR przy użyciu syntetycznych starterów Scal (SEQ ID NO: 100) iNarl (SEQ ID NO: 101), w wyniku czego otrzymano zmienny region łańcucha lekkiego BC2 o końcach Scal, Narl (SEQ ED NO NO: 102 i 103). Tak otrzymany DNA ligowano do F9HZHC1-3 trawionego Scal, Narl (SEQ ID NO: 77) i trawiono Scal, Narl, w wyniku czego otrzymano chimeryczny łańcuch lekki „mysz-czlowiek” F9CHLC (SEQ ID NO NO: 104 i 105).

100 ng RBA BC2 poddano odwrotnej transkrypcji przy stosowaniu zestawu RT-PCR zgodnie z instrukcjami wytwórcy (Boehringer Mannheim, nr kat. 1483-188), przy użyciu do napiętnowania oligo-dT, a następnie amplifikowano metodą PCR przy użyciu syntetycznych starterów Spel (SEQ ID NO: 106) i Nhel (SEQ ID NO: 107), w wyniku czego otrzymano zmienny region łańcucha ciężkiego BC2 o końcach Spel, Nhel (SEQ ID NO NO: 108 i 109). Sekwencję sygnałową campath amplifikowano metodą PCR z łańcucha ciężkiego RSYHZ19

187 274 (SEQ ID NO: 25) przy użyciu starterów EcoRI (SEQ ID NO: 26) i Spel (SEQ ID NO: 87). Te dwa fragmenty DNA ligowano do wektora IL4CHHCpcd trawionego EcoRI, Nhel, opisanego w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr W095/07301, z zastąpieniem zmiennego regionu IL4 mysim zmiennym regionem BC2, skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, w wyniku czego otrzymano chimeryczny łańcuch ciężki „myszczłowiek” F9CHHC (SEQ ID NO NO: 110 i 111). Kotransfekcję i oczyszczanie chimerycznego przeciwciała „mysz-człowiek” chaFIX przeprowadzono sposobem opisanym powyżej odnośnie do konstrukcji humanizowanych.

Przykład 8

Skuteczność działania humanizowanych PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w szczurzym modelu skrzepimy.

Do dokonania oceny skuteczności działania humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w zapobieganiu zakrzepicy tętniczej, posłużono się opisanym w powyższym przykładzie 3 szczurzym modelem zakrzepicy tętnicy szyjnej. Ustalono podstawowe parametry dla szyjnego przepływu krwi, ciśnienia tętniczego, częstości akcji serca, drożności naczyń i czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT). Po upływie 15 minut, w ciągu 10 minut powodowano zaistnienie uszkodzenia szyjnego. Wartości poszczególnych parametrów oznaczono po upływie 60 minut od zaistnienia uszkodzenia szyjnego. Skrzeplinę szyjną wycięto z tętnicy szyjnej i zważono.

Wszystkie środki podawano dożylnie na 15 minut przed zaistnieniem uszkodzenia szyjnego. Zbadano skutki następujących zabiegów i wyniki porównano z wynikami otrzymanymi dla PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX.

Yehiculum
chaFIK:	3 mg/kg	bolus
SB 249413:	3 mg/kg	bolus
SB 249415:	3 mg/kg	bolus
SB 249416:	3 mg/kg	bolus
SB 249417:	3 mg/kg	bolus
SB 257731:	3 mg/kg	bolus
Heparyna:	60 jednostek/kg	(bolus) + 2 jednostki/kg/min (wlew).

Jako podstawowe kryterium oceny skuteczności w funkcji odpowiedzialności środków przeciwkrzepliwych/trombotycznych za krwawienie, przyjęto w niniejszym badaniu aPTT. Wyniki przedstawione na fig. 8 wykazują, że humanizowane PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, a mianowicie SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 i SB 257731 wywierały niewielki wpływ na aPTT w przypadku dawki wynoszącej 3,0 mg/kg, mieszczącej się w zakresie klinicznie akceptowanym.

Wpływ PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na masę skrzepliny przedstawiono na fig. 9. Otrzymane wyniki pokazują, że wszystkie humanizowane PM są w równej mierze skuteczne pod względem redukowania masy skrzepliny.

Badania przeprowadzone na szczurzym modelu zakrzepicy szyjnej wyraźnie wykazują skuteczność humanizowanych PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w zapobieganiu zakrzepicy w wysoce aktywnym pod względem tworzenia skrzeplin modelu uszkodzenia tętniczego. Najbardziej znacząca jest skuteczność wszystkich humanizowanych PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX wykazywana w obrębie pożądanego terapeutycznego przeciwkrzepliwego zakresu określanego przez aPTT.

Przykład 9

Właściwości biochemiczne i biofizyczne przeciwciała.

Masę cząsteczkową SB 249417 oznaczono z zastosowaniem MALD-MS i stwierdzono, że wynosi ona 148000 Da. Identyczną wartość dało analityczne ultrawirowanie SB 249417. W obecności czynnika IX + Ca²⁺, przeciwciała wywodzące się z BC2 osiadały przy wartości masy wynoszącej 248000 Da, co odpowiada połączonej masie PM i dwóch cząsteczek czynnika krzepnięcia IX. Nie stwierdzono występowania wyżej uporządkowanych agregatów

187 274 w obecności lub nieobecności czynnika krzepnięcia IX. Kinetykę wiązania się czynnika krzepnięcia IX z SB 249417 oceniano metodą analizy BIAcore z udziałem przeciwciała związanego z powierzchnią unieruchomionego białka A. Użyto rekombinantowego ludzkiego czynnika krzepnięcia IX (rhFIX, Genetics Institute) przy 49 nM i pomiary przeprowadzono w obecności 5 mM Ca²⁺. Wzajemne oddziaływanie charakteryzowano przez szybkie asocjowanie: kas = 2,0 x 10⁵ M'¹ s’¹ i względnie małą szybkość dysocjacji: kdys = 4,1 x 10'⁴ β⁴. Wartość Kd obliczona dla wiązania się czynnika krzepnięcia IX wynosiła 1,9 nM.

W tabeli 1 zestawiono właściwości biofizyczne SB 249417.

Tabela 1

Podsumowanie właściwości biofizycznych SB 249417

Izotyp

Czystość według SDS-PAGE

Masa cząsteczkowa:

spektrometria masowa ultrawirowanie analityczne

Stechiometria wiązania się czynnika IX: izotermiczna kalorymetria miareczkowa

Powinowactwo wiązania się czynnika IX: izotermiczna kalorymetria miareczkowa biosensor

Kinetyka wiązania się czynnika IX: biosensor

IgG1, kappa >95% (w warnnkach redukujących)

148000 Da 148000 Da

1,5 mola c zynnika IX : 1 mol PM

K_d = 4 iM 0255 C)

Kd = 2rMI kas = 2,0 x 105 M’¹ s-1 kdys = 4 x 00- s’1

W tabeli 2 zestawiono właściwości odnoszące się do wiązania się czynnika krzepnięcia IX z przeciwciałami manoklonalnymi według niniejszego wynalazku. Obliczone stałe dysocjacji były w zasadzie identyczne w granicach błędu doświadczenia.

Tabela 2

Kinetyka wiązania się czynnika krzepnięcia IX z PM skierowanym przeciw czynnikowi krzepnięcia IX

PM	kas, 1 (M’!’1)	kdys (s’1)	obliczono Kd (nM)
SB 249417	2,0 x 105	4,1 x 10-4	1,9
BC2	4,8 x 105	9,1 x 10’4	1,9
Cf99	2,4 x 105	3,0 x 10’4	1,3
SB 249413	6,5 x 105	2,8 x 10’4	3,7-5,1
SB 249415	7,5 x 105	1,8 x 10’4	11-2,3
SB 249416	5,2 x 105	4,1 x 10’4	0,8
SB 257731	9,2 x 105	9,9 x 10’4	1,1
SB 257732	1,1 x 106	1,2 x 10’3	1,5

187 274

Wzajemne oddziaływania między rhFIX i SB 249417, BC2 i innymi humanizowanymi konstrukcjami charakteryzowano metodą mikrokalorymetrii miareczkowej, umożliwiającej mierzenie wzajemnych oddziaływań związanych z wiązaniem się w roztworze, na podstawie ciepła wewnętrznego wiązania. Do kalorymetru wstrzyknięto 9 porcji 106 μΜ FIX z zawartością 2 μΜ Pm SB 249417. Wiązanie, jako wydzielone ciepło, wykryto w 4 pierwszych wstrzyknięciach. W przypadku pięciu ostatnich wstrzyknięć miejsca wiązania PM były wysycone FIX i zaobserwowano jedynie ciepło tłowe, wynikające z mieszania. Otrzymane wyniki wskazują, że punkt równowagi występował, tak jak tego oczekiwano, przy stosunku molowym bliskim 2 FIX na przeciwciało monoklonalne. Analiza danych, wykonana nieliniową metodą najmniejszych kwadratów, pozwoliła ustalić powinowactwo wiązania.

Powinowactwo rhFIX mAb zmierzono w zakresie temperatur od 34 do 44°C w 10 mM HEPES, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, pH 7,4. Otrzymane dane pozwalają określić powinowactwo w temperaturze 37°C bezpośrednio, a powinowactwo w temperaturze 25°C przez obliczenie z równania van't Hoffa. Dane zamieszczone w poniższej tabeli 3 pokazują, że powinowactwa SB 249417, BC2 i innych humanizowanych konstrukcji w granicach błędu (współczynnik 2) są takie same.

Tabela 3

Wyniki kalorymetrii miareczkowej dla PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX

PM Kd,	nM przy 25°C	Kd, nM przy 37°C	Stosunek molowy wiązania FIX/PM
BC2	10	20	1,4
SB 249413	6	12	1,9
SB 249415	3	7	1,7
SB 249417	4	12	1,5
SB 257732	4	9	1,8

Wszystkie PM, a mianowicie SB 249413, SB 249415, SB 249417 i SB 257732 wykazywały bardzo podobną stabilność termiczną w badaniu metodą kalorymetrii skaningowej różnicowej. Ich niefałdujące T_m mieściły się w zakresie od 70 do 75°C, co wskazuje na dużą stabilność wobec denaturacji powodowanej działaniem ciepła.

Przykład 10

Mechanizm hamowania działania czynnika krzepnięcia IX, w którym pośredniczy przeciwciało.

Skonstruowno bibliotekę chimerycznych konstrukcji złożonych z sekwencji czynnika krzepnięcia IX włączanych na drodze cięcia i składania do konstrukcji homologicznego białkowego czynnika VII. Biblioteki tej użyto do mapowania epitopu PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX [patrz: Cheung i in., Thromb. Res., 80, 419 - 427 (1995)]. Wiązanie mierzono z zastosowaniem urządzenia BioCore 2000 Surface Plasmon Resonance. Przeciwciało BC2 sprzężono bezpośrednio ze skrawkiem na drodze reakcji NHS/EDC. Wiązanie mierzono w ciągu 2 minut czasu kontaktowania przy 20 μl/min, z udziałem 200 μΜ każdej z podanych konstrukcji, w 25 mM MOPS, pH 7,4, 0,15 NaCl, 5 mM CaCh. Przebieg dysocjacji śledzono i kontrolowano w ciągu 3 minut przy użyciu tego samego buforu z pominięciem białka. Nie wykryto żadnego wiązania się dla konstrukcji typu dzikiego w obecności 50 mM EDTA. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.

187 274

Tabela 4

Podsumowanie danych dotyczących wiązania się konstrukcji czynnika krzepnięcia IX z przeciwciałem BC2

Konstrukcja

IXa z osocza r-IX

VII z osocza IX LC/VII HC IX-A/VII VII gla/IX VII-A/IX

Vn gla (IX 3-ll)/IX VII gla (IX 3-6)/IX Vn gla (IX 9-ll)/IX IX K5A

Stopień związania się

Wiąże się

Wiąże się

Brak wiązania

Wiąże się

Wiąże się

Brak wiązania Brak wiązania Wiąże się

Bardzo niski stopień wiązania się Bardzo niski stopień wiązania się Wiąże się

Powyższe dane wykazują że konstrukcje zawierające łańcuch lekki czynnika krzepnięcia IX i łańcuch ciężki czynnika krzepnięcia VII (IX LC/VII HC); domeny gla czynnika krzepnięcia IX i aromatyczne domeny pakietowe (IX-A/VIII); reszty 3-11 domeny gla czynnika VIII w obrębie domeny gla czynnika VII (VII gla (IX 3-11 )/IX; oraz czynnik IX posiadający podstawienie lizyny do alaniny przy reszcie 5 (IX K5A), wykazują wiązanie się z BC2. Konstrukcja VII gla (IX 3-11)/IX wykazywała wiązanie się zBC2 równoważne wiązaniu się czynnika krzepnięcia IX typu dzikiego (IXa z osocza i r-IX). Tak więc, przeciwciało wiąże się z epitopem zawartym w obrębie reszt 3-11 domeny gla czynnika krzepnięcia IX.

Wynalazek niniejszy można zrealizować w innych konkretnych postaciach wykonania bez odejścia od istoty lub podstawowych cech znamiennych wynalazku i zgodnie z tym należy odnieść się nie tyle do powyższego opisu, ile raczej do załączonych zastrzeżeń, wskazujących zakres wynalazku.

187 274

Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna (i) Zgłaszający: Blackburn, Michael

Church, William

Gross, Mitchell

Feuerstein, Giora

Nichols, Andrew

Padlan, Eduardo

Patel, Arunbhai

Sylvester, Daniel (ii) Tytuł wynalazku: Środki przeciwkrzepliwe użyteczne w leczeniu zakrzepicy (iii) Liczba sekwencji: 111 (iv) Adres do korespondencji:

(A) Adres: SmithKline Beecham Corporation (B) Ulica : 709 Swedeland Road (C) Miasto: King of Prussia (D) Stan: PA (E) Kraj: USA (F) Kod pocztowy (ZIP): 19406 (v) Postać czytelna dla komputera:

(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM (C) System operacyjny: DOS (D) Oprogramowanie: FastSEQ Version 1.5 (vi) Dane dotyczące niniejszego Zgłoszenia:

(h) Numer Zgłoszenia:

(B) Data złożenia: 16 stycznia 1997 (C) Klasyfikacja:

187 274 (vii) Dane dotyczące Zgłoszenia poprzedzającego:

(A) Numer Zgłoszenia: 60/029119 (B) Data złożenia: 24 października 1996 (viii) Informacja o rzeczniku patentowym/pełnomocniku:

(A) Nazwisko: Baumeister, Kirk (B) Numer rejestracyjny: 33833 (C) Numer sprawy/akt rzecznika patentowego: P50438 (ix) Informacja dotycząca telekomunikacji:

(A) Telefon: 610-270-5096 (B) Telefax:

(C) Telex:

(2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:1

CATCCTAGAG TCACCGAGGA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA

187 274

(iii)	Hipotetyczna:	Nie
(iv)	Antysensowna:	Nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji

AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	36 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:3:

CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

187 274 (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:4:

GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 363 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:5:

CAGATCCAGT	TGGTGCAGTC	TGGACCCGAG	CTGAAGAAGC	CTGGAGAGAC	AGTC/AGATC	60
TCCTGCAAGG	CTTCTGGGTA	CACCCTCACA	AACTATGGAA	TG/AC TGGGT	GGAG CAGGCT	1)20
CCAGGAAAGG	GTTTAAAGTG	GACGAGATGG	ATAAACACCA	GAAGGTGGAGGC		180
GTTGATGACT	TCAAGGGACG	GAGTGAAATG	ΤΟΤΤΤΟΘΑΑΑ	GCTCTGCCAG		240
TTGCAGATCG	ACAACCTCAA	ACAGGACAAG	ACGGCTACAT	A^^^^G^¢^^C3^^G^C		300
AATATGGATG	GTTACTTCCC	TTTTGCCTGG	A(^<AGGCClGGG	GG.'):	CACCGACACT	360
GCA						363

(2) Inffrmacja dotycząca SSQ ID N0:6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 321 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie

187 274 (iv) Antysensowna: nie (v) : Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:6:

CAAATTGTTC	TCTCCCAGTC	TCCAGCAATC	CTGTCTGCAT	CTCCAGGGGA	GAAGGTCACA	60
ATGACTTGCA	GGGCCAGCTC	AAGTGTAAAT	TACATGCACT	GGTACCAGCA	GAAGCCAGGA	120
TCCTCCCCCA	AACCCTGGAT	TTATGCCACA	TCCAACCTGG	CTTCTGGAGT	CCCTGCTCGC	180
TTCAGTGGCA	GTGGGTCTGG	GACCTCTTAC	TCTCTCACAA	TCAGCAGAGT	GGAGGCTGAA	240
GATGCTGCCA	CTTATTACTG	CCAGCAGTGG	AGTATTAACC	CACGGACGTT	CGGTGGAGGC	300
ACCAAGCTGG	AAATCAAACG	G				321

(2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:7

Gln

Ile

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Glu

1

5

10

15

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Pho

187 274

Lys

dy

Arg

rrg

Ala

eae

Ser

Lea

P Du

Ser

Sep

A Is

Glu

Ths

ASe

Alc

65

70

75

80

Leu

Gil:

Ile

Alp

Asr

La u

Ayn

Asp

u lu

Lys

ThA

p i a

Glu

TyA

phh

Alc

85

9a

95

Thr

Arr

Glu

Glu

Asg

ya t

Asp

Gly

o ar

Ase

Pro

y ae

Tyr

Tya

Par

Gie

100

105

110

Gln

Gly

Thr

Leu

Vsl

Thr

Vcl

Ser

Alc

115

120

(2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:8:

(i) ChcockOerysOtkc sekwencji:

(A) Długość: 5 crinokwcsów (B) Typ: arinfkwcsfwc (C) SOoukOuoc niaiowc: nić pojedynacc (D) Tfpflfgic: liniowc (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetycznc: nie (iv) AnOysensfwnc: nie (v) Typ nocgmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Ocncccenie sekwencji: SSE ID NO:8:

Asn Tyo Gly Met Asn

5 (2) ^do^ccca fotcczącD SED ID 00:9:

(i) ChjojkOeotsOykj sekwencji:

(A) Długość: 17 crinokwcsów (B) Typ: crinokwcsowc (Cy Stouktuoc niciowc: nić pojedynczc CD) Topologic: linifwc (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetycznc: nie (iv) Antysensownc: nie (v) Typ noagIrenOu: wewnętrzny

187 274 (vi) róódło pirrwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:9:

Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly (2) Informacja dotycząca. SEQ ID N0:I0:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: pojedyncza .

(D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczna: nie (iv) A^ys^sc^^: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:10:

Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr

10 (2) Informacja dotyczącą SEQ ID NO:11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Attysinsowta: nie (v) Typ fragmentu: wewnątrzny (vi) Źródło pierwotne:

187 274 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID OO:11:

Gln

Ile

VvC

Leu

Ser

Gln

Ser

Pro

Ala

He

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Lys

VvC

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Sto

Ile

Iyr

35

4 0

45

Ala

Thr

Eer

Asn

Leu

Ala

Ser

C^l^y

Val

Pro

Ala

Arg

PPh

Ssi

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Eer

Giy

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

He

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Glu

Trp

Ser

He

Asn

Pro

Arg

Tlnr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) Hormacja dotyccącc SEE ID NO:11:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 10 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: EEQ ID OO:12:

Arg Ala Eer Eer Eer Val Asn Tyr Met His

10 (2) IDfoomacja d^ccacc SEE ID SOH1:

187 274

(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 7 aminokwasów
(B)	Typ: aminokwasowa
(C;	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: peptyd
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu: wewnętrzny
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:13

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1	5
	(2) Informacja dotycząca SEQ	ID	NO
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 9 aminokwasów
(B)	Typ: aminokwasowa
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyne:	za
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: peptyd
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu: wewnętrzny
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID	NO:	: 14

Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr

5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 104 par zasad

187 274 (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:15:

CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG ABGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC 60

AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT 104 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 108 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:16:

TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG 60

AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG 108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza

187 274 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne::

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:17:

GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT 60

CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG 107 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:18:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A.)	Długość:	91 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:18:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA 60

GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G 91 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:19:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	337 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA

187 274 (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Attysitsorta: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha ztamiitta:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 2...337 (C) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:19:

A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 49

Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

10 15

GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC 97

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn

20

22

30

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCC

GGA

CCCA

GGG

CCC

GAAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

45

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Ppo

GGy

GGn

Gly

Leu

Glu

Τττρ

Mtt

Gly

Trp

Ile

35

40

45

AAC

ACC

AGA

gg\T

GGA

CAA

TCA

ACA

TAC

GTT

GAT

GAC

TTC

ca^g

GGG

CGG

133

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lls

See

TCh

Tyr

Val

Asp

Asp

PPa

Lys

Gly

Arg

50

55

60

TTT

GTC

TTC

CCC

TT^CG

GAC

ACC

TCC

GGC

AGC

AC^CA

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

241

Phe

Val

Phe

eer

Leu

Ags

TCh

S^er

Val

Ser

Thr

ATl

Tyr

Leu

Gir

He

65

70

75

80

AGC

AGC

CTA

ααα

GGC

GT.C

GAC

ACC

GCA

GTG

TAT

TAC

TCA

GCG

AGA

GATT

23 9

Ser

Ser

Lee

uys

Ala

Ags

As^s>

TTh

AA a

Val

Tyr

Ty r

Cys

Ala

Arg

GTu

85

90

95

GGG

AAT

ata;

GAA

ATT

TAC

TTC

CCT

ttc

ACT

TAC

TGG

CAG

GGT

ACC

333

Gly

Asn

Met

Agp

Gly

Tyr

Phe

Pro

PPe;

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

GTl

Thr

100 105 110 (2) Informacja dotycza.ca SEQ ID N0:20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

187 274 (A) Długość: 112 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:20:

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

1

5

10

15

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

20

25

30

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

35

40

45

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

50

55

60

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gln

Ile

65

70

75

80

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

85

90

95

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

100

105

110

(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:21:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie

187 274 (ivl Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:21:

GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:22:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A.) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:22:

TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:23:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 97 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Tyo cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierowtne:

(ix) Cecha znamienna:

187 274 (Α5) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 27...95 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:23:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTA GT 97

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu

15 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NQ:24:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 23 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:24:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:25:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 110 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

187 274 (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:25:

GAGGAAGACG GCGAGGTATG GAAGCGCAAA ACCGCGCAGG GAAGGAGGGC GATGGCGGCC

TAGTAGTAGT GAAGGCAGCT AAGAAGATAC ACTACAGAGG ACAGCGAAGA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:26:

(i) Charakterystyka sekwencji:

110

(A)	Długość:	21 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa
(D)	Topologia	: liniowa
Typ cząsteczki:	cDNA

(iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:26:

AGGAGAACAG TAGGGGTAGA A 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:27:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA

187 274

(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 27

GATTGCACTA GTTGGACCTG CGAGTGGACA 30

	(2) Informacja dotycząca SEQ	ID NO
(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 77 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierowtne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID	N0:28

CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG

ACGGGCCGGT TCACGAT (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:29:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 73 pary zasad tB) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

•52

187 274 (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:29:

ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC 60

TCTGCGACCC ACT 73 (2) Informaja dotycząca SEQ ID N0:30:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 363 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...363 (D) Inna informacja: F9HZHC 1-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:30:

CAG

GTG

CAA

CTA

GTG

CAA

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

AAG

CCT

GGG

GCC

48

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AA.G

TCA

ACA

TAr

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly Tro Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe

187 274

AAG

GGA

CGG

• TTT

GTC

TTC

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Ala

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAG

GGT

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

363

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:31:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowne: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:31:

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

187 2174

50

55

60

Lys

Giy

Arg

rhe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Sio

VaS

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Tle

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

95

95

Alc

Aa o

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

eS e

os o

es e

os t

ryr

Ts g

Cly

100

10S

120

Gln

Gil

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

(2) InOormacjas dotycząca SEQ ID OO:32: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 165 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
ID)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDOA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID OO:32:

AGTACTGACA	CAGTCTCCAG	CCACCCTTGT	TTOTCTOA	GGGGAAGGAG	CCACCCTCTC	60
CTGCAGGGCC	AGCTCAAGTG	TAAATTACAT	GCACTGGTAC		CTGGCCAGGC	120
TCCCAGGCTC	CTCATCTATG	CTTCCACGAC	CCTiGCTTCT	GGCAS		165

(2) Inforoacja do^cczcc S SE H S O:13: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	146 par zasad
(B)	T CT : kwa s	nukleinowe
(C)	Struktura	naciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDOA

187 274

(iii)	Hipotetyczna:	nie
(iv)	Antysensowna:	nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji

CCGCGGGTTR ATACTCCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT

GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC

AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CATAGA (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:34:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	280 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna (A) Nazwa/klucz: Sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 2...280 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:34:

A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

10 15

GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser '/al Asn Tyr Met His Trp

120

6

187 274

TAC

CAA

CC.G

AGA

CCT

G<^<C

CAG

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

GCC

ACT

145

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

AA a

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGC

AGC

CCCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

193

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

lie

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

ACA

GAA

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

241

Gly

Thr

Aap

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

GCG

GTT

GAG

TAC

TGT

CAG

CAA

AGG

AGT

AGT

AAC

CCG

CGG

280

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

dl

Ato

Ser

lie

Asn

Pro

Arg

90 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:35:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 93 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:35:

Val 1

Leu

Ghr

Gln

Ser 5

Pro

Ala

Thr

Leu

Srr 10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu 15

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Mee

His

Trp

20

25

30

Gyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

IlA

TTr

AA a

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Iie

Pro

Ala

Arg

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

187 274

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro Glu Asp

Phe

65

70

75

30

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

90 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:36:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (i) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Iznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:36:

TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:37:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: Kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa; nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 37:

GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA

187 274 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:38:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 94 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić	: pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(Vi)	Źródło pierwotne:
(ix)	Cecha znamienna:
	(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca
	(B) Lokalizacja: 27... (D) Inna informacja:	92
(xi)	Oznaczenie sekwencji:	SEQ ID NO:38:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG GTA, GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val

15 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:39:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

(ii)	Typ cząsteczki	: białko
(iii)	Hipotetyczna:	nie
(iv)	Antysensowna:	nie
(v)	Typ fragmentu:	wewnętrzny

187 274 (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:39:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

10 15

Val His Ser Glu Ile Val (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4Q:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 30 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:40

GACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA

(i)	(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 55 par zasad
<B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(VI)	Źródło pierwotne:

187 274 (xi) Oznaczenie sekwencji·: SEQ ID N0:41:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:42:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 51 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza tD) Topologia: liniowa

(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(V)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(x; )	Oznaczenie sekwencj.

CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:43:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	321 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa
Typ cząsteczki:	cDNA

(iii) Hipotetyczna: nia (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne: (ix) Cecha znamienna:

(A)	Nazwa/klucz:	sekwencja kodująca
(3)	Lokalizacja:	1. .	. 321
i D)	Inna informa	cja:	F9HZLCI-0

187 274 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:43:

AAA

ATA

GAC

CCA

ACA

CAG

TCT

CCA

· GCC

CCC

CTG

TCT

TTG

TCT

CCA

GGG

48

Glu

lle

Vv1

Lnu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ali

TOc

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

05

15

AAA

AAA

GGC

ACC

CTC

CCC

TAC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

CATT

TAC

ATG

96

Alu

Arg

ATl

Chr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Src

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

55

30

CAC

TTA

TCC

CAA

CAG

aca

CCT

GGC

CAA

GCC

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

114

His

Trp

Tts

Aln

Gln

Arg

Pro

Gly

Aln

Alc

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

35

40

45

TCC

ACT

AAA

AAC

CTG

GCT

TCT

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

192

Ala

Thr

See

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Ile

Poc

Ala

Arg

PPe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

TTT

TCT

gc^cc

ACA

GAT

TCCC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

^<^T

GAA

ATT

Gly

Ser

Gl/

Thr

Asp

PPe

Thr

Leu

Thr

nC

Ser

Ser

Leu

Glu

PrC

Glu

65

70

75

80

GAT

CCC

GGC

GTC

TAT

TAC

TTT

CAG

CAA

TGG

AGT

ATT

CATC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe

ATl

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Aln

Trp

Ser

Ile

Asn

Ppo

Arg

Thr

8 5

9.C

95

TTC

GAC

GAA

AGT

ACC

ACA

GCG

GAG

ATC

TAA

CGA

Phe

Aly

GAl

Gly

TTr

Lys

Val

GAu

lle

Lys

Acg

100 1^05 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:44: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokrasora (C) Struktura naciowa:

(D) Topologia: liniowa

(ii)	Typ cząsteczki	: białko
(iii)	Hipotetyczna:	nie
(iv)	.Antysntsowta:	nie
(v)	Typ fragmentu:	rnwnntozny

187 274 (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:44:

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Tc'i

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:45:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 134 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (J) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Tyy fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:45:

CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT

GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATA7

CTACAGATCA GCAG

134

187 274 (2) Informacja dotycząca ID N0:46:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 134 par zasad (3) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:46:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA

GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC

AGAGGAGTCT AGAG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:47:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 225 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...225 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:47:

120

134

187 274

CCC

TTA

CAA

TAG

TCC

AAG

TTT·

ATG

GGA

TGG

Atg

AGC

ACC

ATT

ATT

GGA

48

Pro

Gly

G1g

G ly

Llu

Lys

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Acn

TCr

Arg

Acn

GTy

1

3

10

15

AAG

TCA

ACA

CAT

GTT

GAT

GAC

TTC

GAG

GGA

CCT

AT/’

GTC

TTC

TCT

CTA

96

Lys

Ser

Thr

r yr

Av1

Asp

Gsp

Phe

Lys

Gly

Ata

Phh

Vv1

Phe

Ssu

Alu

20

25

30

GAC

TTC

CCT

GTC

AGC

ACG

GCG

TAT

CCC

CAG

ATC

AGC

AGC

CCA

ATG

GCT

144

Asp

Ser?

Ser

Val

Ser

Th?r

Ala

Tyr

Luu

Gln

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

35

40

45

GAC

TAC

ACT

TCA

TGG

TAT

TTC

TGT

ACG

AGA

GGG.

AGG

AAT

ACT

GAT

AGT

192

Asp

Asp

Thr

A Ac

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

GGu

AG y

Acn

Met

Acs

AG.

50

55

60

TAC

TTG

CCC

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CCG

GGT

ACC

Tyr

Phh

hro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

70 75 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:48:

(i) Charakterystyka sekwencji: tA) Długość: 75 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi)	Oznaczenie sekwencji:	SEQ	ID	NO:48:
hro	Gly Gln Gly Leu	LyA Trp	Met	Gly	Trp Ile	As.n	Thr	Arg	Asn Gly
1	5				IA				15
Lys	Ser TGr Tyr Val	Asp Asp	PhA	Lys	Gly Arg	Ahe	Val	hhe	Ser Leu

2A

187 274

Asp

Ser

Ser 35

Val

Ser Thr Ala

Tyr 40

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser 45

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

50

55

60

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

65

70

75

(2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:49: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	27 par zasad
(g)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:49:

TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG 27

	(2) Informacja dotycząca	SEQ	ID NO
(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 24 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
i vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ	ID	N0:50

187 274

TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT 24 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:51:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość : 363 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia : liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: Sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...363 (D) Inna informacja: F9HZHC 1-1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:51:

CAG

GTG

CAA

CTA

GTG

CAA

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

AAG

CCT

GGG

GCC

48

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

GIy

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCT

CTA

GAC

TCC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr-

Ala

Tyr

187 274

CTA

CAG

AAG

AGC

AGC

CTA

AA^G GCT

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC

TGT

2813

Leu

Gln

111

Ser

Ser

Leu

Lys Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

ACG

AGA

GGA

GGG

AAT

aTg

GAG GGT

TAC

TTC

CCT

ttt

ACT

TAC

TGG

GGC

33 6

Thr

Arg

dl

Gly

Asn

Met

Asp Gly

Tyr

Phe

P^o

PPe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAG

GGG

ACC

CGG

GTC

ACC

GGC TCC

TCA

363

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val Ser

Ser

115

120

(2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:52:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową (C) Struktura niciowa: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nir (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi)

> O

znac:

zenie

a se:

kweni

Cji:

SEQ

ID

NO:52:

Gln

Val

Gln

Leu

VaA

Gln

Ser

Gly

Ser

G1a

Leu

LyA

Lys

Pro

GI A

Ala

1

5

0A

15

Ser

Val

Lys

Val

SeA

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

TyA

Thr

PP e

Thr

Asn

Tyr

20

)25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Llu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

T^ł^r

Arg

Asn

G Ly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

555

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

187 274

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser Leu 85

Lys Ala Asp Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

(2) Informacja dotycza.ca SEQ ID NO: 53:

(i) Charakterystyka sekwencji :

(A)	Długość:	82 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii} Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:53:

CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC 60

GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82

	(2)	Informacja	dotycząca SEQ ID NO:54:
(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A)	Długość:	90 par zasad
	(B)	Typ: kwas	nukleinowy
	(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	cDNA

(iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

187 274 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:54:

GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC

TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:55:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

(ii)	Typ cząsteczki: peptyd
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu: wewnętrzny
(Vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ	ID N0:55:
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro	Lys Pro Trp	Ile Tyr Ala Thr Ser
1	5	10	15

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

25

	(2} Informacja dotycząca SEQ	ID N0:56:
(i)	Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 321 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy
(ii) (iii)	(C) Struktura niciowa: nić (D) Topologia: liniowa Typ cząsteczki: cDNA Hipotetyczna: nie	pojedyńcz

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

187 274 (ix) Cecha znamienna:

(A} Oazwc/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...321 (D) Inna informacja: F9HZLC 1-1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID OO:56:

GAA

ATA

GGA

CTG

ACA CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

CCA

GGG

41

Glu

Ile

VvC

Leu

Thr Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

175

GAA

AGA

GGC

GCC

CTC TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

9(5

Glu

Arg

AAl

Thr

Leu Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

2G

3(0

CAC

TGG

TAA

CAG

CAG AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

141

His

Trp

Tac

Gin

Gln Arg

Pro

Gly

lln

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACG

AAG

AAC

CTG-1CT

AGC

GGC

GTC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

112

Alc

Thr

Ssi

Asn

Leu Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

G.AA

24G

Gly

Ser

Gll

Thr

Asp Phe

Thr

Llu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

GAT

TTT

GGC

GTT

TAT TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

GArC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe

AAl

Val

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gln

Trp

S^jr

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

975

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

332.

Phe

Gly

lly

Gly

Thr Lys

Val

llu

Ile

Lys

Arg

100 1.05 (2) Informacja dotycząca SEQ ID OO:57: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową (C) Struktura liniowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

187 274 (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:57:

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gln

5er

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro IS

Gly

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Glv

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:58:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 41 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pjedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:58:

GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T

187 274 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:59:

(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 41 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:59

CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G

	(2) Informacja dotycząca SEQ	ID N0:60
(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 13 aminokwasów
(B)	TYP: aminokwasowa
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: peptyd
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu: wewnętrzny
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi>	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID	N0:60:
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu	Thr Ile
1	5	10

(2) Indormacja dotycząca SEQ ID NO:61:

(i) Charakterystyka sekwencji:

187 274

(A)	Długość: 321 par zasad
(B)	Typ: kwis nukleinowy
(C)	Struktura niciowi: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Attysetpwwna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: Sekwencji kodująca (B) Lokalizacja: 1...321 (D) Inna infori^n^c^jo^::I^!^HC LC1-2 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:61:

GAA

ATA

GCA

CTC

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTT

TCT

TTG

TCC

CCA

GGG

4C

Alu

Ile

Val

Leu

Chr

Aln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

TAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ACA

96

Glu

Arg

Ala

ThC

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

eoC

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

CGA

TAC

CTAC

CAA

AGA

CCT

GGC

CAA

^<CC

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Cln

Ala

Pro

Lys

- Cro

Trp

IL^ie

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

AGT

TACC

CTA

GCT

AGC

GGC

ACC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

192

Ali

Chr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Poc

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

ACT

CCC

ACA

ATA

TCC

AGT

CTA

GATG

CCT

GAC

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

TTr

Lee

Thr

IlC

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

TAT

TTT

gc^cc

GTT

TAC

TAC

TCG

CCC

CAG

TGG

AGT1

AAT

CAiC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tts

CCS

GAn

Gln

Trp

See

He

Asn

Pro

Arg

Thr

90 95

187 274

TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

321

	100	105
	(2) Informacja dotycząca .	SEQ ID NO
(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 107 aminokwasów
(BI	Typ: aminokwasowa
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: białko
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu: wewnętrzny
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ	ID NO:62

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:63:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 165 par zasad

187 274

(B) Typ: kwcs nukleinowy
	(C) Strukturc niciown: (D) Topologic: liniowc	nić	poj edync^
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetycznc: nie
(iv)	AnOtypnsfwnc: nie
(v)	Typ nrjgrpptA:
(vi)	Źródło eiPwo0pρ:
(xi)	Ozprczppip sekwencji:	SSE	ID N0:63:

AGTACTCACC	CAGAGCCCAA	GCAGCCTGAG	CGCCAlClhG	GGTGACAGAG	TGACCATCAC	60
CTGCAGGGCC	AGCTCAAGTG	T^W^ACAT	GCACTGGTAC	CAGCAGAAGC	CAGGT AAGGC	120
TCCAAAGCCT	TGGATCTACG	CCACTAGTTA	CCTGGCTTCT	GGTGT		165

(2) Ipnfrrrąjr dotyczącc SSE ID N0:64:

(i) ChcrcktPrtsOtkc sekwencji:

(A)	Długość:	161 pcr
(B)	Typ: kwcs	nukleinowy
(C)	Strukturc	niciouc: nić pojedynczc
(D)	Topologic	: liniowc

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetycznc: nie (iv) Apttspnsfwpn: nie (v) Typ fragmpoAo:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Ozn^zenie sekwencji: SSE ID N0:64:

CCGCGG1TTA	ATACTCCACT	GCTGGCAGTA	GTAGGTGGCG	ATATCCTCTG	GCTGGAGGCT	66
GCTGATGGTG	rAGGTGTAlT	CTGTACCGCT	ACCGGATCCG	CTGAATCTGC	Ί'hGGCrLCACC	120
AGAAGCCAGG	TTACTAGTGG	CGTAGATCCA	AGGCTTTGGA	G		161

(2) Ipnforrcjj dotyczącc SEQ ID N0:65:

(i) ClrorktprysOtkc sekwencji:

(A) Długość: 280 pcr zcscd

187 274 (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ni) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 2...280 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:65:

A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arrg

10 15

GTG

ACC

ATC

ACC

CGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TTAC

ATG

CAC

TGG

97

Val

Thr

Ile

T Th

Cys

Aao

Ala

Ssr

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

TAC

CAG

CAG

AAA

CCA

GGG

AAG

GCT

CCA

AAG

CCT

TGG

ATC

TT^CC

GCC

ACT

11C

Tyr

Gln

Gln

L ls

Cro

GGy

Lys

AAl

Pro

Lys

Pro

Trp

He

Gyr

Ala

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GGC

CCT

GGG

GAG

CCA

AGC

AGA

TTC

AGC

GGA

TCC

GGT

AGC

193

Ser

Asn

Leu

AAa

Csr

Gly

Val

Pp?o

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ssr

Gly

Ssr

50

55

60

GGT

ACA

GAC

TAA

CCC

TTT

ACC

AAC

AGC

AGC

CTC

CAG

CCA

GAG

GAT

ATC

241.

Gly

Thr

Asp

T ts

CTh

PPh

Thr

111

Ser

Ser

Leu

GGn

Ppo

Glu

Asp

Ule

65

70

75

80

GCC

ACC

TAC

TAC

TGC

CAG

CAG

CGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

280

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

90 (2} Informacja dotycząca SEQ ID NO:66:

187 274 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	93 aminokwasów
(B)	Typ: aminokwasowa
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa
typ cząsteczki:	białko

(iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowan: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vl) Źródło pierwotne (xi) Opis sekwencji: SEQ ID N0:66:

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

65

70

75

80

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

90 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:67:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	27 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(ni)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:

187 274 (vi) AródłA piArwonue:

(xi) Oznaczeniu sekwencji: SEQ ID NO:67:

CTGAGTACTC ACTTGGATTC CAAGCAG

2-7 (2) Informacja dotycząca SSQ ID NO:66:

(i)	Charakterystyka sekwencji:
(C)	Długość: 27 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciom: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniom
(i:)	Typ cząsteczki: cDNC
(iii)	Hipotetyczna: nii
(iv)	AnOyseGnorGα: nii
(v)	Gyp fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczeniu sekwencji: SEQ ID NO:68

TTTCGTTGGT TACTACCCCC CTTCTTG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6:

(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 33 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciom: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	AGOLsensowna: nii
(v)	Gyp fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczeniu sekwencji: SEQ ID NO:69

CGTGAGTGGT ATTACCTGTG ATGGTACATT GGT

187 274 (2) Innfrrcąjr dotyczącc SSE ID N0:70:

(i) Chcocktpoyy0ykr sekwencji:

(A) Długość: 17 rrinfkwcsów (B) TYG: cIripfkwcsowc (C) Strukturc niciowic: nić pojedynczc (D) Topologic: liniowc (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetycznc: nie (iv) Apttspnyownn: nie (v) Typ nrr^|rιpnOA: N-końcowy (vi) Źródło pierwotne:

(xi} Ozn^zenie sekwencji: SSE ID N0:70:

Arg Thr Ghe Gly Gln Gly Thr Lys M Glu Ile Lys Arg Thr ycl Alc

10 15

Alc (2} Ipnorrrcjc dotyczącc SSE ID NO:71:

(i} ClcAjktpryyOtkc sekwencji:

(A) Długość: 48 pcr zcscC (B) Typ: kwcs nukleinowy (C) Strukturc n^ciowc: nić pojedynczc (D) Topologic: liniowc (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetycznc: nie (iv} ApOysppsownj: nie (v) Typ n^gr^ntu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Ozn^zenie sekwencji: SSE ID NO:71:

llAClThCGG CCAAGOGACC AA1GT1GAAA TCAArCGGAC TGTGGCGG 48 (2) Inform^jc dotyczącc SSE ID NO:72:

187 274

(i)	Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 52 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy
	(C) Struktura niciowa: nić (D) Topologia: liniowa	poj edync
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	i Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(V)	Typ fagmentu:
(Vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ	ID N0:72

CGCCGGCACR GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:73:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 321 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) LOCATTON: 1...321 (D) Inna informacja: F9HZLC 2-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:73:

CAG ATA GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

187 274

GAC

AGA

GTG

ACC

ATC

ACC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGT

AAG

GCT

CCA

AAG

CCT

TGG

ATC

TAC

144

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACT

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGT

GTG

CCA

AGC

AGA

TTC

AGC

GGA

TCC

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGT

AGC

GGT

ACA

GAC

TAC

ACC

TTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTC

CAG

CCA

GAG

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

65

7C

75

80

GAT

ATC

GCC

ACC

TAG

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATC

AAA

CGG

321

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:74:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura sieciowa: nić pojedynczą (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło wewnętrzne:

(xi) Oznakowaniwe sekwencji: SEQ ID NO: 74:

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly

187 274

Asp Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr Cys

Arg

Ala 25

Ser

Ser

Ser Val

Asn (30

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Top

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

150

Gly

Ser

Giv

Thr

Asp

Tyr

Thr

l?he

Thr

He

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 (2) InorrmccjA doyccąącA EQA IA N0:55:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 94 pao zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi:	Źródło pierwotne:
(ix)	Cecha znamienna:
	(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca
	(B) Lokalizacja: 27... (D) InaA inforcacjo:	94
(xi)	Oznaczenie sekwencji:	SEQ ID N0:75:

AAATTTTlGl CGTGCGllAC CTCACC ATG GGA TH AGC TGG ATC AGC CTC TTC

Met Gly Trp Sio Cys Ile Ile Leu Phe

187 274

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GUC

CAC

TCC

CAG

ATA

GTA

CT

94

Lpu

Vcl

Alc

Thr

Alc

ThT

G1 y

Yac

His

Ser

GGn

11 €ϊ

vai

Leu

10

15

20

(2) Ipnfrmcąjc dotyczącc SSE ID NO:76:

(i) ChrorkOertytykc sekwencji:

(A) Długość: 23 rmipokwrsów (B) Typ: cmipokwryowr (C} Strukturc piąifwc: nić pojedynczc (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: bicłko (iii) Hipotetycznc: nip (iv) Apttypnyfwpn: nip (v) Typ nocgmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Ozncccpnie sekwencji: SSE ID NO:76:

Met	Gly	Trp	Ser	Cys	Ile	Ile Leu	Ghe Lpu Vcl	Alc Tho Alc Tho Gly
1				5			10	15
Vcl	His	Spa	Glp	Ilp	Vcl	Lpu
			20

(2) Innfrmcąjc dotyczącc SSE ID NO:77 (i) Clrockterysttkr sekwencji:

(A) Długość: 401 pcr zcscC (B) Typ: kwcs nukleinowy (C) Strukturc piciowc: nić pojedynczc (D) Topologic: liniowc (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetycznc: nie (iv) ApOyyepyownc: nie (v) Typ forgmenOu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cechc ^^ριμ :

(A) Njcwc/kluąz: sekwencjc kodują.cc

187 274 (B) Lokalizacja: 27...401 (C) Inna informacja: F9HZLC 1-3 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:77:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

3

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

CCT

GTC

AAC

TAA

CAC

ATA

GTA

CTG

ACA

CAG

Ul

Leu

lal

Ala

T Tr

Ala

Thr

Gly

Val

His

Srr

Gln

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

10

11

20

25

TCT

CCA

GCC

AAA

CTG

TCT

TTC

TCT

CCA

CCC

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

4 49

Ser

Pro

Ala

T Tr

Leu

Se er

Lru

Ser

Pro

Gly

Clu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

30

35

40

TGC

AGG

GCC

AAG

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATC

CAA

TC^<3

TAC

CAAA

CA^CC

AGA

977

Cys

Arg

Ala

S Sr

Ser

Se jo

lal

Asn

Tyr

Mrt

His

Trp

Tyr

Gin

Gln

Arg

43

30

53)

CCT

GGC

CAG

G CC

CCC

AdG

AAC

TC^<G

ATC

TAT

CCC

ACG

AGT

5^0

CTG

GCT

25 5

Pro

Gly

Gln

A Al

Spo

Lls

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Sst

Asn

Llu

Ala

60

63

70

AGC

GGC

GTC

CAA

GCC

AGG

TTC

AGT

CCA

TCC

CCC

TCT

GCG

ACA

GATT

TAC

3933

Ser

Gly

Val

P po

Ala

Arg

Phr

Ssr

Gly

Srr

Gly

Sst

GGy

Thr

Asp

Tvr

73

80

83

ACT

CTC

ACG

AAA

S TC

AGC

CAA

GAG

AAT

GAA

CAT

TTT

gg^c;

GCT

TAA

TAC

3211

Thr

Leu

ThT

0 ll

Ss io

Ssr

Lru

Glu

Pro

Glu

Asp

Phh

AJ. i

Vil

Ttr

Tyr

90

99

100

U5

TGT

CAG

CAC!

CAC

AAC

AAT

AAC

CCG

CCC

AAC

TTC

GCC

GCA

GCG

AAC

lArG

335 9

Cys

Gln

Gln

n to

Sse

Ul

Asn

Ppo

Arg

Thr

Phe

GCy

GCy

Gly

TTh

l^t

110 115 112

CTC	CAC	ATC	CAC
lal	Clu	Ile	Lys
			123

(2) Informacja 5otycząca 5EQ 5D 50:78:

(i) Charakterystyka sekwencji:

187 274 (A) Długość: 125 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna : nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: internal (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:78:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

Gln

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

20

25

30

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

35

40

45

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Lys

Pro

50

55

60

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

65

70

75

80

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

85

90

95

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser·

Ile

Asn

100

105

110

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115 220 125 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:79:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	81 par zasad
(B}	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

187 274 (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie

(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:79:

AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC 60

AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:80:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 99 par zasad (BI Typ: kwas nukleinowy

(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA

(iii) Hipotetyczna: nie

(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:80:

TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC 60

TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NQ:81:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 87 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

187 274 (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:81:

GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA 60

AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT 87 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NQ:82:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A)	Długość:	86 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
tD)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna:

(v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:82:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60

GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT 86 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:83:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	278 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

187 274 (vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 3...278 (D) Inne informacje:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:83:

AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 47

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg

10 15

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

95

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

20

25

30

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

143

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

35

40

45

TCT

CTA

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

191

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser

Leu

50

55

60

AAG

GCT

GAG

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TTC

TGT

ACG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

239

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

65

70

75

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

278

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

80

85

90

(2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:84:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 92 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii} Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie

187 274 (iv) Aptsepsfwpr: nip (v} Typ focgrιpntA: wewnętrzny (vi) Źródło pIpooOpp:

(xi) Ozn^zenie sekwencji: SSO ID NO:84:

Alc

Spa

Gly

Tyr

Thr

PhD

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

1

5

10

15

Alc

Gro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Top

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

20

25

30

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Ghp

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

PGh

Ser

35

40

45

Lpu

Asp

TTr

Ser

Val

Ser

Thr

Alc

Tvo

Leu

Gln

Ilp

Ser

Seo

Llu

Lpy

50

55

(50

Alc

Glu

Aas

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Tho

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

65

70

75

80

Gly

Tyr

PGh

Pro

Phe

Thr

Tyr

Top

Gly

Gln

Gly

Thr

90 (2) Infrrrącj a dotcczcca SEQ D D OCkS:: (i) ClcockOpoysOykc sekwencji:

(A)	Długość:	30 pco zcscC
(B)	Typ: kwcs	nukleinowy
(C)	Strukturc	piciowc: pić pojedynczc
(D)	Topologic	: liniowc

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotecznc: nip (iv) AnOysppsfwnc: nip (v) Typ frcgmiPpnLu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Ozncącpnip sekwencji: SSE ID NO:85:

AGG9Ch9hll ATACACCTTC ACTAA9TAT1 (2) Informacjc dottącz.ąj SSE ID NO:86:

187 274 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość: 26 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:86

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG

	(2) Informacja dotycząca SEQ	ID NO
(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 37 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(Vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ ID	N0:87

CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:88 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 446 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza

187 274 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 27...446 (D) inna informacja: F9HZHC 3-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:88:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

CAG

ATC

CAA

CTA

GTG

CAA

101

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Val

His

Ser

Gln

Ile

Gln

Leu

Val

Gln

10

15

20

25

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

AAG

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

149

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

30

35

40

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

197

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

45

50

55

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

245

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

60

65

70

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

293

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

75

80

85

TCT

CTA

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

341

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser

Leu

100

105

187 274

389

ACT	GCG	GAG	GAC	ACT	TCC	GTG	TAT
Lys	Cla	Glu	Asp	Thr	Gla	Val	Tyr
				110
GCT	GGT	TAC	GTC	CCT	GCT	CCT	TAC
Csp	Gly	Tyr	hhe	Pro	hhi	ThA	Tyr
			125
GCC	TCC	TCC
Val	Sur	Ser

140

CTC	TGT	GCT	AGA	GATT	GGG	AAT	ATG
hhe	Cys	ThA	Arg	Glu	Gly	Asn	Met
	115					120
CGG	TGC	CAT	GGT	ACC	CTG	GTC	ACC
Trp	Gly	Gln	Gly	Thr	Leu	Val	ThA
130					135

437

46 (2) AołoLząąa GEQ A D A0:89:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 140 aminokwasów (B) Gyp: aminokwas (C) Struktura niciom: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) AG0LSUGSOwna: nii (v) Gyp fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotni:

(xi) Oznaczeniu sekwencji: SEQ ID NO:89:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

PhT

Leu

Val

Ala

Thr

Al a

TAt

Gly

1

5

0G

55

Vi|

His

Ser

Gln

ILe

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

SeT

Glu

Leu

Lst

Lys

20

25

30

hro

G1 y

Ala

Cla

VaS

A as

Val

See

s GS

Val

A1s

A Gr

CAs

Tye

s Gr

Cla

35

4T

45

Thr

Asn

Tyr

CLa

MeG

A τη

Tlo

VaT

G Tg

GAn

A1v

l to

CAy

G1t

G Ty

Cu

50

55

60

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

(Arg

Asn

Gly

Ly τ

Ser

Thr

Tag

Val

65

70

77

80

Asp

Gsp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

PhG

Ser

Luu

Asp

Thr

Ser

VaT

Ser

9T

187 274

Thr

Ala

Tyr Leu Gln 100

Ile

Ser

Ser Leu 105

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:90:

(i)	Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 90 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy
	(C) Struktura niciowa: nić (D) Topologia: liniowa	poj edyncza
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ	ID N0:90:

AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC

TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:91:

(i) Charakterysyka sekwencji:

(A)	Długość:	108 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

187 274 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:91:

TCCGCTCCGC CCCTGCCAGC CCGCTTATTC GTGGCATCGA TCTAGCCCTT CGGACTTTTG 60

TTACGCTTTT CTCGGCATTA GTGCATCTAA TTTACATTTG ACTTCCTC 108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:92:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 108 par zasad (Bj Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:92:

TAΑCTCGCTT CCCGCCGCCT TATCCCCGCT CACTCCΑTTC GCGTTTCCCC TCCATTACc.C 60

TCCTATCCCC TCCCCTCTΑC CCCCTCACCC TTTTCTGΑCC TATTAC^ 108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:93:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 102 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (ivy Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:93:

187 274

GGCGCCGĆCA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA

ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:94:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	330 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 2...328 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:94:

A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

10 15

102

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

CAC

TGG

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

-Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

AAA

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

AGC

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

ACA

GAT

TAC

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

CAA

CCT

GAA

GAT

TTT

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

145

193

241

187 274

28C

GCG

ACT

TAA

CAC

CAG

CAG

•TCG

AGT

ATT

TdC

CCG

CGG

ACG

TTC

GGC

Ala

Thr

Tts

Cyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Cst

Ile

AAn

Ppo

Arg

Thr

Phe

Gly

85

90

95

GGA

GGG

AAC

AAG

CTG

GG^G

ATC

TAAA

CGA

ACT

GGA

GCG

GGG

CC

Gly

Gly

TTh

Cls

Leu

Glu

Ile

Lls

Arg

Thr

Val

Ala

AA^

100 105

3(30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:95:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 109 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:95:

Val

Llu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Α1 a

Ser

Val

Gly

Asp

kA^

1

5

10

15

Val

TTr

Ile

Thr

Cys

Arg

Al a

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Tcp

20

25

30

Tyr

Gla

GG^n

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Llu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Thr

AAp

Tho

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

Ala

Thr

T'r

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

G(g

85

90

'55

Gly

dl

Thr

Lys

Leu

Glu

I1c

Lys

Arg

Thr

azć^i

Al a

A. la

100

105

187 274 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:96:

(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 26 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
(C)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hiptetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie'sekwencji: SEQ ID Np:96

CAAGTAĆTGA CACAGTCTCC ATCCTC

	(2) Informacja dotycząca	SEQ ID NO
(i)	Charakterystyka sekwencji:
(A)	Długość: 26 par zasad
(B)	Typ: kwas nukleinowy
CC)	Struktura niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia: liniowa
(ii}	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fagmentu:
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji: SEQ	ID N0:97

AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:98:

(i) Charakterystyka sekwencji:

187 274 (A) Długość: 412 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 27...412 (D) Inna informacja: F9HZLC 3-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:98:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

CAG

ATA

GTA

CTG

ACA

CAG

101

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Val

His

Ser

Gln

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

10

15

20

25

TCT

CCA

TCC

TCC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTT

GGG

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

149

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

30

35

40

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

197

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

45

50

55

CCT

GGC

AAA

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

AGT

AAC

CTG

GCT

245

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

60

65

70

AGC

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

293

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

187 274

341

ACT

CTC ACG

ATA

TCC

AGT

CTA CAA CCT

GAA

GAT

TTT

GCG

ACT

TAT

TAC

Thr

Leu Thr

Ile

Ser

Ser

Leu Gln Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

90

95

100

105

TGT

CAG CAG

TGG

AGT

ATT

AAC CCG CGG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

Cys

Gln Gln

Trp

Ser

Ile

Asn Pro Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

110

115

120

CTG

GAG ATC

AAA

CGA

ACT

GTG GC

Leu

Glu Ile

Lys

Arg

Thr

Val Val

125

(2) Informacja

dotycząca SEQ ID NO

:99:

389

412 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 129 aminokwasów

	(B)	Typ: aminokwsowa
	(C)	Struktura niciowa:	nić	poj edyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: białko
(iii) Hipotetyczna: nie
(iv)	Antysensowna: nie
(v)	Typ fragmentu: wewnętrzny
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji:	SEQ	ID	NO:99:
Met	Gly	Trp Ser Cys Ile Ile	Leu	Phe	Leu	Val	Ala	Thr	Ala	Thr	Gly
1		5			10					15
Val	His	Ser Gln Ile Val Leu	Thr	Gln	Ser	Pro	Ser	Ser	Leu	Ser	Ala
		20		25					30
Ser	Val	Gly Asp Arg Val Thr	Ile	Thr	Cys	Arg	Ala	Ser	Ser	Ser	Val
		35	40					45
Asn	Tyr	Met His Trp Tyr Gln	Gln	Lys	Pro	Gly	Lys	Ala	Pro	Lys	Pro
	50	55					60
Trp	Ile	Tyr Ala Thr Ser Asn	Leu	Ala	Ser	Gly	Val	Pro	Ser	Arg	Phe
65		70				75					80
Ser	Giy	Ser Gly Ser Gly Thr	Asp	Tyr	Thr	Leu	Thr	Ile	Ser	Ser	Leu

100

187 274

Gln

Pro

Ulu Asp 100

Phe Ala

Thr Tyr

Tyr Cys 10A

Gln Gln

Trp

Ser 110

Ile

Asn

Pro

Aao

Thr

Thr

Glp uAy

Gly

ThG

y as

Gly

G1t

I Ae

Lys

Are

uAr

Gli

115

120

125

Val (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:100:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 26 pao zasad (B) Typ: kwap nukleinowy (C) Struktura nściowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:100:

CGAGGAGTGC TCTCCCGGTC TTCAlC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:101:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	41 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: cDNA
(iii)	Hipotetyczna: nie

(iv) Gntysrnsownc: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:101:

187 274

101

GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41 (2) Iformacja dotycząca SEQ ID NO:102:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	335 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (ii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...335 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:102:

CAG

ATA

GTA

CTC

TCC

CAG

TCT

CCA

GCA

ATC

CTG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

48

Gln

Ile

Val

Leu

Ser

Gln

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu

Ser

Al a

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGA

TCC

TCC

CCC

AAA

CCC

TGG

ATT

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAA.

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

102

187 274

CAT

CAT

GCA

ACT

TAC TAC

TAC

CAG

CAG

acc

AGT

ATT

5A^C

CCA

CGG

AAC

288

Asp

Ala

ACe

Tho

TTr Tyl

Cer

Gln

Gln

Top

Ser

He

Asn

Pro

Arg

Tho

8ó

90

93

TTA

cct

GGC

CGA

ACC AAG

CAG

gjct

ATC

AAA

CGG

ACT

GCT

GCG

GCG

CC

33ó

Phr

Cly

GCy

Gly

TTr Lys

Llu

Glu

Ilr

Lys

Arg

TTr

Val

Ala

Ala

Poo

100

103

110

(2)

Informacja dotycząca

SEQ

ID NO:103:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 112 aminokwasów

	(B) Typ:	aminokwasową
	(A) Struktura niciowa	: nić pojedyncza
	(D) Topologia: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki: białko
(iii) Hipotetyczna: nir
(iv)	Antysensowna: nir
(v)	Typ fragmenty: wewnętrzny
(vi)	Źródło pierwotne:
(xi)	Oznaczenie sekwencji:	SEQ	ID	N0:103:
Gln	IIl; lal Leu	Ser Gln Srr	hro		Ile	Luu	Ser	Ala	Ser	Pro	Gl y
1		5			10					15
Clu	Ll/ lal Thi	Met Thr Cys	Aog	Ala	Ser	Ser	Srr	Val	Arn	TTr	Met
	20			25					30
His	Tto Tyr Cln	Gln Lys Pro	Cly	Ser	Srr	Pro	Lys	hro	Tto	51p	Tyo
	33		20					43
Ala	TTh Srr Asn	Leu Ala Ser	Gly	Val	Pro	Ala	Aog	Phe	Srr	Gly	Ser
	30	33					60
Gly	Ser Cly Thi	Seo Tyr Ser	L LU	Thr	T1o	Sen	U5g	Vrl	lii	l 5 a	Glu
63		70				73					80
Asp	Ala Ala Thr	Tyr Tyi Cys	G Cn	Gln	Cen	SeT	I 5e	Aur	Pr c	A5g	hlo
		8Ó			90					95
Phr	GCy Cly Cly	Thr· Lls Leu	Glu	lie	Lys	Arg	Thr	lal	ACe	ACe	Pio
	100			105					m

187 274

103 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:104:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 318 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...318 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:104:

CAG

ATA

GTA

CTC

TCC

CAG

TCT

CCA

GCA

ATC

CTG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

4 8

Gln

Ile

Val

Leu

Ser

Gln

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGA

TCC

TCC

CCC

AAA

CCC

TGG

ATT

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAA

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

104

187 274

288

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCA

CGG

ACG

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:105:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 106 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:105:

Gln

Ile

Val

Leu

Ser

Gln

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Giu

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Trp

Ser

lie

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

187 274

105 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:106: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A)	Długość:	30 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (lv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:1O6:

CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:107:

(i) Charakterystyka sekwencji

(A)	Długość:	32 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Struktura	niciowa: nić pojedyncza
(D)	Topologia	: liniowa

(ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:107:

TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:108:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 369 par zasad IB) Typ: kwas nukleinowy

106

187 274 (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sekwencja genetyczna (B) Lokalizacja: 1...369 (D) Inna informacja:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:108:

CAG

ATC

CAA

CTA

GTG

CAG

TCT

GGA

CCT

GAG

CTG

AAG

AAG

CCT

GGA

GAG

48

Gln

Ile

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Glu

1

5

10

15

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGG

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAT

96

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCA

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

dy

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGC

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GCC

TTC

TCT

TTG

GAA

AGC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

AAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

65

70

75

80

TTG

CAG

ATC

GAC

AAC

CTC

AAA

GAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

288

Leu

Gln

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Al a

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

ACA

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe'

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

187 274

107

CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCT AGC

Gln Gly Thr Lpu Vcl Tho Val Ser Alc Ala Ser

115 120 :

(2) Informccjc dotyczącc SSO ID NO: 109:

(i) 9hrock0erty0tkc sekwencji:

(A) LENGTH: 123 cminokwjyów (B) Typ: minokwcs (C) Strukturc piciowc: nić pojedynczc (D) Topologic: liniowc (ii) Typ cząsteczki: bicłko (iii) Hipotetycznc: nie (iv) Anttspnsfwnc: nie (v) Typ nocgmpnOu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Ocnrczpnip sekwencji: SSE ID NO : 109:

369

Gln

Ile

dn

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Pro

Glu

Lpu

Lys

Lys

Pro

Gly

du

1

5

10

15

Tho

Vcl

Lys

lP 5

Ser

Cys

Lys

Alc

Ser

dy

Tyo

Thr

Phe

Tio

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Apd

Vcl

Lys

Gln

Ala

Pro

dy

Lys

Gly

Lpu

Lys

Tro

MeP

35

0 5

45

G1y

Top

IIe

Asn

Thr

Aog

Asn

Gly

Lys

Ser

Tho

Tyr

acl

Asp

Asp

Phi

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Alc

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

' Spo

.dD

Spr

Thr

Alc

Am

65

70

75

80

Lpu

Gln

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

AL·

Tir

Tfr

Pie

CCy

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Pip

Pro

Pip

Tio

Tyr

Tro

Dl.y

100

105

110

dn

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Sspa

Alc

Alc

Ser

115

120

108

187 274 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:110:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 363 pir zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowi: nić pojedyncza (D) Topologii: liniowi (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Attysetsowna: nie (v) Typ fragmentu:

(vi) Źródło pierwotne:

(ix) Cecha znamienni :

(A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: 1...363 (D) Inni informacji:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:O1O:

CAA

ACC

CAC

C CC

GTG

CC^CC

TCT

GGA

CCT

TAA

CCT

ACG

AAG

CCT

GGA

GAG

4C

Aln

Ile

Gin

L LU

Val

GL η

Ser

Gly

Pro

TLu

Leu

Lys

Lys

Pro

GAy

GAu

1

5

10

15

ACA

GTC

AAG

ACC

TCC

TGC

TAAG

GCT

TCT

CCA

CAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TCA

96

Thr

ViL

Lys

I Iu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Aly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ατη

T(s

20

25

30

ACA

ACC

AAC

T CA

GTG

CAGG

CAG

GCT

CCA

AGA

AAA

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

144

Aly

Met

Asn

T to

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Aly

Lys

Gly

Leu

Lys

Ter

Mee

35

40

45

TAC

TAC

ATA

AAA

ACC

AGA

CAGT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TGC

192

Gly

Trp

Ile

A gs

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Agp

PPh

50

55

60

AAT

AAA

CGG

T CC

GCC

TTC

TCT

TTG

GAA

AGC

TCT

GCC

AGC

ACT

GAC

CAT

24C

Lys

Aly

Arg

P Ph

Ala

PPe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

ATl

Agn

65

70

75

80

TTG

CAA

ATCC

GCC

AAC

CTC

CAAT

GAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

2138

Leu

Aln

Ile

A as

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Chr

Ala

Thr

Tyr

ΡΡε:

CCs

187 274

109

ACA

AGA

GGA

CGG

CGG

CTG

TAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGA

Tho

Arg

dl

Gly

AAs

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

GSy

100

105

110

CGG

AAC

CCG

CTC

ACT

GTC

TCT

TCC

Gln

Gly

TTh

Alu

Cal

Thr

Val

Ser

Ala

115 120

336

363 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO^h:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową (C) Stouktuoa niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowna: nie (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (vi) Źródło pierwotne:

(xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:919:

Gln

Ile

Gln

Leu

viC

Gln

Sec

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lyc

Pro

Gly

Glu

1

5

19

15

Thr

Val

Lys

Ile

SeC

CyC

Lyc

Ala

Ser

Tyr

Thr

Phę

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

VlC

LSsc

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

ił 9

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Wl

Asp

Asp

PPh

50

59

60

Lys

Gly

Aog

Phe

Ala

Phs

Ser

Leu

Glu

Ser

Seo

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

65

70

75

80

Leu

Gln

Ile

Asp

Asn

Lsu

.Lyr

Asa

GC u

Glu

ThA

pTa

Tli

Tyc

O Ce

Gro

110

187 274

Thi	Cig Gln GCy 5SC A5t Mup Gic T5^ Clr	rih ;5ρ T5p U5T iTy Aiy 110
100	ios
Gln	Gly ThT: Llu 5a1 1 51? Ahl	Sei 153
	113	120

187 274

187 274

Czas krzepnięcia, sekundy

Podłoża hybryd<?acve, μι

Fig. 2

187 274

Pig. 3

187 274

Zamknięcie przepływu

8ó Λ) 34 O O o

IM 92 75 29 O

Granica testu

ASA ASA _ofix aftx oHX oRX-l

H30 1 J i ASA

Eig. 4

187 274 >>

τ) a

0) ra

IG

V HIS HJO HM H120

ASA ASA HJO ofK <tflX aflX aftx -I

J 4 aSA

Pig. 5

187 274 % osobników z zamknięciem przepływu

H3O ¹ 3 i ASA

Fig. 6

187 274

Masa skrzepliny (mg)

Eig. 7

187 274 aPTT (s ekundy)

Fig. 8

187 274

Φ Φ > W lig. 9

187 274

Czas krzepnięcia, sekundy 40 60 80 100

CN

01234567 PM/IX mol/mol

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (41)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia posiadającego samoograniczającą się aktywność neutralizowania do wytwarzania leku do hamowania zakrzepicy u ludzi i zwierząt.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek zawiera dodatkowo kwas acetylosalicylowy.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik VIIIa, czynnik V, czynnik Va.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem monokolnalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 lub SB 257732.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB 249417.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) zostaje wydłużony bez znaczniejszego wydłużenia czsu protrombinowego (PT).
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że aPTT wynosi od około 35 sekund do około 100 sekund.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do leczenia zakrzepicy związanej z zawałem mięśnia serca, niestabilną dusznicą bolesną, migotaniem przedsionków, udarem mózgu, uszkodzeniem nerek, zakrzepem tętnicy płucnej, zakrzepicą żył głębokich, przezskómą angioplastyką wieńcową zespołem rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, posocznicą obecnością sztucznych narządów, przetok i protez.
11. 11. Przeciwciało monoklonalne stanowiące środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia.
12. 12. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że jest skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik VIIIa, czynnik V, czynnik Va.
13. 13. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że jest skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina.
14. 14. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że monoklonalnym przeciwciałem stanowiącym środek przeciwkrzepliwy jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX.
15. 15. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 14, znamienne tym, że ma charakterystykę identyfikującą SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732.

    187 274
16. 16. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 14, znamienne tym, że ma charakterystykę identyfikującą: 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9.
17. 17. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 14, znamienne tym, że ma charakterystykę identyfikującą SB 249417.
18. 18. Hybrydoma, znamienna tym, że ma charakterystykę identyfikującą linii komórkowej 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9.
19. 19. Neutralizujący fragment Fab, lub fragment F(ab')2, delecyjnie pozbawiony regionu Fc przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia.
20. 20. Neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, znamienny tym, że jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, prowadzącego do ekspresji łańcucha ciężkiego Fd przeciwciała monoklonalnego w reprodukcyjnej bibliotece Fab lekkiego łańcucha faga włóknistego myszy.
21. 21. Neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab% znamienny tym, że jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, w wyniku którego łańcuch lekki przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, ulega ekspresji w reprodukcyjnej bibliotece Fab ciężkiego łańcucha faga włóknistego myszy.
22. 22. Region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i 10.
23. 23. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8,9 i 10.
24. 24. Region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NO NO: 12, 13 i 14.
25. 25. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NO NO: 12,13 i 14.
26. 26. Zmienione przeciwciało, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego.
27. 27. Zmienione przeciwciało według zastrz. 26, znamienne tym, że jest humanizowane.
28. 28. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, 52 lub 89.
29. 29. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 lub 99.
30. 30. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 44.
31. 31. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przestawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 57.
32. 32. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencją aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 62.
33. 33. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki na sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 74.
34. 34. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 78.

    187 274
35. 35. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 89, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 99.
36. 36. Przeciwciało chimeryczne zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, znamienne tym, że hamuje działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczajacy się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i które skierowane jest przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia.
37. 37. Przeciwciało według zastrz. 36, znamienne tym, że regiony stałe wybrane są spośród immunoglobulin ludzkich.
38. 38. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera humanizowane przeciwciało obejmujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, przy czym sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
39. 39. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało chimeryczne obejmujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, charakteryzujące się tym, że hamuje działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczający się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, przy czym sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i które skierowane jest przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
40. 40. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że regiony stałe wybrane są spośród immunoglobulin ludzkich.
41. 41. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 40, znamienna tym, że zawiera ponadto kwas acetylosalicylowy.

    Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego (PM), przeciwciało monoklonalne, hybrydoma, neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego, region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie, zmienione przeciwciało, przeciwciało chimeryczne i kompozycja farmaceutyczna. Przeciwciała te są skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia i wiążąc się z ludzkim czynnikiem lub kofaktorem krzepnięcia mają zastosowanie jako samoograniczające się inhibitory zakrzepicy.

    W prawidłowych warunkach mniejszy lub większy uraz wyzwala w komórkach śródbłonka naczyniowego, wyściełających naczynie krwionośne, reakcję hemostatyczną poprzez sekwencję zjawisk zwaną powszechnie „kaskadą krzepnięcia”. Kulminacją tej kaskady jest przejście rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę, która, wraz z płytkami, tworzy miejscową skrzeplinę, czyli zakrzep, zapobiegający wynaczynianiu się składników krwi. Może następnie dojść do gojenia się rany, i potem do rozpuszczenia skrzepliny i przywrócenia integralności naczynia krwionośnego oraz przepływu.

    187 274

    Reakcje zachodzące między urazem a wytworzeniem zakrzepu stanowią precyzyjnie regulowany i związany ze sobą ciąg. Pokrótce, we krwi krążącej znajduje się pewna ilość osoczowych białek krzepnięcia w postaci nieaktywnych proenzymów oraz czynniki krzepnięcia. W miejscu urazu gromadzą się aktywne kompleksy enzymatyczne, aktywowane następnie do proteaz serynowych, przy czym każda kolejna proteaza serynowa katalizuje aktywację kolejnego proenzymu do proteazy. Wynikiem tej kaskady enzymatycznej jest to, że każdy kolejny etap zwielokrotnia działanie następnego etapu. Kaskadę krzepnięcia omówiono ogólnie w pierwszym rozdziale „Thrombosis and Hemorrhage”, pod red. J. Loscałzo i A. Schafer, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Anglia (1994).

    O ile skuteczne krzepnięcie krwi zmniejsza utratę krwi w miejscu urazu, nieprawidłowe tworzenie zakrzepów w tętnicach lub żyłach jest częstą przyczyną kalectwa i zgonu. Nieprawidłowa aktywność krzepnięcia może być spowodowana przez pewne stany chorobowe i pewne rodzaje terapii (może ona również powodować niektóre z tych stanów chorobowych), jak zawał mięśnia serca, niestabilna dusznica bolesna, migotanie przedsionków, udar mózgu, uszkodzenie nerek, przezskóma angioplastyka wieńcowa, zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, posocznica, zakrzep tętnicy płucnej i zakrzepica żył głębokich. Problemem jest również tworzenie się zakrzepów na powierzchniach ciał obcych, a mianowicie sztucznych narządów, przetok i protez, na przykład na powierzchni sztucznych zastawek serca.

    Do obecnie stosowanych, zarejestrowanych środków przeciwkrzepliwych, używanych w leczeniu tych stanów chorobowych, oraz innych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych, należą sulfonowane heteropolisacharydy heparyny oraz heparyna o niskiej masie cząsteczkowej (Iow molecular weight - LMW). Środki te podaje się pozajelitowo; mogą one powodować szybkie i pełne hamowanie krzepnięcia poprzez aktywację inhibitora trombiny, antytrombiny III, oraz unieczynnienie wszystkich czynników krzepnięcia.

    Heparyna i heparyna LMW, z powodu swej siły działania, mają jednak pewne wady. Głównym powikłaniem jest niekontrolowane krwawienie wskutek prostych ruchów lub kontaktu z przedmiotami, lub krwawienie w miejscach po zabiegu operacyjnym; powikłanie to obserwuje się u 1-7% pacjentów otrzymujących wlew ciągły i u 8-14% pacjentów otrzymujących heparynę okresowo, w postaci bolusów. W celu zmniejszenia do minimum tego ryzyka dokonuje się częstych pobrań krwi w celu ciągłego nadzorowania czasu krzepnięcia, co znacznie powiększa koszt leczenia i dyskomfort pacjenta.

    Ponadto, zakres terapeutyczny, zapewniający korzystny poziom skuteczności, bez narażania pacjenta na ryzyko krwawienia, jest wąski. Zakres terapeutyczny wynosi od około 1 do poniżej 3 pg heparyny/ml osocza, co powoduje wydłużenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) do wartości od około 35 do około 100 sekund. Zwiększenie stężenia heparyny do 3 pg/ml powoduje przekroczenie zakresu terapeutycznego, a przy stężeniu powyżej 4 pg/ml nie wykrywa się aktywności krzepnięcia. Tak więc należy zachować dużą ostrożność, tak aby utrzymać stężenie środka w osoczu pacjenta w zakresie terapeutycznym.

    Innym zarejestrowanym środkiem przeciwkrzepliwym, o powolniejszym i bardziej długotrwałym działaniu, jest warfaryna, pochodna kumaryny. Warfaryna działa poprzez konkurencję z zależną od witaminy K posttranslacyjną modyfikacją protrombiny i innych czynników krzepnięcia zależnych od witaminy K.

    W przypadku warfaryny, podobnie jak w przypadku heparyny i heparyny LMW, ogólny wzorzec działania przeciwkrzepliwego jest taki, że przy stężeniu nieznacznie tylko przekraczającym zakres terapeutyczny dochodzi do całkowitego zahamowania krzepliwości krwi. Wobec tego istnieje niewątpliwie potrzeba opracowania przeciwkrzepliwego skutecznego w leczeniu zaburzeń zakrzepowo-zatorowych leku, który nie stwarzałby zagrożenia niekontrolowanego krwawienia.

    Zgodnie z powyższym, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia posiadającego samoograniczającą się aktywność neutralizowania do wytwarzania leku do hamowania zakrzepicy u ludzi i zwierząt.

    Lek ten może zawierać dodatkowo kwas acetylosalicylowy.

    187 274

    W korzystnym wykonaniu wynalazku przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik VIIla, czynnik V, czynnik Va, oraz równie korzystnie przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina.

    Także korzystnie przeciwciałem monokolnalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 lub SB 257732, lub przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB 249417. Inną korzystną cechą wynalazku jest to, że czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) zostaje wydłużony bez znaczniejszego wydłużenia czsu protrombinowego (PT), a jeszcze bardziej korzystnie aPTT wynosi od około 35 sekund do około 100 sekund.

    Innym korzystnym aspektem wynalazku jest to, że lek przeznaczony jest do leczenia zakrzepicy związanej z zawałem mięśnia serca, niestabilną dusznicą bolesną, migotaniem przedsionków, udarem mózgu, uszkodzeniem nerek, zakrzepem tętnicy płucnej, zakrzepicą żył głębokich, przezskórną angioplastyką wieńcową, zespołem rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, posocznicą, obecnością sztucznych narządów, przetok i protez.