KR20180128436A - 인자 xi의 활성 부위에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인자 xi의 활성 부위에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 항-인자 XI(FXI) 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 항-FXI 항체는 FXI의 활성 중심에 특이적으로 결합하고 FXI의 기능적 활성을 억제한다. 본 발명은 또한 병리학적 혈전 형성 또는 혈전 색전증이 관련된 상태의 예방 및 치료에 유용한 항-FXI 항체의 인간화된 버전을 제공한다. 본 발명은 또한 항-FXI 항체를 코딩하는 핵산 분자, 항-FXI 항체를 발현하는 세포 및 항-FXI 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

인자 XI의 활성 부위에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
본 발명은 일반적으로 의학 및 약학 분야, 특히 혈액학-응고에 사용하기 위한 생물 약제학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 활성화 인자 XI에 의한 인자 IX의 활성화를 억제하는 인자 XI의 활성 부위에 대한 항체에 관한 것이다. 인자 XI의 활성 부위에 대한 항체는 병리학적 혈전 형성 또는 혈전 색전증이 관련되는 상태의 예방 및 치료에 유용하다.
응고는 체액성 및 세포 반응으로 이루어지며, 혈액이 상처 또는 손상을 통해 손실되는 것을 정지시키는 과정인 지혈의 필수 부분이다. 병리학적 응고 또는 혈전증은 정상적인 지혈 과정의 일부가 아니며 질환 증상을 유발할 수 있는 응괴 형성을 의미한다. 심부 정맥 혈전증, 혈관 이식편의 혈전증, 관상 동맥의 죽상경화 플라크의 혈전증, 미세혈관 혈전증 및 패혈증의 확산형 혈관내 응고가 병리학적 응고의 예이다. 또한, 병리학적 혈전의 일부는 방출되어 혈류와 함께 운반되어 폐 또는 뇌와 같은 신체의 다른 곳에서 혈관을 막을 수 있고, 이 과정을 색전술이라고 한다. 색전술이 있거나 없는 혈전증이 역할을 하는 질환을 혈전 색전증이라고한다.
혈전 색전증의 주된 치료법은 항응고제의 투여로 이루어지고, 이 약물은 응고 시스템을 억제한다. 이 시스템은 불활성 효소 및 보조 인자로서 순환하고 캐스케이드 유사 방식으로 서로 활성화시킬 수 있는 혈장 단백질 세트이다. 이 캐스케이드의 핵심 효소는 가용성 피브리노겐을 불용성 피브린으로 전환시키고 FXI, FVIII 및 FV를 포함하는 다수의 다른 응고 인자를 활성 종으로 활성화시켜 활성화 증폭을 제공하는 트롬빈이다(응고 인자는 FXI, FIX 등으로 지칭되고; 활성화된 응고 인자는 FXIa, FIXa 등으로 지칭된다). 과도한 응고 활성화는 항트롬빈과 같은 순환 억제제에 의해 예방된다.
응고 캐스케이드의 간략화된 반응식은 도 10에 도시되어 있다. 응고는 주요 또는 기초 경로 및 두 개의 증폭 루프를 통해 발생한다.
현재의 항응고제는 응고의 공통 경로를 억제한다: 헤파린(항트롬빈을 통해)은 트롬빈, FXa 및 FIXa에 충돌하고, 쿠마린은 프로트롬빈, 인자 VII, IX 및 X의 합성을 억제하는 반면, 저분자량 헤파린은 주로 FXa를 억제한다. 이러한 약물의 치료 창은 좁고, 그들의 사용은 매년 환자의 약 1 내지 2%에서 심한 출혈 부작용을 일으킬 수 있으며 경미한 출혈 에피소드는 심지어 더 자주 발생한다. 예를 들어, 정맥 혈전증 때문에 항응고제로 치료받은 환자는 100인-년당 7.2 이벤트의 주요 출혈 위험이 있으며, 치명적인 출혈 위험은 100인-년당 1.31명이며, 주요 출혈로 인한 사망률은 13.4%이다(참조: Linkins LA, Ann Intern Med 2003;139:893-900). 따라서, 일상 생활에서 항응고제의 사용은 출혈 부작용 위험이 높으며, 조심스러운 환자 모니터링을 필요로 한다.
현재, FXI를 표적으로 하는 승인된 항응고제는 없다. 이것은, 지혈에서 FXI의 역할이 제한적이라고 간주되기 때문에, 오랫 동안 FXI가 혈전 색전증 과정에서 경우에 따라 최소의 역할을 하는 것으로 여겨졌다는 것을 반영한다. 사실, FXI 결핍은 혈우병 A 및 B와 같은 관절 및 연조직에서의 자발 출혈의 에피소드를 갖는 심한 출혈 경향을 초래하지 않고, 오히려 손상 관련 출혈 장애와 관련된다(참조: Duga S et al., Semin Thromb Hemost 2013;39:621-31; F Peyvandi et al., Haematologica 2002;87:512-514). 많은 FXI 결핍자는 심각한 출혈 에피소드를 경험하지 않는다(참조: Castaman G et al., Haemophilia 2014;20:106-13). 그러나, 다수의 연구는 생체내에서 FXI의 기능을 억제하면 출혈 시간에 영향을 미치지 않고 병리학적 혈전증을 예방하여(참조: Minnema et al., 1998, J Clin Invest. 101:10-14; Gruber and Hanson, 2003, Blood 102:953-955; Tucker et al., 2009, Blood, 113:936-44; Cheng et al., 2010, Blood 116:3981-9; Takahashi et al., 2010, Thromb Res, 125:464-70; van Montfoort et al., 2013, Thromb Haemost 110:1065-73), 병리학적 혈전 형성에서 FXI의 중요한 역할을 지지할 수 있다는 것을 나타냈다. 아마도, 정상적인 지혈 대 병리학적 혈전 형성에서 FXI의 이러한 차등적 사용은 정상적인 지혈이 주로 높은 조직 인자(TF) 농도에 의해 유발되고, 따라서 FXI 증폭 루프에 독립적인(참조: 도 10) 반면, 병리학적 혈전 형성은 낮은 TF 농도에서 시작한다는 것을 반영한다. 정상적인 지혈 대 혈전색전성 과정에서의 이러한 차별적인 역할은 FXI를 항응고 전략의 매력적인 표적으로 만든다(참조: Lowenberg EC et al., J Thromb Haemost 2010; 8: 2349-57). FXI을 표적으로 하는 한 가지 접근법은 간에서 FXI의 합성을 감소시키는 것을 목표로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 요법이다. 이 접근법은 인간(참조: Buller H et. al., N Engl J Med J 2015;372:232-40)뿐만 아니라 동물 모델(참조: Zhang H et al., Blood. 2010;116: 4684-4692; Younis HS et al., Blood 2012;119:2401-08)에서 유망한 결과를 보여 주었다. 그러나, FXI의 합성을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 FXI 수준을 충분히 낮추는데 적어도 1 내지 2주가 걸리기 때문에 급성 혈전 색전증 상태에는 사용될 수 없다(참조: Younis HS et al., Blood 2012;119:2401-08). 더욱이, 장기간 독성은 공지되지 않는다. 따라서, 항응고 전략으로서 FXI를 표적으로 하는 상이한 접근법이 필요하다. 한 가지 대안적인 접근법은 FXI의 기능적 활성을 차단하는 모노클로날 항체(mAb)를 적용하는 것이다.
본 발명은 FXI를 표적으로 하고, 경우에 따라, 출혈 위험이 낮은 신규한 항응고제를 개시한다. 따라서, 이러한 신규한 항응고제의 임상적 사용은 환자를 모니터링할 필요가 없다. FXI/FXIa의 활성 부위를 차단하는 억제제는 FXI를 표적으로 하는 바람직한 접근법이다. 그러나, FXI는 세린 프로테아제이고, 이의 활성 부위는 수 많은 다른 세린 프로테아제의 활성 부위, 특히 세린 프로테아제의 트립신 패밀리의 활성 부위와 상동성이다. 다른 응고 인자, 섬유소 용해 및 보체 프로테아제는 동일한 패밀리에 속하고, 모두가 상동성 활성 부위를 갖는다. 따라서, FXIa의 소분자 억제제는 다른 세린 프로테아제와의 교차 반응으로 인해 독성의 고유한 위험을 갖는다. FXI/FXIa의 활성 부위에 결합하고 FXIa에 의한 단백질 및 펩티드 기질의 전환을 차단하는 mAb는 치료적 적용의 바람직한 옵션이다. 그러나, 지금까지 FXIa의 활성 부위에 대한 이러한 억제성 mAb는 기재되어 있지 않다.
문헌[참조: Sinha et al. (J Biol Chem 1985;260:10714-9)]은 5F4 mAb를 개시하고, 이는 FXIa의 경쇄에 대해 지시된 것으로 나타나고 이 항체는 FXIa 활성의 100%를 억제하는 것을 개시된다. 그러나, 문헌[참조: Akiyama et al. (J. Clin. Invest. 1986; 78: 1631-1637)]은 5F4M mAb가 FXIa의 발색 활성을 억제하지 않고, 따라서 FXIa의 활성 부위을 결합하지 않는다고 후속적으로 보고했다. 아마도, 5F4 mAb는 FXIa의 경쇄 상의 엑소사이트에 대해 지시된다(참조: Sinha et al., Biochemistry 2007; 46:9830-9).
따라서, 인자 XI(a)의 세린 프로테아제 도메인에 결합하고, 인자 XIa의 작은 발색 기질의 전환뿐만 아니라 인자 XIa에 의한 인자 IX의 인자 IXa로의 전환을 억제하는 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명은 또한 이러한 모노클로날 항체(mAb)의 인간화된 버전뿐만 아니라 혈전 색전증을 치료하거나 예방하기 위한 항체의 적용을 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 인자 XI의 경쇄(인자 XI)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 항체는 바람직하게는 활성화 인자 XI(인자 XIa)의 발색 활성을 감소시키고, 이에 의해 바람직하게는 발색 기질은 L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린이다. 항체는 또한 바람직하게는 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 1을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 2를 포함하는 항체와 인자 XI에 대한 결합에 대해 교차 경쟁한다.
본 발명에 따르는 바람직한 항체는 서열 번호 3의 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호 6의 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 하나의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 항체는 서열 번호 3의 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호 6의 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다.
본 발명에 따르는 항체는 바람직하게는 마우스, 키메라 또는 인간화 항체이다. 대안적으로, 항체는 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', (Fab')2 및 나노바디로부터 선택된 항체 단편일 수 있다.
본 발명에 따르는 바람직한 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 13 내지 16 중 적어도 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 17 내지 20 중 적어도 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르는 항체는 바람직하게는 쇄내 디설파이드 브릿지 형성에 비해 중쇄의 쇄간 디설파이드 브리징을 선호하는 힌지 영역의 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이는 S241P이다.
본 발명에 따르는 바람직한 항체에서, 항체는 IgG4 영역, 보다 바람직하게는 인간 IgG4 영역인 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르는 항체가 인간 FXIa의 경쇄에 결합하는 것이 더욱 바람직하다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따르는 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 i) FXI 활성화에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태; 및 ii) FXI의 억제가 유익한 효과를 갖는 질환, 장애 또는 상태 중 적어도 하나를 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따르는 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 질환, 장애 또는 상태는 응고가 관련되는 질환, 장애 또는 상태이다. 더욱 바람직하게는, 상기 질환은 혈전 색전증 또는 FXI를 통한 응고 활성화를 수반하는 염증성 질환이다. 대안적으로, 상기 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물은 본 발명에 따르는 용도를 위한 것이고, 여기서 상기 용도는 병리학적 혈전증을 예방하거나 치료하기 위한 것이거나 의학적 절차로 인해 혈전증을 유발할 위험이 증가된 대상체에서 혈전증을 예방하는 데 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 용도는 심근 경색증, 허혈성 뇌졸중, 심방 세동으로 인한 심장-색전증, 혈관 접근 혈전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 관상 동맥 혈전증, 죽상동맥경화증, 관절염, 혈관염, 호흡 곤란 증후군, 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌 질환, 폐색전증, 수술 또는 고정화로부터 생성된 정맥 혈전 색전증, 합성 이식편, 스텐트 또는 AV-누관의 혈전증 및 폐색, 보철 심장 판막, 확산형 혈관내 응고(DIC), 혈액 투석, 심방 세동, 패혈증, 패혈성 쇼크, 장기 부전, 신부전, 치료 단백질의 생체내 투여에 의해 유도된 독성, 다발성 외상, 허혈-재관류 손상, 국부적인 바람직하지 않은 피브린 침착 및 성인 호흡 곤란 동안 폐 폐포에서의 피브린 침착으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 장애, 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하기 위한 용도일 수 있다.
바람직하게는, 상기 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물은 본 발명에 따르는 용도를 위한 것이고, 여기서 상기 항체는 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하로 투여된다. 정맥내 투여는 바람직하게는 볼루스 주입(bolus infusion)으로서 또는 2시간 미만 내지 24시간의 기간 동안 연속 주입으로서이다.
바람직하게는, 상기 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물은 규칙적인 투석 중인 신장 환자의 합성 이식편, 스텐트 또는 AV-누관의 혈전증 (및 폐색)을 예방하고, 감소시키거나 치료하는 데 사용하기 위한 것일 경우, 여기서 상기 항체, 항체 단편 또는 조성물은 환자에게 반환되는 투석된 체액으로 환자에게 투여된다.
대안적으로, 본 발명에 따르는 용도를 위한 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물은 심방 세동, 불안정 협심증, 정맥 혈전 색전증, 보철 심장 판막, 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌 질환, 혈관 이식편, 확산형 혈관내 응고, 패혈증 환자, 또는 전립선 또는 정형 외과 수술을 받는 환자에서 혈전증을 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한 것이고, 여기서 결합 분자는 2주에 1회 이하 (빈번하게) 투여된다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 핵산 분자는 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 중 적어도 하나를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 핵산 분자에서, 코딩 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에서 코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
제6 측면에서, 본 발명은 제5 측면에 따르는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
발명의 설명
정의
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 유니바디, 디아바디, 트리아바디, 4가 또는 FXI/FXIa에 특이적으로 결합하고 FXI/FXIa의 기능적 활성을 억제하는 다른 다가 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-FXI/FXIa 항체 조성물, 파지 라이브러리로부터 유도되는 전장 또는 무손상 모노클로날 항체를 포함하는 모노클로날 항체(mAb), 인간화 항체, 인간 항체, 합성 항체, 키메라 항체, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함하는 항-FXI/FXIa 항체(이하 참조)의 단일 도메인 항원 결합 단백질 및 단편(이하 참조), 디아바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 단일 쇄 Fv'를 의미한다. 낙타(camelid) 항체 또는 이의 단편("나노바디")과 같은 다른 동물 종에서 제조된 항체도 또한 본원의 범위 내에 속한다. 또한, DARPin(설계된 안키린 반복 단백질; Designed Ankyrin Repeat Proteins)과 같은 설계된 반복 단백질과 같은 항체 유사 결합 특성을 갖는 분자도 본원의 범위 내에 있다. 이러한 항체 형태 모두는 그들이 목적하는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 나타내는 한, 본 발명의 범위 내에 있다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 항체와 상호교환 가능하게 사용된다. 항체는 인간 및/또는 인간화될 수 있다.
용어 "항-FXI/FXIa 항체" 또는 "FXI/FXIa에 결합하는 항체"는 상기 항체가 는 FXI/FXIa를 표적화하고 억제하는 데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 FXI/FXIa에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 천연 FXI에 대한 결합 친화도는 FXIa의 결합 친화도와 유사할 수 있거나, 천연 FXI보다 FXIa에 대해 더 높을 수 있거나 FXIa와 비교하여 FXI에 대해 더 높을 수 있다. 텍스트에서, 항체는 다른 장소에서 항-FXIa 항체 또는 항-FXI 항체로 표시되지만, 세 가지 유형의 항-FXI mAb 모두는 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 관련되지 않은 비-FXI 단백질에 대한 항-FXI/FXIa 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정(RIA) 또는 ELISA에 의해 측정된 FXI/FXIa에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, FXI/FXIa에 결합하는 항체는 1mM 이하, 100nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하, 5nM 이하, 1nM 이하 또는 0.1nM 이하의 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-FXIa 항체는 상이한 종으로부터의 FXIa 중에서 보존되는 FXIa의 에피토프에 결합한다.
"분리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 로리법(Lowry method)에 의해 결정된 항체의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 이상으로, (2) 스피닝 컵 서열분석기의 사용으로 적어도 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는, 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 조건 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 원위치로 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적인 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L)쇄와 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 헤테로테트라머 당단백질이다(IgM 항체는 J 쇄라고 칭명되는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 헤테로테트라머 단위로 구성되고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체를 중합시켜 J 쇄와 함께 2 내지 5개의 기본적인 4-쇄 단위를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다). IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소타입에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. IgG4는 하위부류는 비공유 방식으로 연결될 수 있는 2개의 H 쇄로 구성된다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 α 및 γ 쇄 각각에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 이소타입에 대한 4개의 CH 도메인이 뒤따르는 가변 도메인(VH)을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N 말단에 가변 도메인(VL)을, 이어서 다른 말단에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 간주된다. VH와 VL의 쌍은 함께 하나의 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 다른 부류의 항체의 구조와 성질에 대해서는, 예를 들어, 문헌(참조: Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6)을 참조한다.
임의의 척추 동물 종으로부터의 L 쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(kappa) 및 람다(lambda)라고 칭명되는 2개의 명백하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 그들의 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소타입에 할당될 수 있다. 각각 중쇄 지정된 α, δ, ε, γ 및 μ를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 부류의 면역글로불린이 존재한다. γ 및 α 부류는 CH 서열과 기능의 비교적 최소한의 차이를 기반으로 하위부류로 추가로 나누어진다, 예를 들어, 인간은 다음 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변적"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 중 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110-아미노산 범위에 고르게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 길이 9 내지 12 아미노산인 "상보성 결정 영역"(CDR) 또는 "초가변 영역"(HVR)이라고 칭명되는 극단적인 가변성의 보다 짧은 영역으로 분리된 15-30 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 칭명되는 비교적 불변 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 크게 β-시트 형태를 채택하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각 쇄 중의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합시키는 데 직접 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
"무손상" 항체는 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3 뿐만 아니라 항원-결합 부위를 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예: 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
본원의 목적을 위한 "네이키드 항체(naked antibody)"는 세포독성 잔기 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(참조: 미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 [1995]); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원을 결합하는 능력을 보유한다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라고 칭명되는 2개의 동일한 항원 결합 단편과 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영하는 명칭인 잔류성 "Fc 단편"을 생성한다. Fab 단편은 H 쇄(VH)의 가변 영역 도메인 및 하나의 중쇄(CH1)의 제1 불변 도메인과 함께 전체 L 쇄로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이고, 즉 이는 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디설파이드 연결된 Fab 단편에 강하게 상응하는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 생성하며, 여전히 항원을 가교 결합시킬 수 있다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에 추가로 적은 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디설파이드에 의해 함께 보유된 두 H 쇄의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되며, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식된 부분이다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 단단한 비공유 결합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 단일 쇄 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은, 경쇄 및 중쇄가 2개-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 결합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이러한 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 쇄로부터 각각 3개 루프)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 사이트보다 낮은 친화도에서일지라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
또한 "sFv"또는 "scFv"로서 약칭되기도 한 "단일-쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해, 문헌[참조: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정 인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 대해 지시된다. 그들의 특이성 이외에, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의해 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 모노클로날 항체는 문헌(참조: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975))에 최초로 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 문헌[참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체를 포함하는 반면, 쇄(들)의 나머지는 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심있는 키메라 항체는 비-인간 영장류(예: 구세계 원숭이(Old World Monkey), 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
비-인간(예: 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수령자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 마우스, 래트, 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체) 또는 목적하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수령자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수령자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선시키기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 전형적으로 두 개의 가변 도메인 모두를 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 임의로 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용을 위해, 문헌[참조: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 본원에 인용된 다음의 검토 기사 및 참조문헌을 참조한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994).
용어 "초가변 영역", "HVR"은 본원에서 사용되는 경우 서열이 초가변성이고/이거나 항원 결합을 담당하는 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역; VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있으며, 본원에 포함되어 있다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(예: 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨질 때 VL에서 약 잔기 "24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 부근, 및 VH에서 약 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 주위; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))로부터의 아미노산 잔기; 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(예: 코티아(Chothia) 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨지면, VL에서 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서 26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); 및/또는 "초가변 루프"/CDR로부터의 잔기(예: IMGT 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨지면, VL에서 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH에서 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3); Lefranc, MP et al., Nucl. Acids Res.27:209-212 (1999), Ruiz, M.et al. Nucl. Acids Res.28:219-221 (2000))를 포함한다. 임의로, 항체는 문헌[참조: Honneger, A. and Plunkthun, A. J. (Mol. Biol. 309:657-670 (2001))]에 따라 번호가 매겨질 때, 다음 포인트 VL에서 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) 및 123 (L3), 및 VH에서 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) 및 123 (H3) 중 하나 이상에 대칭성 삽입부를 갖는다. 본 발명의 항체의 초가변 영역/CDR은 바람직하게는 카바트 넘버링 시스템에 따라 정의되고 번호매겨진다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "작용제 항체"는 관심 있는 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
포유류 항-인간 IgE 항체와 같은 "종-의존성 항체"는 제2 포유류 종으로부터의 항원의 동족체에 대해 갖는 것보다 제1 포유류 종으로부터의 항원에 대해 더 강한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합"(즉, 약 1 x 10-7M 이하, 바람직하게는 약 1 x 10-8M 이하, 가장 바람직하게는 약 1 x 10-9M 이하의 결합 친화도(KD)를 갖는다)하지만, 인간 항원에 대한 이의 결합 친화도보다 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배인 제2 비인간 포유류 종으로부터의 항원 동족체에 대한 결합 친화도를 갖는다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예: 항체)와 그 결합 파트너(예: 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍(예: 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 의미한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 친화도 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원을 서서히 결합시키고, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원을 더 빠르게 결합시키고 더 오래 결합되어 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정 예시적인 구현예가 다음에 기재된다.
"KD" 또는 "KD 값"은 약 10 내지 50 반응 단위(RU)로 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIAcore Inc.)은 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원은 약 5μl/분의 유속으로 주입하기 전에 10mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로 5μg/ml(약 0.2μM)로 희석하여 약 10 반응 단위(RU)의 결합 단백질을 달성한다. 항원 주입 후, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응 그룹을 차단한다. 동역학 측정을 위해, 25℃에서 약 25μl/분의 유속으로 0.05% Tween 20(PBST)을 갖는 PBS에 항체 또는 Fab의 2배 연속 희석액 (0.78nM 내지 500nM)을 주입한다. 결합 속도(kon 또는 ka)와 해리 속도(koff 또는 kd)는 결합 및 해리 센소그램을 동시에 적합화하여 단순한 일대일 랑뮈어(Langmuir) 결합 모델(BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon 비로서 계산된다[참조: 예를 들어, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881]. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106M-1S-1을 초과하면, 온-레이트는 정지-유동 장착 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 레드 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계(ThermoSpectronic)와 같은 분광계에서 측정된 항원의 증가하는 농도의 존재하에 25℃에서 PBS, pH 7.2 중의 20nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기 = 295nm; 방출 = 340nm, 16nm 밴드-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 급냉 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명에 따르는 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 상기한 바와 같은 BIAcore™-2000 또는 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 결정될 수 있다.
관심 있는 항원을 "결합하는" 항체, 즉 FXI의 활성 중심은 항체가 FXI의 기능적 활성을 억제하는 데 있어서 치료제로서 유용하고, 다른 단백질과 유의적으로 교차 반응하지 않도록 충분한 친화도로 항원을 결합하는 것이다. 이러한 구현예에서, "비표적" 단백질에 대한 항체의 결합 정도는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 분석 또는 방사성 면역 침전법(RIA)에 의해 결정된 바와 같이 이의 특정 표적 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합에 관하여, 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적인"이란 용어는 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교된 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어, 과량의 비표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되면 특이적 결합이 나타난다. 본원에서 사용된 특정 폴리펩티드 표적 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이란 용어는, 예를 들어, 적어도 약 10-4M, 또는 적어도 약 10-5M, 또는 적어도 약 10-6M, 또는 적어도 약 10-7M, 또는 적어도 약 10-8M, 또는 적어도 약 10-9M, 또는 적어도 약 10-10M, 또는 적어도 약 10-11M, 또는 약 10-12M 이상인 (상기한 바와 같이 측정될 수 있는) 표적에 대한 KD를 갖는 분자에 의해 나타낼 수 있다. 하나의 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다.
"에피토프"라는 용어는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체에 의해 결합된 분자의 일부이다. 이 용어는 항체와 같은 항원 결합 단백질 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정 인자를 포함한다. 에피토프는 인접하거나 비인접할 수 있다(예를 들어, 폴리펩티드에서, 폴리펩티드 서열에서 서로 인접하지 않지만 분자의 맥락내에서 항원 결합 단백질에 의해 결합되는 아미노산 잔기). 특정 구현예에서, 에피토프는 그들이 항원 결합 단백질을 생성시키는 데 사용되는 에피토프와 유사하지만 항원 결합 단백질을 생성하는 데 사용된 그 에피토프에서 발견되는 아미노산 잔기가 없거나 단지 일부만을 포함하는 3차원 구조를 포함한다는 점에서 모방적일 수 있다. 가장 자주, 에피토프는 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우에는 핵산과 같은 다른 종류의 분자 상에 체류할 수 있다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 설포닐 또는 설페이트 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함할 수 있으며, 특정의 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 우선적으로 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중의 표적 항원 상의 에피토프를 인식할 것이다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 두 서열의 길이에 따라, 전체 또는 국소 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전체 정렬 알고리즘(예: Needleman Wunsch)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예: Smith Waterman)을 사용하여 정렬된다. 이어서, 서열은 (예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때) 서열 특이성(하기 정의된 바와 같음)의 적어도 특정 최소 백분율을 공유할 때 "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한"으로서 지칭될 수 있다. GAP는 Needleman 및 Wunsch 전체 정렬 알고리즘을 사용하여 전체 길이(전장)에 걸쳐 두 서열을 정렬하여 정합 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화한다. 전체 정렬은 두 서열이 유사한 길이를 가질 때 서열 동일성을 결정하는 데 적합하게 사용된다. 일반적으로, 갭 생성 패널티 = 50(뉴클레오타이드)/8(단백질) 및 갭 연장 패널티 = 3(뉴클레오타이드)/2(단백질)와 함께 GAP 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오타이드의 경우, 사용된 디폴트 득점 매트릭스는 nwsgapdna이고, 단백질의 경우 디폴트 득점 매트릭스는 B10sum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). 서열 정렬 및 퍼센트 서열 동일성에 대한 스코어는 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA로부터 입수할 수 있는 GCG Wisconsin Package, Version 10.3과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하거나, EmbraceWIN 버전 2.10.0에서 프로그램 "needle"(전체 Needleman Wunsch 알고리즘 사용) 또는 "water"(국소 Smith Waterman 알고리즘 사용)와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하거나, 상기 GAP에 대한 것과 동일한 파라미터를 사용하거나, 디폴트 세팅('needle'과 'water'를 위한 것 모두와 단백질 및 DNA 정렬을 위한 모두, 디폴트 갭 오프닝 패널티는 10.0이고 디폴트 갭 연장 패널티는 0.5이며; 디폴트 득점 매트릭스는 단백질의 경우 Blossum62이고, DNA의 경우 DNAFull이다)을 사용하여 결정할 수 있다. 서열이 실질적으로 상이한 전체 길이를 가질 경우, Smith Waterman 알고리즘을 사용하는 것과 같은 국소 정렬이 바람직하다. 대안적으로, 퍼센트 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공개 데이터베이스에 대해 검색함으로써 결정될 수 있다.
임의의 상기 정렬 프로그램을 사용하여 2개의 아미노산 서열이 정렬되면, 소정의 아미노산 서열 A의 소정의 아미노산 서열 B와의 % 아미노산 서열 동일성 (소정의 아미노산 서열 B와의 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있음)은 다음 100 X 분수 X/Y로서 계산되고, 여기서 X는 A 및 B의 그 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 정합으로 득점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것으로 이해될 것이다.
"핵산 작제물" 또는 "핵산 벡터"는 본원에서 재조합 DNA 기술의 사용으로부터 생성된 사람이 만든 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "핵산 작제물"은 핵산 작제물이 자연 발생 핵산 분자 (의 일부)를 포함할 수 있을지라도, 자연 발생 핵산 분자를 포함하지 않는다. "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"이라는 용어는 숙주 세포 또는 이러한 서열과 양립할 수 있는 숙주 유기체에서 유전자의 발현을 수행할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적합한 전사 조절 서열 및 임의로 3' 전사 종결 신호를 포함한다. 발현 인핸서 요소와 같은 발현을 수행하는 데 필요하거나 도움이 되는 추가의 인자들도 존재할 수 있다. 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입되고, 숙주 세포의 시험관내 세포 배양에서 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 발현 벡터는 본 발명의 숙주 세포 또는 유기체에서의 복제에 적합할 것이다.
본원에 사용된 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 조절하는 기능을 하는 핵산 단편을 의미하고, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하고, DNA 의존성 RNA 폴리머라제, 전사 개시 부위 및 전사 인자 결합 부위, 억제제 및 활성화제 단백질 결합 부위를 포함 하나 이에 한정되지 않는 임의의 다른 DNA 서열, 및 프로모터로부터 전사량을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하는 작용을 하는 당업자에게 공지된 뉴클레오타이드의 임의의 다른 서열에 대한 결합 부위의 존재에 의해 구조적으로 동정된다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건하에서 대부분의 조직에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는, 예를 들어, 화학적 유도제의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발달적으로 조절되는 프로모터이다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 기능적 관계로 폴리뉴클레오타이드 요소의 연결을 의미한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 것은 연결된 DNA 서열이 전형적으로 인접하고, 필요한 경우 2개의 단백질 인코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이며 판독 프레임에 있음을 의미한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 항-FXI 항체
본 발명은 FXI를 표적화하는 항응고제 요법을 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. FXI 억제제는 FXI가 정상 지혈에서 최소한의 역할을 하기 때문에 출혈 부작용의 위험이 적다. 실제로, 동물에서의 FXI 결핍 또는 FXI 억제는, 출혈 시간을 현저하게 연장시키고 심각한 출혈 부작용과 관련되는 임상 실습 중인 고용량 헤파린과는 대조적으로, 출혈 시간에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 병리학적 혈전증에서의 이의 활동적인 역할과 경우에 따라 정상적인 지혈에서의 최소한의 역할 때문에, FXI는 항응고제 요법의 매력적인 표적이다. 본 발명자들은 인간에서 FXI 활성을 억제하기 위한 독특한 항체를 개발했다.
제1 측면에서, 본 발명은 FXI 또는 FXIa의 활성 중심에 특이적으로 결합하고, FXIa의 기능적 활성을 억제하는 모노클로날 항체(mAb)에 관한 것이다. FXI는 본원에서 포유류 혈장 응고 인자 XI로서 이해된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 인자 XI의 세린 프로테아제 도메인에 특이적으로 결합하고 FXIa에 의한 기질의 전환을 억제한다.
본 발명의 항체는 발색 검정에서 결정된 FXIa의 발색 활성에 대한 그들의 (부분적) 억제 효과에 의해 동정되는 바와 같이, FXIa의 촉매 중심을 억제한다. 발색 기질은 p-니트로아닐리드(pNA)에 결합된 작은 펩티드로 구성된다. 기질의 가수 분해는 분광 광도계로 측정될 수 있는 pNA를 방출한다. 특정 프로테아제에 대한 기질의 특이성은 pNA에 연결된 펩티드의 정확한 서열에 의존한다. FXIa의 경우, 기질 S2366(L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐리드; Chromogenix, Molndal, Sweden)이 적합하다. 이 기질로 FXIa 활성을 측정하는 것은 문헌[참조: Minnema MC et al. (Blood 1998, 92: 3294-3301)]에 기재된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 FXI 및 FXIa 중 적어도 하나에 결합하고, FXIa의 효소 활성을 억제한다. 이러한 FXIa의 억제된 활성은 바람직하게는 하나 이상의 FIX의 FIXa로의 전환, (FXI의 자동 활성화 동안) FXI의 FXIa로의 전환 및 발색 기질의 전환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 FXI가 활성화되는 방법과 독립적으로 FXI/FXIa의 활성을 억제한다.
바람직하게는, 항체는 분자의 세린 프로테아제 도메인에 위치된 활성 부위에 또는 그 근처에 결합함으로써, 보다 바람직하게는 이의 기질 FIX와의 상호 작용에 관여하는 세린 프로테아제 도메인 내의 부위에 또는 그 근처에 결합함으로써 FXI/FXIa의 활성을 억제한다.
항체는 바람직하게는 FXI의 천연 형태뿐만 아니라 활성화된 형태 FXIa에 결합하고, 이의 기질 FIX와의 상호 작용에 관여하는 부위에 또는 그 근처에 결합함으로써 FXIa의 활성을 억제한다.
따라서, 본 발명의 항체는 FXI/FXIa의 활성 부위 도메인에 결합하고, FXIa의 효소 활성을 억제하고, FIX의 활성화를 억제하는 능력을 특징으로 한다. 상기 항체는 본원의 실시예에 기재된 검정에서 이들의 효과의 평가에 의해 선택될 수 있다. 특히, 항-FXI 항체는 인간 혈장에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)으로 결정된 응고 시스템의 응고 활성에 대한 효과를 평가함으로써 선택될 수 있다. 본 발명의 FXI-항체의 기능적 성질은 이들을 새로운 인간 혈장에 첨가 한 다음 규칙적인 응고 검정에서 APTT를 측정하여 시험할 수 있다. FXI/FXIa의 활성을 억제하는 항체의 경우, APTT의 연장이 관찰된다. 대조군으로서 정상 혈장(정상 APTT)과 FXI 결핍 혈장(연장된 APTT)을 시험한다. 이러한 응고 검정은 당업계에 익히 공지되어 있다(본원의 실시예도 참조).
본 발명의 바람직한 항체는 a) 활성화 인자 XI의 경쇄에 결합하고, b) L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린 상의 인자 XIa의 발색 활성을 감소시키고, c) 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 1을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 2를 포함하는 항체와 인자 XI에 대한 결합에 대해 교차 경쟁하는 항체이다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 상기 본원에서 정의된 바와 같은 활성화 인자 XI의 경쇄에 특이적으로 결합한다. 따라서, 바람직하게는 항체는 항체가 상기한 발색 검정에서 FXI의 기능적 활성을 억제하는 데 있어서 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 FXI의 활성 중심과 결합한다. 바람직하게는 항체는 다른 단백질과 유의하게 교차 반응하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 100, 50, 10 또는 5nM 미만, 보다 바람직하게는 1nM 미만의 친화도로 FXI에 결합할 것이다. FXI에 대한 항체의 특이성은 플라즈몬 표면 공명 및/또는 효소 면역검정과 같은 결합 검정을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 발색 기질로서 L-피로글루타밀-L-프롤-L-아르기닌-p-니트로아닐린(S2366) 상의 인자 XIa의 발색 활성을 감소시킨다. 바람직하게는, 항체는 S2366 기질 상의 인자 XIa의 발색 활성을 적어도 2, 5, 10, 20 또는 50% 감소시킨다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 1을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 2를 포함하는 항체와 인자 XIa에의 결합에 대해 교차 경쟁한다. 2개 이상의 항체의 맥락에서 본원에 사용될 경우, "와 경쟁한다" 또는 "와 교차 경쟁한다"란 용어는 2개 이상의 항체가 FXI에 대한 결합에 대해 경쟁한다, 예를 들어, 본원의 실시예 1.4에 기재된 ELISA에서 FXI 결합에 대해 경쟁한다는 것을 나타낸다. 일부 항체 쌍의 경우, 실시예 1.4의 검정에서의 경쟁은 한 항체가 플레이트에 코팅되고 다른 항체가 경쟁에 사용되는 경우에만 관찰되며, 반대의 경우는 그렇지 않다. 본원에 사용되는 경우 용어 "와 경쟁한다"는 또한 이러한 조합 항체를 포함하도록 의도된다. 서열 번호 1 및 2의 가변 도메인에 의해 정의된 항체와 인자 XIa에의 결합에 대해 교차 경쟁하는 본 발명의 항체는 바람직하게는 ELISA에서 이렇게 정의된 항체의 FXIa에 대한 결합을 적어도 2, 5, 10, 20 또는 50% 감소시킨다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 바람직하게는 APTT 검정에서 약 25 내지 100nM의 농도에서 적어도 FXI 활성의 적어도 10, 20, 50 또는 90% 억제를 생성하는 분자인 FXI/FXIa의 기능적 활성을 억제한다. 보다 바람직하게는, 상기 분자는 APTT 검정에서 약 25 내지 100nM의 농도에서 FXI 활성의 적어도 95% 억제를 생성한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 서열 번호 3의 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호 6의 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 하나의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 항체는 서열 번호 3의 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호 6의 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 마우스, 키메라 또는 인간화 항체이거나, 항체는 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', (Fab')2 및 나노바디로부터 선택된다.
본 발명에 따르는 바람직한 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 13 내지 16 중 적어도 하나와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 17 내지 20 중 적어도 하나와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 실시예의 항체의 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인 또는 하나 이상의 HVR의 기능적 변이체를 포함하는 항체를 제공한다. 항-FXI 항체의 맥락에서 사용된 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인, 또는 하나 이상의 HVR의 기능적 변이체는 항체가 모체 항체의 친화도/결합력 및/또는 특이성/선택도의 적어도 실질적인 비율(적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상)을 유지하도록 하고, 일부 경우에, 이러한 항-FXI 항체는 모체 항체보다 큰 친화도, 선택도 및/또는 특이성에 관련될 수 있다. 이러한 기능적 변이체는 전형적으로 상기 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있는 바와 같이 모체 항체에 대한 유의적인 아미노산 서열 동일성을 보유한다.
HVR 변이체의 서열은 대부분 보존적 치환을 통해 모체 항체 서열의 HVR의 서열과 상이할 수 있고; 예를 들어, 변이체에서 치환의 적어도 약 35, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%는 보존적 아미노산 잔기 대체이다. HVR 변이체의 서열은 대부분 보존적 치환을 통해 모체 항체 서열의 HVR의 서열과 상이할 수 있고; 예를 들어, 변이체에서 치환의 적어도 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1은 보존적 아미노산 잔기 대체이다. 본 발명의 맥락에서, 보존적 치환은 하기 3개의 표 중 하나 이상에 반영된 아미노산 부류 내에서의 치환에 의해 정의될 수 있다:
보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 부류
Figure pct00001
대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 부류
Figure pct00002
아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
Figure pct00003
보다 보존적 치환 그룹으로는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민을 포함한다. 추가의 아미노산 그룹은 또한, 예를 들어, 문헌(참조: Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company)에 기재된 원리를 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 수치 요법/친수성 및 잔기 중량/크기 면에서의 보존은 또한 실시예의 항체의 HVR과 비교하여 변이체 HVR에서 실질적으로 유지된다(예를 들어, 서열의 중량 부류, 수치 요법 점수 또는 모두는 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 유지된다). 예를 들어, 보존적 잔기 치환은 또한 또는 대안적으로 당해 기술 분야에 공지된 강 또는 약 기반 중량 기반 보존 그룹의 대체에 기초할 수 있다.
유사한 잔기의 보유는 또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램(예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 개방 갭 = 11 및 연장 갭 = 1을 사용하여 NCBI를 통해 입수 가능한 BLAST 2.2.8)의 사용에 의해 결정된 바와 같이, 유사성 점수에 의해 측정될 수 있다. 적합한 변이체는 전형적으로 모체 펩티드와 적어도 약 45, 55, 65, 75, 85, 90, 95 또는 99% 유사성을 나타낸다.
본 발명의 한 구현예에서, 항체는 쇄내 디설파이드 브릿지 형성에 비해 중쇄의 쇄간 디설파이드 브리징을 선호하는 힌지 영역의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 문헌[참조: Angel et al. (1993, Mol Immunol 30:105-8)]에 기재된 S241P이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 IgG4 영역, 바람직하게는 인간 또는 인간화 IgG4, 뮤린 IgG1 영역, IgG1 영역, 바람직하게는 인간 또는 인간화 IgG1 영역, 더욱 바람직하게는 보체 활성화 또는 Fc 수용체 상호 작용을 감소시키거나 방지하기 위해 불변 영역에서 돌연변이된 IgG1 영역인 중쇄 불변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체는 단량체성 IgM 항체 서브유닛 또는 단량체성 IgA 항체 서브유닛, 바람직하게는 단량체성 인간(화) IgM 항체 서브유닛 또는 단량체성 인간(화) IgA 항체 서브유닛이다.
본 발명의 항체의 생성
본 발명의 MAb는 인간 FXI/FXIa 또는 이들 분자의 일부로 면역화된 동물로부터 면역 세포를 단리시키고 이들 세포를 불멸화하여 하이브리도마와 같은 항체 분비 세포주를 수득함으로써 수득될 수 있다. 인간 FXI, FXIa, 이의 단편, 예를 들면, FXI의 단리된 세린-프로테아제 도메인 및/또는 다양한 정제 방법에 따라 단리된 FXI 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드의 것들은 적절한 숙주 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다. 목적하는 항체를 생산하는 세포주는 항체 활성의 존재에 대해 배양 상청액을 스크리닝하고 FXI의 기능적 활성에 대한 선택된 항체의 효과를 확립함으로써 동정될 수 있다.
MAb는 당업자에 의해 잘 이해되는 다양한 기술로 생성될 수 있다. 본 출원의 범위에 속하는 것으로 의도된 것은 제조되거나 제조된 방법과 독립적으로 FXI/FXIa의 세린 프로테아제 도메인의 활성 부위에 결합하고 FXIa에 의한 기질의 전환을 차단함으로써 인간 FXI/FXIa의 활성을 차단하는 임의의 항체 또는 이의 단편이다. 활성 부위에서 mAb에 대한 에피토프의 국소화는 mAb가 FXIa의 발색 활성을 (부분적으로) 억제한다는 것을 입증함으로써 확인된다.
인간 또는 뮤린 또는 다른 림프구로 시험관내뿐만 아니라 다양한 동물에서 생체내 둘 다에서 다양한 면역화 프로토콜이 이용될 수 있고, 당업자에게 익히 공지되어 있다. 인간 FXI에 대한 항체를 갖는 환자의 인간 림프구는 또한, 예를 들어, 투여된 외인성 FXI에 대한 항체 반응을 개발되었거나(참조: Salomon O et al., Blood 2003;101:4783-8), 다른 이유로 FXI 결핍을 획득한 FXI가 결핍된 사람으로부터 mAb를 생성하는 데 사용될 수 있다.
FXI, FXIa, 이의 일부 또는 FXI 펩티드로 면역화된 마우스의 림프구를 적절한 융합 파트너와 융합시킴으로써 수득된 하이브리도마의 배양 상청액의 초기 스크리닝 단계는 바람직하게는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 수행된다. 이 검정은 당업자에게 공지되어 있다. 이어서, FXI(a)의 활성에 대한 항체의 효과를 시험한다. 편리한 검정은 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간(APTT)에 대한 효과를 시험하는 것이다. FXI/FXIa의 활성을 차단하는 항체는 인간 혈장에 첨가될 때 APTT를 연장시킨다. mAb 또는 이의 단편에 대한 에피토프의 국소화는 FXIa의 발색 활성에 대한 mAb의 효과를 평가함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 조성물
제2 측면에서, 본 발명은 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 보조제 또는 비히클과 같은 약제학적으로 허용되는 담체는 대상체에게 항체 또는 항체 단편의 투여를 위한 것이다. 상기 약제학적 조성물은 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 하기 본원에 기재된 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "대상체"는 포유동물로 분류된 모든 동물을 의미하고, 영장류 및 인간을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 대상체는 바람직하게는 임의의 연령 또는 인종의 남성 또는 여성 인간이다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 양립할 수 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함하는 것으로 의도된다(참조: 예를 들어, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe et al eds. 7th edition, 2012, www.pharmpress.com). 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립 불가능한 경우를 제외하고, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수령자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시 놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리 돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글로코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예: Zn- 단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 항체는 동일한 제형에 존재할 수 있거나 상이한 제형으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 또는 순차적일 수 있으며, 어느 순서로나 효과적일 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 목적하는 생체내 혈청 반감기를 달성하도록 변형된다. 이 목적을 위해, 폴리알킬렌글리콜 그룹(예: 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 혈청 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 또는 트랜스페린이 항체에 연결되거나 접합될 수 있고/있거나 항체의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 특히, 항체인 항체의 불변 도메인의 아미노산 서열은 (예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 도입하여) 변형될 수 있다. 따라서, 임의의 이러한 변형을 사용하여 항체의 생체내 혈청 반감기를 1, 2, 5, 10 또는 20일 이상으로 증가시킬 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이의 반감기를 증가시기 위한 본 발명의 항체의 변형은 반복 투여의 경우에 항체가 낮은 투여량 및/또는 감소된 빈도로 투여되도록 할 것이다.
약제학적 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입을 포함하는 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 비경구 투여를 위해, mAb는 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클과 배합된 주사 가능한 형태로 제형화될 것이다. 이러한 비히클은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 이의 예로는 식염수, 덱스트로스 용액, 링거 용액 및 소량의 인간 혈청 알부민을 함유하는 용액이 포함된다. 전형적으로, mAb 또는 이의 단편은 약 20mg 내지 약 100mg/ml의 농도로 이러한 비히클 중에 제형화될 것이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 항체는 정맥 내 주사로 투여된다.
본 발명의 항체의 용도
제3 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 FXI 활성화에 의해 매개되고/되거나 FXI의 억제가 유익한 효과를 갖는 질환, 장애 및/또는 상태를 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 상기 질환, 장애 및/또는 상태를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 상기 본원에서 개시된 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 이러한 측면에서, 본 발명은 i) FXI 활성화에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태; 및 ii) FXI의 억제가 유익한 효과를 갖는 질환, 장애 또는 상태 중 적어도 하나를 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한, 상기 본원에서 정의된 항체 또는 항체 단편 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에서 질환, 장애 및/또는 상태를 예방하거나 치료하는 것은 질환, 장애 및/또는 상태 또는 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 증상이 발생할 위험을 감소시키는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 이 측면에서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 응고가 관련되는 질환, 장애 또는 상태이다. 더욱 바람직하게는, 상기 질환은 FXI를 통한 응고 활성화에 의해 매개되는 혈전 색전증 또는 염증성 질환이다. 따라서, 이들 구현예에서, 본 발명의 항체는 병리학적 혈전증을 예방하거나 치료하기 위해, 또는 의료 절차로 인해 혈전증이 발병할 위험이 증가된 대상체에서 혈전증을 예방하는 데 사용된다. 바람직하게는, 이들 구현예에서, 상기 용도는 심근 경색, 허혈성 뇌졸중, 심방 세동에 의한 심장-색전증, 혈관 접근 혈전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 관상 동맥 혈전증, 죽상동맥경화증, 관절염, 혈관염, 호흡 곤란 증후군, 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌 질환, 폐색전증, 수술 또는 고정화로 인한 정맥 혈전 색전증, 합성 이식편, 스텐트 또는 AV-누관의 혈전증 및 폐색, 보철 심장 판막, 확산성 혈관내 응고(DIC), 혈액 투석, 심방 세동, 패혈증, 패혈성 쇼크, 장기 부전, 신부전, 치료용 단백질의 생체내 투여에 의해 유도된 독성, 다발성 외상, 허혈-재관류 손상, 국부적으로 바람직하지 않은 피브린 침착 및 성인 호흡 곤란 동안 폐 폐포에서의 피브린 침착으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 장애, 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하기 위한 것이다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 다양한 인간 질환에서의 응고를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 억제제는 생체내에서 응고를 억제함으로써 혈전 색전 장애를 약화시키기 위한 의약의 제조용으로 사용될 수 있다. 항체는 단독으로 또는 다른 약물과 함께 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 병리학적 혈전증 또는 색전증으로 인한 질환 또는 질환 증상을 앓고 있거나 이러한 질환과 관련하여 위험한 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조를 위해 임의의 적합한 비율로 단독으로 또는 다른 약물과 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에서, 응고 매개 손상을 동반한 질환을 앓고 있는 환자에게 FXI의 활성화를 억제할 수 있도록 본 발명의 항-FXI 항체의 유효량을 투여할 수 있다. "유효량"이란 트롬빈 생성 및 피브린의 형성을 억제할 수 있는 항체의 농도를 의미한다.
(예방적 또는 치료적) 치료는 일반적으로 본 발명의 항체, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 비경구적, 바람직하게는 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 투여하는 것으로 이루어진다. 그루버 및 한슨(Gruber and Hanson)(참조: Gruber and Hanson, 2003, Blood 102: 953-955)은 비비에서 FXI의 충분한 억제를 달성하기 위해 염소 항-FXI 항체를 kg 당 16 내지 50mg의 투여량으로 투여했다. 대조적으로, 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 섭생은 바람직하게는 주당 체중 kg 당 0.5 내지 10mg의 IgG 용량과 동등한 용량 범위이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 항체는 주당 체중 kg 당 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4mg 미만의 용량과 동등한 용량 및/또는 주당 체중 kg 당 적어도 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.5, 2 또는 4mg의 IgG의 용량과 동등한 용량으로 투여된다. 예를 들어, 항체 단편의 경우, 사용되는 용량은 지시된 바와 같이 체중 1㎏ 당 IgG 분자의 mg의 상응하는 양의 몰 당량일 것으로 이해된다.
본 발명의 항체에 대한 용량 섭생은 약 7일의 인간 항체의 평균 혈청 반감기에 기초한다는 것이 추가로 이해된다. 당업자는 7일보다 짧거나 긴 반감기로 항체의 용량 섭생을 조정하는 방법을 알 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는, 정맥내 주입을 통해 인간 환자에게 투여될 경우, 바람직하게는 10 또는 5mg 이하/kg 체중의 용량에서 FXI의 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90% 억제를 제공한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는, 정맥내 주입을 통해 인간 환자에게 투여되는 경우, 바람직하게는 10 또는 5mg 이하/kg 체중의 용량에서 적어도 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 2.0, 2.2, 2.5, 3 또는 4배까지 aPTT를 연장시킨다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 정맥내 주입을 통해 인간 환자에게 투여될 경우, 10 또는 5mg 이하/kg 체중의 용량에서 치료 이점을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명에 따르는 항체의 상기 주간 용량의 등가물은 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여는 목적하는 만큼 반복될 수 있다. 투여는 2시간 미만 내지 24시간의 기간에 걸쳐, 예를 들어, 2 내지 12시간 동안 볼루스 주사 또는 주입 또는 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 24시간 이상과 같은 장기간에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 섭생은 필요에 따라, 예를 들어, 6개월 또는 12개월 후에 1회 이상 계속되거나 반복될 수 있다. 용량은 본 발명의 mAb를 표적으로 하는 항유전자형 항체를 사용하여 생물학적 샘플에 투여시 순환하는 항-FXI 항체의 양을 측정함으로써 결정되거나 조절될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 6개월 이상 동안 1, 2, 3, 4 또는 6주당 1회와 같은 유지 요법으로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 규칙적인 투석을 받는 환자에서 합성 이식체, 스텐트 또는 AV-누관의 혈전증 (및 폐색)의 예방 또는 감소에 사용된다. 이들 환자에서, 항체는 바람직하게 환자가 투석을 받는 경우에, 적어도 매주 또는 주당 수회(예: 2, 3 또는 4회) 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 환자에게 반환되는 투석된 체액으로 투석 장치를 통해 환자에게 투여된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 심방 세동, 불안정 협심증, 심부 정맥 혈전증, 확산성 혈관내 응고, 전립선 수술, 특히 엉덩이 또는 무릎의 정형 외과 수술, 및 기타 혈전 색전 장애 환자에서와 같이 연속적인 항응고제 요법을 필요로 하는 규칙적인 비경구 접근이 없는 환자에게 투여된다. 이러한 환자들에서, 바람직하게는 시간 주기 당 항체의 특정 횟수의 투여, 예를 들어, 2, 3, 4 또는 6주 당 1회 적용된다.
공통의 일반 지식에 기초하여, 당업자는 FXI 활성화에 의해 매개되고/되거나 FXI의 억제가 유리한 효과를 갖는 임의의 소정의 질환, 장애 및/또는 상태에서 요구되는 목적하는 예방적 또는 치료적 효과를 위해 (a) FXI 활성의 실질적인 차단 및 (b) 트롬빈 생성의 실질적인 차단 중 적어도 하나로서 적어도 하나를 달성하기 위해 순환에서 또는 국소로 항체의 충분히 높은 수준을 생산하기 위해 본 발명의 항체를 투여하는 적합한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 항체의 생산 및 정제
본 발명의 항-FXI의 항체는 임의의 다수의 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 그들은 통상적으로 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 재조합 발현 시스템으로 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌(참조: Shukla and Thommes (2010, "Recent advances in large-scale production of monoclonal antibodies and related proteins", Trends in Biotechnol. 28(5):253-261), Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, and Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.)을 참조한다. 당업계에 공지된 임의의 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-FXI 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 하나의 뉴클레오타이드 서열은 적어도 본 발명의 항-FXI 항체의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 다른 뉴클레오타이드 서열은 적어도 본 발명의 항-FXI의 중쇄의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직한 핵산 분자는 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, 예를 들어, 프로모터 및 신호 서열과 같은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터이다.
다른 측면에서, 본 발명은 이 섹션에서 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 세포에 관한 것이다. 세포는 바람직하게는 단리된 세포 또는 배양된 세포이다. 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 원핵 생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실루스를 포함한다. 고등 진핵 세포는 곤충 세포 및 포유류 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장 세포의 COS-7 주(참조: Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, BHK 세포주, 및 문헌(참조: McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821)에 기재된 바와 같은 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CVI 유래의 CVI/EBNA 세포주를 포함한다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)]에 기재되어 있다.
형질 전환된 세포는 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건하에서 배양될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-FXI 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 폴리펩티드의 발현에 도움이 되는 조건하에서, 본원에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계 및, 임의로, 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항-FXI 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는, 예를 들어, 낙타 유래 단일 도메인(VHH) 항체 단편(참조: 예를 들어, Eifler et al., 2014. Biotechnology Progress DOI:10.1002/btpr.1958)에 기초한 독특한 친화도 정제 용액을 제공하는 CaptureSe1ect™ 리간드를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 포함하는 친화도 크로마토그래피(참조: 예를 들어, Low et al., 2007, J. Chromatography B, 848:48-63; Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848:28-39)를 포함하는 통상적인 단백질 정제 절차에 의해 회수될 수 있다. 본원에서 사용하기 위해 고려되는 폴리 펩티드는 실질적으로 오염성 내인성 물질을 함유하지 않는 실질적으로 균일한 재조합 항-FXI 항체 폴리펩티드를 포함한다.
이 문서와 이의 청구범위에서, "포함하다"라는 동사와 이의 활용은 그 단어에 뒤따르는 항목은 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 것을 의미하기 위해 비제한적인 의미로 사용된다. 또한, 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 요소에 대한 언급은, 문맥이 하나의 요소가 존재하고 하나의 요소만이 존재한다는 것을 명백히 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참조문헌은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다.
하기 실시예는 예시 목적으로만 제공되고, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다.
도 1. 인간 혈장의 A) aPTT, B) PT 또는 C) FXI 활성에 대한 정제된 마우스 항-인간 FXI mAb의 효과. 0.2 내지 0.9mg/ml의 MAb를 지시된 바와 같이 희석하고, 인간 혈장과 1:1로 혼합했다. 혼합물의 APTT(A), PT(B) 또는 C) FXI 활성을 측정했다.
도 2. MAb 항-FXI 34.2는 FXI의 세린 프로테아제 도메인의 에피토프에, mAb 항-FXI 15F8.3은 애플 2 도메인의 에피토프에 결합한다. ELISA 웰을 tPA의 융합 단백질 및 FXI의 단일 애플 도메인(도면에서 애플 1 내지 4로서 표시됨) 또는 정제된 혈장 FXI(인자 XI)로 코팅했다. 항-FXI mAb의 결합은 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG 항체로 검출되었다. MAb 항-FXI 34.2는 임의의 애플 도메인에 결합하지 않지만, 4개의 애플 도메인 외에, 세린-프로테아제 도메인을 또한 포함하는 혈장 인자 XI에만 결합한다.
도 3. A) aPTT 시약, B) 저농도 TF(1pM) 또는 C) 고농도 TF(5pM)에 의해 유도된 혈장에서의 트롬빈 생성에 대한 mAb 항-FXI 34.2의 효과. mAb를 지시된 바와 같은 최종 농도로 풀링된 정상 인간 혈장에 첨가했다. aPTT 시약(A), 최종 농도 1pM의 TF(B) 또는 최종 농도 5pM의 TF(C)를 첨가하고, 트롬빈의 생성을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 실시간으로 측정하였다. X축은 시간(분)을 나타내고, Y축은 지시된 시간(nM)에 혈장내 트롬빈(FIIa) 농도이다.
도 4.
A) FXIa의 발색 활성 및 B) FXIa에 의한 FIX의 전환에 대한 항-FXI mAb 34.2의 효과. A) MAb 항-FXI 34.2는 FXIa의 발색 활성을 억제한다. 정제된 FXIa(약 3nM)를 대조군 mAb뿐만 아니라 25 및 50nM에서 정제된 항-FXI mAb 34.2와 함께 배양하였다. 이어서, FXIa의 활성을 발색 기질 S2366으로 평가하였다. B) MAb 항-FXI 34.2는 FXIa에 의한 FIX의 전환을 억제한다. 정제된 FXIa를 정제된 항-FXI mAb와 함께 배양하였다. 이어서, 활성을 정제된 FIX와의 배양에 의해 평가하였다. 이어서, FIXa의 생성은 FX와의 배양에 의해 모니터링하였다. 이어서, 혼합물 내의 FXa 수준은 발색 기질 S2222로 측정하였다. mAb와 배양되지 않은 FXIa는 100%로 설정하였다.
도 5. 생체내 mAb 항-FXI 34.2의 효과. A) 마우스의 IVC 혈전증에 대한 mAb 항-FXI 34.2의 효과. FXI-/-마우스에게 인간 FXI를 투여한 후 식염수 또는 mAb 항-FXI 34.2(8mg/kg)를 주사하였다. IVC에 10% FeCl3에 침지된 여과지를 3분간 적용하여 혈전증을 유도하였다. 정맥혈 유량을 30분 동안 측정하였다. 데이터는 5마리 동물의 평균 및 SD를 나타낸다. B) MAb 항-FXI 34.2는 꼬리 출혈 시간을 연장시키는 에녹사파린과는 대조적으로 마우스에서 꼬리 출혈 시간에는 영향을 미치지 않는다. FXI-/- 마우스에게 인간 FXI를 투여한 후 식염수(대조군), 에녹사파 린(1mg/kg) 또는 mAb 항-FXI 34.2(8mg/kg)의 단일 투여량을 투여했다. 후속적으로, 꼬리 출혈을 유발하고 출혈이 정지될 때까지의 시간을 초 단위로 기록했다. 각 기호는 하나의 동물을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타낸다.
도 6. A) 인간 혈장의 aPTT에 대한 A) 키메라 마우스-인간 항-FXI 34.2 또는 B) 정제된 복합 인간 항-인간 FXI mAb의 효과.
A) 키메라 mAb를 지시된 농도로 인간 혈장에 첨가했다. 이어서, 혼합물의 aPTT를 결정하였다. B) 원래의 마우스 mAb 항-FXI 34.2 및 마우스-인간 키메라 항체의 효과를 비교를 위해 나타내었다. NPP = 정상 풀링 혈장(mAb 없음). MAb 항-C2-60은 대조군 mAb이며, mAb 항-FXI-20D4 및 항-FXI-100은 대조군으로 포함된 비억제성 항-FXI mAb이다.
도 7. A) A) mAb VH4Vκ4 또는 B) 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2와 함께 20명의 공여자로부터의 PBMC의 배양시 관찰된 5 내지 8일째의 증식 지수. 자극 지수 ≥2는 양성으로 간주된다. 경계선 증식은 별표로 표시된다.
도 8. A) aPTT 시약, B) 5pM TF, C) 1pM TF 또는 D) 0.25pM TF에 의해 유도된 혈장에서의 트롬빈 생성에 대한 mAb VH4Vκ4의 효과. MAb VH4Vβ4를 풀링된 정상 인간 혈장에 지시된 최종 농도로 첨가하였다. aPTT 시약(A) 또는 최종 농도 5pM의 TF(B), 1pM의 TF(C) 또는 0.25pM의 TF(D)를 첨가하고, 트롬빈의 생성을 실시간으로 측정하였다. X축은 시간(분)을 나타내고, Y축은 지시된 시간에 혈장 중 트롬빈 농도(nM)이다.
도 9. 마우스에서 실험적 IVC 혈전증에 대한 mAb VH4VK4의 효과. FXI-/- 마우스에게 인간 FXI를 투여한 다음, 단일 용량의 식염수 또는 mAb VH4VK4(8mg/kg)를 투여하였다. 이어서, 혈전증은 10% FeCl3에 침지된 여과지를 하대 정맥(IVC)에 3분간 적용하여 유도하였다. 정맥혈 유동을 30분 동안 측정하였다. 데이터는 6 마리 동물의 평균 및 SEM을 나타낸다. 식염수 대조군은 도 5a에서와 동일하다.
도 10. 단순화된 응고 반응식. 명확하게 하기 위해, 인지질 막과 같은 중요한 성분, 항트롬빈 및 TFPI와 같은 조절 단백질, 및 단백질 C 시스템은 묘사되지 않는다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1 재료
인간 응고 인자 FXI, FX 및 FIX는 Haematologic Technologies, Inc.(Essex Junction, VT, USA)에서 구입했다. 혈장 FXI는 또한 LFB(Hemoleven; LFB, Les Ulis, France)로부터 입수했다. 또한, FXI의 공급원이 이하 개시된 실험 결과와 관련이 없기 때문에, 다른 공급원으로부터의 FXI(Prof JC Meijers, Amsterdam으로부터 입수된 혈장 또는 재조합 인간 FXI로부터 정제된 FXI)를 사용했다. 프리칼리크레인(PK)은 독일 다름슈타트 소재의 Merck Millipore에서 입수했다. 파트롬틴 SL 또는 카올린 STA(Stago)(aPTT 시약), 재조합 인노빈 및 FXI 결핍 혈장은 Siemens Healthcare Diagnostics(독일 마르부르크)에서 입수했다. 트롬빈 칼리브레이터 및 플루카 키트는 네덜란드 마스트리히트의 Thrombinoscope BV에서 입수했다. 형광성 기질 Z-Gly-Gly-Arg-AMC는 스위스 부벤도르프의 Bachem으로부터 구입하였다. 인지질(PC/PS/PE, 40/40/20)은 알라바마주 앨러배스터의 Avanti Polar Lipids에서 입수했다. 발색 기질 S2366 및 S2222는 Chromogenix(이탈리아 밀라노)로부터 입수했다. tPA의 재조합 융합 단백질 및 FXI의 개별 애플 도메인은 기재된 바와 같이 제조했다(참조: van Montfoort ML et al., Thromb Haemost 2013; 110:1065-73). 에녹사파린(클렉산)은 Sanofi-Aventis(프랑스 파리)에서 입수했다.
1.2 인간 FXI에 대한 마우스 mAb의 생성
FXI에 대한 MAb는 정제된 인간 혈장 인간 FXI로 마우스를 주사한 후 통상적인 방법에 의해 생성되었다. 간단히 말하자면, BALB/c 마우스(암컷, 6 내지 8주령, Charles River Laboratories)는 0일째에 완전 프로인트 애쥬번트 중의 정제된 FXI를 피하 주사했다(각 마우스는 250μL의 완전 프로인트 애쥬번트(Sigma)와 혼합된 250μL 인산염 완충 식염수, pH 7.4(PBS) 중의 25㎍의 FXI를 가짐). 이어서, 마우스의 항체 반응은 21일째 및 42일째에 불완전 프로인트 애쥬번트 중의 정제된 FXI의 피하 주사(각 마우스는 250μL의 불완전 프로인트 애쥬번트(Sigma)와 혼합된 250μL PBS 중의 25㎍의 FXI를 가짐) 및 63일째 및 64일째에 애쥬번트 없이 FXI의 복강내 주사(각 마우스는 250μL PBS 중의 25μg FXI를 가짐)로 증가시켰다.
67일째, 면역화된 마우스의 비장 세포를 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975, Nature, 256: 495-7)]에 원래 기재된 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 SP2/0-Ag14 골수종 세포와 융합시켰다. 간략하게, 면역화된 마우스를 희생시켰다. 비장에서 비장 세포를 뽑고, GlutaMax(Invitrogen/Life Technologies Corp)를 갖는 무혈청 opti-MEM® I 배지로 세척했다. 대수적으로 성장하는 SP2/0-Ag14 골수종 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 5:1 비의 비장 세포 대 골수종 세포로 비장 세포에 첨가했다. 이어서, 세포를 펠렛화하고, 상청액을 제거하였다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜 4000(Merck)의 37%(w/v) 용액 1ml를 60초에 걸쳐 적가하고, 그 후 세포를 37℃에서 추가의 60초 동안 배양하였다. 이어서, 8ml의 무혈청 배지에 이어, GlutaMax/10% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS; Bodinco)을 포함하는 5ml의 opti-MEM I 배지를 완만하게 진탕시키면서 서서히 첨가하였다. 실온(RT)에서 30분 후, 세포를 펠렛화하고, GlutaMax/10% FCS를 갖는 opti-MEM I로 세척하여 잔류성 폴리에틸렌 글리콜을 제거하고, 최종적으로 아미노프테린 선택 배지, 즉 50x Hybri-Max™ 아미노프테린(드 노보 DNA 합성 억제제, Sigma)이 보충된 GlutaMax/10% FCS를 갖는 opti-MEM I 배지에서 웰당 105 세포/200㎕의 농도로 플레이팅했다. 융합 실험 7일째부터 2 내지 3일마다 아미노프테린 선택 배지를 보충하였고, 13일째에 아미노프테린 선택 배지를 GlutaMax/10% FCS를 갖는 opti-MEM I로 대체하였다.
융합 후 13일째부터, 하이브리도마의 상청액을 96-웰 플레이트 상에 코팅된 정제된 혈장 FXI를 갖는 ELISA를 사용하여 항-FXI 항체 생산에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝 ELISA는 다음과 같이 수행하였다. 인간 FXI는 코팅용으로 사용하였다(PBS 중 1μg/ml, 100μl/웰). PBS/0.05%, w/v, Tween 20으로 광범위하게 세척 한 후, 플레이트를 PBS/0.05% Tween 20/1%, w/v, 소 혈청 알부민(BSA; Roche)으로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 100㎕의 희석되지 않은 하이브리도마 상청액/웰로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS/0.05% Tween 20으로 광범위하게 세척한 후, 항체의 결합은 1:5000 희석된 서양 고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 Fcγ-특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)로 실온에서 1시간 동안, 이어서 비색 검출을 위한 TMB 기질(Invitrogen)의 즉시 사용 가능한 용액으로 결정했다. 1M H2SO4를 첨가한 후, 마이크로플레이트 판독기(BioRad)를 사용하여 파장 450nm(기준 파장 655nm)에서 광학 밀도를 측정하였다. 이 ELISA에서 양성인 하이브리도마를 확대하고 저온 보존했다.
aPTT를 연장시킨 mAb를 생산한 하이브리도마를 추가로 배양하였다. 마우스 IgG는 제조자의 지침에 따라 사전패킹된 컬럼(Pharmacia Healthcare)을 사용하는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 이 상청액으로부터 정제하였다.
프리칼리크레인(prekallikrein, PK)에 의한 항-FXI mAb의 교차-반응성은 웰 당 100ng으로 정제된 PK를 FXI 대신 코팅에 사용하고, BSA에 의한 차단 단계가 생략되고, 1/1000 희석으로 염소 항-마우스 Fcγ-특이적 항체(Santa Cruz)를 사용하여 결합된 mAb를 검출하였다는 것을 제외하고는 상기한 ELISA에 필적할 만한 ELISA로 시험하였다. BSA로 코팅된 웰을 대조군으로 포함시켰다.
1.3 표면 플라즈몬 공명
표면 플라즈몬 공명은 연구 등급 cm5 센서 칩이 장착된 Biacore 2000(GE Healthcare)에서 FXI에 대한 mAb의 친화도 상수를 평가했다. 인자 FXI는 아민 커플링 화학을 사용하여 고정시켰다. 표면을 0.1M N-하이드록시석신이미드와 0.1M 3-(N,N-디메틸아미노) 프로필-N-에틸카보디이미드의 1:1 혼합물로 분당 10㎕의 유속으로 7분 동안 활성화시켰다. 10mM 나트륨 아세테이트, pH 5.5 중의 10㎍/ml 농도의 리간드를 1000ru의 밀도로 고정시켰다. 처리되지 않은 유동 세포는 기준 표면으로 작용했다. 모든 표면은 1M 에탄올아민, pH 8.0의 7분 주입으로 차단시켰다. 다음의 프로토콜을 사용하여 FXI에 대한 mAb의 동역학 결합을 평가하였다. 분석물은 유속 60μl/분 및 온도 20℃에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.01% 트윈 20, pH 7.4에서 6.25-100nM 범위의 농도로 2개의 유동 세포에 주사했다. 복합체는 각각 360초 및 600초 동안 결합 및 해리시켰다. 표면을 50mM NaOH의 10초 주사로 재생시켰다. 각 샘플 및 완충액 블랭크의 3중 주사액(무작위 순서로)을 두 표면 위에 유동시켰다. 데이터는 1Hz의 속도로 수집했다. 이 데이터는 BiaEvaluation 4.1 소프트웨어에서 사용할 수 있는 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 간단한 1:1 상호 작용 모델에 적합화했다.
1.4 FXI 도메인 상에서 억제성 mAb에 대한 에피토프의 국부화
FXI의 개별적 애플 도메인은 기재된 바와 같이 tPA를 갖는 융합 단백질로서 발현시켰다(참조: Meijers JC et al., Biochemistry 1992;31:4680-4). 이들 융합 단백질에 대한 mAb의 결합은 4개의 융합 단백질 및 정제된 혈장 FXI를 1㎍/ml로 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 후속적으로 상이한 mAb와 함께 배양한 ELISA를 사용하여 평가했다(참조: van Montfoort et al., Thromb Haemost, 2013; 110: 1065-73). 이어서, 융합 단백질에 대한 mAb의 결합을 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG로 측정하고, 플레이트에 결합된 항체를 오르토-페닐렌디아민-디하이드로클로라이드(OPD)와의 배양으로 검출하였다. 결과는 490nm에서 OD로 나타냈다.
1.5 응고 검정
프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)은 제조사(Siemens Healthcare Diagnostics)의 시약 및 프로토콜로 자동화 응고 분석기(Behring Coagulation System)로 측정했다.
mAb의 효과를 시험하기 위해, 하이브리도마 상청액을 동일 용적의 새로운 인간 혈장과 혼합하였다. FXI의 활성에 대한 하이브리도마 상청액의 영향은 정제된 FXI(25nM 이하)의 희석액과 1:1로 혼합된 FXI-결핍 혈장과 비교하여 정량화하였다. 결과는 FXI의 % 억제로서 나타냈고, 첨가된 FXI 없는 FXI-결핍 혈장은 100% 억제로 설정하고, 25nM FXI와 혼합된 혈장을 갖는 것들은 0% 억제로서 설정했다.
aPTT 및 일부 대조군 mAb를 연장시킨 MAb를 정제하고, 혈장에 첨가하고, aPTT, PT 및 FXI 활성에 대한 효과를 시험하였다.
1.6 혈장내 트롬빈 생성
실시간으로 혈장내 트롬빈 생성은 문헌[참조: Hemker et al (Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32: 249-53)]에 기재된 바와 같이 제조자(Thrombinoscope, Maastricht, Netherlands)가 제공한 매뉴얼로 측정하였다. 간단히 말해, 응고는 1 또는 5 pM의 재조합 인간 조직 인자(인노빈, Siemens Healthcare Diagnostics) 또는 aPTT 시약(8배 희석됨; Pathromtin SL, Siemens Healthcare Diagnostics), 4μM 인지질 및 417μM 형광원 기질 z-Gly-Gly-Arg-AMC(Bachem, Bubendorf, Switzerland)의 존재하에 혈장의 재석회화로 유발시켰다. 형광은 Fluoroskan Ascent 형광 측정기(Thermolabsystems, Helsinki, Finland)를 사용하여 모니터링하였고, Thrombinoscope® 소프트웨어를 사용하여 내인성 트롬빈 포텐셜(ETP), 피크, 시간-대-피크, 지체 시간 및 속도 지수를 계산했다.
1.7 FXI의 활성화에 대한 mAb의 영향을 평가하기 위한 검정
발색 검정은 25mM Hepes, pH 7.4, 137mM NaCl, 3.5mM KCl, 3mM CaCl2 및 0.1mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)에서 수행했다.
FXIIa에 의한 FXI의 활성화에 대한 항-FXI mAb의 효과를 평가하기 위해, 100nM의 정제된 FXI를 실온(RT)에서 30분 동안 1 내지 10배 몰 과량의 mAb와 함께 배양하였다. 다음으로, 5mM FXIIa를 첨가하고, 샘플을 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 혼합물 내의 FXIa 수준을 발색 기질 S2366(0.5mM)으로 측정하였다. 이 검정은 50nM 고분자량 키니노겐(HK)을 사용하거나 사용하지 않고 수행하였다.
비교 실험에서, 트롬빈(FIIa)에 의한 FXI의 활성화에 대한 항-FXI mAb의 효과를 평가하였다. FXI(50nM)를 실온에서 30분 동안 10배 과량의 mAb와 함께 배양하였다. 이어서, 10nM 트롬빈을 첨가하고, 혼합물을 밤새 배양하였다. 혼합물에서 생성된 FXIa의 양은 1U 히루딘(트롬빈을 차단하기 위해) 및 발색 기질 S2366(0.5mM)을 첨가하여 측정하였다.
1.8 FXIa의 활성에 대한 mAb의 효과를 평가하기 위한 검정
FXIa의 효소 활성에 대한 정제된 항-FXI mAb의 효과를 평가하기 위해, FXIa 및 정제된 mAb를 37℃에서 30분간 각각 최종 농도 50nM 및 500nM의 발색 검정 완충액에서 배양하였다. 이어서, 발색 기질 S2366을 최종 농도 0.5mM로 첨가하고, 기질의 전환을 405nm에서 측정하였다. FXIa의 발색 활성에 대한 mAb 항-FXI 34.2의 효과를 확인하기 위한 일부 실험에서, 약간 상이한 조건, 즉 2.5nM FXIa 및 25nM 항-FXI mAb를 사용하였다.
FXIa에 의한 FIX 활성화에 대한 항-FXI mAb의 효과를 평가하기 위해, 10nM의 FXIa는 37℃에서 30분 동안 7mM의 CaCl2를 갖는 발색 기질 완충액 중의 항-FXI mAb와 함께 배양한 다음, 100nM FIX를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 혼합물 중의 FIXa를 평가하기 위해, 정제된 FX(100nM) 및 발색 기질 S2222(0.5mM)를 첨가하였다. 이어서, 발색 기질의 전환을 405nm에서 측정하였다.
1.9 마우스의 실험용 혈전증 모델
동물 수술은 Academic Medical Center(네덜란드 암스테르담)에서 실시되었고, 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
C57BL/6 배경 상의 8주령 수컷 및 암컷 인자 XI 녹아웃 마우스(FXI-/- 마우스)가 본 연구에 포함되었다(참조: Rosen ED et al., Thromb Haemost 2002; 87: 774-6). 마우스는 일정한 명-암 주기로 마이크로-아이솔레이터 케이지(micro-isolator cages)에 수용하고, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 했다.
혈전증을 유도하는 외과 수술 전에, 동물에게 5U의 인간 혈장 인자 XI 농축 물(1 단위는 풀링된 정상 인간 혈장 1ml에 존재하는 FXI의 양이다)을 보충했다. 그 후, 마우스에게 mAb(8mg/kg) 또는 식염수를 정맥 주사하였다. 에녹사파린(LMWH; 1mg/kg)을 수술 6시간 전에 피하 주사하였다.
충분히 확립된 마우스 혈전증 모델, 염화제2철(FeCl3) 유도된 하대 정맥(IVC) 혈전증을 mAb의 효능을 평가하는데 사용하였다. 간단히 말하면, FXI-/- 마우스를 2.5% 흡입제 이소플루란 및 케타민/크실라진(2:1)의 혼합물로 마취시켰다. 이어서, 정중선 절개를 하고, IVC를 무딘 절개로 노출시켰다. 이어서, 10% FeCl3 용액에 침지된 여과지를 IVC 상의 신장 정맥 아래에 3분 동안 위치시켰다. 종이를 제거하고, 조직 관류 모니터(유형 BLF22; Transonic Systems Inc., 미국 뉴욕주 이타카)를 사용하여 30 내지 45분 동안 정맥 유동을 측정하였다. FeCl3의 투여 전 유동을 100%로 설정하고 기준으로 사용하였다. 투여 후의 유속은 이러한 사전-투여 유동의 %로서 계산했다. 치료 당 6마리의 마우스 그룹을 연구했다.
1.10 출혈 검정
마우스 꼬리 출혈 검정을 기재된 바와 같이 사용하였다(참조: Wang X et al., J Thromb Haemost 2006;4:1982-8). 간단히 말하면, 마우스를 마취시키고, 37℃ 가열 패드에 위치시켰다. 약 1mm의 꼬리 직경(끝으로부터 2 내지 4mm)으로 꼬리를 절단하고, 37℃에서 충전된 식염수에 위치시켰다. 출혈이 멈출 때까지의 시간을 기록했다. 30분 후, 동물이 여전히 출혈이 있어도 실험을 중단하고, 동물을 희생시켰다. 혈액 손실은 출혈 꼬리에서 혈액을 수집하는 데 사용된 575nM의 식염수 용액에서 OD를 측정하여 평가했다.
1.11 mAb FXI 34.2의 cDNA의 클로닝
하이브리도마 세포를 PBS로 세척하고, 분액화하고, -80℃에서 펠렛으로 저장하였다. RNeasy 미니 단리 키트(QIAGEN)를 사용하여 RNA를 이들 펠렛으로부터 분리하였다. RNA 농도는 분광 광도계(A260nm)로 측정하였다. 역전사 효소에 의해 cDNA는 RevertAidTM H Minus First Strand cDNA 합성 키트(Fermentas)를 사용하여 2μg의 RNA로부터 합성하였고, 추후 사용시까지 -20℃에서 저장했다. 이소타입 특이적 프라이머(센스 및 안티센스)는 마우스 mAb 항-FXI 34.2의 V-영역을 증폭하도록 설계했다(표 1).
mAb 항-FXI 34.2의 cDNA를 클로닝하는데 사용된 PCR 프라이머. 변형된 프라이머: M = C 또는 A; R = A 또는 G; W = A 또는 T.
중쇄 서열 번호
센스 5'-ATGGRATGGAGCKGGGTCTTTMTCTT-3' 9
안티센스 5'-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3' 10
경쇄
센스 5'-ATGGGCWTCAAAGATGGAGTCACA-3' 11
안티센스 5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3' 12
mAb 항-FXI 34.2의 V-영역의 서열을 확인하기 위해, 불변 마우스 k 및 CH 도메인이 인간 도메인으로 교환된 mAb 항-FXI 34.2의 키메라 인간 IgG4 포맷을 제조했다. 중쇄간 디설파이드 브릿징을 보장하기 위해, 힌지 영역의 돌연변이가 서열에 도입되었다(S241P; Angal S et al., Mol Immunol 1992;30:105-8). 이를 위해, 키메라 인간 IgG4 중쇄 및 키메라 인간 κ 경쇄를 코딩하는 CHO 세포 최적화 cDNA 서열은 Geneart(Regensburg, Germany)로부터 구입하였고, 이는 각각 인간 IgG4 불변 영역에 연결된 뮤린 가변 중쇄 또는 인간 카파 불변 영역에 연결된 뮤린 가변 경쇄가 이어지는 뮤린 신호 펩티드를 코딩한다. 항체는 단백질 A 친화도 크로마토그래피(GE Healthcare)로 정제된 FreeStyle™ MAX CHO (CHO-S 세포) 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 CHO 세포에서 발현시키고, 인간 FXI가 코팅으로 사용된 ELISA에 의해 인간 FXI에 대한 결합에 대해 및 단백질 G-정제된 제제를 인간 혈장에 첨가하고 aPTT를 측정함으로써 기능적 활성에 대해 시험하였다.
1.12 뮤린 mAb 항-FXI 34.2의 인간 및 탈면역화 변이체
마우스 mAb 항-FXI 34.2의 서열은 복합 인간 항체 기술(www.antitope.co.uk)을 사용하여 인간화하고 탈면역화하였다. 복합 인간 항체는 비관련 인간 항체의 V 영역으로부터 유래된 다중 서열 세그먼트('복합체')를 포함한다. 인간 V 영역 데이터베이스로부터 유래된 모든 선택된 서열 세그먼트는 잠재적 T 세포 에피토프의 존재를 위해 인 실리코 여과시켰다.
이를 위해, 출발 항체의 항원 결합에 중요하다고 간주되는 아미노산을 먼저 결정하였다. 이어서, mAb 항-FXI 34.2의 VH 및 Vκ 도메인의 서열을 비관련 인간 V 영역의 데이터베이스로부터 유래된 상동성 서열 세그먼트를 선택하는 데 사용하였다. 4개의 상이한 VH 및 4개의 상이한 Vκ 서열을 설계하여 16개의 상이한 항체를 생성했다. 이어서, V 영역 유전자는 선택된 인간 서열 세그먼트의 조합을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생성하였다. 이어서, 이들을 힌지 안정화 돌연변이 S241P(Angal S et al., Mol Immunol 1992; 30: 105-8)를 함유하는 인간 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄를 함유하는 벡터로 클로닝하였다. 키메라 항체 유전자 및 선택된 항-FXI 34.2 IgG4 (S241P)의 모든 조합을 전기천공을 통해 NS0 세포로 안정하게 형질 감염시켰다. 각 세포주의 동일성은 게놈 DNA로부터 가변 도메인의 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 최상의 발현 주를 선택하여 17개의 mAb(16개의 복합 인간 항체™ 변이체 및 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2)를 발현시키는 데 사용했다. 재조합 항체는 단백질 A 세파로스 컬럼(GE Healthcare) 상에서 세포 배양 상청액으로부터 정제했다.
인간 FXI에 대한 결합을 위한 다양한 mAb를 시험하기 위해, 처음에 경쟁 ELISA를 사용하였고, 여기서 인간 FXI는 코팅용으로 사용되고, 비오티닐화 뮤린 mAb 항-FXI 34.2는 기준 항체로 사용되었다. 이를 위해, 16.66㎍/ml 내지 0.023㎍/ml의 농도에서 키메라 항체 및 mAb 항-FXI 34.2의 16개의 복합 변이체 각각과 함께 정제된 뮤린 mAb 항-FXI 34.2 항체의 희석 시리즈를 1x PBS pH 7.4에서 희석된 0.5μg/ml 인자 XI로 사전 코팅된 Nunc Immuno MaxiSorp 96 웰 평저 미세역가 플레이트 상에서 실온에서 1시간 동안 배양하기 전에 일정한 농도의 비오티닐화 뮤린 mAb 항-FXI 34.2(0.12μg/ml, 최종 농도)와 사전혼합했다. 비오티닐화 항체의 결합은 스트렙타비딘-HRP(시그마) 및 OPD 기질(시그마)로 검출시켰다. 반응은 3M HCl로 중지시키고, 흡광도는 Dynex Technologies MRX TC II 플레이트 판독기에서 490nm에서 판독하고, 결합 곡선을 플롯팅했다.
1.13 인간화 mAb 34.2의 면역원성을 평가하기 위한 시험관내 모델
납 완전 인간 복합 납 항-FXI mAb의 면역원성 잠재력은 HLA 유형화 공여자(EpiScreen™ 기술; 안티토프, Cambridge, UK)의 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 시험관내에서 평가하였다. 간단히 말하면, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Lymphoprep(Axis-shield, Dundee, UK) 밀도 원심분리에 이어, T 세포 고갈(CD8+RosetteSepTM; StemCell Technologies Inc, London, UK)을 사용하여 건강한 지역 사회 공여자 연막으로부터 단리시켰다. 공여자는 HLA SSP-PCR에 기초한 조직 타이핑 키트(Biotest, Solihull, UK)를 사용하여 HLA-DR 일배체형을 위해 유형화되었다. 세계 및 유럽/북아메리카 집단에서 발현된 HLA-DR 동종형의 수 및 빈도를 나타내는 20명의 공여자로부터의 PBMC를 선택하고, 샘플 당 50㎍/㎖의 최종 농도로 정제 복합 항체로 배양하였다. 각 공여자를 위해, 재현성 대조군(100μg/ml 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)으로 배양된 세포, Pierce (Perbio), Cramlington, UK KLH), 임상 대조군(50μg/ml 인간화 A33 항체), 배양 배지 단독 대조군, 및 키메라 마우스-인간 mAb 항-FXI 34.2의 대조군도 포함시켰다. 배양액을 총 8일 동안 배양하였다. 5일, 6일, 7일 및 8일째에 0.75μCi [3H]-티미딘(Perkin ElmerR, Beaconsfield, UK)을 사용하여 환저 96 웰 플레이트에서 3 x 100μl 분취액을 추가로 18시간 동안 펄싱하여 세포의 증식을 측정하였다. 이어서, 세포를 필터 매트(Perkin ElmerR) 상에서 수거하고, MeltilexTM(Perkin ElmerR) 섬광 계수로 각 샘플에 대한 분당 카운트(cpm)를 결정하였다. 이어서, 자극 지수(SI)는 시험 샘플과 함께 배양된 PBMC의 증식(cpm)과 배지만으로 배양된 PBMC의 증식(cpm)의 비율을 평가하여 결정하였다. 자극 지수 ≥2는 중요한 반응을 나타내는 것으로 간주되었다.
2. 결과
2.1 인간 FXI에 대한 억제성 항체의 생성
ELISA에서 인간 FXI에 결합된 mAb를 생성하는 32개의 하이브리도마가 생성되었다. 이들 하이브리도마의 상청액을 인간 혈장에 첨가하고 aPTT에서 억제 활성을 시험하였다. 이 aPTT에서 다양한 양의 FXI가 보충된 FXI 결핍 혈장을 기준으로 사용했다. 2개의 하이브리도마 상청액, 항-FXI mAb 34.2 및 항-FXI mAb 15F8.3은 FXI를 90% 이상 억제하였다. 이들 mAb를 제한된 희석에 의해 서브클로닝하고 하이브리도마 상청액으로부터 단백질 G 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 mAb를 인간 혈장에 첨가하고, aPTT 및 PT 응고 활성에 대한 효과를 시험하였다(도 1a 및 1b). MAb 34.2 및 15F8.3은 aPTT를 용량 의존적으로 연장시켰지만, 그들은 PT에는 영향을 미치지 않았다. 또한, 대조군(비-억제성 항-FXI) mAb는 aPTT 시험에서 영향을 미치지 않았다.
마지막으로, 정제된 mAb와 인간 혈장의 혼합물을 FXI 응고 검정에서 시험하였다(도 1c). 결과는 100% FXI를 함유하고 있는 것으로 밝혀진 인간 혈장 풀의 희석에 대한 참조로 % FXI 활성으로 나타냈다. aPTT를 연장시키는 두 개의 mAb는 사람 혈장에서 FXI 활성을 90% 초과로 감소시켰지만, 다른 항체는 영향을 미치지 않았다(도 1c). 표면 플라즈몬 공명(Biacore)을 사용하여, 인간 FXI에 대한 mAb 34.2의 KD는 0.2nM인 것으로 밝혀졌고, mAb 15F8.3의 KD는 0.15nM이었다.
2.2 에피토프 맵핑
FXI의 도메인 상에 그들의 에피토프를 맵핑하기 위해, mAb를 단일 애플 도메인의 재조합 융합 단백질로 코팅된 ELISA 웰에서 tPA 또는 혈장 FXI와 함께 배양하였다. ELISA 플레이트에 대한 mAb의 결합은 퍼옥시다아제-접합된 항-마우스 IgG로 평가하였다. 이 시스템을 사용하여, mAb 항-FXI 15F8.3에 대한 에피토프는 애플 2 도메인에 위치되는 것으로 밝혀진 반면, mAb 항-FXI 34.2는 임의의 애플 도메인에 결합하지 않고 혈장 FXI에만 결합하여 이의 에피토프가 FXI의 세린 프로테아제 도메인에 위치되는 것을 시사한다(도 2).
2.3 혈장내 트롬빈 생성에 대한 억제성 항-FXI mAb의 효과
FXI 활성에 대한 항-FXI mAb의 효과를 추가로 평가하기 위해, 트롬빈은 항-FXI mAb의 부재 또는 존재하에 다양한 자극, 높은 조직 인자(TF; 5pM), 낮은 TF(1pM) 또는 aPTT 시약에 의해 인간 혈장에서 생성되고, 실시간으로 측정하였다. mAb 항-FXI 34.2(도 3a) 및 항-FXI 15F8.3(데이터는 도시되지 않음)은 aPTT 시약에 의해 유도된 트롬빈 생성을 용량 의존적으로 감소시켰고, 이는 인간 혈장에 첨가 될 때 그들 모두가 aPTT를 연장시키기 때문에 예상된다(참조: 도 1a). 낮은 TF 농도에 의해 유도된 혈장내 트롬빈 생성은 부분적으로 FXI에 의존하는 것으로 공지되어 있다. 트롬빈 생성이 낮은 TF에 의해 혈장에서 유도되었을 때, mAb 항-FXI 34.2만이 용량 의존적으로 트롬빈을 30-40%까지 감소시켰다(도 3b). 대조적으로, mAb 15F8.3은 낮은 TF에 의한 트롬빈 생성을 감소시키지 않았다(데이터는 도시되지 않음). mAb 항-FXI 34.2(도 3c)도 mAb 항-FXI 15F8.3(데이터는 도시되지 않음)도 높은 TF에 의한 트롬빈 생성에 영향을 미치지 않았다.
이러한 실험으로부터 mAb 항-FXI 34.2는 활성화 기전과 독립적으로 FXI를 억제하는 반면, mAb 항-FXI 15F8.3만이 FXIIa에 의해 활성화될 때 FXI를 억제한다고 결론지어 졌다. 따라서, mAb 항FXI 34.2는 추가의 특성화 및 인간화를 위해 선택되었다.
2.4 모노클로날 항체 항-FXI 34.2는 FXI의 활성 부위에 결합하고 FIX 활성화를 방지함으로써 FXI 활성을 억제한다
FXI/FXIa의 활성 부위에 대한 mAb는 전형적으로 발색 기질과 같은 작은 기질의 전환을 포함하여 FXIa의 기질의 전환을 억제한다. FIX와 같은 대형 기질은 활성 사이트 외부의 FXIa 상의 엑소사이트로서 공지된 부위와 상호 작용하는 반면, 소형 기판은 오로지 활성 부위와만 상호 작용한다. 따라서, mAb에 의한 FXIa의 발색 활성의 억제는 그 mAb에 대한 에피토프가 (적어도 부분적으로) 활성 부위와 중첩된다는 것을 나타낸다. 엑소사이트에 대한 항체는 FXIa에 의한 큰 기질의 전환을 억제하지만 FXIa의 발색 활성에는 영향을 미치지 않는다는 것을 특징으로 한다. MAb 항-FXI 34.2는 세린 프로테아제 도메인에 결합하고(도 2), 혈장에서 FXI의 기능적 활성을 억제한다(도 1c). 다음으로, 이 mAb는 FXIa에 의한 작은 기질의 전환에 대한 효과에 대해 시험하였다. 정제된 인자 XIa를 mAb 항-FXI 34.2 및 대조군 mAb와 함께 배양하였다. 이어서, 잔류하는 FXIa 활성은 발색 기질 S2366으로 측정하였다.
MAb 항-FXI-34.2는 작은 억제 효과를 갖지만, 다른 mAb 중 어떤 것도 FXIa 발색 활성을 억제하지 않았다(도 4a). mAb 항-FXI 34.2의 이 작은 효과를 실험 전반에 걸쳐 지속적으로 관찰되었고, 항-FXI 34.2의 재조합 키메라 인간-마우스 mAb 포맷을 사용하는 다른 실험에서도 관찰되었다. 발색 기질 S2366이 p-니트로아닐린(L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린)에 연결된 작은 트리펩티드로 이루어지기 때문에, mAb 항-FXI 34.2의 억제 효과는 그것이 (적어도 부분적으로) FXIa의 활성 부위에 중접되는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. mAb 항-FXI 34.2는 비활성화된 FXI에 대한 고친화도를 갖고(0.2nM의 표면 플라즈몬 공명을 갖는 겉보기 KD; 결과 섹션 2.1 참조), 따라서 mAb 항-FXI 34.2는 FXI 상 뿐만 아니라 FXIa 상에서 발현된다는 것이 주시되어야 한다.
발색 기질은 비교적 작지만, FXIa의 천연 기질인 응고 인자 IX(FIX)는 비교적 큰 기질이다. 또 다른 세트의 실험에서, FIXa의 활성은 FIX의 FIXa로의 전환을 모니터링함으로써 측정하였다. FIXa 활성을 기질로서의 FX로 측정하였고, 이를 FXa로 전환시킨 후 발색 기질 S2222로 측정하였다. MAb 항-FXI 34.2는 FXIa에 의해 FIX의 FIXa로의 전환을 억제하는 반면, 대조군 mAb는 어떤 영향도 미치지 않았다(도 4b).
따라서, 이 실시예에 나타낸 실험은 mAb FXI 34.2가 활성 부위에 (적어도 부분적으로) 위치된 에피토프에 결합함으로써 FXIa의 기질의 전환을 억제함으로써 FXI 활성을 억제함을 나타낸다. mAb 항-FXI 34.2의 이러한 작용 기전은 독특하며, 인간 FXI에 대한 항체에 대해서는 이전에 기재되지 않았다.
2.5 실험적 혈전증에 대한 마우스 모델에서 mAb 항-FXI 34.2의 효과
인간 FXI(참조: van MontfoortM et al., Thromb Haemost 2013;110:1065-73)가 보충된 FXI-녹 아웃 마우스(참조: Wang X et., J Thromb Haemost 2006;4:1982-8)의 하대 정맥(IVC) 혈전증에 대한 마우스 모델을 사용하여 mAb 항-FXI 34.2의 효과를 평가하였다. 외인성 FXI 없이, FXI-/-마우스의 aPTT는 야생형 마우스에서 25 초 내지 30초에 비해 150초 초과이다. IVC 혈전증은 IVC에 10% FeCl3의 적용에 의해 유도되었다. IVC를 통한 혈류의 급격한 감소가 10% FeCl3 적용 후 1분 이내에 관찰되었다(도 5a의 식염수 그룹). 마우스의 에녹사파린 치료는 45분의 관찰 기간 동안 이 FeCl3 유도 혈류 장애를 완전히 방지했다(참조: van Montfoort M et al., Thromb Haemost, 2013:110:1065-73; 이 기사의 도 7 참조). 염화제2철을 사용한 혈전증 유도 전에 mAb 항-FXI 34.2를 투여하면 전체 관찰 기간 전반에 걸쳐 혈류 장애를 예방했다(도 5a).
정상 지혈에 대한 mAb 항-FXI 34.2의 영향을 평가하기 위해, 꼬리 출혈 검정(참조: Wang X et., J Thromb Haemost 2006;4:1982-8)를 사용하였다. 꼬리 출혈 시간을 현저하게 연장시키는 에녹사파린과 대조적으로, MAb 항-FXI 34.2는 꼬리 출혈 시간에 영향을 미치지 않는다(도 5b). 대조적으로, 에녹사파린은 관찰 시간(30분)의 종료까지 동물 출혈을 치료했다.
따라서, 이 실시예에 기재된 실험은 mAb 항-FXI 34.2가 혈전증을 예방하기 위한 에녹사파린 만큼 효과적이지만, 에녹사파린과는 대조적으로 mAb 항-FXI 34.2는 출혈 시간에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
2.6 mAb 항-FXI 34.2의 cDNA 서열
mAb 항-FXI 34.2의 VH 및 Vκ 영역은 상기 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 클로닝했다. mAb 항-FXI 34.2의 VH 및 Vκ 도메인의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 1 및 2로서 서열 목록에 제시된다. 이들 서열의 사용하여 인간 IgG4의 CH 도메인 및 인간 Cκ 도메인에 연결된 마우스 VH 및 Vκ 가변 도메인을 갖는 키메라 mAb를 작제하였다.
마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2는 CHO 세포에서 발현시키고, 정제하고, 이를 정상 혈장과 혼합하고 혼합물의 aPTT를 측정함으로서 억제 활성에 대해 시험하였다(도 6a). 도 6a에 도시된 바와 같이, mAb 항-FXI 34.2 및 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2는 aPTT(들)를 용량 의존적으로 감소시켰다.
2.7. mAb 항-FXI 34.2의 인간화
mAb 항-FXI 복합 인간 항-FXI의 서열에 기초하여, 경우에 따라, 최소한의 면역원성을 갖는 mAb는 복합 인간 항체 플랫폼(Antitope, Cambridge, UK)을 사용하여 설계되었다.
mAb 항-FXI 34.2의 VH 및 Vκ 서열은 표 3에 나타낸 바와 같이 전형적인 골격 잔기 및 CDR 1, 2 및 3 모티프로 구성되는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00004
상기 분석으로부터, mAb 항-FXI 34.2의 복합 인간 서열은 CDR 외부의 많은 대체 잔기로 생성되지만 CDR 서열 내에서 소수의 가능한 잔기만으로 생성될 수 있다고 간주되었다. 예비 분석은 여러 인간 항체로부터 상응하는 서열 세그먼트가 조합되어 뮤린 서열에서와 유사하거나 동일한 CDR을 생성할 수 있음을 나타냈다. CDR의 외측 및 인접하는 영역에 대해, 인간 서열 세그먼트의 광범위한 선택은 신규 복합 인간 항-FXI 항체 V 영역의 가능한 성분으로서 동정되었다.
구조 분석에 기초하여, 인간화 mAb 항-FXI 34.2를 생성하는 데 사용될 수 있는 서열 세그먼트의 큰 예비 세트를 선택하고, 공지된 항체 서열 관련 T 세포 에피토프의 존재에 대해 인 실리코 분석하였다. 인간에서 잠재적으로 면역원성으로 동정된 서열 세그먼트는 폐기했다. 이는 세그먼트의 감소된 세트를 초래했다. 이들의 조합을 잠재적 면역원성에 대해 다시 분석하여 세그먼트 사이의 접합부가 잠재적 T 세포 에피토프를 함유하지 않음을 보장했다. 선택된 서열 세그먼트를 중요한 T 세포 에피토프가 없는 완전한 V 영역 서열로 조립하였다. 이어서, 4개의 바람직한 중쇄(VH1-4) 및 4개의 경쇄 서열(Vκ1-4)을 선택하였다. 표 4는 4개의 바람직한 중쇄(VH1-4)와 4개의 경쇄 서열(Vκ1-4)의 아미노산 서열을 제시하는 서열 번호의 개요를 제공한다.
중쇄의 4개의 상이한 가변 영역(VH 변이체 1-4) 및 경쇄의 4개의 상이한 가변 영역(Vκ 변이체 1-4)의 서열. 단백질 서열 넘버링은 카바트에 따른다.
가변 영역 아미노산 서열 번호 뉴클레오타이드 서열 번호
34.2 VH 변이체 1 13 21
34.2 VH 변이체 2 14 22
34.2 VH 변이체 3 15 23
34.2 VH 변이체 4 16 24
34.2 Vk 변이체 1 17 25
34.2 Vk 변이체 2 18 26
34.2 Vk 변이체 3 19 27
34.2 Vk 변이체 4 20 28
mAb 항-FXI 34.2에 대한 모든 변이체 복합 인간 항체™ VH 및 Vκ 영역 유전자를 합성하고, 카파 경쇄 및 IgG4(S241P, 힌지 돌연변이체; Angal S et al., Mol Immunol 1992;30:105-8) 중쇄로 발현시켰다. 작제물은 서열 분석으로 확인했다. 원래의 뮤린 mAb 항-FXI 34.2 항체의 VH 및 Vκ 서열도 또한 발현되었다. 키메라 항체 유전자 및 복합 mAb 항-FXI 34.2 IgG4(S241P) VH 및 Vκ 쇄의 가능한 모든 조합, 즉 총 16 쌍, Vκ1, Vκ2, Vκ3 또는 Vκ4와 조합된 VH1; Vκ1, Vκ2, Vκ3 또는 Vκ4와 조합된 VH2 등은 전기천공을 통해 NS0 세포로 안정적으로 형질감염되었다. mAb 항-FXI 34.2의 다양한 복합 인간 변이체는 그들의 쇄 구성, 즉 VH1Vκ1, VH2Vκ4 등에 따라 추가로 지시된다. 최고의 발현 주를 사용하여 17개의 mAb(16개의 복합 이간 항체™ 변이체 및 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2)를 발현시켰다. 재조합 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼(GE Heathcare) 상에서 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 방법 섹션에서 기재된 바와 같이, 경쟁 ELISA에서 인간 FXI에 대한 결합에 대해 시험했다. 결과는 mAb 항-FXI 34.2의 모든 복합 변이체가 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2와 마찬가지로 인간 FXI에 동등하게 잘 결합되었음을 나타냈다(데이터는 도시되지 않음).
이어서, 데이터를 사용하여 각 항체에 대한 IC50 값을 계산하였고, 이들을 키메라 마우스-인간 mAb 항-IFI 34.2 항체의 IC50으로 표준화하였다(표 5). 시험된 모든 변이체에 대한 표준화된 IC50 데이터는 0.69 내지 1.13의 범위에 있으며, 모든 복합 항-FXI mAb의 결합 효율이 키메라 34.2의 결합 효율에 필적할 만 했다는 것을 나타낸다. 더욱이, 대부분의 변이체는 키메라 항체보다 각각의 NS0 세포주에 의해 더 잘 발현되었다.
mAb 항-FXI 34.2로부터 유래된 복합 인간 mAb의 상대적 IC50, KD 및 상대적 aPTT
복합 mAb 상대적 IC 50 1 APTT (% NPP) K D (nM)
VH1/Vκ1 0.75 253 0.12
VH1/Vκ2 0.69 248 0.25
VH1/Vκ3 0.91 257 0.17
VH1/Vκ4 0.89 260 0.35
VH2/Vκ1 0.84 252 0.24
VH2/Vκ2 0.92 243 0.88
VH2/Vκ3 0.93 247 0.51
VH2/Vκ4 0.98 259 0.062
VH3/Vκ1 0.87 250 0.13
VH3/Vκ2 0.87 255 0.079
VH3/Vκ3 0.99 256 0.081
VH3/Vκ4 1.13 255 0.42
VH4/Vκ1 0.91 253 1.14
VH4/Vκ2 0.76 247 0.071
VH4/Vκ3 0.99 256 0.14
VH4/Vκ4* 1.09 259 0.13
aC2-60 (대조군) NA 97 NA
1 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2의 IC 50 에 대한 경쟁 ELISA에서 결정된 IC 50 값;
*추가의 실험을 위해 선택됨
복합 인간 항-FXI mAb의 친화도를 확인하기 위해, 그들은 Biacore 시스템을 사용하여 플라즈몬 표면 공명과 함께 FXI에 대한 결합에 대해 시험하였다. 마우스 mAb 항-FXI 34.2는 FXI에 대한 결합에 대해 0.2nM의 KD를 갖는다. 결과는 상기 표 5에 요약되어 있다.
복합 인간 mAb로 측정된 친화도는 0.071 내지 1.14nM 범위이고(표 5), 0.2nM의 KD를 갖는 마우스 mAb 항-FXI 34.2와 비교하여, 일부에 대해서는 약간 더 낮은 친화도를, 다른 항-FXI 복합 mAb에 대해서는 약간 더 높은 친화도를 나타낸다.
복합 mAb의 억제 활성은 정제된 mAb를 정상 인간 혈장과 혼합하고 혈장 혼합물의 aPTT를 측정하여 평가하였다. 결과는 모든 복합 인간 항-FXI mAb가 aPTT를 필적할 만한 정도로 연장시켰음을 나타냈다(참조: 도 6b; 표 5).
이들 실험은, 모든 복합 인간 항-FXI 항체는 마우스 mAb보다 약간 높은 KD를갖는 복합 mAb VH2Vκ3 및 VH4Vκ1의 가능한 예외로 0.2nM의 KD를 갖는 원래 마우스 mAb 항-FXI 34.2 범위 내의 친화도를 가졌음을 나타냈다. aPTT에서 측정된 기능 적 활성에 대하여, 모든 복합 mAb는 또한 마우스 mAb 항-FXI 34.2의 억제 활성에 필적하는 억제 활성을 가졌다. 마지막으로, 모든 mAb는 NS0 세포에서 적절한 발현 수준을 가졌다. 복합 mAb VH4Vκ4는 최저 면역원성 잠재력을 갖는 것으로 예측되었으며, 이 Mab는 친화도, 기능적 활성 및 발현에 관하여 대부분의 다른 mAb에 필적할 만하기 때문에, 이 복합 mAb VH4Vκ4를 추가 분석을 위해 선택하였다. 특히,이 항체의 포맷은 생체내 사용에서와 마찬가지로 인간 IgG4이고, 이는 보체 또는 Fcγ-수용체와 상호 작용하는 것을 의도하지 않는다. 힌지 영역의 돌연변이(S241P)가 IgG4 중쇄에 도입되었는데, 이는 이 돌연변이가 쇄내 디설파이드 브릿지 형성 대신 IgG4 중쇄의 쇄간 디설파이드 브릿징을 선호하기 때문이다.
2.8 mAb VH4VK4의 면역원성 잠재력
mAb VH4Vκ4의 면역원성 잠재력은 20명의 건강한 공여자의 패널로부터의 PBMC와의 배양 및 시간 맞춰 세포의 증식을 측정하여 시험하였다. 이 시험에서, mAb VH4Vκ4는 50㎍/㎖의 최종 농도로 시험한다. 검정을 추가로 향상시키기 위해, T 세포 활성화에 대한 척도로서 4일간의 측정치를 5일 내지 8일째에 평가하였다. MAb VH4Vκ4는 6명의 공여자로부터의 세포 및 7일 배양 후 PBMC의 트리판 블루 염료 배제로 결정된 PBMC 생존력에 영향을 미치지 않았다(도 7a). 또한, 도 7b는 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2로 관찰된 증식 결과를 제공한다. 알 수 있는 바와 같이, 4명의 공여자로부터의 PBMC로 유의한 증식이 관찰되었고, 다른 공여자로부터의 PBMC로 경계선 증식이 관찰되었다.
일반적으로, mAb VH4Vκ4로 관찰된 자극 지수는 키메라 mAb 항-FXI 34.2로 관찰된 자극 지수보다 낮았으며, 단 한 번의 경우에만 2를 넘는 SI가 관찰되었다. 이러한 데이터는 키메라 mAb를 사용하는 경우보다 mAb VH4Vκ4와 함께 배양시 CD4 T 세포의 증식이 덜하다는 것을 나타낸다. 따라서, 이들 결과는 마우스-인간 키메라 mAb 항-FXI 34.2와 비교하여 낮은 면역원성 잠재력 mAb VH4Vκ4를 지지하였다.
2.9 mAb VH4Vκ4의 시험관내 시험
인간 혈장에 정제된 mAb VH4Vκ4의 첨가는 aPTT 시약에 의해 유도된 트롬빈 생성을 사실상 폐지하였지만(도 8a), TF에 의한 트롬빈 생성에 대한 영향은 혈장 내 트롬빈을 생성하는 데 사용된 TF의 투여량에 의존하였다(도 8b-d). 따라서, MAb VH4Vκ4는 이 실험에서 aPTT 시약에 의해 유도된 트롬빈 생성의 완전한 억제, 낮은 TF 농도에 의한 트롬빈 생성의 부분 억제 및 높은 TF 농도의 트롬빈 생성의 억제 부재인 FXI 억제제의 전형적인 거동을 나타냈다.
2.10 혈전증 마우스 모델에서 mAb VH4VK4의 생체내 시험
MAb VH4Vβ4는 섹션 2.5에서 기재된 바와 같이 혈전증 마우스 모델에서 생체내 시험하였다. FeCl3로 혈전증을 유도하기 전에 인간화 mAb VH4VK4를 투여하면 전체 관찰 동안 혈류 장애를 예방하여 MAB VH4VK4가 효과적으로 혈전증의 형성을 예방했음을 나타낸다(도 9).
SEQUENCE LISTING <110> PROTHIX BV <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE ACTIVE SITE OF FACTOR XI AND USES THEREOF <130> IPA181101-NL <150> NL2016477 <151> 2016-03-23 <160> 28 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Thr Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Met Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Phe Gln His Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Arg Tyr Trp Met His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Arg 1 5 10 15 Thr <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Heavy chain sense primer <400> 9 atggratgga gckgggtctt tmtctt 26 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Heavy chain antisense primer <400> 10 cagtggatag acagatgggg g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain sense primer <400> 11 atgggcwtca aagatggagt caca 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain antisense primer <400> 12 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized heavy chain variable domain Variant 1 <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Met Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized heavy chain variable domain Variant 2 <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Met Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized heavy chain variable domain Variant 3 <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Thr Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Met Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized heavy chain variable domain Variant 4 <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Thr Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Met Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized light chain variable domain Variant 1 <400> 17 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized light chain variable domain Variant 2 <400> 18 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized light chain variable domain Variant 3 <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 34.2 mAb humanized light chain variable domain Variant 4 <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 21 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized heavy chain variable domain variant 1 <400> 21 caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ctgaagaagc ctggagcttc agtgaagctc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agatactgga tgcactgggt gaagcaggcc 120 catggacaag ggcttgagtg gattggaaat atctatcctg atagtgatag tactaactac 180 gatgagaagt tcaggaccag agccaccctg accgcagaca catccacaag cacagcctac 240 atgcacctga gcagcctgac atctgaggac tctgccgtgt attactgtac aagaatgggt 300 ttctacgcta tggactactg gggccaaggg accagcgtca ccgtctcctc a 351 <210> 22 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized heavy chain variable domain variant 2 <400> 22 caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ctgaagaagc ctggagcttc agtgaagctc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agatactgga tgcactgggt gaagcaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggaaat atctatcctg atagtgatag tactaactac 180 gatgagaagt tcaggaccag agccaccctg accgcagaca catccacaag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagaatgggt 300 ttctacgcta tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351 <210> 23 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized heavy chain variable domain variant 3 <400> 23 caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ctgaagaagc ctggagcttc agtgaagctc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agatactgga tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggaaat atctatcctg atagtgatag tactaactac 180 gatgagaagt tcaggaccag agtcaccctg accgcagaca catccacaag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagaatgggt 300 ttctacgcta tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351 <210> 24 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized heavy chain variable domain variant 4 <400> 24 caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ctgaagaagc ctggagcttc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agatactgga tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggaaat atctatcctg atagtgatag tactaactac 180 gatgagaagt tcaggaccag agtcaccatc accgcagaca catccacaag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagaatgggt 300 ttctacgcta tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized light chain variable domain variant 1 <400> 25 aacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtga gaatgtggtg acttatgtat cctggtttca gcagaaacca 120 gggcaggctc ctaagctgct gatctacggt gcatccaatc ggtacactgg ggtcccagac 180 aggttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct 240 gaagatgtgg cagattatca ctgtggacag agttacagtt accctctcac tttcggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized light chain variable domain variant 2 <400> 26 aacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtga gaatgtggtg acttatgtat cctggtttca gcagaaacca 120 gggcaggctc ctaagctgct gatctacggt gcatccaatc ggtacactgg ggtcccagac 180 aggttcagcg gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct 240 gaagatgtgg cagattatca ctgtggacag agttacagtt accctctcac tttcggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 27 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized light chain variable domain variant 3 <400> 27 gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtga gaatgtggtg acttatgtat cctggtttca gcagaaacca 120 gggcaggctc ctaagctgct gatctacggt gcatccaatc ggtacactgg ggtcccagac 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct 240 gaagatgtgg cagattatca ctgtggacag agttacagtt accctctcac tttcggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nt sequence encoding humanized light chain variable domain variant 4 <400> 28 gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtga gaatgtggtg acttatgtat cctggtttca gcagaaacca 120 gggcaggctc ctaagctgct gatctacggt gcatccaatc ggtacactgg ggtcccagac 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct 240 gaagatgtgg caacttatca ctgtggacag agttacagtt accctctcac tttcggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321

Claims (26)

  1. 인자 XI의 경쇄(인자 XI)에 결합하고, L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린 상의 활성화 인자 XI(인자 XIa)의 발색 활성을 감소시키고, 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 1을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 2를 포함하는 항체와 인자 XI에 대한 결합에 대해 교차 경쟁하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 3의 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호 6의 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 하나의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 3의 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호 6의 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 마우스, 키메라 또는 인간화 항체인, 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', (Fab')2 및 나노바디(nanobody)로부터 선택된 항체 단편인, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 13 내지 16 중 적어도 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 17 내지 20 중 적어도 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인이 서열 번호 16의 아미노산을 포함하고, 상기 항체의 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 쇄간 디설파이드 브릿지 형성(inter-chain disulphide bridge formation)에 비해 중쇄의 쇄간 디설파이드 브리징을 선호하는 힌지 영역의 돌연변이를 포함하는, 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이가 S241P인, 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG4 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 FXIa의 경쇄에 결합하는, 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 항체 단편, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, i) FXI 활성화에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태; 및 ii) FXI의 억제가 유익한 효과를 갖는 질환, 장애 또는 상태 중 적어도 하나를 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태가 응고가 관련되는 질환, 장애 또는 상태인, 제14항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 질환이 혈전 색전증 질환 또는 FXI를 통한 응고 활성화를 수반하는 염증성 질환인, 제14항 또는 제15항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 용도가 병리학적 혈전증을 예방하거나 치료하기 위한 것이거나 의학적 절차로 인해 혈전증을 유발할 위험이 증가된 대상체에서 혈전증을 예방하는 데 있는, 제15항 또는 제16항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 용도가 심근 경색증, 허혈성 뇌졸중, 심방 세동으로 인한 심장-색전증, 혈관 접근 혈전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 관상 동맥 혈전증, 죽상동맥경화증, 관절염, 혈관염, 호흡 곤란 증후군, 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌 질환, 폐색전증, 수술 또는 고정화로부터 생성된 정맥 혈전 색전증, 합성 이식편, 스텐트 또는 AV-누관의 혈전증 및 폐색, 보철 심장 판막, 확산형 혈관내 응고(DIC), 혈액 투석, 심방 세동, 패혈증, 패혈성 쇼크, 장기 부전, 신부전, 치료 단백질의 생체내 투여에 의해 유도된 독성, 다발성 외상, 허혈-재관류 손상, 국부적인 바람직하지 않은 피브린 침착 및 성인 호흡 곤란 동안 폐 폐포에서의 피브린 침착으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 장애, 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하기 위한 것인, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체가 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하로 투여되는, 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편 또는 조성물이 볼루스 주입(bolus infusion)으로서 또는 2시간 미만 내지 24시간의 기간 동안 연속 주입으로서 정맥내 투여되는, 제19항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편 또는 조성물이 규칙적인 투석 중인 신장 환자의 합성 이식편, 스텐트 또는 AV-누관의 혈전증 (및 폐색)을 예방, 감소 또는 치료하는 데 사용하기 위한 것이고, 상기 항체, 항체 단편 또는 조성물이 환자에게 반환된 투석된 체액으로 환자에게 투여되는, 제18항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편 또는 조성물이 심방 세동, 불안정 협심증, 정맥 혈전 색전증, 보철 심장 판막, 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌 질환, 혈관 이식편, 확산형 혈관내 응고, 패혈증 환자, 또는 전립선 또는 정형 외과 수술을 받는 환자에서 혈전증을 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한 것이고, 상기 결합 분자가 2주에 1회 이하로 투여되는, 제18항에 따르는 용도를 위한, 항체 또는 항체 단편, 또는 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 중 적어도 하나를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 코딩 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에서 코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는, 핵산 분자.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따르는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2702365T3 (es) * 2008-06-19 2019-02-28 Prothix Bv Uso de anticuerpos antifactor XI para la prevención o el tratamiento de la formación de trombos
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
JP7139332B2 (ja) 2016-12-23 2022-09-20 ノバルティス アーゲー 第ｘｉ因子抗体および使用方法
US11958911B2 (en) 2017-02-10 2024-04-16 Shanghai Benemae Pharmaceutical Anti-coagulation factor XI antibody
CA3108708A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Shanghai Benemae Pharmaceutical Corporation Anti-factor xi antibodies
CN113474374A (zh) * 2019-04-16 2021-10-01 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗FXI/FXIa抗体及其用途
CN110423278B (zh) * 2019-08-08 2020-07-17 上海博槿生物科技有限公司 一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体及其制备方法和应用
CN117487016A (zh) * 2020-07-02 2024-02-02 北京拓界生物医药科技有限公司 抗FXI/FXIa抗体、其抗原结合片段及医药用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009154461A1 (en) * 2008-06-19 2009-12-23 Prothix Bv Use of anti-factors xi antibodies for prevention of thrombus formation
WO2010080623A2 (en) * 2008-12-18 2010-07-15 Oregon Health & Science University Anti-fxi antibodies and methods of use
WO2013167669A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibodies capable of binding to the coagulation factor xi and/or its activated form factor xia and uses thereof
WO2016207858A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Novartis Ag Factor xi antibodies and methods of use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
SI3002298T1 (sl) * 2007-11-21 2019-12-31 Oregon Health & Science University Monoklonska protitelesa proti faktorju XI in postopki njihove uporabe

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009154461A1 (en) * 2008-06-19 2009-12-23 Prothix Bv Use of anti-factors xi antibodies for prevention of thrombus formation
WO2010080623A2 (en) * 2008-12-18 2010-07-15 Oregon Health & Science University Anti-fxi antibodies and methods of use
WO2013167669A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibodies capable of binding to the coagulation factor xi and/or its activated form factor xia and uses thereof
WO2016207858A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Novartis Ag Factor xi antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATAFONOV A. et al, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 11: pp.2118-2127 (2013.)* *

Also Published As

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