KR19990077329A - 혈전증 치료에 유용한 항응고제 - Google Patents

혈전증 치료에 유용한 항응고제

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KR19990077329A
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레지나 에이치. 화이트
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Abstract

본 발명은 응고 인자에 대한 모노클로날 항체 및 혈전증 억제에서 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

혈전증 치료에 유용한 항응고제
정상 환경 하에서, 혈관을 감싸는 혈관 내피세포에 대한 손상은 그 정도에 상관없이 통상 응고 "케스케이드"로 언급되는 일련의 사건을 통한 지혈 반응을 촉발한다. 케스케이드는 최종적으로 가용성 피브리노겐을 불용성 피브린으로 전환시키는데, 이 피브린은 혈소판과 함께 혈액 성분의 누출을 억제하는 국지적 혈병 또는 혈전을 형성한다. 상처 치료 후에 혈병이 용해되고 혈관이 원상 회복될 수 있다.
손상 및 혈병 형성 사이에 발생하는 사건은 철저하게 조절되고, 일련의 반응과 연결된다. 요약하면, 불활성 전구효소 형태의 다수의 혈장 응고 단백질이 형성되고 보조인자가 혈액 내에서 순환한다. 활성 효소 복합체는 손상 부위에 회합한 후, 세린 프로테아제로 활성화되고, 각각의 연속적인 세린 프로테아제는 전구효소의 프로테아제로의 활성화를 촉매한다. 이 효소 케스케이드는 연속 단계의 효과를 증가시키는 각 단계를 발생시킨다. 응고 케스테이드의 개요는 문헌 [Thombosis and Hemorrhage, J. Loscalzo and A. Schafer, eds., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1994)]의 제1장 참조.
효율적인 응혈은 손상 부위에서의 혈액 손실을 제한하지만, 정맥 또는 동맥 내에서의 부적절한 혈전 형성은 장애 및 사망의 주요 원인이다. 비정상적 응혈 활성은 심근 경색증, 불안정한 앙기나, 심방 섬유성 연축, 뇌졸중, 신장 손상, 경피 경강적(transluminal) 관상동맥 혈관형성, 광범성 혈관내 응고, 패혈증, 폐 색전증 및 심부 정맥 혈전증과 같은 병변을 야기하고(하거나) 이들의 치료에 의해 발생한다. 인공 기관의 외부 표면, 션트(shunt) 및 인공 심장 밸브와 같은 보철 상의 혈병 형성도 문제가 된다.
현재 상기 병변 및 다른 혈전증 및 색전증 질환의 치료에 사용되는 인증된 항응고제는 황산염화 헤테로폴리사카라이드 헤파린 및 저분자량 (LMW) 헤파린을 포함한다. 이들 제제는 비경구적으로 투여되고, 트롬빈 억제제인 항트롬빈 III의 활성화 및 모든 응혈 인자의 불활성화에 의해 응혈의 신속하고 완전한 억제를 야기할 수 있다.
그러나, 그 효능에 의해 헤파린 및 LMW 헤파린은 결점을 갖고 있다. 단순한 활동 스트레스 및 이에 수반하는 물리적 사물과의 접촉의 결과로서 또는 수술 부위에서의 비조절된 출혈은 주요 합병증이고, 연속 주입 투여된 환자 1 내지 7%에서, 단속적 볼러스 투여된 환자 8 내지 14%에서 관찰된다. 이러한 위험을 최소화하기 위해서, 시료를 연속적으로 채취하여 체외 응혈 시간을 연속적으로 기록하여 치료 비용 및 환자의 불편을 최소화시킬 수 있다.
또한, 환자를 출혈 위험에 노출시키지 않으면서 목적 수준의 효율을 달성할 수 있는 치료 표적 범위는 좁다. 치료 범위는 약 1 내지 3 ㎍ 미만의 헤파린/ml (혈장)이고, 이것은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 분석 시간을 약 35 내지 약 100 초로 만든다. 헤파린 농도를 3 ㎍/ml로 증가시키면 표적 범위를 초과하고, 4 ㎍/ml 보다 높은 농도에서는 응혈 활성을 검출할 수 없다. 따라서, 환자의 혈장 농도를 치료 범위 내로 유지하기 위하여 지대한 주의가 필요하다.
다른 인증된, 그 효과가 보다 느리고 오래 지속되는 항응고제는 쿠마린 유도체인 와르파린이다. 와르파린은 프로트롬빈 및 다른 비타민 K 의존적 응혈 인자의 비타민 K 의존적 번역후 변형과 경쟁함으로써 작용한다.
치료 범위보다 단지 근소하게 높은 농도에서 혈액을 비응고성으로 만드는 항응고 작용의 일반적인 패턴은 헤파린 및 LMW 헤파린 뿐만 아니라 와르파리에서도 관찰되었다. 분명한 것은, 조절되지 않은 출혈 또는 그 가능성을 야기하지 않는, 혈전증 및 색전증 질환의 조절에 효과적인 항응고제에 대한 필요성이 존재한다는 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 한 특징은 자기제한 중화 활성을 갖는 항응고 인자 모노클로날 항체의 유효 투여량을 투여하는 것으로 이루어지는, 동물의 혈전증을 억제하는 방법이다.
본 발명의 다른 특징은 응고 인자에 대한 자기제한 중화 활성을 갖는 항응고 인자 모노클로날 항체이다.
본 발명의 다른 특징은 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732, 9E4(2)F4 또는 11G4(1)B9의 동정 특성을 갖는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 또다른 특징은 9E4(2)F4 또는 11G4(1)B9의 동정 특성을 갖는 하이브리도마 세포주이다.
본 발명의 또다른 특징은 본 발명의 모노클로날 항체의 Fc 영역의 결실에 의해 생성되는 중화성 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편이다.
본 발명의 또다른 특징은 본 발명의 모노클로날 항체의 Fd 중쇄가 무린 경쇄 필라멘트성 파지 Fab 디스플레이 라이브러리에서 발현되는 사슬 셔플링(shuffling)에 의해 생성되는 중화성 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편이다.
본 발명의 또다른 특징은 본 발명의 모노클로날 항체의 경쇄가 무린 중쇄 필라멘트성 파지 Fab 디스플레이 라이브러리에서 발현되는 사슬 셔플링에 의해 생성되는 중화성 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편이다.
본 발명의 또다른 특징은 서열 8, 9 및 10으로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역이다.
본 발명의 또다른 특징은 서열 12, 13 및 14로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역이다.
본 발명의 또다른 특징은 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역이 하나 이상의 선택된 항체로부터 유래하고 상기 각각의 사슬의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열이 응고 인자에 대한 자기제한 중화 활성을 갖는 항응고 인자 모노클로날 항체로부터 유래하는, 중쇄 및 경쇄로 이루어진 변형 항체이다.
본 발명의 또다른 특징은 혈전증이 억제되고 응고의 제한적 조절이 발생하고, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 하나 이상의 선택된 항체로부터 유래하고 상기 각각의 사슬의 가변 영역의 아미노산 서열이 응고 인자에 대한 자기제한 중화 활성을 갖는 항응고 인자 모노클로날 항체로부터 유래하는, 자기제한 방식으로 고유 또는 공통의 응고 경로의 응고 인자의 기능을 억제하는 특징을 갖는, 중쇄 및 경쇄로 이루어진 키메라 (chimera) 항체이다.
본 발명의 또다른 특징은 본 발명의 인간화 (humanized) 항체 또는 키메라 항체 및 제약상 허용되는 담체로 이루어진 제약 조성물이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 무린 항인자 IX mAb BC1 및 BC2를 사용한 정상 인간 혈장의 적정을 예시한 실험 결과의 그래프이다.
도 2는 무린 항인자 IX mAb 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9를 사용한 정상 인간 혈장의 적정을 예시한 실험 결과의 그래프이다.
도 3은 무린 항인자 IX mAb HFXHC 및 HFXLC 및 무린 항인자 XI mAb HFXI를 사용한 정상 인간 혈장의 적정을 예시한 실험 결과의 그래프이다.
도 4는 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 60분에서의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 대한 헤파린, 아세틸살리실산 및 무린 인자 IX mAb의 효과를 예시한 실험 결과의 히스토그램이다.
도 5는 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 60분에서의 프로트롬빈 시간에 대한 헤파린, 아세틸살리실산 및 무린 인자 IX mAb의 효과를 예시한 실험 결과의 히스토그램이다.
도 6은 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 경동맥 폐색에 대한 헤파린, 아세틸살리실산 및 무린 인자 IX mAb의 효과를 예시한 실험 결과의 히스토그램이다.
도 7은 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 혈전 중량에 대한 헤파린, 아세틸살리실산 및 무린 인자 IX mAb의 효과를 예시한 실험 결과의 히스토그램이다.
도 8은 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 60분에서의 aPTT에 대한 헤파린, 무린 인자 IX mAb BC2, 키메라 인자 IX mAb 및 인간화 인자 IX mAb의 효과를 예시한 실험 결과의 히스토그램이다.
도 9는 쥐 경동맥 혈전증 모델에서 혈전 중량에 대한 헤파린, 무린 인자 IX mAb BC2, 키메라 인자 IX mAb 및 인간화 인자 IX mAb의 효과를 예시한 실험 결과의 히스토그램이다.
본 발명은 인간 응고 인자 또는 보조인자에 결합하는 모노클로날 항체 (mAb) 및 혈전증의 자기제한 억제제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 자기제한 중화 활성이라는 특징을 갖는, 응고 인자에 대한 다양한 항체, 그의 변형 항체 및 단편을 제공한다. 바람직하게는, 응고 인자는 고유 또는 공통의 응고 경로에서 유래한다. 가장 바람직하게는, 항응고 인자 항체는 항인자 IX, 항인자 IXa, 항인자 X, 항인자 Xa, 항인자 XI, 항인자 XIa, 항인자 VIII, 항인자 VIIIa, 항인자 V, 항인자 Va, 항인자 VII, 항인자 VIIa 또는 항-트롬빈 항체이다. 특히 바람직한 것은 항인자 IX 항체이다. 항응고 인자 항체의 예는 인간 인자 IX에 대한 인간화 모노클로날 항체 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 및 SB 257732, 인간 인자 IX에 대한 키메라 모노클로날 항체 chαFIX, 인간 인자 IX 및(또는) 인자 IXa에 대한 무린 모노클로날 항체 BC1, BC2, 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9 또는 인간 인자 X 및 XI에 대한 무린 모노클로날 항체 HFXLC 및 HFXI이다. 특히 바람직한 것은 항-인간 인자 IX 모노클로날 항체 SB 249417이다.
본 발명의 항체는 신규한 자기제한 중화성 항체를 생성시키는 통상의 하이브리도마 기술, 파지 디스플레이 조합 라이브러리, 면역글로불린 사슬 셔플링 및 인간화 기술에 의해 제조될 수 있다. 또한, 자기제한 중화 활성을 갖는 인간 mAb도 포함된다. 이들 생성물은 심근경색, 불안정한 협심증, 심방 섬유성 연축, 뇌졸중, 신장 손상, 폐 색전증, 심부 정맥 혈전증, 경피 경강적 관상동맥 혈관형성, 광범성 혈관내 응고, 패혈증, 인공 기관, 션트 및 보조물에 관련된 혈전증 및 색전증 질환용 치료 및 제약 조성물에 유용하다.
본원에서 사용된 용어 "자기제한 중화 활성"은 바람직하게는 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa 및 V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈을 포함하여 고유 및 공통의 경로로부터 유래한 인간 응고 인자에 결합하여 응고의 제한된 완화가 생성되는 방식으로 혈전증을 억제하는 항체의 활성을 의미한다. "응고의 제한된 완화"는 모노클로날 항체의 농도 증가에도 불구하고 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)이 최대치에 도달하면서 혈장이 응고가능 상태를 유지하는, aPTT의 연장으로 측정되는 응혈 시간의 증가로서 정의된다. 이 응고의 제한된 완화는 헤파린 농도 증가의 존재시에 혈장이 비응고성이 되고 무한한 aPTT를 보이는 것과 대조적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법의 최대 aPTT 값은 헤파린 치료 범위 내에 존재한다. 가장 바람직하게는, 최대 aPTT는 정상 조절 aPTT값의 약 1.5배 내지 약 3.5배에 해당하는 약 35초 내지 약 100초의 범위 내에 존재한다. 본 발명의 한 실시형태에서, aPTT는 프로트롬빈 시간 (PT)이 그다지 연장되지 않은 채로 연장된다.
"변형 항체"는 선택된 숙주 세포에서 발현에 의해 수득될 수 있는 변형 면역글로불린 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질이다. 이러한 변형 항체는 공학적으로 처리된(engineered) 항체 (예를 들면 키메라 또는 인간화 항체) 또는 면역글로불린 불변 영역의 전부 또는 일부가 결여된 항체 단편, 예를 들면 Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2등이다.
"변형 면역글로불린 코딩 영역"은 본 발명의 변형 항체를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 변형 항체가 상보성 결정 영역(CDR) 이식 항체 또는 인간화 항체인 경우에, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 상보성 결정 영역을 코딩하는 서열이 인간 가변 프레임워크 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 파트너 내로 삽입된다. 임의로, 제1 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너에 조작 연결된다.
"제1 면역글로불린 파트너"는 천연 (또는 자연 생성) CDR 코딩 영역이 공여체 항체의 CDR 코딩 영역에 의해 대체된, 인간 프레임워크 또는 인간 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 인간 가변 영역은 면역글로불린 중쇄, 경쇄 (또는 중쇄 및 경쇄 모두), 그의 유사체 또는 기능성 단편일 수 있다. 항체(면역글로불린)의 가변 영역 내에 위치한 상기 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]에는 CDR 배치에 대한 규칙이 기재되어 있다. 또한, CDR 영역/구조의 동정에 유용한 컴퓨터 프로그램이 공지되어 있다.
"제2 면역글로불린 파트너"는 제1 면역글로불린 파트너가 인 프레임(in frame)으로 또는 임의의 통상의 링커 서열에 의해 (즉, 조작 연결됨) 융합되는, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 제2의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이 파트너는 면역글로불린 유전자가 바람직하다. 제2 면역글로불린 파트너는 동일한 항체 (즉, 상동성, 제1 및 제2 변형 항체가 동일한 공급원으로부터 유래) 또는 추가의 항체 (즉, 이종성)의 전체 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 (또는 단일 폴리펩티드의 일부로서의 중쇄 및 경쇄 모두)일 수 있다. 제2 면역글로불린 파트너는 특정 면역글로불린 클래스 또는 이소타입에 제한되지 않는다. 또한, 제2 면역글로불린 파트너는 Fab 또는 F(ab)2(즉, 적절한 인간 불변 영역 또는 프레임워크 영역의 불연속 부분)에서 발견되는 것과 같은 면역글로불린 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2 면역글로불린 파트너는 예를 들면 파지 디스플레이 라이브러리의 일부로서 숙주 세포의 외부 표면에 노출된 인테그랄 멤브레인 단백질을 코딩하는 서열 또는 분석 또는 진단 검출을 위한 단백질, 예를 들면 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제 등을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' 또는 F(ab')2는 이들의 표준 의미로서 사용된다. 예를 들면, 문헌 [Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조.
본원에서 사용된 "공학적으로 처리된 항체"는 선택된 수용체 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인의 일부가 선택된 에피토프에 대한 특이성을 갖는 1종 이상의 공여체 항체로부터 유래한 유사 부분에 의해 대체된 변형 항체 종류, 즉 전체 길이의 합성 항체 (예를 들면 항체 단편에 대립하는 것으로서 키메라 또는 인간화 항체)를 의미한다. 예를 들면, 상기 분자는 비변형 경쇄 (또는 키메라 경쇄)와 결합된 인간화 중쇄 또는 비변형 중쇄 (또는 키메라 중쇄)와 결합된 인간화 경쇄라는 특성을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 공학적으로 처리된 항체는 공여체의 항체 결합 특이성을 보유하기 위해서 수용체 항체 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열의 변형에 의해 특성화될 수 있다. 이들 항체는 수용체 항체로부터 유래한 1종 이상(바람직하게는 모두)의 CDR 대신에 치환된 본원에서 기술된 공여체 항체로부터 유래한 CDR을 포함할 수 있다.
"키메라 항체"는 수용체 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 결합한, 공여체 항체로부터 유래한 자연 생성 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)를 함유하는 공학적으로 처리된 항체 종류를 의미한다.
"인간화 항체"는 비인간 공여체 면역글로불린으로부터 유래한 CDR을 갖고, 분자의 나머지 면역글로불린 유래 부분은 1종 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래한 것인 공학적으로 처리된 항체 종류를 의미한다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10032 (1986), Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)] 참조.
용어 "공여체 항체"는 그 가변 영역, CDR 또는 그의 다른 기능성 단편 또는 유사체의 핵산 서열을 제1 면역글로불린 파트너에게 제공하여, 변형된 면역글로불린코딩 영역을 제공하고 공여체 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특성을 갖는 변형 항체를 발현시키는 모노클로날 항체 또는 재조합 항체를 의미한다. 본 발명에 사용하기 적합한 공여체 항체는 BC2로 명명된 무린 자기제한 중화성 모노클로날 항체이다. 다른 적합한 공여체 항체는 BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC 및 HFXI로 명명된 무린 자기제한 중화성 모노클로날 항체이다.
용어 "수용체 항체"는 제1 면역글로불린 파트너에 중쇄 및(또는) 경쇄 프레임워크 영역 및(또는) 중쇄 및(또는) 경쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 제공하는 공여체 항체에 이종성인 모노클로날 항체 또는 재조합 항체를 의미한다. 인간 항체는 수용체 항체인 것이 바람직하다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 예를 들면, 문헌[Kabat et al., Sequence of Protein of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institute of Health (1987)] 참조. 면역글로불린의 가변 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역이 존재한다. 따라서, "CDR"은 본원에서 적절한 경우, 3개 모두의 중쇄 CDR 또는 3개 모두의 경쇄 CDR, 또는 경쇄 및 중쇄 CDR 전부를 의미하는 것으로 사용된다.
CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 본 발명에서 목적하는 CDR은 공여체 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래하고, 이들이 유래하는 공여체 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 활성을 공유하거나 보유하는 자연 발생 CDR의 유사체를 포함한다.
"항원 결합 특이성 또는 중화 활성의 공유"는 예를 들면 mAb BC2가 특정 수준의 자기제한 중화 활성이라는 특징을 갖는다 할지라도 적절한 구조적 환경에서 BC2의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CDR은 더 낮거나 더 높은 활성을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 상기 환경에서 BC2의 CDR은 BC2와 동일한 에피토프(들)을 인식할 것으로 예상된다.
"기능성 단편"은 단편이 유래된 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 활성을 보유하는 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열 (예를 들면 면역글로불린 가변 영역의 아미노 또는 카르복시 말단 서열의 미소한 결실체)이다.
"유사체"는 아미노산 서열이 비변형 서열의 생물학적 특성, 예를 들면 항원 특이성 및 높은 친화도를 갖도록 하는, 몇 개의 아미노산 (즉, 10개 이하)의 화학적 치환 또는 재배열되어 1개 이상의 아미노산 서열이 변형된 아미노산 서열이다. 유사체의 예는 치환에 의해 CDR 코딩 영역 내에 또는 주위에 특정 엔도뉴클레아제 제한 부위를 생성시킬 수 있는 사일런트 돌연변이체를 포함할 수 있다.
또한, 유사체는 대립유전자 변이로서 발생할 수도 있다. "대립유전자 변이 또는 변형"은 본 발명의 아미노산 또는 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열의 변형이다. 이러한 변형 또는 변이는 유전자 코드의 동의성 (degeneracy)에 의한 것일 수 있고, 목적 특성을 제공하기 위해서 공학적으로 처리될 수도 있다. 이러한 변이 또는 변형은 임의의 코딩되는 아미노산 서열을 변형시킬 수도 있고 변형시키지 않을 수도 있다.
용어 "이펙터 물질(effector)"은 변형 항체 및(또는) 공여체 항체의 천연 또는 합성 경쇄 또는 중쇄 또는 공여체 항체의 다른 단편이 통상의 수단에 의해 결합될 수 있는 비단백질성 캐리어 분자를 의미한다. 이러한 비단백질성 캐리어는 진단 분야에 사용되는 통상의 캐리어, 예를 들면 BIAcore (Pharmacia) 시스템에 사용되는 폴리스티렌 또는 기타 플라스틱 비드, 폴리사카라이드, 또는 의료 분야에 유용하고 인간 및 동물에 안전하게 투여되는 다른 비단백질성 물질을 포함할 수 있다. 다른 이펙터 물질은 중금속 원자 또는 방사성 동위원소를 킬레이팅시키기 위한 마크로사이클을 포함할 수 있다. 이러한 이펙터 물질, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜은 또한 변형 항체의 반감기를 증가시키는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 항체, 변형 항체 및 단편 제조에 사용하기 위해서, 인간외 종, 예를 들면 소, 양, 원숭이, 닭, 설치류 (예를 들면 무린 및 쥐)를 사용하여 인간 응고 인자, 바람직하게는 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈 또는 이로부터 유래한 펩티드 에피토프로 처리하여 바람직한 면역글로불린을 생성시킬 수 있다. 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 각각의 응고 인자에 대한 비인간 mAb를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 이어서, 실시예에서 기술되는 96웰 플레이트에 코팅된 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈을 사용하여 또는 별법으로 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 결합된 비오티닐화 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈을 사용하여 상기 하이브리도마를 결합에 대하여 스크리닝한다. 별법으로, 당업계에 공지되고 본 발명에서 사용된 기술을 사용하여 인간 mAb를 충분히 생성시킬 수 있다.
일례로서, 본 발명의 자기제한 중화성 mAb는 키메라 또는 인간화 분자의 발생에 사용할 수 있는 무린 항체 mAb BC2이다. BC2 mAb는 응혈 시간에 대해 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는다. aPTT 분석에 의해 측정한 바, 응혈 시간에 대한 BC2 mAb의 효과는 약 100 초의 최대값을 보인다. 또한, BC2 mAb는 인자 IXa에 결합하고, 인자 IX의 인자 IXa로의 전환을 억제하고, 인자 IXa 활성을 억제한다. 이가 금속 보조 인자(cofactor)는 활성에 필요하고, mAb는 Mn+2보다는 Ca2+에 대하여 큰 선호도를 보인다. aPTT 분석에서 관찰된 IC50은 약 50 nM이다. BC2 mAb는 쥐에 대한 종 교차 반응성을 보이고, 이소타입 IgG2a이다.
다른 바람직한 공여체 항체는 무린 mAb, BC1, 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9이다. 이들 mAb는 응혈 시간에 대한 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는다. aPTT 분석에 의해 측정한 바, 이들 mAb의 효과는 9E4(2)F4에 대해서는 약 90 내지 100초, 11G4(1)B9에 대해서는 약 80초의 최대값을 보인다. 또한, BC1 mAb는 인자 IXa에 결합하고, 인자 IXa의 활성을 억제하지만 인자 IX의 인자 IXa로의 전환을 억제하지 않는다. 금속 보조 인자는 활성을 위해 필요하다. aPTT 분석에서 BC1에 대해 관찰된 IC50은 약 35 nM이다. BC1 mAb는 이소타입 IgG1이다.
응혈 시간에 대한 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는 또다른 바람직한 공여체 항체는 무린 mAb HFXLC이다. aPTT 분석에 의해 측정한 바, 응혈 시간에 대한 HFXLC mAb의 효과는 약 50 내지 60초의 최대값을 보인다. HFXLC mAb는 인자 X 경쇄에 결합하고, 인자 X/Xa의 활성을 억제한다. aPTT 분석에서 관찰된 IC50은 약 20 nM이다.
응혈 시간에 대한 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는 또다른 바람직한 공여체 항체는 무린 mAb HFXI이다. aPTT 분석에 의해 측정한 바, 응혈 시간에 대한 HFXLI mAb의 효과는 약 100초의 최대값을 보인다. HFXLI mAb는 인자 XI에 결합하고, 인자 XI/XIa의 활성을 억제한다. aPTT 분석에서 관찰된 IC50은 약 30 nM이다.
작용 메카니즘에 대하여 특정 이론에 지지되는 것을 의도하지 않지만, 이들 mAb는 단지 부분적인 억제가 달성되는 비경쟁적 또는 알로스테릭(allosteric) 메카니즘에 의해 응고를 조절하는 것으로 보인다.
본 발명은 BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI 또는 이들의 초가변 (즉, CDR) 서열의 사용에 제한되지 않는다. 자기제한 중화 활성이라는 특징을 갖는 임의의 다른 적절한 고친화도 항체 및 대응하는 CDR이 대신 사용될 수 있다. 다음 설명에서 공여체 항체를 BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI로서 나타낸 것은 단지 예시 및 설명의 단순화를 위한 것이다.
또한, 본 발명은 적절한 인간 응고 인자 또는 보조 인자에 대해 지향하는 mAb로부터 유래한 Fab 단편 또는 F(ab')2단편의 사용을 포함한다. 이들 단편은 응고 인자, 바람직하게는 인자 IX/IXa, X/Xa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈에 대하여 자기제한 중화 활성을 갖는 물질로서 유용하다. Fab 단편은 전체 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단부를 함유한다. F(ab')2단편은 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편에 의해 형성된 단편이다. mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC 및 HFXLI 및 다른 유사한 고친화도 항체는 통상의 방법, 예를 들면 적절한 단백질 분해 효소인 파파인 및(또는) 펩신을 사용한 mAb의 분해 또는 재조합 방법에 의해 수득할 수 있는 Fab 단편 및 F(ab')2단편의 공급원을 제공한다. 이들 Fab 및 F(ab')2단편은 그 자체로 치료제, 예방제 또는 진단제로서 유용하고, 가변 영역 및 CDR 서열을 포함하는 서열의 공여체로서 본원에서 기술한 재조합 또는 인간화 항체의 형성에 유용하다.
Fab 및 F(ab')2단편은 재조합 파지 라이브러리[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994) 참조] 또는 면역글로불린 사슬 셔플링 [Marks et al., Bio/Technology, 10779-783 (1992) 참조]에 의해 제조할 수 있다. 상기 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함되었고, 선택된 항체(예를 들면 BC2)로부터의 Fd 또는 VH면역글로불린은 경쇄 면역글로불린 VL(또는 VK)의 군과 결합하여 신규 Fab를 형성할 수 있다. 반대로, 선택된 항체로부터의 경쇄 면역글로불린은 중쇄 면역글로불린 VH(또는 Fd)의 군과 결합하여 신규 Fab를 형성할 수 있다. 자기제한 중화성 인자 IX Fab는 mAb BC2의 Fd를 경쇄 면역글로불린의 레파토리와 결합시켜 수득할 수 있다. 따라서, 사슬 셔플링 기술로부터 특유한 서열 (뉴클레오티드 및 아미노산)을 갖는 중화성 Fab를 수득할 수 있다.
상기 설명한 mAb BC2 또는 다른 항체는 공여체 항체의 항원 특이성에 의해 특성화되는 다양한 변형 항체의 고안 및 수득에 유용한, 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 서열, 프레임워크 서열, CDR 서열, 기능성 단편 및 그의 유사체, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열과 같은 서열을 제공할 수 있다.
또한, 가변 경쇄 및 중쇄 펩티드 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 서열 또는 그의 단편은 CDR 또는 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열 내에 특이적 변화의 돌연변이적 도입 및 생성되는 변형 또는 융합 핵산 서열의 발현을 위한 플라스미드 내로의 도입에 유용하다. 예를 들면, 프레임워크 및 CDR 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 내의 사일런트 치환을 사용하여 돌연변이된 CDR 및(또는) 프레임워크 영역의 삽입을 촉진하는 제한 효소 부위를 생성시킬 수 있다. 상기 CDR 코딩 영역은 본 발명의 인간화 항체의 제조에 사용될 수 있다.
BC2 중쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 서열 5 및 7에 나타내었다. 상기 서열로부터의 CDR 서열은 서열 8, 9 및 10에 나타내었다.
BC2 경쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 서열 6 및 11에 나타내었다. 상기 서열로부터의 CDR 서열은 서열 12, 13 및 14에 나타내었다.
유전자 코드의 동의성을 고려하여, 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 본 발명의 CDR 서열 뿐만 아니라 공여체 항체의 항원 특이성을 공유하는 그의 기능성 단편 및 유사체를 코딩하는 다양한 코딩 서열을 제조할 수 있다. 가변 사슬 펩티드 서열 또는 CDR을 코딩하는 본 발명의 단리된 핵산 서열 또는 그의 단편을 사용하여 변형 항체, 예를 들면 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체 또는 다른 공학적으로 처리된 항체를 생성시킬 수 있다.
본원에서 설명하는 변형 항체 및 항체들의 일부를 코딩하는 단리된 핵산 서열 외에, 천연 CDR 코딩 서열에 상보성인 서열 또는 CDR 코딩 영역 주위의 변형 인간 프레임워크 영역에 상보성인 서열과 같은 기타 핵산 서열도 본 발명에 포함된다는 것을 알아야 한다. 유용한 DNA 서열은 엄격한 혼성화 조건 하에서 상기 DNA 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다 (문헌 [T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pp. 387-389] 참조). 엄격한 혼성화 조건의 일례는 65℃에서 4XSSC에서 혼성화시킨 후 65℃에서 1시간 동안 0.1XSSC로 세척하는 것이다. 별법으로, 엄격한 혼성화 조건의 다른 예는 50% 포름아미드, 42℃에서의 4XSSC이다. 바람직하게는, 상기 혼성화 DNA 서열은 약 18개 이상의 뉴클레오티드의 길이, 즉 약 CDR의 크기이다.
변형 면역글로불린 분자는 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 공학적으로 처리된 항체를 포함하는 변형 항체를 코딩할 수 있다. 목적하는 변형 면역글로불린 코딩 영역은 인간 프레임워크 또는 인간 면역글로불린 가변 영역과 같은 제1 면역글로불린 파트너 내로 삽입되는, 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈 항체, 바람직하게는 본 발명에 의해 제공되는 것과 같은 고친화도 항체의 항원 특이성을 갖는 펩티드를 코딩하는 CDR 코딩 영역을 함유한다.
바람직하게는 제1 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너에게 조작 연결된다. 제2 면역글로불린 파트너는 상기 정의된 바와 같고, 목적하는 제2 항체 영역, 예를 들면 Fc 영역을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 제2 면역글로불린 파트너는 또한 경쇄 또는 중쇄 불변 영역이 인 프레임으로 또는 링커 서열을 통하여 융합되는 다른 면역글로불린을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다. 응고 인자의 기능성 단편 또는 유사체를 지향하는 공학적으로 처리된 항체는 동일한 항체와의 결합이 증강되도록 고안될 수 있다.
또한, 제2 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너가 통상의 수단에 의해 조작 연결될 수 있는, 비단백질성 캐리어 분자를 포함하여 상기 정의된 이펙터 물질과 결합할 수 있다.
제2 면역글로불린 파트너, 예를 들면 항체 서열과 이펙터 물질 사이의 융합 또는 결합은 임의의 적합한 수단, 예를 들면 통상의 공유결합 또는 이온결합, 단백질 융합 또는 이종-2기능성 교차 결합제, 예를 들면 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 통상의 화학 및 생화학 교재에 기재되어 있다.
또한, 단순히 제2 면역글로불린 파트너와 이펙터 물질 사이에 요구되는 양의 공간을 제공하는 통상의 링커 서열을 변형 면역글로불린 코딩 영역 내로 도입할 수 있다. 이러한 링커의 고안은 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
또한, 발현을 증강시키기 위한 본 발명의 분자에 대한 시그날 서열은 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
바람직한 변형 서열은 mAb BC2, 예를 들면 VH및 VL사슬의 항원 특이성을 갖는 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 또는 단백질 서열을 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형 항체는 무린 항체 분자 BC2의 중쇄 및(또는) 경쇄의 가변 영역의 CDR을 하나 이상, 바람직하게는 전부 함유하는 아미노산 서열이고, 나머지 서열은 인간 공급원에서 유래한 서열 또는 그의 기능성 단편 또는 유사체인 아미노산 서열에 의해 특성화된다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 변형 항체에는 추가의 물질이 부착될 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 사용하여 완전한 항체 분자의 Fc 단편 또는 CH2 CH3 도메인이 효소 또는 다른 검출가능한 분자 (즉, 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자)로 대체된 본 발명의 변형 항체를 생성시킬 수 있다.
또한, 제2 면역글로불린 파트너는 응고 인자, 바람직하게는 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈에 대한 항원 특이성을 갖는 CDR 함유 서열에 이종성인 비면역글로불린 펩티드, 단백질 또는 그의 단편에 조작 연결될 수 있다. 생성되는 단백질은 발현시에 비면역글로불린의 항원 특이성 및 특성을 모두 보일 수 있다. 융합 파트너 특성은 예를 들면 다른 결합 또는 수용체 도메인과 같은 기능적 특성 또는 융합 파트너 자체가 치료 단백질인 경우의 치료 특성, 또는 추가의 항원 특성일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 단백질은 충분한 길이의 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 그의 임의의 불연속 단편, 예를 들면 Fab 및 F(ab')2단편, 중쇄 다이머 또는 그의 임의의 최소 재조합 단편, 예를 들면 FV또는 단일쇄 항체 (SCA) 또는 선택된 공여체 mAb, 예를 들면 mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC 또는 HFXLI와 동일한 특이성을 갖는 임의의 기타 분자를 포함할 수 있다.
제2 면역글로불린 파트너가 공여체 항체와 상이한 항체, 예를 들면 면역글로불린 프레임워크 또는 불변 영역의 임의의 이소타입 또는 클래스에서 유래할 때는 항상 공학적으로 처리된 항체가 생성된다. 공학적으로 처리된 항체는 특정 공급원, 예를 들면 수용체 항체로부터의 면역글로불린(Ig) 불변 영역 및 가변 프레임워크 영역, 및 본원에서 기술된 공여체 항체, 예를 들면 항인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈 항체로부터의 1종 이상의 (바람직하게는 전부) CDR을 포함할 수 있다. 또한, 핵산 또는 아미노산 수준에서 수용체 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 또는 공여체 CDR 영역의 변형, 예를 들면 결실, 치환 또는 삽입은 공여체 항체 항원 결합 특이성을 보유하기 위해서 실시될 수 있다.
이러한 공학적으로 처리된 항체는 응고 인자 mAb (상기한 바와 같이 임의로 변형된)의 가변 중쇄 및(또는) 경쇄의 하나 (또는 두 개) 또는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 사용하여 고안된다. 본 발명의 공학처리된 항체는 자기제한 중화 활성을 보인다.
이러한 공학처리된 항체는 선택된 인간 면역글로불린 또는 서브형의 프레임워크 영역을 함유하는 인간화 항체 또는 응고 인자 항체 기능성 단편에 융합된 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 함유하는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 적합한 인간 (또는 다른 동물) 수용체 항체는 통상의 데이터 베이스, 예를 들면 KABAT(등록상표) 데이터 베이스, 로스 알라모스 (Los Alamos) 데이터 베이스 및 스위스 프로테인 (Swiss Protein) 데이터 베이스로부터 공여체 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과의 상동성에 의해 선택되는 것일 수 있다. 공여체 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성(아미노산 기준으로)이라는 특징을 갖는 인간 항체가 공여체 CDR의 삽입을 위한 중쇄 가변 프레임워크 영역의 제공에 적합할 수 있다. 경쇄 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체로부터 유래하지 않아도 된다는 것을 유의하여야 한다.
바람직하게는, 이종성 프레임워크 및 불변 영역은 인간 면역글로불린 클래스 및 이소타입, 예를 들면 IgG (서브형 1 내지 4), IgM, IgA 및 IgE로부터 선택된다. 그러나, 수용체 항체가 인간 면역글로불린 단백질 서열만으로 이루어질 필요는 없다. 예를 들면, 인간 면역글로불린 사슬의 일부를 코딩하는 DNA 서열이 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자와 같은 비면역글로불린 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열에 융합된 유전자를 제조할 수 있다.
특히 바람직한 인간화 항체는 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역 상에 삽입된 BC2의 CDR을 함유한다. 중화성 인간화 항체를 위해서, 인자 IX 항체 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 영역으로부터 유래한 1, 2, 바람직하게는 3개의 CDR이 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역 내에 삽입되어 인간 항체의 천연 CDR을 대체한다.
인간화 항체에서, 인간 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR 치환에 의해 공학적으로 처리되는 것이 바람직하다. 6개의 CDR 모두, 또는 6개 미만의 CDR의 다양한 조합을 사용할 수도 있다. 6개의 CDR이 전부 치환되는 것이 바람직하다. 경쇄로서 인간 수용체 항체로부터 유래한 비변형 경쇄를 사용하여 인간 중쇄의 CDR만을 치환시키는 것도 가능하다. 별법으로, 혼화성 경쇄는 통상의 항체 데이터 베이스를 통하여 다른 인간 항체로부터 선택될 수 있다. 공학적으로 처리된 항체의 나머지 부분은 임의의 적합한 수용체 인간 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
공학처리된 인간화 항체는 천연 인간 항체 또는 그의 단편의 구조를 갖고, 효과적인 치료, 예를 들면 인간의 혈전증 및 색전증 치료에 사용하기 위하여 필요한 특성의 조합을 보유하는 것이 바람직하다.
가장 바람직하게는, 인간화 항체는 서열 31, 52 또는 89에 나타낸 중쇄 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 44, 57, 62, 74, 78 또는 99에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 31의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 44의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249413이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 57의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249415이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 62의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249416이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 74의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249417이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 78의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 257731이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 89의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 99의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 257732이다.
당업계의 숙련가는 공학적으로 처리된 항체는 가변 도메인 아미노산의 변화에 의해 공여체 항체 (즉, 유사체)의 특이성 및 고친화도에 반드시 영향을 주지는 않으면서 추가로 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 중쇄 및 경쇄 아미노산은 가변 도메인 프레임워크 또는 CDR 중 어느 하나 또는 둘 모두에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있음이 예상된다. 이러한 치환은 공여체 항체 또는 특정 하위그룹으로부터의 콘센서스 (consensus) 서열에 의해 제공될 수 있다.
또한, 불변 영역은 본 발명의 분자의 선택적 특성, 예를 들면, 이량체화, Fc 수용체에 대한 결합, 또는 상보체에 결합하여 활성화시키는 능력을 증강시키거나 감소시키기 위해 변형될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Angal et al., Mol. Immunol, 30, 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269, 3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307434-B] 참조).
키메라 항체인 변형 항체는 경쇄 및 중쇄를 위한 인간 면역글로불린 불변 영역과 함께 프레임워크 영역을 포함하여 전체 비인간 공여체 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 제공함으로써 상기한 인간화 항체와 상이하다. 본 발명의 인간화 항체와 달리 추가의 비인간 서열을 보유하는 키메라 항체는 인간에서 상당한 면역 반응을 유도할 수 있을 것으로 예상된다.
상기 항체는 후술되는 혈전증 및 색전증 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
가변 경쇄 및 중쇄 서열 및 mAb BC2 또는 다른 적합한 공여체 mAb, 예를 들면 BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXLI의 CDR 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 하기 방법에 의한 본 발명의 변형 항체, 바람직하게는 인간화 항체의 제조에 유용하다. 또한, 동일하거나 유사한 기술을 사용하여 본 발명의 다른 실시형태를 제조할 수 있다.
선택된 공여체 mAb, 예를 들면 무린 항체 BC2를 생성하는 하이브리도마는 통상적으로 클로닝되고, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA는 당업계의 숙련가에게 공지된 기술, 예를 들면 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Sprin Harbor Laboratory (1989)]에 기재된 기술에 의해 수득할 수 있다. 적어도 CDR 코딩 영역을 함유하는 BC2의 가변 중쇄 및 경쇄 영역 및 공여체 mAb 결합 특이성을 보유하기 위해서 필요한 수용체 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 부분 뿐만 아니라 인간 면역글로불린으로부터 유래한 항체 사슬의 나머지 면역글로불린 유래 부분은 폴리뉴클레오티드 및 역전사효소를 사용하여 수득된다. CDR 코딩 영역은 공지의 데이터 베이스를 사용하여 다른 항체와 비교함으로써 확인된다.
다음으로, 생쥐/인간 키메라 항체를 제조하여 결합 능력을 분석할 수 있다. 이러한 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄를 위한 인간 Ig 불변 영역과 함께 전체 비인간 공여체 항체 VH및 VL영역을 함유한다.
인간 항체에서 유래한 중쇄 가변 영역의 상동성 프레임워크 영역은 컴퓨터 데이터 베이스, 예를 들면 KABAT(등록상표)을 사용하여 확인하고, BC2에 상동성을 갖는 인간 항체가 수용체 항체로서 선택된다. 인간 항체 프레임워크 내의 BC2 CDR 코딩 영역을 함유하는 합성 중쇄 가변 영역의 서열은 제한 부위를 도입하기 위해서 프레임워크 영역 내의 임의의 뉴클레오티드 치환을 사용하여 고안된다. 이어서, 이 고안된 서열은 장쇄의 합성 올리고머를 사용하여 합성된다. 별법으로, 고안된 서열은 올리고뉴클레오티드의 중첩에 의해서 합성되고, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 합성 오류에 대하여 보정될 수 있다. 적합한 경쇄 가변 프레임워크 영역은 유사한 방식으로 고안될 수 있다.
인간화 항체는 키메라 항체로부터 유래될 수 있거나, 바람직하게는 선택된 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 내에 중쇄 및 경쇄로부터 유래한 공여체 mAb CDR 코딩 영역을 적절하게 삽입하여 합성에 의해 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간화 항체는 표준 돌연변이 유발 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서, 생성되는 인간화 항체는 인간 프레임워크 영역 및 공여체 mAb CDR 코딩 영역을 함유한다. 이어서, 프레임워크 잔기를 조작 처리할 수 있다. 생성되는 인간화 항체는 재조합 숙주 세포, 예를 들면 COS, CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 인자 IX 특이적 또는 다른 응고 인자 특이적, 자기제한, 중화성, 고친화도, 비인간 항체에 대한 다른 인간화 항체는 상기 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
통상의 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 숙주 세포 내에서 복제 및 발현 및(또는) 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상의 조절 서열과 변형 항체를 위한 상기 코딩 서열을 조작 결합시켜 생성된다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예를 들면 CMV 프로모터, 및 다른 공지 항체로부터 유도될 수 있는 시그날 서열을 포함한다. 유사한 방식으로, 상보성 항체 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 제2 발현 벡터를 제조할 수 있다. 상기 제2 발현 벡터는 가능한 한 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현되는 것을 확실하게 하기 위해서 코딩 서열 및 선별가능 마커를 제외하고 제1 발현 벡터와 동일하다. 별법으로, 변형 항체의 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 1개의 벡터 상에 존재할 수도 있다.
선택된 숙주 세포는 제1 및 제2 벡터 모두로 통상적인 기술을 사용하여 동시 형질감염시킴으로써 (또는 단일 벡터로 간단히 형질감염시킴) 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 모두를 포함하는 본 발명의 형질감염 숙주 세포를 제조한다. 이어서 형질 감염 세포는 통상의 기술로 배양하여 본 발명의 공학적 공학적 조작 항체를 제조한다. 재조합 중쇄 및(또는) 경쇄 모두의 조합물을 포함하는 인간화 항체는 ELISA 또는 RIA와 같은 적당한 분석법으로 배양물로부터 스크리닝된다. 통상적인 유사한 기술을 사용하여 본 발명의 다른 변형 항체 및 분자를 작제할 수 있다.
본 발명의 방법 및 본 발명의 조성물의 작제법에 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에서의 적당한 벡터는 당 업계의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 애머샴 (Amersham) 또는 파마시아 (Pharmacia)와 같은 공급원으로부터 구매가능한, 예를 들어 pUC19와 같은 pUC 시리즈의 클로닝 벡터를 사용할 수 있다. 추가로 용이하게 복제할 수 있고 풍부한 클로닝 부위 및 선별가능한 유전자 (예를 들어 항생제 내성)를 가지며 쉽게 조작되는 임의의 벡터를 클로닝에 사용할 수 있다. 따라서 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 요소가 아니다.
유사하게 본 발명에 따른 공학적 조작 항체의 발현에 사용되는 벡터는 임의의 통상의 벡터로부터 당 업계의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 벡터는 또한 선택된 숙주 세포 내에서 이종 DNA 서열을 복제시키고 발현시키는 선택된 조절 서열 (예를 들어 CMV 프로모터)을 포함한다. 상기 벡터는 공학적 조작 항체 또는 변형 면역 글로불린 코딩 영역을 코딩하는 상기 DNA 서열을 포함한다. 또한 이 벡터들은 용이한 조작을 위하여 원하는 제한효소 부위를 삽입시킴으로써 변형시킨 선택된 면역글로불린 서열을 삽입시킬 수 있다.
발현 벡터는 또한 이종 DNA 서열, 예를 들어 포유류 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 (DHFR)의 발현을 증폭시키는 데 적당한 유전자로 특성화될 수 있다. 다른 바람직한 벡터 서열은 예를 들어 소 성장 호르몬 (BGH) 및 베타글로빈 프로모터 서열 (betaglopro)로부터의 폴리 A 신호 서열을 포함한다. 본 명세서에서 유용한 발현 벡터는 당 업계의 숙련자들에게 널리 알려진 기술로 합성시킬 수 있다.
상기와 같은 벡터의 성분, 예를 들어 레플리콘 (replicon), 선별 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호 서열 등은 선택된 숙주 내에서 재조합 DNA의 생성물을 발현시키고(시키거나) 분비시키는 데 사용하기 위하여 구매될 수 있거나 또는 천연 원료로부터 수득될 수 있거나 또는 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 당 업계에 공지된 다수의 유형의 포유류, 세균류, 곤충류, 효모류 및 진균류 발현을 위한 다른 적당한 발현 벡터를 상기 목적을 위하여 또한 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 공학적 조작 항체 또는 그의 변형된 면역글로불린 분자의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로 형질감염된 세포주를 포함한다. 상기 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포도 또한 종래의 것이다. 하지만, 가장 바람직하게는 E. coli의 다양한 균주로부터의 세포가 본 발명의 변형 항체의 작제에 있어서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용된다.
본 발명의 공학적 조작 항체 또는 변형 항체의 발현에 적당한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는 CHO, COS, 섬유아 세포 (예를 들어 3T3) 및 척수성 세포와 같은 포유류 세포이며, 더 바람직하게는 CHO 또는 척수성 세포이다. 인간 세포를 사용함으로써 인간 글리코실화 패턴으로 분자를 변형시킬 수 있다. 별법으로는 다른 진핵 세포주를 사용할 수 있다. 적당한 포유류 세포, 형질전환 방법, 배양 방법, 증폭 방법, 스크리닝 방법 및 생성물 생산 방법과 정제 방법의 선택은 당 업계에 공지되어 있다 (예를 들어 샘브룩 등의 상기 문헌 참조).
본 발명의 재조합 Fab의 발현을 위한 적당한 숙주 세포로서 세균류 세포가 유용한 것으로 판명될 수 있다 (예를 들어 플리크툰 (Pluckthun, A.)의 문헌 [Immunol. Rev., 130, 151-188 (1992)] 참조). 그러나 세균류 세포 내에서 발현되는 단백질은 비폴딩 형태 또는 부적당하게 폴딩된 형태 또는 비글리코실화 형태로 되는 경향이 있기 때문에 세균류 세포에서 생산되는 모든 재조합 Fab는 항원 결합능의 보유에 대하여 스크리닝되어야 한다. 세균류 세포에 의해 발현되는 분자가 정확히 폴딩된 형태로 생산된다면 상기 세균류 세포는 바람직한 숙주일 것이다. 예를 들어 발현에 사용되는 다양한 이. 콜라이 균주는 생물공학 분야에서 숙주 세포로 널리 알려져 있다. 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 다른 세균류 등의 다양한 균주도 또한 사용될 수 있다.
원한다면 당 업계의 숙련자에게 공지된 효모 세포주 및 곤충류 세포주, 예를 들어 초파리 및 인시류와 바이러스 발현 시스템도 또한 숙주 세포로서 유용하다 (예를 들어 밀러 (Miller) 등의 문헌 [Genetic Engineering, 8, 277-298 (1986), 플레눔 프레스 (Plenum Press)사] 및 본 명세서에 인용되어 있는 참조 문헌 참조).
본 발명의 벡터를 작제할 수 있는 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 제조하는 데 필요한 형질감염 방법, 및 상기와 같은 숙주 세포로부터의 본 발명의 변형 항체의 생산에 필요한 배양 방법 모두는 종래 기술이다. 또한 본 발명의 변형 항체는 일단 생산되면 황산 암모늄 침전법, 친화 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동법 등을 포함하는 당 업계의 표준 방법에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제시킬 수 있다. 상기와 같은 기술은 당 업계의 기술 내에 존재하며 본 발명을 한정하지 않는다.
그러나 인간화 항체의 다른 발현 방법에서는 미국 특허 제4,873,316호에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 (transgenic) 동물에서의 발현법을 사용할 수 있다. 상기의 방법은 포유류 내로 트랜스제닉하게 삽입될 경우 암컷이 그의 유액으로 원하는 재조합 단백질을 생산하게 하는 동물 카제인 프로모터를 사용하는 발현 시스템과 관련된 것이다.
원하는 방법으로 일단 발현되면 그 후 공학적 조작 항체를 적당한 분석법을 사용하여 시험관내 활성에 대하여 시험한다. 현재 통상적인 ELISA 분석 포맷을 사용하여 인자 IX 또는 다른 적당한 응고 인자에 대한 공학적 조작 항체의 결합을 정성적으로 그리고 정량적으로 평가한다. 또한 다른 시험관내 분석법을 사용하여 일반적인 클리어런스 (clearance) 기작에도 불구하고 체내에서 공학적 조작 항체가 존속하는 것을 평가하기 위하여 수행되는 이후의 인간 임상 연구 전에 중화 효능을 증명할 수 있다.
BC2로부터 제조된 인간화 항체에 대하여 기술된 방법에 따라 당 업계의 숙련자는 본 명세서에 기술되어 있는, 다른 공여체 항체로부터의 인간화 항체, 가변 영역 서열 및 CDR 펩티드를 또한 작제할 수 있다. 공학적 조작 항체는 공학적 조작 항체의 수용자에 의해 "자신"으로서 잠재적으로 인지되는 가변 영역 구조를 갖도록 생산될 수 있다. 가변 영역 구조에 대한 사소한 변형은 수용자에 있어서 면역성을 상당히 증가시키지 않고 항원 결합에서의 큰 증가를 달성하게 할 수 있다. 상기와 같은 공학적 조작 항체는 응고 인자 매개 질환에 있어서 인간을 효과적으로 치료할 수 있다. 상기와 같은 항체는 또한 상기와 같은 질환의 진단법에도 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 동물, 특히 인간에 있어서 자기제한 (self-limiting) 중화 활성을 갖는 항응고 인자 모노클로날 항체를 유효량 투여하는 것을 포함하는 혈전증의 억제 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 응고 인자는 고유 또는 공통의 응고 경로로부터의 것이다. 가장 바람직하게는 항응고 인자 모노클로날 항체는 항인자 IX, 항인자 IXa, 항인자 X, 항인자 Xa, 항인자 XI, 항인자 XIa, 항인자 VIII, 항인자 VIIIa, 항인자 V, 항인자 Va, 항인자 VII, 항인자 VIIa 또는 항트롬빈이다. mAb는 본 명세서에 기술되어 있는 하나 이상의 공학적 조작 항체 또는 변형 항체 또는 그의 단편들을 포함할 수 있다.
별법으로 아세틸살리실산을 항응고 인자 모노클로날 항체와 배합시켜 투여할 수 있다. 몇몇 경우 배합 요법에서는 항응고 인자 모노클로날 항체의 치료적 유효량이 감소된다.
본 발명의 분자를 사용함으로써 야기되는 치료적 응답은 각각의 응고 인자에 결합함으로써 그리고 그 후의 응고 캐스케이드의 자기제한 억제에 의해 생길 수 있다. 따라서 본 발명의 분자는 치료 용도에 적당한 제제 및 조성물의 형태인 경우 제한되는 것은 아니지만 심근경색증, 불안정한 앙기나, 심방 섬유성 연축, 뇌졸중, 신장 손상, 폐동맥색전증, 심부정맥혈전증, 및 인공 기관 및 보철 이식물과 관련된 비정상적인 응고 활성을 일으킬 수 있거나 또는 겪는 인간에게 매우 바람직하다.
본 발명의 변형 항체, 항체 및 그의 단편들도 또한 다른 항체, 특히 본 발명의 공학적 조작 항체에 대한, 질환과 관련있는 다른 표지물 (에피토프)에 반응성을 갖는 인간 mAb와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 치료약은 약 1일 내지 약 3주, 또는 필요한 동안의 비정상적인 응고 질환의 치료에 바람직한 것으로 여겨진다. 상기는 현재 사용되는 항응고제인 헤파린 및 와파린보다 상당히 진보적이다. 치료시의 투여량 및 지속 기간은 본 발명의 분자의 인간 순환에서의 상대적 지속 기간에 관련되며 치료될 질환 및 환자의 종합 건강에 따라 당 업계의 숙련자에 의해 조정될 수 있다.
본 발명의 치료약의 투여 방법은 약제를 숙주에 전달하는 임의의 적당한 경로일 수 있다. 본 발명의 변형 항체, 항체, 공학적 조작 항체, 및 그들의 단편들과, 제약 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내, 정맥내 또는 비강 내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 치료약은 제약적으로 허용가능한 담체 중 활성 성분으로서 본 발명의 공학적 조작 (예를 들어 인간화된) 항체를 유효량 함유하는 제약 조성물로서 제조될 수 있다. 별법으로 본 발명의 조성물은 아세틸살리실산을 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 예방약에 있어서 주사가 용이한 형태의 공학적 조작 항체를 함유하는, 바람직하게는 생리학적 pH로 완충된 수성 현탁액 또는 수용액이 바람직하다. 비경구 투여용 조성물은 일반적으로 제약적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 본 발명의 공학적 조작 항체 또는 그의 칵테일의 용액을 포함한다. 다양한 수성 담체에는 예를 들어 0.4%의 염수, 0.3%의 글리신 등이 사용될 수 있다. 상기 용액은 살균시킨 것이며 일반적으로 미립자 물질이 없다. 상기 용액들은 널리 알려진 통상의 살균 기술 (예를 들어 여과법)로 살균시킬 수 있다. 본 조성물은 pH 조정제 및 완충제 등과 같은 적당한 생리학적 조건에 요구되는 제약적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기와 같은 제약 조성물에서의 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만, 일반적으로 약 1 중량% 이상 내지 15 중량% 이하 또는 20 중량% 이하에서 변화시킬 수 있고 선택된 특정 투여 방법에 따라 유체 부피, 점도 등에 주로 기초하여 선택될 것이다.
따라서 근육내 주사용의 본 발명의 제약 조성물은 1 mL의 살균완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg 이상, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 공학적 조작 항체를 함유하도록 제조할 수 있다. 유사하게는 정맥내 주입용의 본 발명의 제약 조성물은 약 250 ml의 살균 링거 용액 (Ringer's solution), 및 약 1 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 공학적 조작 항체를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물의 실제적인 제조 방법은 당 업계의 숙련자에게 널리 알려져 있거나 또는 명백할 것이며 예를 들어 미국 펜실바니아주 이스톤 소재의 맥 퍼블리슁 캄파니 (Mack Publishing Company)사의 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15판]에 더 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 치료약은 제약 제제의 형태일 경우 단위 투여량 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 적당한 치료적 유효량은 당 업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 인간 또는 다른 동물에서의 혈전증 또는 색전증 병을 효과적으로 치료하기 위하여 kg 체중 당 단일 투여량이 대략 0.1 mg 내지 대략 20 mg인 본 발명의 단백질 또는 항체를 비경구적으로, 바람직하게는 정맥내 또는 근육내 투여하여야 한다. 상기 투여는 필요할 경우 혈전증 응답 동안 의사에 의해 적당하다고 선택된 적당한 시간 간격으로 반복될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 항체, 변형 항체 또는 그의 단편들은 저장을 위하여 동결건조시킬 수 있으며 사용 직전에 적당한 담체로 재구성시킬 수 있다. 상기 기술은 통상의 면역 글로불린에 유효한 것으로 나타났으며 당 업계에 공지된 동결건조 기술 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
본 발명을 이제 하기의 비제한적인 구체예를 참고로 하여 기술할 것이다.
<실시예 1>
항인자 IX 모노클로날 항체의 제조 및 스크리닝
제니 (Jenny, R.) 등의 문헌 [Prep. Biochem. 16, 227-245 (1986)]에 기술된 바와 같이 정제된 인간 인자 IX를 암컷 Balb/C 생쥐에 주사하였다. 일반적으로 각 생쥐에는 0.15 mL의 인산 완충 염수 (PBS)에 용해되고 0.15 mL의 완전한 프로인드 (Freund) 보조약과 혼합된 100 μg의 단백질을 초기에 주사하였다. 0.15 mL의 불완전한 프로인드 보조약을 함유하는 0.15 mL의 PBS 중 50 μg의 단백질을 사용하여 두 달 내지 석달에 걸쳐 대략 2주마다 추가항원자극 면역화를 수행하였다. 최종 항원자극 후 비장/골수종 세포 융합 3일 전에 PBS 중 50μg의 인자 IX를 생쥐에게 제공하였다. 비장 세포는 면역화 생쥐로부터 단리시켜 오이 (Oi, V.T.) 등의 문헌 [Selected Methods in Cellular Immunology, 미국 샌프란시스코 소재의 프리맨 프레스 (Freeman Press)사, 미쉘 (Mishell, B.B.) 및 쉬기이 (Shigii, S.M.) 편집]에 기술되어 있는 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 NS-1 골수종 세포와 융합시켰다 (쾰러 (Kohler, G.) 등의 문헌 [Eur. J. Immunol. 6, 292-295 (1976)] 참조). 융합 후 이 세포를 10%의 송아지 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰으며 0.5 mL의 복막 세척 세포 조절 배지를 포함하는 4개의 24웰 플레이트의 각 웰에 분액을 두었다. 다음날에 10%의 송아지 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중 2 x 10-4M의 히포크산틴, 8 x 10-7M의 아미노프테린 및 3.2 x 10-5M의 티미딘 1.0 mL을 각 웰에 제공하였다. 매 3일 내지 4일에 배지의 절반을 제거하고 1 x 10-4M의 히포크산틴 및 1.6 x 10-5M의 티미딘을 함유하는 신선 배지로 대체시킴으로써 세포를 배양하였다.
대략 2주 후에, 1.0 mL의 하이브리도마 배지를 각 웰로부터 제거하였고 제니 등의 문헌 [Meth. Enzymol. 222, 400-416 (1993)]에 기술된 바와 같이 ELISA 분석법을 사용하여 항인자 IX 항체에 대하여 시험하였다. 간단히 인자 IX를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 플라스틱 웰 상에 고정시켰다. 이어서 하이브리도마 상청액 또는 정제 항체의 희석물을 웰에서 인큐베이션시켰다. 이 웰을 세척시켰으며 항체-항원 복합체의 존재는 말 라디쉬 (radish) 페록시다제에 결합된 염소 항무린 면역글로불린 제2 항체 및 색원체성 기질인 o-디아니시딘을 사용하여 검출하였다.
항인자 IX 항체를 포함하는 웰은 희석을 제한시킴으로써 서브클로닝하였고 96웰 플레이트에서 배양되었다. 클로닝된 하이브리도마 세포 배양물로부터의 상청액은 상기에 기술되어 있는 ELISA 분석법을 사용하여 인자 IX에 대한 항체에 대하여 스크리닝하였고 양성 하이브리도마로부터의 세포를 확장시켰으며 냉동시켰고 액체 질소에 저장하였고 이어서 생쥐의 복수 종양으로 배양하였다.
<실시예 2>
응고 작용에서의 항응고 인자 항체의 자기제한 효과
항응고 인자 항체의 농도를 증가시킬 경우 인간 혈장의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간에 대한 효과를 박스터 (Baxter, 미국 뉴저지주 에디슨 소재의 박스터 사이언티픽 (Baxter Scientific)사) 참고 방법인 LIB0293-J (93년 3월에 개정)를 사용하여 피브로미터 (fibrometer, 미국 매릴랜드주 콕케이스빌 소재의 벡톤-디킨슨 마이크로바이올로지 시스템즈 (Becton-Dickinson Microbiology Systems)사)로 측정하였다.
실험 시작 전에 5 mL의 튜브 중 2 내지 3 mL의 0.02 M CaCl2를 섬유아세포 계량기의 가열 챔버 내에 두었다. 인간 혈장 시료는 신선하게 채취하여 얼음에서 유지되었거나 또는 헤모스타시스 레퍼런스 플라스마 (Hemostasis Reference Plasma, 미국 코넥티커트주 그리니치 소재의 아메리칸 다이아그노스틱스 (American Diagnostics)사)의 제조자의 권고에 따라 재구성시켰다.
돼지 장 점막 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 (Sigma Chemical)사)으로부터의 비분획 헤파린, 돼지 장 점막으로부터의 저분자량 헤파린 (로베녹스 (등록상표, Lovenox), 에녹사파린 나트륨, 미국 펜실베니아주 칼리지빌 소재의 롱-쁠랑 로어러 파마슈티칼스 (Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals)사) 또는 mAb 항응고제를 대략 50 μM 원액으로 제조하였으며 시험 혈장 내로 직접적으로 연속 희석시켰다. 항응고제가 없는 혈장을 함유하는 블랭크가 참고물로서 포함되었다.
2개의 파이브로튜브 (등록상표, fibroTube) 피브로미터 컵에 100 ㎕의 시험 혈장 또는 100 ㎕의 항응고제 함유 시험 혈장 및 125㎕의 액틴 활성화 세팔로플라스틴 시약 (박스터 사이언티픽사로부터 입수가능한 엘라그산 중의 토끼 뇌 세팔린으로부터의 액틴 시약)을 각각 충전시켰으며 피브로미터 웰에서 37℃에서 두었다.
1분 후에 100 ㎕의 액틴 시약을 혈장 함유 컵으로 옮겼으며 피펫으로 내용물을 여러번 혼합시켰다. 3분 동안의 인큐베이션 후 37℃에서 예열한 100 ㎕의 CaCl2를 자동화 피펫/타이머 제동 (벡톤-디킨슨사)을 사용하여 혈장-액틴 시약 혼합물에 첨가하였다. 응고 시간을 기록하였으며 도 1의 결과는 전체 분석 부피 300 ㎕에서 항응고제의 최종 농도의 함수로서 응고 시간을 나타낸다. 분석에서의 인자 IX의 명목상의 농도는 30 내지 40 nM이다.
도 1에 나타낸 결과에서 무린 항인자 IX mAB인 BC1 및 BC2의 농도를 증가시킬 경우의 aPPT 응고 시간에 대한 영향이 증명되었다. 상기 mAb 모두는 aPTT를 연장시킴으로써 응고를 억제하고 상기 mAb 모두는 aPTT에 대한 최종 포화 효과에 이른다. IC50치는 각각 BC1과 BC2에 대하여 약 35 nM 및 약 50 nM에서 유사하지만 두 가지 항체에 대한 최대 응답에서의 상이함이 현저하다. BC1의 포화 농도는 aPTT를 약 50%로 약 40초 증가시킨다. 반면 BC2는 aPTT를 3.5배로 약 90초 증가시킨다. 헤파린을 사용하는 항응고제 요법에서 사용되는 치료적 표적 영역에 흥미가 집중된다. 결과에서 두 mAb가 헤파린 치료 aPTT 범위를 포함한다는 것이 나타났다.
mAb인 BC1 및 BC2의 특성이 표 I에 요약되어 있다. 각각의 BC mAb들은 모두 지모겐인 인자 IX 및 활성 프로테아제인 인자 IXa 모두를 인지하지만 단지 BC2만이 지모겐 활성화 및 프로테아제 활성 모두를 차단시킬 수 있다. BC1 및 BC2는 시노몰로고우스 (Cynomologous) 원숭이 인자 IX와 교차 반응하는 것으로 밝혀졌다. 추가로 BC2는 또한 쥐 인자 IX와 교차 반응한다.
항인자 IX mAb들의 시험관내 특성의 요약
BC1 BC2
인자 IX와 결합 예 예
인자 IXa와 결합 예 예
IX에서 IXa로의 전환을 억제 아니오 예
Xase 복합체에서 IXa 활성을 억제 예 예
보조인자 요구 없슴 2가 금속 (Ca2+> Mn2+)
(aPTT최대치/aPTT정상치) x 100 (%) 150 350
IC50(nM) ∼ 35 ∼ 50
종 교차 반응성 원숭이 쥐, 원숭이
이소타입 IgG1 IgG2a
도 2에 나타낸 결과는 항인자 IX mAb인 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9의 농도를 증가시킬 경우 aPTT 응고 시간에 대한 영향을 증명한다. 분석용 혈장을 정상 농도의 절반으로 희석시키면 초기 aPTT는 45초였다. mAb들 모두는 aPTT를 연장시킴으로써 응고를 억제하고 mAb들 모두는 aPTT에 대한 최종 포화 효과에 이른다. 포화 농도의 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9는 9E4(2)F4의 경우 aPTT를 약 90 내지 100초 증가시키고 11G4(1)B9의 경우 약 80초까지 증가시킨다. 이 결과는 두 가지 mAb들이 헤파린 치료 aPTT 범위의 상위 말단에 존재함을 나타낸다.
도 3에 나타낸 결과는 항인자 X mAB인 HFXLC (경쇄 에피토프에 대한 것), HFXHC (중쇄 에피토프에 대한 것) 및 항인자 XI mAb인 HFXI의 농도를 증가시킬 경우 aPTT 응고 시간에 대한 영향을 나타낸다. 상기 mAb들은 엔자임 리서치 래버러토리즈 (Enzyme Research Laboratories, 미국 인디애나주 사우쓰 벤드 소재)사로부터 획득하였다. mAb들인 HFXLC 및 HFXI는 aPTT를 연장시킴으로써 응고를 억제하고 mAb들 모두는 aPTT에 대하여 최종 포화 효과에 이른다. HFXLC에 대한 IC50치는 약 40 nM이며 포화 농도는 aPTT를 약 60초 이하까지 증가시킨다. HFXI에 대한 IC50치는 약 20 nM이며 포화 농도는 aPTT를 약 100초 이하까지 증가시킨다. 이 결과는 HFXLC가 헤파린 치료 aPTT 범위 내인 반면 HFXI는 헤파린 치료 범위의 상위 말단에 존재함을 나타낸다. mAb인 HFXHC는 aPTT 응고 시간에 대하여 아무런 영향도 미치지 않았다.
aPTT의 자기제한 연장화는 또한 인자 IXa에 대한 공동 인자인 인자 VIII에 대한 항체에서 관찰되었다. 예를 들어 어피니티 바이올로지칼스, 인크. (Affinity Biologicals, Inc.)로부터 구매한 항인간 인자 VIII 항체인 SAF8C-IG는 aPTT를 최대 약 65초 이하로 증가시켰다. 약 100 nM의 항체로 aPTT의 최대 연장치의 절반의 연장치가 획득되었다.
<실시예 3>
쥐 혈전 모델에서의 무린 인자 IX mAb들의 효능
동맥 혈전증의 예방에 있어서 항인자 IX 항체의 효능을 평가하기 위하여 슈마허 (Schumacher) 등의 문헌 [J. Cardio. Pharm. 22, 526-533 (1993)]에 보고된 바와 같은 쥐 경동맥 혈전증 모델을 채용하였다. 상기 모델은 경동맥의 표면상에 도포된 FeCl3용액에 의해 생성된 산소 라디칼에 의한 경동맥 내피의 부분적 손상으로 구성된다.
간단하게는 쥐를 펜토바르비톤 나트륨으로 마취시켰으며 정맥내 주사를 위하여 경정맥에 캐뉼라를 삽입시켰고 좌측 대퇴부 동맥에 혈압 및 심박수 모니터링을 위하여 캐뉼라를 삽입시켰다. 목에서 외과 절개를 통하여 무균 기술을 사용하여 경동맥을 단리시켰으며 혈류량 측정을 위한 자성 유동 프로브를 설비하였다. 안정화 기간 후 기준선 매개 변수들을 하기 변수들에 대하여 확립하였다: 경동맥 혈류량, 동맥 압력, 심박수, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aTPP) 및 프로트롬빈 시간 (PT). 그 후 50%의 FeCl3용액에 침지시킨 예비측정 와트만 필터 페이퍼를 기저부 내피 세포의 완전한 손상을 위하여 15분 동안 경동맥 상에 두었다. FeCl3침지 페이퍼를 제거한 후 60분에 걸쳐 실험을 완료하였다. 실험의 마지막에 경동맥으로부터 경동맥 혈전을 추출하여 무게를 재었다.
모든 약제는 경동맥 손상의 개시 15분 전에 투여하였다. 하기의 처치를 시험하였으며 인자 IX mAb인 BC2와 비교하였다.
1. 헤파린: 각각 60분에 걸쳐, 15, 30, 60 또는 120 U/kg의 볼러스, 이어서 0.5, 1, 2 또는 4 U/kg/분으로 주입.
2. 아세틸살리실산 (ASA, 아스피린): 5 mg/kg의 볼러스.
3. 항인자 IX mAb인 BC2: 각각 60분에 걸쳐, 1, 3 또는 6 mg/kg의 볼러스, 이어서 0.3, 1, 또는 2 μg/kg/분으로 주입.
4. 헤파린: kg 당 5 mg으로 30 U/kg의 볼러스 + 1 U/kg/분 + ASA.
5. 항인자 IX mAb인 BC2: kg 당 5 mg으로 1 mg/kg + 0.3μg/kg/분 + ASA.
도 4 및 도 5에서는 aPTT (도 4) 및 PT (도 5)에 대한 헤파린, ASA 및 인자 IX mAb인 BC2의 영향을 나타냄으로써 항응고제/혈전증 섭생의 비교 약리학이 증명되었다.
출혈 소인인 aPTT에 대한 주요 인덱스를 효능 대 본 연구에서 사용되는 항응고제/혈전증 약의 출혈성의 평가에 대한 1차 기준으로 사용하였다. 도 4의 결과에서 두가지의 더 높은 투여량에서 시험 제한을 초과하는, 응고 시간의 최대 연장의 헤파린에 의한 aPTT의 투여량 의존적 연장이 증명되었다. ASA는 단독으로는 aPTT를 현저하게 증가시키지 않았지만 헤파린과 배합되면 현저한 상승 효과가 관찰되었다. 인자 IX mAb들은 aPTT에 대하여 적당한 효과를 가졌으며 심지어 가장 높은 투여량에서조차 응고 시간에서의 증가가 임상적으로 실행되는 표준 항응고제의 3배 제한을 초과하지 않았다. 가장 현저하게는 ASA와 배합시킨 인자 IX mAb인 BC2의 저투여량이 aPTT를 변화시키지 않았다.
도 5에서의 데이터는 PT도 또한 인자 IX mAb가 단독으로 또는 ASA와 배합되었을 경우는 아니지만, 두 가지 높은 투여량에서의 헤파린 및 ASA + 헤파린 배합물에 의해 현저하게 연장되었음을 나타낸다.
경동맥 폐색에 대한 헤파린, ASA 및 인자 IX mAb의 효과를 도 6에 나타낸다. 이 결과는 비히클 처리 동물 모두의 경동맥이 손상에 응답하여 폐색됨을 나타낸다. 헤파린 투여량에 의존적으로 경동맥의 폐색이 억제되었다. 가장 높은 투여량에서 헤파린은 경동맥의 폐색을 완전히 방지하였지만, 이 투여량에서 어떤 응고 작용도 시작될 수 없었다. ASA 단독으로는 경동맥 폐색에 대하여 단지 적은 영향만을 미쳤다. 헤파린과 배합된 ASA도 또한 경동맥 폐색을 완전히 방지하지는 못하였다. 인자 IX mAb는 두 가지 높은 투여량에서 경동맥 폐색을 차단하였는데 임상적으로 원하는 표적을 벗어나는 응고작용은 연장시키지 않았다. 단독으로는 효능을 크게 보증하지 않는, 더 낮은 투여량의 인자 IX mAb는 ASA와 배합시켜 투여할 경우 경동맥 폐색의 완전한 억제를 증명하였다.
혈전 중량에 대한 헤파린, ASA 및 인자 IX mAb의 영향을 도 7에 나타낸다. 헤파린은 경동맥에서 혈전 질량을 투여량에 의존적으로 감소시켰다. 그러나 응고를 완전히 차단시켰음에도 불구하고 약간의 나머지 혈전이 경동맥에서 여전히 발견되었다. ASA는 단독으로 또는 헤파린과 배합되어 (30 U/kg 섭생) 혈전 질량에 단지 부분적인 효과만을 미쳤다. 인자 IX mAb는 투여량에 의존적으로 혈전 질량을 감소시켰고 고투여량은 실질적으로 혈전 형성을 완전히 방지하였다. 또한 응고 인덱스에 나쁜 영향을 주지 않고 경동맥 폐색을 완전히 방지하는 저투여량의 항인자 IX mAb 및 ASA의 배합물은 혈전 형성을 완전히 방지하였다.
쥐 경동맥 혈전증 모델에서 행해진 연구에서 혈전 형성을 많이 하는 동맥 손상 모델에서 혈전증의 예방에 있어서의 인자 IX mAb의 효능이 명확하게 입증되었다. 가장 현저하게는 인자 IX mAb의 효능은 aPTT에 의해 정의된 원하는 치료적 항응고제 표적 내에서 입증되었다. 또한 현재의 표준 항응고제인 헤파린은 단지 응고가능한 혈액이 아닌 혈액을 생산하는 정도의 응고 작용과 겨우 타협하는 낮은 투여량에서 인자 IX mAb와 비견할 만한 효능에 이르렀다. 흥미롭게도 헤파린과 ASA를 함께 처리함으로써 획득되는 약효 증가 및 상승 작용이 관찰되는 것이 또한 ASA를 항인자 IX mAb와 함께 투여할 경우 증명되었다. 하지만 항혈전증 및 항응고제 효과 모두를 증가시키는 헤파린과 ASA와의 배합물과는 달리 인자 IX mAb와 ASA와의 배합물은 생체 외 혈액 응고 매개 변수에 대한 일관된 효과를 가지지 않고 항 혈전증 효능을 증가시켰다. 함께 고려해보면 이 데이터는 인자 IX mAb는 헤파린, ASA 또는 헤파린과 ASA와의 배합물과 비교하여 우수한 항혈전증능을 나타낸다.
<실시예 4>
쥐 혈전증 모델의 주사 전자 현미경 검사
쥐 경동맥의 단편들을 모의 (sham) 염화 제2철 단독 및 염화 제2철 + 6 mg/kg의 인자 IX 항체 (군 당 3)로부터 염화 제2철의 도포 15분 후에 수집하였다. 동맥을 포름알데히드로 관류시킴으로써 고정시켰고 손상 영역의 위와 아래를 라이게이션시켰다. 고정 동맥을 탈수시켰으며 헥사메틸디실라잔에서 인큐베이션시켰고 건조기에서 건조시켰다. 건조 동맥을 세로로 개봉시켰으며 금이 도포된 주사 전자 현미경 검사 (Scanning Electron Microscopy, SEM) 스투브 (stub) 및 스푸터 (sputter) 상에 두었다.
모의 동맥 SEM에서는 매우 드문 산발적인 혈소판을 포함하는 본질적으로 정상인 내피가 나타났다. 아마도 외과적 처치 동안의 기계적 손상의 결과로서 내피에 약간의 파괴가 있었고 기초를 이루는 최하부 막은 혈소판의 카펫으로 덮여 있었다. 모의 쥐에서는 혈전 형성의 증거가 전혀 관찰되지 않았다.
염화 제2철로 처리된 동맥의 SEM에서는 혈관의 루멘의 대부분을 차지하는 큰 벽재성의 혈전이 나타났다. 이 혈전은 응집 혈소판, 적혈구 및 무정형의 섬유 단백질성 물질로 구성되었다. 단백질성 물질은 피브린과 일관된 것이다. 동맥의 내피는 큰 혈전으로 대부분 덮여져 있었다. 육안으로 보이는 곳에서는 염화 제2철로 처리된 영역 위에 존재하는 내피가 다수의 점착성 혈소판 및 무정형의 단백질성 물질로 덮여 있었다.
염화 제2철로 처리되고 인자 IX 항체로 또한 처리된 쥐의 동맥의 SEM에서 혈전이 대부분 없는 혈관의 루멘이 나타났다. 염화 제2철로 처리된 영역 위에 존재하는 내피는 광범한 손상을 나타내었으며 몇몇 지역은 점착성 혈소판 및 혈소판 응집물에 의해 덮였지만 거의 또는 전혀 단백질성 물질이 없었다.
<실시예 5>
항인자 IX mAb인 BC2의 중쇄 및 경쇄 cDNA 서열의 분석
트리리에이젼트 (TriReagent, 미국 오하이오주 신시내티주 소재의 몰레큘러 리서치 센터, 인크. (Molecular Research Center, Inc.))를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 정제하였다. RNA는 이소프로판올로 침전시켰으며 0.5% SDS에 용해시켰고 0.5 M의 NaCl에 조정하였다. 폴리 A+ RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 디나비즈 (Dynabeads) 올리고 (dT)25(미국 뉴욕주 레이크 석세스 소재의 디날 에이.에스. (Dynal A.S.)사)를 사용하여 단리시켰다. 폴리 A+ RNA는 비드로부터 용출시켰고 TE 완충제에 재현탁시켰다. 100 ng의 RNA의 12개의 분액을 제조자의 지시에 따라 프라이밍을 위하여 dT 올리고를 사용하여 RT-PCR 키트 (뵈링거 만하임 카탈로그 번호 제1483-188)를 사용하여 역전사시켰다. 중쇄를 위하여 6가지의 RNA/DNA 하이브리드의 PCR 증폭을 무린 IgG2a 힌지 (hinge) 프라이머 (서열 번호 1) 및 중쇄 신호 서열 프라이머 (서열 번호 2)를 사용하여 25회의 사이클 동안 수행하였다. 유사하게는 경쇄에 있어서, 무린 카파 프라이머 (서열 번호 3) 및 퇴화 경쇄 신호 서열 프라이머 (서열 번호 4)를 사용하여 6가지의 RNA/DNA 하이브리드의 PCR 증폭을 25회의 사이클 동안 수행하였다. 각각의 12가지의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 PCR2000 벡터 (TA 클로닝 키트, 인비트로겐 (Invitrogen)사의 카탈로그 번호 제K2000-01)에 라이게이션시켰다. 재조합 클론의 콜로니를 임의로 골라 비른보임 (Birnboim) 및 돌리 (Doly)의 문헌 [Nucl. Acids Res. 7, 1513 (1979)]에 기술되어 있는 알칼리성 추출 방법을 사용하여 플라스미드 DNA의 소량제조물을 제조하였다. 단리시킨 플라스미드 DNA를 EcoRI으로 절단시켰고 0.8%의 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 적당한 크기, 즉 중쇄의 경우 약 700 bp, 경쇄의 경우 약 700 bp의 이중 가닥 cDNA 인서트를 생거 (Sanger) 방법의 변형법으로 서열분석하였다. 모든 열두가지의 중쇄 및 경쇄의 서열을 비교하여 BC2 중쇄 가변 영역 콘센서스 서열 (서열 번호 5) 및 BC2 경쇄 가변 영역 콘센서스 서열 (서열 번호 6)을 생성시켰다.
BC2 중쇄 가변 영역 cDNA의 서열 분석에서 121개의 아미노산 서열을 코딩하는 363개 뉴클레오티드의 개봉 판독 프레임 (open reading frame)이 나타났다 (서열 번호 7). 중쇄인 CDR1, 2 및 3의 서열을 서열 번호 8, 9 및 10에 각각 나타낸다.
BC2의 경쇄 가변 영역 cDNA의 서열 분석에서 107개의 아미노산 서열을 코딩하는 321개 뉴클레오티드의 개봉 판독 프레임이 나타났다 (서열 번호 11). 경쇄인 CDR1, 2 및 3의 서열을 각각 서열 번호 12, 13 및 14에 나타낸다.
<실시예 6>
인간화 항체
SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 및 SB 257732로 나타낸 6개의 인간화 항체는 인간 항체 프레임워크에서 상기에 기재된 무린 CDR를 포함하도록 고안하였다.
SB 249413
SB 249413은 중쇄 F9HZHC 1-0 및 경쇄 F9HZLC 1-0을 포함하였다. 합성 가변 영역 인간화 중쇄인 F9HZHC 1-0은 면역 글로불린인 RF-TS3'CL(카프라(Capra), J.D. 등의 문헌 [J. Clin. Invest. 86, 1320-1328(1990)], Kabpro:Hhc10w로서 Kabat 데이터 베이스에서 확인됨) 및 상기에 기재된 BC2 중쇄 CDR로부터 얻어지는 중쇄의 처음 세가지 프레임워크 영역을 사용하여 고안하였다. CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 어떠한 프레임워크 아미노산 치환도 만들어지지 않았다. 어닐링시키고 신장시킬 경우 중쇄 가변 영역을 나타내고 아미노산을 코딩하는 CDR3(서열 번호: 19 및 20)을 포함하는 4 개의 오버랩 합성 올리고뉴클레오티드를 제조하였다 (서열 번호: 15, 16, 17 및 18). 이어서 이 합성 유전자를 PCR 프라이머(서열 번호: 21 및 22)를 사용하여 증폭시켰고 pCR2000 벡터(TA 클로닝 키트, 인비트로겐, 카탈로그 번호 K2000-01)로 라이게이션시켰고 SpeI, KpnI 제한 효소 절단물로부터 단리시켰다. 가변 영역의 첫 번째 5개의 아미노산을 포함하는 캄파쓰 (campath) 신호 서열을 코딩하는 두 번째 DNA 단편(서열 번호: 23 및 24)는 두 프라이머 (서열 번호 26 및 27)을 사용하여 인간화 항레스퍼러토리 신시셜 바이러스(Anti-Respiratory Syncitial Virus) 중쇄 (서열 번호: 25)를 코딩하는 작제물의 적당한 영역을 PCR 증폭시키고 EcoRI 및 SpeI 제한효소로 절단시킬 수 있다. 생성되는 두 단편을 인간 콘센서스 프레임워크 4 및 IgG1 불변 영역을 포함하는 EcoRI, KpnI 절단 pFHZHC2-6pCD 포유류 세포 발현 벡터에 라이게이션시켰다. 벡터는 국제 특허 출원 공개 제WO 94/05690호에서 기재된 pFHZHC2-3pCD 벡터의 단일 아미노산 돌연 변이를 포함하였다. 프레임워크 2의 최종 잔기 (잔기 49)는 pFHZHC2-3pCD를 XBaI 및 EcoR5로 절단하고 2 개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 번호: 28 및 29)로부터 생성되는 링커를 삽입함으로써 Ser에서 Ala으로 돌연 변이시켰다. F9HZHC 1-0 인서트의 서열은 서열 번호 30 및 31에서 나타내었다.
합성 가변 영역 인간화 경쇄인 F9HZLC 1-0은 면역 글로불린 LS8'CL (카르맥(Carmack) 등의 문헌 [J. Exp. Med. 169, 1631-1643(1989)], Kabpro:Hk1318로서 Kabat 데이터 베이스에서 확인됨) 및 상기에 기재된 BC2 경쇄 CDR로부터 얻어지는 인간 경쇄의 프레임워크 영역을 사용하여 고안하였다. CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 어떠한 프레임워크 아미노산 치환도 만들어지지 않았다. 어닐링 및 신장시킬 경우 경쇄 가변 영역을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2 개의 오버랩되는 합성 올리고뉴클레오티드가 생성되었다 (서열 번호: 32 및 33). 이어서 이 합성 유전자는 PCR 프라이머 (서열 번호: 36 및 37)를 사용하여 증폭시켰고 pCR2000 벡터 (TA 클로닝 키트, 인비트로겐, Cat No. K2000-01)로 라이게이션시켰고 ScaI, SacII 제한 효소 절단물로부터 단리시켰다. 가변 영역의 첫 번째 두 개의 아미노산을 포함하는 캄파쓰 신호 서열을 코딩하는 제2 DNA 단편 (서열 번호 38 및 39)는 두 개의 프라이머 (서열 번호 26 및 40)을 사용하여 인간화 항레스퍼러토리 신시셜 바이러스 중쇄를 코딩하는 작제물 (서열 번호 25)의 적당한 영역을 PCR 증폭시키고 제한 효소 EcoRI 및 ScaI으로 절단시킴으로써 제조하였다. 생성된 두 개의 단편은 인간 프레임워크 4 및 카파 불변 영역의 나머지를 포함하는 EcoRI, SacII 절단 pFHzLC1-2pCN 포유류 세포 발현 벡터에 라이게이션시켰다. 이 벡터는 국제 특허 출원 공개 제WO94/05690호에 기술되어 있는 pFHZLC1-1pCN 벡터의 단일 아미노산 돌연변이를 포함하였다. 프레임워크 2 잔기는 SmaI 및 Kpn1으로 pFHZLC1-pCN을 절단시키고 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 번호 41 및 42)로부터 생성된 링커를 삽입시킴으로써 Ser에서 Pro로 돌연변이시켰다. F9HZLC 1-0 인서트의 서열은 서열 번호: 43 및 44에서 나타내었다.
SB 249415
SB 249415는 중쇄 F9HZHC 1-1 및 경쇄 F9HZLC 1-1을 포함한다. 이러한 중쇄 및 경쇄 작제물은 개별적으로 F9HZHC 1-0 및 F9HZLC 1-0에 기초하고 있지만, 이들은 CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 프레임워크 아미노산 치환을 가진다.
F9HZHC 1-1은 CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 3 개의 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다. 어닐링시키고 신장시킬 경우 변형된 중쇄 가변 영역의 변형된 일부 (서열 번호 47 및 48)를 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 오버랩 합성 올리고뉴클레오티드를 제조하였다 (서열 번호: 45 및 46). 이어서 이 합성 유전자를 PCR 프라이머(서열 번호: 49 및 50)를 사용하여 증폭시켰고 pCR2000 벡터 (TA 클로닝 키트, 인비트로겐, 카탈로그 번호 K2000-01)로 라이게이션시켰고 EcoNI, KpnI 제한 효소 절단물로부터 단리시켰다. 이 단편을 EcoNI, KpnI 절단 F9HZHC1-0 (서열 번호 30) 벡터 내로 라이게이션시켰다. F9HZHC1-1 인서트의 서열을 서열 번호 51 및 52에 나타내었다.
F9HZHC1-1은 CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 4개의 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다. 어닐링시킬 경우 KpnI 및 BamHI 부착 말단을 가지며 경쇄 가변 영역의 변형된 부분 (서열 번호 55)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 제조하였다 (서열 번호 53 및 54). F9HZLC 1-0 (서열 번호 43)은 제한 효소 KpnI 및 BamHI으로 절단시켜 합성 DNA에 라이게이션시켰다. F9HZLC 1-1 인서트의 서열을 서열 번호 56 및 57에 나타내었다.
SB 249416
SB 249416은 중쇄 F9HZHC 1-1(상기에 기재됨)(서열 번호: 52) 및 경쇄 F9HZLC 1-2를 포함하였다. 경쇄 작제물은 F9HZLC 1-1을 기초로 하였지만, 추가로 CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 하나의 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다.
어닐링시킬 경우 BamHI 및 XbaI 부착 말단을 가지고 경쇄 가변 영역 (서열 번호 60)의 변형 부분을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 생성시켰다 (서열 번호 58 및 59). F9HZLC1-1(서열 번호: 56) 벡터를 제한 효소 BamHI 및 XbaI로 절단하였고 합성 DNA에 라이게이션시켰다. F9HZLC 1-2 인서트의 서열은 서열 번호: 61 및 62에서 나타내었다.
SB 249417
SB 249417은 중쇄 F9HZHC 1-1(상기에 기재됨)(서열 번호: 52) 및 경쇄 F9HZLC 2-0을 포함하였다. F9HZLC 2-0 합성 가변 영역 인간화 경쇄는 면역 글로불린 REI (팜 (Palm) 및 힐쉬만 (Hilschmann), Z. Physiol. Chem. 354, 1651-1654 (1973) Kabpro: HKL111로서 Kabat 데이터 베이스에서 확인됨) 및 상기에 기재된 BC2 경쇄 CDR로부터 얻어지는 인간 경쇄의 프레임워크 영역을 사용하여 고안하였다. 5개의 아미노산 콘센서스 인간 치환을 도입하였다. CDR 제시에 영향을 줄 수 있는 6개의 프레임워크 아미노산 돌연 변이 치환을 만들었다. 어닐링 및 신장시킬 경우 경쇄 가변 영역 (서열 번호 65 및 66)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 오버랩되는 합성 올리고뉴클레오티드를 생성시켰다 (서열 번호 63 및 64). 이어서 이 합성 유전자는 PCR 프라이머 (서열 번호: 67 및 68)를 사용하여 증폭시켰고 pCR2000 벡터 (TA 클로닝 키트, Invitrogen, Cat No. K2000-01)로 라이게이션시켰고 ScaI, SacII 제한효소 절단물로부터 단리시켰다. 가변 영역의 첫 번째 2개의 아미노산을 포함하는 캄파쓰 신호 서열을 코딩하는 제2 DNA 단편은 두 개의 프라이머 (서열 번호 26 및 69)를 사용하여 인간화 항레스퍼러토리 신시셜 바이러스 중쇄를 코딩하는 작제물 (서열 번호 25)의 적당한 영역을 PCR 증폭시킴으로써 제조하였다. 인간 프레임워크 4의 나머지를 코딩하고 SacII 및 NarI 부착 말단을 갖는 제3 DNA 단편 (서열 번호 70)는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 번호 71 및 72)를 어닐링시킴으로써 제조하였다. F9HZLC 1-0(서열 번호: 43)을 제한 효소 EcoRI 및 NarI로 절단시켰고 3개의 DNA 단편에 라이게이션시켰다. F9HZLC 2-0 인서트의 서열은 서열 번호: 73 및 74에서 나타내었다.
SB 257731
SB 257731은 중쇄 F9HZHC 1-1 (서열 번호 52), 및 F9HZLC 1-2 (서열 번호 62)의 단일 아미노산 돌연변이된 경쇄 F9HZLC 1-3을 포함한다. F9HZLC 1-2는 2개의 프라이머 (서열 번호 26 및 69)로 PCR 증폭시키고 제한효소 EcoRI 및 ScaI로 절단하였다. 94 bp 단편 (서열번호 75 및 76)을 단리하였다. 단편을 EcoRI 및 ScaI으로 절단된 F9HZLC 1-2 백터에 라이게이션시켜 경쇄 작제물 F9HZLC 1-3을 제조하였다. F9HZLC 1-3 인서트의 서열을 서열 번호 77 및 78에 나타냈다.
SB 257732
SB 257732는 합성 가변 영역 인간화 중쇄 F9HZHC 3-0 및 경쇄 F9HZLC 3-0을 포함한다. 어닐링시키고 신장시킬 경우 변형시킨 중쇄 가변 영역 (서열 번호 83 및 84)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 4개의 오버랩되는 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 번호 79, 80, 81 및 82)를 제조하였다. 이어서 이 합성 유전자를 PCR 프라이머 (서열 번호 85 및 86)를 사용하여 증폭시키고 pCR2000 벡터 {티에이 클로닝 키트 (TA cloning Kit), Invitrogen, Cat. No. K2000-01 제품}에 라이게이션시키고 StuI, KpnI 제한 효소 절단물로부터 단리하였다. 단리된 단편을 StuI, KpnI으로 절단된 F9HZHC 1-1 (서열 번호 52) 벡터에 라이게이션시켰다. 이어서 이 벡터를 EcoRI, SpeI으로 절단하여 신호 서열을 제거시켰다. 2개의 프라이머 (서열 번호 26 및 87)로 F9HZHC1-0을 PCR 증폭시키고 제한효소 EcoRI 및 SpeI으로 절단시킴으로써 가변 영역의 처음 5개 아미노산을 포함하는 캄파쓰 신호 서열을 코딩하는 DNA 단편 (서열 번호 23)를 제조하였다. 생성된 단편을 벡터에 라이게이션시켰다. F9HZHC3-0 인서트를 서열 번호 88 및 89에 나타냈다.
어닐링시키고 신장시킬 경우 경쇄 가변 영역 (서열 번호 94 및 95)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 4개의 오버랩되는 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 번호 90, 91, 92 및 93)를 제조하였다. 이어서 PCR 프라이머 (서열 번호 96 및 97)를 사용하여 이 합성 유전자를 증폭시키고 pCR2000 벡터 (티에이 클로닝 키트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01 제품)에 라이게이션시키고 ScaI, NarI 제한 효소 절단물로부터 단리하였다. 단리된 단편을 ScaI, NarI으로 절단된 F9HZLC1-3 (서열 번호 77) 벡터로 라이게이션시켰다. F9HZLC3-0 인서트의 염기 서열을 서열 번호 98 및 99에 나타냈다.
인간화 항인자 Ⅸ mAb들을 CHO 세포에서 발현시켰다. 무혈청 배지에서 현탁 배양을 위해 순응된 DG-44 세포주를 37℃에서, 5% CO2, 95% 공기 가습된 배양기에서, 150 rpm으로 인노바 (Innova) 2100 플랫폼 진탕기 (New Brunswick Scientific 제품) 상의 250 ㎖ 1회용 살균 얼렌메이어 (erlenmeyer) 플라스크에서 1X 뉴클레오시드 및 0.05% F68을 포함하는 단백질 무함유 배지 100㎖에서 배양시켰다. 이 세포들을 매주 2회씩 4 X 105세포/㎖로 계대배양시켰다. pCN-Lc-경쇄 벡터 및 pCD-Hc-중쇄 벡터 각각의 15 ㎍을 NotI으로 절단시켜 선형화시키고, 살균 조건하에서 동시 침전시키고 1X TE 완충제 (10mM 트리스 (Tris), 1mM EDTA, pH 7.5) 50 ㎕에 재현탁시켰다. 헨슬레이 등 (Hensley et al.)의 문헌 [J. Biol. Chem. 269, 23949-23958 (1994)]의 기술을 이용하여 DNA를 바이오-래드 진 펄서 (Bio-Rad Gene Pulser) (Bio-Rad Laboratories 제품)를 이용하여 Acc-098 세포에 일렉트로포레이션시켰다. 1.2 X 107개 세포를 빙냉 PB수크로스 (PBS, 272 mM 수크로스, 7 mM 인산나트륨 pH 7.4, 1 mM MgCl2) 12.5㎖에서 1회 세척하고 PBS 0.8 ㎖에 재현탁시키고 DNA 용액 50 ㎕에 첨가하고 얼음에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 380 V 및 25 마이크로 패러드로 세포에 펄스를 가한 후 이어서 얼음에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 선별하기 전에 보존 배지에서 24 시간 동안 5 X 105세포/플레이트로 96웰 배양 플레이트에 플레이팅시켰다. 보존 배지에서 400 ㎍/㎖의 G418 {제네티신 (Genetician), Life Technologies, Inc.}에 대해 내성을 갖는 세포를 선별하였다. 분석 24 시간 전에, 세포에 보존 배지 150 ㎕를 공급하였다.
오리젠 (Origen) 분석기 (IGEN, Inc.)에서 전기화학적발광 (ECL) 검출 방법을 이용하여 개별 콜로니로부터의 조정 배지를 분석하였다 (양 (Yang) 등의 문헌 [ Biotechnology 12, 193-194 (1994)] 참조).
분석을 수행하는데 필요한 모든 용액 (분석 완충제) 및 분석기 (세포 세정기)를 작동시키는데 필요한 모든 용액을 IGEN으로부터 얻었다. 모두 IGEN의 추천 방법에 따라, 항체 {항인간 IgG (g쇄 특이적)) (Sigma Chemicals 제품), 및 인간 IgG (H+L)에 대한 F(ab')2단편 (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. 제품)}를 TAG:단백질 7:1의 몰비로 TAG-NHS-에스테르 (IGEN, INC. 제품)로 표지시킨 반면, 단백질 A (Sigma 제품)를 바이오틴:단백질 20:1의 몰비로 바이오틴-LC-술포-NHS-에스테르 (IGEN, INC. 제품)로 표지시켰다. 스트렙타비딘으로 코팅된 자성 비드 (M-280)를 Dynal로부터 얻었다.
다음 프로토콜을 이용하여 면역분석을 수행하였다. 샘플 당, 스트렙타비딘-코팅된 비드 (1.25% 트윈 (Tween)을 함유하는 pH 7.8의 PBS에서 최종 농도 600 ㎍/㎖으로 희석) 50 ㎕를 바이오틴-단백질 A (1.25% 트윈 (Tween)을 함유하는 pH 7.8의 PBS에서 최종 농도 1 ㎍/㎖로 희석) 50 ㎕와 혼합하고 교반시키면서 실온에서 15분 동안 인큐베이션시키고, TAG 항체 {최종 농도 1.25 ㎍/㎖의 인간 IgG (H+L)에 대한 F(ab')2단편, 및 최종 농도 0.25 ㎍/㎖의 1.25% 트윈 (Tewwn)을 함유하는 pH 7.8의 PBS에서 희석된 안티-인간 IgG (g쇄 특이적)의 혼합물}을 첨가한 후 이어서 조정 배지 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 분석 완충제 200 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고 ECL을 측정하기 위해 오리젠 I 상에서 시료를 분석하였다. 분석 결과 분석된 콜로니의 약 20-37%는 평균 발현량이 약 150 mg/ml인, 150 ng/㎖을 초과하여 분비한다는 것이 나타났다.
인간화 항인자 Ⅸ mAb들을 프로셉 (Procep) A 포획 단계를 이용하는 조정 배지로부터 정제한 후 이온 교환 크로마토그래피하여 DNA의 부하량을 감소시켰다. 직경:높이가 1:1 비율인 컬럼을 제조하기 위해 프로셉 A 흡착 물질 (영국 더럼 소재, Bioprocessing Ltd.,)을 사용하였다. 세정된 조정 배지를 약 150 cm/시간으로 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 인산염 완충 염수 (PBS), 1 M NaCl을 포함하는 PBS, 마지막으로 PBS로 연속적으로 세척하였다. 결합된 물질을 0.1 M 아세트산 용출로 회수하였다. 용출물을 pH 5.5로 조절하고 물로 희석 (1:4)하였다. 희석된 용액을 80 cm/시간으로, pH 5.5의 20 mM 아세트산나트륨으로 S-세파로스 컬럼 (2.5 x 13 cm)에 로딩하였다. 일정한 기선이 얻어질 때까지 컬럼을 아세트산염 완충제로 세척하고, 25 cm/시간으로, pH 7.4의 20 mM 아세트산나트륨으로 결합된 단백질을 용출시켰다. 용출된 물질을 0.4 마이크론 막으로 여과시키고 4℃에 저장하였다.
<실시예 7>
생쥐-인간 키메라 항체
제조자의 지시 (베링거 만하임 Cat. No. 1483-188)에 따라서, 프라이밍을 위한 dT 올리고, 및 합성 ScaI (서열 100) 및 NarI (서열 101) 프라이머로 증폭된 PCR을 사용하는 RT-PCR 키트를 이용하여 100 ng의 BC2 RNA를 역전사하여 Sca1, Nar1 말단 (서열 102 및 103)을 가진 BC2 경쇄 가변 영역을 생성하였다. 이 DNA를 ScaI, NarI로 분해된 F9HZHC1-3 (서열 77)에 접합하고 ScaI, NarI로 분해하여 생쥐-인간 키메라 경쇄 F9CHLC (서열 104 및 105)를 생성하였다.
제조자의 지시 (베링거 만하임 Cat. No. 1483-188)에 따라서, 프라이밍을 위한 dT 올리고, 및 합성 SpeI (서열 106) 및 NheI (서열 107) 프라이머로 증폭된 PCR을 사용하는 RT-PCR 키트를 이용하여 100 ng의 BC2 RNA를 역전사하여 Spe1, Nhe1 말단 (서열 108 및 109)을 가진 BC2 경쇄 가변 영역을 생성하였다. 캄파쓰 신호 서열은 EcoRI (서열 26) 및 SpeI (서열 87) 프라이머를 사용하여 RSVHZ19 중쇄 (서열 25)로부터 증폭된 PCR이었다. 이들 2개의 DNA 단편을, BC2 인자 IX 생쥐 가변 영역으로 IL4 가변 영역을 대체하는 국제 출원 제95/07301호에 기재되어 있는 EcoRI, NheI로 분해된 IL4CHHCpcd 벡터에 접합하여, 생쥐-인간 키메라 중쇄 F9CHHC (서열 110 및 111)을 생성하였다.
인간화 작제물에 있어서 생쥐-인간 키메라 항체 chαFIX의 동시트랜스펙션 및 정제를 상기와 같이 이룩하였다.
<실시예 8>
쥐 혈전 모델에서 인간화 인자 IX mAb의 효능
동맥 혈전증의 예방에서 인간화 항인자 IX 항체의 효능을 평가하기 위해, 실시예 3에 기재된 것과 같은 쥐 경동맥 혈전증 모델을 사용하였다. 경동맥 혈류, 동맥압, 심박도수, 혈관 개존 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)를 기본적인 파라메터로 사용하였다. 15분 후, 10분간 경동맥 상처를 일으켰다. 경동맥 상처를 일으킨 후 60분간 위의 파라메터들을 측정하였다. 또한 경동맥으로부터 경동맥 혈전을 추출하고 정량하였다.
모든 시약은 경동맥 상처를 일으키기 15분 전에 정맥내로 투여하였다. 아래의 처리를 시험하고 항인자 IX mAb BC2와 비교하였다.
1. 비히클
2. chαFIX: 3 mg/kg 볼러스
3. SB 249413: 3 mg/kg 볼러스
4. SB 249415: 3 mg/kg 볼러스
5. SB 249416: 3 mg/kg 볼러스
6. SB 249417: 3 mg/kg 볼러스
7. SB 257731: 3 mg/kg 볼러스
8. 헤파린: 60 단위/kg 볼러스 + 2 단위/kg/분 주입
본 연구에 사용된 항응고제/혈전제의 효능 대 출혈성에 대한 평가의 일차 척도로서 aPTT를 사용하였다. 도 8의 결과는 인간화 인자 IX mAb SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 및 SB 257731이 임상적 허용 범위내인 3.0 mg/kg에서 aPTT에 대해 적합한 효능을 가짐을 설명한다.
혈전량에 대한 인자 IX mAb의 효능은 도 9에서 나타내었다. 이 결과는 인간화 mAb 모두가 혈전량 감소에 동등하게 효과적임을 나타낸다.
쥐의 경동맥 혈전증 모델에서 수행된 연구들은 심한 혈전성 동맥 손상 모델에서 혈전증 예방에 인간화 인자 IX mAb의 효능을 뚜렷이 설명한다. 특히, 모든 인간화 인자 IX mAb의 효능은 aPTT에 의해 제한되는 원하는 치료용 항응고제 표적내에서 설명된다.
<실시예 9>
항체 생화학적 및 생물물리학적 특성
MALD-MS로 측정하여, SB 249417의 분자량이 148,000 Da였다. SB 249417에 대한 분석 초원심분리로도 같은 값을 얻었다. 인자 IX 플러스 Ca2+의 존재하에서, BC2로부터 유도된 항체는 mAb 및 2 분자의 인자 IX를 합한 질량과 같은 248,000 Da의 질량으로 침전하였다. 인자 IX가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 보다 고도로 정렬된 응집체에 대한 증거는 관찰되지 않았다.
SB 249417에 결합하는 인자 IX의 운동 역학은 고정된 단백질 A 표면에 결합된 항체를 사용한 바이아코어 (BIAcore) 분석으로 산정하였다. 49 nM에서 재조합 인간 인자 IX (rhFIX, Genetics Institute)를 사용하여 5 mM Ca2+가 존재하는 상태에서 측정을 실시하였다. 상호 작용은 급속한 회합 (Kass = 2.0 x 105M-1s-1) 및 상대적으로 느린 분리 속도 (Kdiss = 4.1 x 10-4s-1)를 특징으로 한다. 인자 IX 결합에 대한 이론 Kd는 1.9 nM였다.
표 1은 SB 249417의 생물학적 특성을 요약한 것이다.
표 2는 본 발명의 mAb에 대한 인자 IX 결합 특성을 요약한 것이다. 이론적인 분리 상수들은 실험 오차내에서 실질적으로 동일하였다.
항인자 IX mAb에 대한 인자 IX 결합의 운동 역학
mAb Kass (M-1s-1) Kdiss (s-1) 이론치 KD(nM)
SB 249417 2.0 x 105 4.1 x 10-4 1.9
BC2 4.8 x 105 9.1 x 10-4 1.9
Chf9 2.4 x 105 3.0 x 10-4 1.3
SB 249413 6.5 x 105 2.8 x 10-3 3.7-5.1
SB 249415 7.5 x 105 1.8 x 10-4 1.1-2.3
SB 249416 5.2 x 105 4.1 x 10-4 0.8
SB 257731 9.2 x 105 9.9 x 10-4 1.1
SB 257732 1.1 x 106 1.2 x 10-3 1.5
rhFIX 및 SB 249417, BC2 및 다른 인간화 작제물간의 상호 작용은 결합의 고유열로부터 용액중의 결합 상호 작용을 측정하는 적정 마이크로열량측정법을 특징으로 한다. 2 μM mAb SB 249417을 함유하는 열량측정기에 106 μM FIX로된 9개의 주사액을 주입하였다. 일차 4개의 주사액 중에서 발열에 의해 결합을 검출하였다. 마지막 5개의 주사액에서, mAb 결합 부위를 FIX로 포화시키자, 단지 혼합에 의한 배경열만이 관찰되었다. 이 결과는 예상한 것과 같이, mAb 당 거의 2 FIX의 몰 결합비로 등량점이 발생하였음을 나타낸다. 이 데이터의 비선형 최소 정방형 분석법 (nonlinear least squares analysis)으로 결합 친화도를 얻었다.
10 mM HEPES, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl 중에서, pH 7.4에서 34 - 44℃의 온도 범위에 걸쳐서 mAb의 rhFIX 친화도를 측정하였다. 이들 데이터는 37℃에서의 친화도는 직접 측정한 것이고, 25℃에서의 친화도는 반트 호프 (van't Hoff)의 식으로부터 계산한 것이다. 표 3에서의 데이터는 SB 249417, BC2 및 그의 다른 인간화 작제물의 친화도가 오차 (표 2의 인자)내에서 모두 동일함을 나타낸다.
항-FIX mAb에 대한 적정 열량측정법 결과
mAb Kd, 25℃에서의 nM Kd, 37℃에서의 nM 몰 결합비 (FIX/mAb)
BC2 10 20 1.4
SB 249413 6 12 1.9
SB 249415 3 7 1.7
SB 249417 4 12 1.5
SB 257732 4 9 1.8
mAb SB 249413, SB 249415, SB 249417 및 SB 257732는 차동 주사 열량측정법에 의하면 모두 아주 유사한 열적 안정도를 나타내었다. 그들의 언폴딩 (unfolding) Tm은 열적으로 야기된 변성에 대해 높은 안정도를 나타내는 70 내지 75℃의 범위였다.
<실시예 10>
인자 IX에 대한 항체-중재된 억제 메카니즘
인자 IX의 서열을 동종 단백질 인자 VII의 프레임워크로 스플라이싱하여 구성된 키메라 작제물의 라이브러리를 구축하고 이를 사용하여 인자 IX BC2 mAb에 대한 에피토프를 매핑하였다 (문헌 [Cheung et al., Thromb. Res. 80, 419-427 (1995)]을 참조). 바이아코어 (BiaCore) 2000 표면 플라스몬 공명 기구를 사용하여 결합을 측정하였다. NHS/EDC 반응을 사용하여 BC2 항체를 칩 (chip)과 직접 커플시켰다. 25 mM MOPS, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2에서 주어진 작제물을 각각 200 nM씩 사용하여 20 ㎕/분에서 2분간의 접촉 시간으로 결합을 측정하였다. 단백질이 없는 동일한 완충액을 사용하여 3분간 분리를 관찰하였다. 50 mM EDTA의 존재하에서 야생형 작제물에 대한 결합은 검출되지 않았다. 이 데이터를 표 4에 나타내었다.
BC2 항체에 대한 인자 IX 작제물의 결합에 대한 요약
작제물 결합도
혈장 IXa 결합
r-IX 결합
혈장 VII 결합하지 않음
IX LC/VII HC 결합
IX-A/VII 결합
VII gla/IX 결합하지 않음
VII-A/IX 결합하지 않음
VII gla (IX 3-11)/IX 결합
VII gla (IX 3-6)/IX 아주 낮은 결합
VII gla (IX 9-11)/IX 아주 낮은 결합
IX K5A 결합
이들 데이터는 인자 IX 경쇄 및 인자 VII 중쇄 (IX LC/VII HC); 인자 IX gla 및 방향족 스택 도메인 (IX-A/VII); 인자 VII gla 도메인 내의 인자 IX gla 도메인의 잔류물 3-11 (VII gla (IX 3-11)/IX); 및 잔기 5에서 알라닌에 대한 라이신 치환을 가지는 인자 IX (IX K5A)를 함유하는 작제물이 BC2에 대해 결합함을 나타낸다. VII gla (IX 3-11)/IX 작제물은 야생형 인자 IX (혈장 IXa 및 r-IX)과 동등한 BC2 결합을 나타내었다. 따라서, BC2 항체는 인자 IX gla 도메인의 잔기 3-11 내에서 함유된 에피토프에 결합한다.
본 발명은 본 발명의 취지 또는 필수적인 특징에서 일탈하지 않는 다른 특정 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위를 나타내는 외연은 상기 명세서 보다 첨부된 특허 청구의 범위로 이루어져야 한다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 블랙번, 마이클
처치, 윌리암
그로스, 미첼
포이어스타인, 죠라
니콜스, 앤드류
패들랜, 에듀어도
패텔, 애런브하이
실베스터, 다니엘
(ii) 발명의 명칭: 혈전증 치료에 유용한 항응고제
(iii) 서열수: 111
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 스미스클라인 비참 코포레이션
(B) 거리: 스웨드랜드 로드 709
(C) 도시: 킹 오브 프러시아
(D) 주: 펜실바니아
(E) 국가: USA
(F) 우편번호: 19406
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM 호환형
(C) 작동 시스템: DOS
(D) 소프트웨어: 패스트SEQ 버전 1.5
(vi) 현재 출원 데이터
(A) 출원 번호:
(B) 출원일: 1997년 1월 16일
(C) 분류:
(vii) 선행 출원 데이터
(A) 출원 번호: 60/029,119
(B) 출원일: 1996년 10월 24일
(viii) 대리인 정보
(A) 성명: 바우미스터, 커크
(B) 등록 번호: 33,833
(C) 일련 번호: P50438
(ix) 원거리 통신 정보
(A) 전화: 610-270-5096
(B) 팩스:
(C) 텔렉스:
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 363 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 321 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 121 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 17 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 12 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 10 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 9 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 104 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 108 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 91 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 337 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 2 . . . 337
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 112 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 97 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 27 . . . 95
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 110 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 77 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 29에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 73 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 363 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 363
(D) 다른 정보: F9HZHC 1-0
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 121 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 165 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 146 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 280 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 2 . . . 280
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 93 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 94 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 27 . . . 92
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 55 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 321 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 321
(D) 다른 정보: F9HZLC1-0
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 134 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 134 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 225 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 225
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 75 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 363 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 특징:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 363
(D) 다른 정보: F9HZHC 1-1
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 121 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 82 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 90 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 321 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 특징:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 321
(D) 다른 정보: F9HZLC 1-1
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 57에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 58에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 59에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 60에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 13 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 61에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 321 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 특징:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 321
(D) 다른 정보: F9HZLC 1-2
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 62에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 63에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 165 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 64에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 161 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 65에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 280 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 특징:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 2 . . . 280
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 66에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 93 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 67에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 68에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 69에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 70에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 17 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: N-말단
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 71에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 48 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 72에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 52 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 73에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 321 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 321
(D) 다른 정보: F9HZLC 2-0
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 74에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 75에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 94 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 27 . . . 94
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 76에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 77에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 401 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 27 . . . 401
(D) 다른 정보: F9HZLC 1-3
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 78에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 125 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 81 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 80에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 99 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 81에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 87 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 82에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 86 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 83에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 278 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 3 . . . 278
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 84에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 92 아미노
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 85에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 86에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 87에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 37 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 88에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 446 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 27 . . . 446
(D) 다른 정보: F9HZHC 3-0
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 89에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 140 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 90에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 90 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 91에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 108 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 92에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 108 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 93에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 102 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 94에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 330 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 2 . . . 328
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 95에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 109 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 96에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 97에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 98에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 412 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 27 . . . 412
(D) 다른 정보: F9HZLC 3-0
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 99에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 129 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 100에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 101에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 102에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 335 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 335
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 103에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 112 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 104에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 318 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 318
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 105에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 106 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 106에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 107에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 108에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 369 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 369
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 109에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 123 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 110에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 363 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(ix) 양상:
(A) 이름/키: 코딩 서열
(B) 위치: 1 . . . 363
(D) 다른 정보:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 111에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 121 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(iii) 가설: 없슴
(iv) 안티센스: 없슴
(v) 단편 형태: 내부형
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:

Claims (38)

  1. 자기제한성 중화 활성을 가지는 항응고 인자 모노클로날 항체의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는 동물의 혈전증 억제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항응고 인자 모노글로날 항체와 합하여 아세틸살리실산을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 응고 인자가 고유 또는 공통 응고 경로로부터의 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항응고 인자 모노클로날 항체가 항인자 IX, 항인자 IXa, 항인자 X, 항인자 Xa, 항인자 XI, 항인자 XIa, 항인자 VIII, 항인자 VIIIa, 항인자 V, 항인자 Va, 항인자 VII, 항인자 VIIa 또는 항트롬빈인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 항응고 인자 모노클로날 항체가 항인자 IX인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 항인자 IX 모노클로날 항체가 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 또는 SB 257732의 동정 특성을 가지는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 항인자 IX 모노클로날 항체가 SB 249417의 동정 특성을 가지는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, aPTT가 PT의 현저한 연장 없이 연장된 것인 방법.
  9. 제4항에 있어서, aPTT가 약 35초 내지 약 100초인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈전증이 심근경색증, 불안정한 앙기나, 심방 섬유성 연축, 뇌졸중, 신장 손상, 폐동맥색전증, 심부정맥혈전증, 경피 경강적 관상동맥 혈관형성 (percutaneous translumenal coronary angioplasty), 광범성 혈관내 응고, 패혈증, 인공 기관, 션트 (shunt) 또는 보철과 관련된 것인 방법.
  11. 응고 인자에 대한 자기제한 중화 활성을 가지는 항응고 인자 모노클로날 항체.
  12. 제11항에 있어서, 응고 인자가 고유 또는 공통 응고 경로로부터의 것인 모노클로날 항체.
  13. 제12항에 있어서, 항응고 인자 모노클로날 항체가 항인자 IX, 항인자 IXa, 항인자 X, 항인자 Xa, 항인자 XI, 항인자 XIa, 항인자 VIII, 항인자 VIIIa, 항인자 V, 항인자 Va, 항인자 VII, 항인자 VIIa 또는 트롬빈인 모노클로날 항체.
  14. 제12항에 있어서, 항응고 인자 모노클로날 항체가 항인자 IX인 모노클로날 항체.
  15. 제14항에 있어서, SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 2249417, SB 257731, SB 257732, 9E4(2)F4 또는 11G4(1)B9의 동정 특성을 가지는 모노클로날 항체.
  16. 제14항에 있어서, SB 249417의 동정 특성을 가지는 모노클로날 항체.
  17. 세포주 9E4(2)F4 또는 11G4(1)B9의 동정 특성을 가지는 하이브리도마.
  18. 제11항의 모노클로날 항체의 Fc 영역을 결실시킴으로써 생성된 중화 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편.
  19. 제11항의 모노클로날 항체의 Fd 중쇄가 무린 경쇄 필라멘트성 파지 Fab 디스플레이 라이브러리에서 발현되게 함으로써, 사슬 셔플링 (shuffling)에 의해 생성된 중화성 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편.
  20. 제11항의 모노클로날 항체의 경쇄가 무린 중쇄 필라멘트성 파지 Fab 디스플레이 라이브러리에서 발현되게 함으로써, 사슬 셔플링 (shuffling)에 의해 생성된 중화성 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편.
  21. 아미노산 서열이 서열 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역.
  22. 제21항의 면역글로불린 상보성 결정 영역을 코딩하는 핵산 분자.
  23. 아미노 서열이 서열 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역.
  24. 제23항의 면역글로불린 상보성 결정 영역을 코딩하는 핵산 분자.
  25. 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 (framework) 영역이 하나 이상의 선택된 항체로부터 유래하고 각 쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열이 제11항의 모노클로날 항체로부터 유래하는 것인, 중쇄 및 경쇄를 함유하는 변형 항체.
  26. 제25항에 있어서, 인간화된 것인 변형 항체.
  27. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 31, 52 또는 89에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  28. 제26항에 있어서, 경쇄가 서열 44, 57, 62, 74, 78 또는 99에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  29. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 31에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 경쇄가 서열 44에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  30. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 52에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 경쇄가 서열 57에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  31. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 52에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 경쇄가 서열 62에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  32. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 52에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 경쇄가 서열 74에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  33. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 52에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 경쇄가 서열 78에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  34. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열 89에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 경쇄가 서열 99에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화 항체.
  35. 혈전증이 억제되고 응고의 제한된 완화가 발생하고, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 하나 이상의 선택된 항체로부터 유도되고, 상기 각 쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 제11항의 모노클로날 항체로부터 유래하는, 자기제한 방식으로 고유 또는 공통 경로 응고 인자의 작용을 억제함을 특징으로 하는, 중쇄 및 경쇄를 함유하는 키메라 항체.
  36. 제35항에 있어서, 불변 영역이 인간 면역글로불린으로부터 선택된 것인 항체.
  37. 제26항 또는 제35항의 변형 항체 및 제약상 허용되는 담체로 이루어지는 제약 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 아세틸살리실산을 더 함유하는 제약 조성물.
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