CZ222598A3 - Antikoagulační přípravek vhodný k léčení trombózy - Google Patents

Description

1 el>Ur~ • · • · · ♦ · » ♦ · · · • · · · # • · · · ··«···«· ·« • · · é «*

Antikoagulační přípravek vhodný k léčení trombosy

Oblast techniky

Tento vynález se týká monoklonálních protilátek (mAb), které se váží na lidský koagulační faktor nebo kofaktor a jejich užití jako inhibitorů trombosy s vlastním vymezením.

Dosavadní stav techniky

Za normální okolností spouští poškození, at malé, nebo velké, cévních endotelových buněk v cévách hemostatickou odpověď zprostředkovanou sekvencí dějů obecně označovaných jako koagulační "kaskáda”. Kaskáda vrcholí konversí rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin, který spolu s destičkami tvoří lokalizovanou sraženinu neboli trombus, který brání extravasaci složek krve. Potom může proběhnout hojení a po něm rozpuštění sraženiny a obnovení integrity cév a průtoku. Děje, které probíhají v době od poškození do tvorby sraženiny jsou důkladně regulovány a jsou spojeny sérií reakcí. Stručně uvedeno, mnoho plasmatických koagulačních proteinů v inaktivních proenzymových formách a kofaktorů cirkuluje v plasmě. V místě poškození jsou tvořeny aktivní enzymové komplexy a jsou sekvenčně aktivovány na serinové proteasy, kdy každá následující serinová proteasa katalýzuje následující proteasovou aktivaci proenzymu. Tato enzymatická kaskáda vede v každém dalším kroku k zvýšení účinku v následujícím kroku. Pro přehled o koagulační kaskádě viz první kapitolu "Thrombosis and Hemorrhagie", J. Loscalzo a A. Schafer, vyd., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Anglie (1994)). .*· 99 ·· ···· · ♦ · * 2 » · » · ·· · · · · · • » · « · «··· · • 9 ·· · · · ······ • · 9 9 · 9 ♦ * #··· ···· ·* *· ·· Μ I když účinné srážení limituje ztrátu krve v místě poškození, nevhodná tvorba trombů v žílách a v tepnách je často příčinou chorobného stavu a smrti. Abnormální srážecí aktivita může vést k patologickým stavům jako je infarkt myokardu, nestabilní angína pectoris, fibrilace síní, mrtvice, renální poškození, a/nebo může vznikat v důsledku léčby jako je perkutánní transluminální koronární angioplastika nebo stavů jako je disseminovaná intravaskulární koagulace, sepse, plicní embolie a trombosa hlubokého žilního systému. Tvorba sraženina na povrchu cizích těles arteficiálních orgánů, zkratů a protes jako jsou umělé srdeční chlopně je také problematická.

Osvědčená antikoagulancia používaná v současné době v léčbě těchto patologií a jiných trombotických a embolických onemocnění zahrnují sulfatovaný heteropolysacharidový heparin a nízkomolekulámí (LMW) heparin. Tato činidla jsou podávána parenterálně a mohou způsobit rychlou a úplnou inhibici srážení aktivací inhibitoru trombinu, antitrombinu III a inaktivaci všech srážlivých faktorů.

Nicméně, díky jejich silné účinnosti mají heparin a LMW nevýhody. Nekontrolovatelné krvácení v důsledku prostých stresových pohybů a souvisejícího kontaktu s fyzikálními objekty nebo místy chirurgického zákroku je hlavní komplikací a je pozorováno u 1 až 7% pacientů léčených kontinuální infusí a u 8 až 14% pacientů léčených intermitentními bolusovými dávkami. Pro minimalizaci rizika jsou kontinuálně odebírány vzorky krve pro kontinuální testování ex vivo srážecích časů, což způsobuje nákladnost terapie a nepohodlí pro pacienta. Dále, terapeutické rozmezí pro dosažení požadované účinnosti |· · * ·· ···· 9« ·· 3 ···· 99 9 99·« • · · · · ·«·«. • « * · · * * 9·«··· • · ··«« · · ········ · · · · ·· · * bez rizika krvácení je úzké. Terapeutický rozsah je od přibližně 1 do méně než 3 heparinu /ml plasmy, což vede k aktivovanému parciálnímu tromboplastinovému času (APTT) od asi 35 až do asi 100 sekund. Zvýšení koncentrace heparinu nad 3 μg/ml vyvolá překročení požadovaného rozmezí a při zvýšení nad 4 μg/ml není srážlivost detekovatelná. Tak musí být největší pozornost věnována udržení plasmatických koncentrací u pacienta v terapeutickém rozmezí.

Dalším osvědčeným antikoagulačním činidlem s pomalejším a dlouhodobějším účinkem je warfarin, kumarinový derivát. Warfarin působí kompeticí s vitamin K-dependentní posttranslační modifikací protrombinu a dalších srážecích faktorů závislých na vitaminu K.

Společný rys antikoagulačního účinku, při kterém je krev učiněna nesrážlivou při koncentracích pouze o málo vyšších než je terapeutický rozsah, je možné pozorovat jak pro warfarin, tak pro heparin a LMW heparin. Je jasné, že existuje potřeba antikoagulačního činidla, které by bylo účinné při léčbě trombotických a embolických onemocnění, ale které by nezpůsobovalo nekontrolovatelné krvácení nebo jeho možnost.

Podstata vynálezu V souladu s tím je jedním aspektem předkládaného vynálezu způsob pro inhibici trombosy u zvířat, který obsahuje podání účinné dávky monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru, která má neutralizační účinnost s vlastním omezením.

Jiným aspektem vynálezu je monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

Jiným aspektem vynálezu je monoklonální protilátka mající identifikační charakteristiky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732, 9E4(2)F4 nebo 11G4{1)B9.

Jiným aspektem vynálezu je hybridomní buněčná linie mající identifikační charakteristiky 9E4(2)F4 nebo 11G4(1)B9.

Jiným aspektem vynálezu je neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab1)2 fragment, který je produkován delecí Fc regionu monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu.

Jiným aspektem vynálezu je neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment, který je produkován výměnou řetězců, kdy je Fd těžký řetězec monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu exprivován v myší filamentosní fágové Fab zobrazovací knihovně lehkého řetězce.

Jiným aspektem vynálezu je neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment, který je produkován výměnou řetězců, kdy je lehký řetězec monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu exprivován v myší filamentosní fágové Fab zobrazovací knihovně těžkého řetězce.

Jiným aspektem vynálezu je komplementaritu určující region těžkého řetězce imunoglobulinu mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládáj ící se z SEQ ID NO: 8, 9 a 10.

Jiným aspektem vynálezu je komplementaritu určující region • · • * • · • · · · • · • · • · • • ♦ • • · • · • % • · · • • • · • · ♦ « ♦ « · ···· ·» « · • t lehkého řetězce imunoglobulinu mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 12, 13 a 14.

Jiným aspektem vynálezu je alterovaná protilátka obsahujíc těžký řetězec a lehký řetězec, kde regiony pracovních rámečků uvedených těžkých a lehkých řetězců jsou odvozeny od alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence komplementarritu určujících regionů uvedených řetězců jsou odvozeny od monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

Jiným aspektem vynálezu je chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde uvedená protilátka je charakterizována inhibicí funkce vnitřní nebo společné dráhy koagulačních faktorů s omezenou účinností, kde protilátka inhibuje trombosu a produkuje limitovanou modulaci koagulace, kde konstantní regiony uvedených těžkých a lehkých řetězců jsou odvozeny od alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence variabilních regionů uvedených řetězců jsou odvozeny od monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

Ještě jiným aspektem vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující humanizované protilátky nebo chimérické protilátky podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Μ Μ · · · · · ♦ · · · · 6* · · · · · · «««· • · · * * » · · · • · · « · · · *···«· • · · · · · · » ······*· « · ·· ·« Μ

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 je graf experimentálních výsledků demonstrujících titraci normální lidské plasmy myšími mAb BC1 a BC2 proti faktoru IX.

Obrázek 2 je graf experimentálních výsledků demonstrujících titraci normální lidské plasmy myšími mAb 9E4{2)F4 a 11G4(1)B9 proti faktoru IX.

Obrázek 3 je graf experimentálních výsledků demonstrujících titraci normální lidské plasmy myšími mAb HFXHC a HFXLC proti faktoru X a myší mAb HFXI proti faktoru IX.

Obrázek 4 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) v 60. minutě v krysím modelu trombosy karotidy.

Obrázek 5 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na protrombinový čas v 60. minutě v krysím modelu trombosy karotidy.

Obrázek 6 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na uzávěr průtoku arteria carotis v krysím modelu trombosy karotidy.

Obrázek 7 je histogram experimentálních výsledků Μ ·· ·· ···· *· «· Η *··♦·· ·«··· 7 · · · · ♦ » · · · • ♦ · ♦ · · * «·· ··· • · « ι · · · · ···· ···· |9 9· 99 99 demonstrujících účinost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu v krysím modelu trombosy karotidy.

Obrázek 8 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinost heparinu, myší mAb BC2 proti faktoru IX, chimérické mAb proti faktoru IX a humanizované mAb proti faktoru IX na APTT v 60. minutě v krysím modelu trombosy karotidy.

Obrázek 9 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinost heparinu, myší mAb BC2 proti faktoru IX, chimérické mAb proti faktoru IX a humanizované mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu v krysím modelu trombosy karotidy. Předkládaný vynález poskytuje různé protilátky, pozměněné protilátky a jejich fragmenty proti koagulačním faktorům, které jsou charakterizované neutralizační aktivitou s vlastním omezením Výhodně je koagulační faktor z vnitřní nebo ze společné dráhy.

Nej výhodněji jsou protilátky proti koagulačnímu faktoru anti-faktor IX, anti—faktor IXa, anti-faktor X, anti-faktor Xa, anti-faktor XI, anti-faktor Xla, anti-faktor VIII, anti-faktor Vlila, anti-faktor V, anti-faktor Va, anti-faktor VII, anti-faktor Vila nebo anti-trombinové. Zejména výhodné jsou protilátky proti faktoru IX. Příklady protilátek proti koagulačním faktorům jsou humanizované monoklonální protilátky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 a SB 257732 namířené proti lidskému faktoru IX, chimérická monoklonální protilátka chaFIX namířená proti lidskému faktoru IX, myší monoklonální protilátky BC1, BC2, 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9, které jsou namířené proti lidskému faktoru IX a/nebo IXa nebo myší monoklonální protilátky HFXLC a HFXI, které jsou namířené proti lidskému faktoru X a XI, v příslušném pořadí. Nejvýhodnější je monoklonální protilátka SB 249417 proti lidskému faktoru IX.

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny konvenčními hybridomními technikami, fágovýmy zobrazovacími kombinatoriálními knihovnami, přeskupováním imunoglobulinových řetězců a humanizačními technikami pro vývoj nových neutralizačních protilátek s vlastním omezením. Také jsou zde obsaženy plně lidské mAb mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením. Tyto produkty jsou použitelné v terapeutických a farmaceutických přípravcích pro léčbu trombotických a embolických onemocnění asociovaných s infarktem myokardu, nestabilní angínou pectoris, plicní embolií, trombosou hlubokých žil, perkutánní transluminální koronární angioplastikou, disseminovanou intravaskulární koagulací, sepsí, artificiálními orgány, zkraty nebo protesami.

Jak je zde použit označuje termín "neutralizační aktivita s vlastním omezením" aktivitu protilátky, která se váže na lidský koagulační faktor, výhodně z vnitřní nebo společné dráhy, včetně faktoru IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIla a V/Va, VH/VIIa a trombin, a inhibuje trombosu takovým způsobem, že koagulace je modulována omezeným způsobem. "Omezená modulace koagulace" je definována jako zvýšení časů srážení, jak je měřeno prodloužením aktivovaného parciálního tromboplastinového času (APTT), kdy plasma je stále schopná srážení, s APTT dosahujícím maximálních hodnot i přes zvýšení koncentrací monoklonální protilátky. Tato omezená modulace koagulace kontrastuje s nesrážlivostí plasmy a nekonečně dlouhým APTT, jak je způsobeno vyššími koncentracemi • e ·· • · • · · · • · ·· • · · · • • • • * • · • · • • • • · • · • · · • • • * • · · • · · • · • • • · • • ···· ···· • · • ♦ • · • · heparinu. výhodně jsou maximální hodnoty APTT způsobů podle předkládaného vynálezu v terapeutickém rozmezí pro heparin.

Nej výhodněji je maximální APTT v rozmezí od asi 35 sekund do asi 100 sekund, což odpovídá asi 1,5-násobku až 3,5 násobku normální kontrolní hodnoty APTT. V jednom provedení vynálezu je APTT prodlouženo bez významného prodloužení protrombinového času (PT). "Pozměněná protilátka" označuje protein kódovaný pozměněným imunoglobulin kódujícím regionem, který může být získán expresí ve vybrané hostitelské buňce. Takové pozměněné protilátky jsou zpracované protilátky (např. chimérické nebo humanizované protilátky) nebo fragmenty protilátekbez celého nebo bez části konstantního regionu imunogl obul inu (například Fv, Fab, Fab' nebo F(ab')a a podobně). "Pozměněný imunoglobulinový kódující region" označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující pozměněnou protilátku podle předkládaného vynálezu. Pokud je pozměněná protilátka CDR-přenesená nebo humanizovaná protilátka, pak jsou sekvence kódující komplementaritu určující regiony (CDR) z non-lidského imunoglobulinu insertovány na první imunoglobulinový partner skládájícíc se ze sekvencí lidských variabilních pracovních rámečků. Volitelně je první imunoglobulinový partner navázán na druhý imunoglobulinový partner. "První imunoglobulinový partner" označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující lidský pracovní rámeček nebo variabilní region lidského imunoglobulinu, ve kterém jsou nativní (nebo přirozené) CDR-kodující regiony nahrazeny CDR kódujícími regiony dárcovské protilátky. Lidský variabilní region může být z imunoglobulinového těžkého řetězce, lehkého řetězce (nebo z 10 10 • · · · « » ·· ·· ♦ · · · t · I · · · · • ι ··· · · · · • · t · I » · »·····

·· · · · · · I ·+·····« ·· ·« ·# ·« obou), nebo jejich analog nebo funkční fragment. Takové CDR regiony, umístěné ve variabilním regionu protilátek (imunoglobulinů) mohou být určeny metodami známými v oboru. Například Kabat et al., v "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987), popisuje pravidla pro lokalizaci CDR. Kromě toho, jsou známé počítačové programy, které jsou použitelné pro identifikaci CDR regionů/struktur. "Druhý imunoglobulinový partner" označuje jinou nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo peptid, se kterým je první imunoglobulinový partner fušován v rámečku nebo pomocí volitelné běžné linkerové sekvence (t.j. operativně navázán). Výhodně to je imunoglobulinový gen. Druhý imunoglobulinový partner může obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující celý konstantní region pro stejnou (t.j. homologní, kde první a druhá pozměněná protilátka jsou odvozeny ze stejného zdroje), nebo jinou (t.j. heterologní) požadovanou protilátku. Může to být těžký nebo lehký řetězec imunoglobulinu (nebo oba řetězce jako součást jednoho polypeptidu) . Druhý imunoglobulinový partner není omezen určitou třídou nebo izotypem imunoglobulinu. Kromě toho, druhý imunoglobulinový partner může obsahovat část konstantního regionu imunoglobulinu, jak je tomu u Fab nebo F(ab')2 (t.j. určitou část vhodného lidského konstantního regionu nebo regionu pracovního rámečku). Takový druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující integrální membránový protein přítomný na zevním povrchu hostitelské buňky, například jako část fágové zobrazovací knihovny, nebo sekvenci kódující protein pro analytickou nebo diagnostickou detekci, například křenovou peroxidasu, β-galaktosidasu, atd. 11 11 • · φφφφ φφ φφ • φ · · φ φ · φφφφ φ φ φφ φ φ φφφ φ φ φφ φ φ · φ φ φ φ · φ φφ φφφφ φφ φφφφφφφφ φφ φφ φφ φφ

Terminy Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' nebo F(ab')2 jsou použity ve standartnich významech. Viz například Harlow et al., v "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988) .

Jak je zde použito popisuje "zpracovaná protilátka" typ pozměněné protilátky, t.j. kompletní syntetickou protilátku (například chimérickou nebo humanizovanou protilátku v protikladu k fragmentu protilátky), ve které je část variabilních domén lehkého a/nebo těžkého řetězce vybrané akceptorové protilátky nahrazena analogickou částí z jedné nebo z více dárcovských protilátek, které mají specificitu pro vybraný epitop. Například, takové molekuly mohou zahrnovat protilátky charakterizované humanizovaným těžkým řetězcem asociovaným s nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo chimérickým lehkým řetězcem), nebo naopak. Zpracované protilátky mohou být také charakterizovány alterací sekvencí nukleových kyselin kódujících pracovní regiony variabilních domén lehkých a/nebo těžkých řetězců akceptorové protilátky, ktará uchovává vazebnou specificitu dárcovské protilátky. Tyto protilátky mohou obsahovat nahrazení jednoho nebo více CDR (výhodně všech) akceptorové protilátky CDR z dárcovské protilátky zde popsané. "Chimérická protilátka" označuje zpracovanou protilátku, která obsahuje přirozené variabilní regiony (lehkého řetězce a těžkého řetězce) odvozené od dárcovské protilátky ve spojení s konstantními regiony lehkého řetězce a těžkého řetězce odvozenými z akceptorové protilátky. "Humanizovaná protilátka" označuje typ zpracované protilátky mající své CDR odvozené z non-lidského dárcovského imunoglobulinu ·· • é ·· ···· 1» • • ♦ • · • • · · • • • · • ♦ · • · · · · • • • • • · • ··· ·· ·· ·· ·· a zbývajíc! imunoglobulinové části molekuly jsou odvozeny od jednoho nebo více imunoglobulinů. Kromě toho, zbytky pracovního rámečku mohou být pozměněny tak, aby byla zachována vazebná afinita. Viz například Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029 - 10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology 9: 421 (1991) .

Termín "dárcovská protilátka" označuje monoklonální nebo rekombinantní protilátku, která je kódována sekvencemi nukleové kyseliny pro své variabilní regiony, CDR nebo jejich jiné funkční fragmenty nebo analogy prvního imunoglobulinového partnera, takže je poskytnut pozměněný imunoglobulinový kódující region a výsledná exprivovaná pozměněná protilátka s antigenní specificitou a neutralizační aktivitou charakteristickou pro dárcovskou protilátku. Jednou dárcovskou protilátkou vhodnou pro použití v předkládaném vynálezu je myší monokonální protilátka s vlastní neutralizační aktivitou označená BC2. Jinými vhodnými dárcovskými protilátkami jsou myší monokonální protilátky s vlastní neutralizační aktivitou označené BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC a HFXI.

Termín "akceptorová protilátka" označuje monoklonální nebo rekombinantní protilátku heterologní k dárcovské protilátce, která má všechny, nebo části sekvencí nukleových kyselin kódujících její regiony pracovních rámečků lehkého řetězce a/nebo těžkého řetězce a nebo konstantní regiony lehkého řetězce a/nebo těžkého řetězce prvního imunoglobulinového partnera. Výhodně je akceptorovou protilátkou lidská protilátka. "CDR" jsou definovány jako aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů protilátky, které jsou #· ·· ·· • · · · • · ·· • • * • · • * · • · • • • · • • · • · • • • · · • · ··· • · · • • • * • · • • • · · • « · · ·· • · • 9 • # hypervariabilními regiony lehkých a těžkých řetězců imunogl obul inu. Viz, například Kabat et al., v "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) . Ve variabilní části imunoglobulinu jsou tři CDR nebo CDR regiony v těžkém řetězci a tři v lehkém řetězci. Proto, "CDR", jak je zde použito, označuje všechny tři CDR těžkého řetězce, nebo všechny tři CDR lehkého řetězce, nebo všechny CDR lehkého a těžkého řetězce, jak je to vhodné. CDR obsahuje většinu kontaktních zbytků pro vazbu protilátky na antigen nebo epitop. Požadované CDR v tomto vynálezu jsou odvozeny z variabilních sekvencí lehkých a těžkých řetězců dárcovské protilátky a zahrnují analogy přirozených CDR, kde tyto analogy také mají nebo si uchovávají stejnou antigenní vazebnou specificitu a/nebo neutralizační schopnost jako dárcovská protilátka, ze které jsou odvozeny. "Vlastnit stejnou antigenní vazebnou specificitu a/nebo neutralizační schopnost" znamená, například, že ačkoliv mAb BC2 může být charakterizována určitou hladinou neutralizační aktivity s vlastním omezením, může mít CDR kódovaný sekvencí nukleové kyseliny BC2 ve vhodném prostředí nižší nebo vyšší aktivitu. Předpokládá se, že CDR BC2 v takovém prostředí budou nicméně rozpoznávat stejný epitop jako BC2. "Funkční fragment" je část variabilní sekvence lehkého nebo těžkého řetězce (např. drobné delece na amino nebo na karboxy konci variabilního regionu imunoglobulinu), která si uchovává stejnou antigenní vazebnou specificitu a/nebo neutralizační schopnost jako protilátka, ze které byl fragment odvozen. • · ·· • · 9999 9 9 99 • · 1 · • 9 9 9 9 • · • • • · 9 9 9 • · • • 9 9 9 9 9 999 « · · • • 9 9 9 9 9 • ···· • · M 9 9 9 9 9 9 • · "Analog" je aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kde uvedená modifikace může být chemická nebo substituce nebo přeskupení několika aminokyselin (t.j. ne více než 10), kde tato modifikace umožňuje zachování biologických charakteristik aminokyselinové sekvence, například antigenní specificity a vysoké afinity, stejných jako u nemodifikované sekvence. Příklady analogů zahrnují silentní mutace, které mohou být konstruovány substitucí, pro vytvoření určitých restrikčních míst pro endonukleasy v nebo v okolí CDR-kodujících regionů.

Analogy mohou také vznikat.v důsledku alelických variací. "Alelická variace nebo modifikace" je alterace v sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinové nebo peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Takové variace nebo modifikace mohou být způsobeny degenerací genetického kódu nebo mohou být záměrně vytvořeny pro vznik požadovaných charakteristik. Tyto variace nebo modifikace mohou, ale nemusí vést k alteraci v jakékoliv kódované aminokyselinové sekvenci.

Termín "efektorové činidlo" označuje neproteinové molekulové nosiče, se kterými mohou být pozměněné protilátky, a/nebo přirozené nebo syntetické lehké nebo těžké řetězce dárcovské protilátky nebo jiné fragmenty dárcovské protilátky asociovány běžnými prostředky. Takové neproteinové nosiče mohou zahrnovat konvenční nosiče používané v oblasti diagnostiky, například polystyrénové nebo jiné plastové korálky, polysacharidy, například jak jsou použity v BIAcore (Pharmacia) systému, nebo jiné neproteinové substance použitelné v oblasti medicíny a bezpečné pro podání lidem a zvířatům. Jiná efektorová činidla mohou obsahovat makrocykly, pro chelací atomů těžkých kovů nebo radioizotopů. Taková efektorová činidla mohou být také užitečná 15

Μ ·«*· • · · · • · · · • · · · · t · · · • ·· «I • · • · #··

pro zvýšení poločasu pozměněných protilátek, například jako tomu je u polyethylenglykolu.

Pro použití při konstrukci protilátek, pozměněných protilátek a fragmentů podle předkládaného vynálezu mohou být použity jiné než lidské druhy, jako je hovězí dobytek, ovce, opice, kuřata, hlodavci (například myši a krysy) pro generování požadované imunogl obul inu za imunizace s lidským koagulačním faktorem, výhodně faktorem IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, VII/Vila nebo trombinem nebo peptidovým epitopem z nich odvozeným.Pro získání hybridomních buněčnýh linií secemujících non-lidské mAb k příslušnému koagulačnímu faktoru jsou použity běžné hybridomní techniky. Takové hybridomy jsou potom vyšetřovány na vazbu za použití faktorem IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, VlI/VIIa nebo trombinem potažených 96-jamkových plotenm jak je popsáno v části Příkladů, nebo alternativně biotinylováným faktorem IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, VlI/VIIa nebo trombinem navázaným na plotnu potaženou streptavidinem. Alternativně může být vytvořena plně lidská mAb za použití technik dobře známých v oboru a použitých v tomto vynálezu.

Jedním příkladem mAb s vlastní omezenou neutralizační aktivitou podle předkládaného vynálezu je mAb BC25, myší protilátka, která může být použita pro vývoj chimérické nebo humanizované molekuly. BC2 mAb je charakterizována inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek BC2 mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 100 sekund. BC2 mAb se také váže na faktor IXa, inhibuje konversi faktoru IX na IXa a inhibuje aktivitu faktoru IXa. Kofaktory ve formě dvojmocných kovů jsou nutné pro aktivitu, kdy 16

·· ·· * · · · • ♦ · · f·· ··· • · ·· mAb vykazuje vyšší preferenci pro Ca2"" než pro Mn2~. Pozorovaná ICso v APTT testu je přibližně 50 nM. BC2 mAb vykazuje mezidruhovou zkříženou reaktivitu s krysami a její izotyp je IgG2a.

Dalšími vhodnými dárcovskými protilátkami jsou myší mAb BC1, 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9. Tyto mAb jsou charakterizovány inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek těchto mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 90 až 100 sekund pro 9E4(2)F4 a okolo 80 sekund pro 11G4(1)B9. BC1 mAb se také váže na faktor IXa, inhibuje aktivitu faktoru IXa, ale neinhibuje konversi faktoru IX na IXa. Kofaktory ve formě dvojmocných kovů nejsou nutné pro její aktivitu. Pozorovaná ICso v APTT testu je přibližně 35 nM. BC2 mAb je izotyp IgGl.

Ještě jinou vhodnou dárcovskou protilátkou charakterizovanou inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas je myší mAb HFXLC. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek HFXLC mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 50 až 60 sekund. HFXLC mAb se také váže na lehký řetězec faktoru X a inhibuje aktivitu faktoru X/Xa. Pozorovaná ICso v APTT testu je přibližně 20 nM.

Ještě jinou vhodnou dárcovskou protilátkou charakterizovanou inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas je myší mAb HFXI. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek HFXI mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 100 sekund. HFXI mAb se také váže na faktor XI a inhibuje aktivitu faktoru Xl/XIa. Pozorovaná ICso v APTT testu je přibližně 30 nM. Ačkoliv není zamýšlena vazba na jakoukoliv jednotlivou teorii «1 4 4 4 · • II» 4 4 4 4 • · · 4 4 4 4 4 4 4 • · · 4 4 4 4 4 4 • · · * 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 « 4 4 4 4 4 4 4 9 4 4 týkající se mechanismu účinku, zdá se, že tyto mAb regulují koagulaci nekompetitivním nebo alosterickým mechanismem, čímž je dosaženo pouze částečné inhibice.

Tento vynález není omezen na použití BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI nebo jejich hypervariabilních (t.j. CDR) sekvencí. Jakákoliv jiná vhodná vysokoafinitní protilátka charakterizovaná neutralizační aktivitou s vlastním omezením a odpovídajícími CDR může za ně být substituována. Identifikace dárcovské protilátky v následujícím popisu jako BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(l)B9, HFXLC nebo HFXI je provedena pouze pro ilustraci a zjednodušení popisu. Předkládaný vynález také obsahuje použití Fab fragmentů nebo F(ab')2 fragmentů odvozených od protilátek proti určitým lidským koagulačním faktorům nebo kofaktorům. Tyto fragmenty jsou použitelné jako činidla mající vlastní omezenou neutralizační aktivitu proti koagulačním faktorům, výhodně proti faktorům IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, VlI/VIIa nebo trombinu. Fab fragment obsahuje celý lehký řetězec a amino koncovou část těžkého řetězce. F(ab')2 je fragment tvořený dvěma Fab fragmenty spojenými disulfidovými vazbami. mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC a HFXI a další podobné protilátky s vysokou afinitou jsou zdroje pro Fab fragmenty a F(ab')2 fragmenty, které mohou být získány běžnými prostředky, například štěpením mAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními metodami. Tyto Fab a F(ab') fragmenty jsou použitelné sami o sobě jako terapeutická, profylaktická nebo diagnostická činidla, a jako dárci sekvencí obsahujících variabilní regiony a CDR sekvence použitelné pro tvorbu rekombinantních nebo humanizovaných protilátek jak je zde ·· • * • f MM • « • * • 0 • • e • · • · • • • • • • · '· · • • · • • • ® • · · 000 • • • • • 0 t • • · · · • · · · • 0 0 0 • · • · popsáno. Fáb a F(ab1)2 fragmenty mohou být konstruovány pomocí kombinatoriálních fágových knihoven (viz například Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433 - 455 (1994)) nebo pomocí přeskupování imunoglobulinových řetězců (viz například Marks et al., Bio/Technology, 10: 779 - 783 (1992)), kde oba odkazy jsou zde uvedeny ve své úplnosti, kde je imunoglobulinový Fd nebo vh z vybrané protilátky (například BC2) asociován s repertoárem imunoglobulinových lehkých řetězců, v (nebo νχ) za vzniku nových Fab. Naopak, imunoglobulinový lehký řetězec z vybrané protilátky může být asociován s repertoárem imunoglobulinových těžkých řetězců, vh (nebo Fd) za vzniku nových Fab. Fab proti faktoru IX s neutralizační aktivitou s vlastním omezením mohou být získány asociací Fd mAb BC2 s repertoárem imunoglobulinových lehkých řetězců. Proto je možné získat neutralizační Fab s jedinečnou sekvencí (nukleotidovou a aminokyselinovou) technikou přeskupování řetězců. mAb BC2 a další protilátky popsané výše mohou mít sekvence, jako jsou variabilní peptidové sekvence těžkých a/nebo lehkých řetězců, sekvence pracovních rámečků, CDR sekvence, funkční fragmenty a jejich analogy, a nukleotidové sekvence, které je kódují, použitelné při vývoji a získání různých pozměněných protilátek, které jsou charakterizovány antigenní vazebnou specificitou dárcovské protilátky.

Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující variabilní peptidové sekvence lehkého řetězce a těžkého řetězce, jsou také užitečné pro mutagenní vložení specifických změn do sekvence nukleových kyselin kódujících CDR nebo regiony pracovního rámečku a pro inkorporaci výsledných modifikovaných nebo fúsních sekvencí nukleové kyseliny do plasmidu pro expresi. Například, silentní substituce v nukleotidové sekvenci pracovního rámečku a CDR kódujících regionů může být použita pro vytvoření míst pro restrikční enzymy, která usnadní inserci mutovaných CDR a/nebo regionů pracovních rámečků. Tyto CDR kódující regiony mohou být použity při konstrukci humanizovaných protilátek podle předkládaného vynálezu.

Sekvence nukleových kyselin a aminokyselin pro variabilní region těžkého řetězce BC2 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 5a SEQ ID NO: 7. CDR sekvence z tohoto regionu j sou uvedeny v SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9a SEQ ID NO: 10.

Sekvence nukleových kyselin a aminokyselin pro variabilní region lehkého řetězce BC2 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 11. CDR sekvence z tohoto regionu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 14.

Vzhledem k degeneraci genetického kódu mohou být konstruovány různé kódující sekvence, které kódují variabilní aminokyselinové sekvence lehkého a těžkého řetězce a CDR sekvence podle předkládaného vynálezu, stejně jako jejich funkční fragmenty a analogy, které mají antigenní specificitu dárcovské protilátky. Izolované sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující variabilní peptidové sekvence řetězců nebo CDR mohou být použity pro produkci pozměněných protilátek, například chimérických nebo humanizovaných protilátek, nebo jinak zpracovaných protilátek podle předkládaného vynálezu, pokud jsou operativně navázány s •9 44 99 9999 • · ·# 9 9 · · · • • · • 4 • · · · • • 4 4 4 • 9 9 9 9 ·. · 999 444 • · · «9 • · • 4 44 • # 4 4 druhým imunoglobulinovým partnerem. Mělo by být uvedeno, že kromě izolovaných sekvenci nukleových kyselin kódujících části pozměněné protilátky a protilátek jak jsou zde popsány obsahuje předkládaný vynález také další takové sekvence nukleových kyselin, jako jsou sekvence komplementární k přirozeným CDR-kodujícím sekvencím nebo sekvence komplementární k modifikovaným lidským regionům pracovních rámečků sousedících s CDR-kódujíčími regiony. Použitelné DNA sekvence zahrnují ty sekvence, které hybridizují s DNA sekvencemi za přísných hybridizačních podmínek. Viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 - 389. Příkladem takových přísných hybridizačních podmínek je hybridizace při 4xSSC při 65 °C, následovaná promytím v 0,lxSSC při 65 °C po dobu jedné hodiny. Alternativně, přísnými hybridizačními podmínkami je 50% formamid, 4xSSC při 42 °C. Výhodně mají tyto hybridizující DNA sekvence délku alespoň 18 nukleotidů, t.j. přibližně délku CDR.

Pozměněné imunoglobulinové molekuly mohou kodovat pozměněné protilátky, kam patří zpracované protilátky jako jsou chimérické protilátky a humanizované protilátky. Požadovaný pozměněný imunoglobulinový kódující region obsahuje CDR-kodující regiony, které kódují peptidy mající antigenní specificitu protilátky proti faktoru IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, VlI/VIIa nebo trombinu, výhodně protilátky s vysokou afinitou, jako jsou ty, které poskytuje předkládaný vynález, insertované do prvního imunoglobulinového partnera, jako je region lidského pracovního rámečku nebo lidský variabilní imunoglobulinový region. Výhodně je první imunoglobulinový partner operativně navázán ·· ·· ···· ·· 0n ♦ · · m • ♦ • ♦ » 0 0 • · • · • • · 0 0 • · • · · • « ·»· 00 0 * · * · • ♦ • 0 ···· ···· • · • 0 *· 9 0 na druhý imunoglobulinový partner. Druhý itrtunoglobulinový partner je definován výše a může obsahovat sekvence kódující druhý požadovaný region protilátky, například Fc region. Druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující jiný imunoglobulin, se kterým je konstantní region lehkého nebo těžkého řetězce fúsován v rámečku nebo pomocí linkerové sekvence. Zpracované protilátky proti funkčním fragmentům nebo analogům koagulačních faktorů mohou být vyvinuty tak, aby vyvolávaly zvýšenou vazbu se stejnou protilátkou.

Druhý imunoglobulinový partner může být také asociován s efektorovým činidlem definovaným výše, včetně neproteinových nosičových molekul, na které může být druhý imunoglobulinový partner operativně navázán běžnými prostředky. Fúse nebo vazba mezi druhým imunoglobulinovým partnerem, například protilátkovou sekvencí, a efektorovým činidlem, může být zprostředkována jakýmikoliv vhodnými prostředky, například běžnými kovalentními nebo iontovými vazbami, proteinovou fúsí nebo hetero-bifunkčními zesilovacími činidly, například karboimidem, glutaraldehydem a podobně. Takové techniky jsou v oboru známé a jsou popsané v běžných chemických a biochemických textech. Dále, běžné linkerové sekvence, které jednoduše dodávají dostatečný prostor mezi druhým imunoglobulinovým partnerem a efektorovým činidlem mohou také být konstruovány do pozměněného imunoglobulinového kódujícího regionu. Vývoj takových linkerů je v oboru dobře znám.

Kromě toho, pro zvýšení exprese mohou být signální sekvence • · • * ♦ · • Ml * · ♦ « • · * · • • · • · • • • · 1» • · • · • Φ » · · • * • · · • · * • • • · • « • ···« • · · · «· • · * * • # pro molekuly podle předkládaného vynálezu modifikovány technikami v oboru známými. Výhodná pozměněná protilátka obsahuje peptidové nebo proteinové sekvence variabilního lehkého a/nebo těžkého řetězce mající antigenní speciíicitu mAb BC2, například vh a V^ řetězce. Ještě další výhodná protilátka podle předkládaného vynálezu je charakterizována aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden, a výhodně všechny, CDR variabilního regionu těžkého a/nebo lehkého řetězce molekuly myší protilátky BC2 a zbývající sekvence odvozené z lidského zdroje, nebo jeho funkčního fragmentu nebo analogu. V ještě dalším provedení může být pozměněná protilátka podle předkládaného vynálezu připojena na další činidlo, například, rekombinantní DNA technologie může být použita pro produkci pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu, ve které je Fc fragment nebo CH2 CH3 doména kompletní molekuly protilátky nahrazena enzymem nabo jinou detekovatelnou molekulou (t.j. polypeptidovým efektorem nebo reportérovou molekulou) .

Druhý imunoglobulinový partner může být také operativně navázán na neimunoglobulinový peptid, protein nebo jeho fragment heterologní k CDR obsahující sekvenci mající antigenní speciíicitu pro koagulační faktor, výhodně pro faktor IX/IXa, X/Xa, Xl/Xla, VlII/VIIIa a V/Va, VlI/VIIa nebo trombin. Vzniklý protein může po expresi vykazovat jak antigenní speciíicitu, tak charakteristiky non-imunoglobulinu. Tyto charakteristiky fúsního partnera mohou být, například, funkční charakteristiky jako je jiná vazba nebo receptorová doména nebo terapeutické charakteristiky, pokud je fúsní partner sám o sobě terapeutickým 23 • ♦

• · «· #* • · · · #· ·· proteinem nebo další antigenní charakteristiky.

Další výhodný protein podle předkládaného vynálezu může obsahovat kompletní molekulu protilátky, mající kompletní lehký a těžký řetězec nebo jakýkoliv jejich fragment, jako je Fab nebo F(ab')2 fragment, dimer těžkých řetězců nebo jejich jakýkoliv minimální rekombinantní fragment, jako je Fv nebo jednořetězcová protilátka (SCA) nebo jakoukoliv jinou molekulu se stejnou specificitou jako má vybraná dárcovská mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC nebo HFXI. Takový protein může být použit ve formě pozměněné protilátky nebo může být použit ve své nefúsované formě.

Pokud je druhý imunoglobulinový partner odvozen od protilátky jiné než od dárcovské protilátky, například od pracovního rámečku nebo konstantních regionů jakéhokoliv izotypu nebo třídy imunoglobulinu, vzniká zpracovaná protilátka. Zpracované protilátky mohou obsahovat imunoglobulinové (Ig) konstantní regiony a variabilní regiony pracovního rámečku z jednoho zdroje, například z akceptorové protilátky, a jeden nebo více (výhodně všechny) CDR z dárcovské protilátky, například z protilátek proti faktoru IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIHa a V/Va, VlI/VIIa nebo trombinu, které jsou zde popsány. Kromě toho, mohou být provedeny takové alterace, například delece, substituce nebo adice, variabilních domén pracovního rámečku lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové protilátky, nebo CDR regionů dárcovské protilátky, které zachovávají antigenní vazebnou specificitu dárcovské protilátky.

Takové zpracované protilátky jsou navrženy tak, aby využívaly jeden (nebo oba) variabilní lehké a/nebo těžké řetězce mAb proti 24 ·· Μ « « · · ·· ·* • · · · • · * · • · · · · « • · «I f ♦ koagulačnímu faktoru (volitelně modifikované jak je zde popsáno) nebo jeden nebo více CDR lehkého nebo těžkého řetězce. Zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu vykazují neutralizační aktivitu s vlastním omezením.

Takové zpracované protilátky mohou obsahovat humanizované protilátky obsahuj íc regiony praciovního rámečku vybraného lidského imunoglobulinu nebo subtypu nebo chimérické protilátky obsahující konstantní region lidských lehkých a těžkých řetězců fúsovaný s funkčními fragmenty protilátky proti koagulačnímu faktoru. Vhodné lidské (nebo jiné zvířecí) akceptorové protilátky mohou být vybrány z konvenční databaze, jako je například KABATR databaze, Los Alamos databaze, a Swiss Protein databaze, podle homologie s nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi dárcovské protilátky. Lidská protilátka charakterizovaná homologií s regiony pracovních rámečků dárcovské protilátky (na úrovni aminokyselin) může být vhodná pro dodání variabilního regionu pracovního rámečku těžkého řetězce pro inserci CDR z dárcovské protilátky. Vhodná akceptorová protilátka schopná dodání variabilního regionu pracovního rámečku lehkého řetězce může být vybrána podobným způsobem. Mělo by být uvedeno, že není nutné, aby těžké a lehké řetězce akceptorové protilátky pocházely ze stejné akceptorové protilátky. Výhodně jsou heterologní pracovní rámečky a konstantní regiony vybrány ze tříd a izotypů lidských protilátek, jako jsou IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. Nicméně, akceptorová protilátka nemusí obsahovat pouze lidské imunoglobulinové proteinové sekvence. Například, může být konstruován gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část lidského imunoglobulinového řetězce fúsována na DNA sekvenci kódující neimunoglobulinovou 25 25 9 9

··

Μ *· • · · · • · • · · · ·Μ« aminokyselinovou sekvenci jako je polypeptidový efektor nebo reportérové molekula.

Zejména výhodná humanizovaná protilátka obsahuje CDR BC2 insertované do regionů pracovního rámečku vybrané lidské protilátkové sekvence. Pro neutralizační lidské protilátky jsou jeden, dva nebo výhodně tři CDR z variabilních regionů těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátky proti faktoru IX insertovány do regionů pracovního rámečku vybrané lidské protilátkové sekvence, takže nahrazují přirozené CDR této druhé uvedené protilátky. Výhodně, u humanizované protilátky, byla variabilní doména v obou lidských těžkých a lehkých řetězcích upravena náhrazením jednoho nebo více CDR. Je možné použít všech šest CDR, nebo je možné použít různé kombinace méně než šesti CDR. Výhodně je nahrazeno všech šest CDR. je možné nahradit CDR pouze v lidském těžkém řetězci a použít jako lehký řetězec nemodifikovaný lehký řetězec z lidské akceptorové protilátky, ještě jako jiná alternativa může být kompatibilní lehký řetězec vybrán z jiné lidské protilátky za použití konvenční databaze protilátek.

Zbytek zpracované protilátky může být odvozen od jakéhokoliv vhodného lidského akceptorového imunoglobulinu.

Zpracovaná humanizovaná protilátka tak výhodně má strukturu přirozené lidské protilátky nebo jejího fragmentu a má kombinaci vlastností nutných pro účinné terapeutické použití, například pro léčbu trombotických nebo embolických onemocnění u lidí.

Nejvýhodněji mají humanizované protilátky aminokyselinové sekvence těžkého řetězce uvedené v SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52 nebo SEQ ID NO: 89. Také nej výhodněji mají humanizované Μ ·· »· *·*« »· ·· 26 protilátky aminokyselinové sekvence lehkého řetězce uvedené v SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78 nebo SEQ ID NO: 99. Zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249413, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249415, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249416, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 62. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249417, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 74. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 257731, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 257732, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.

Odborníkům v oboru bude jasné, že zpracovaná protilátka může být dále modifikována změnami v aminokyselinách variabilní domény bez nezbytného volivnění specificity a vysoké afinity dárcovské protilátky (t.j. analog). Předpokládá se, že aminokyseliny těžkého a lehkého řetězce mohou být substituovány inými aminokyselinami v pracovním rámečku variabilní domény nebo v CDR nebo v obou. Tyto substituce mohou být dodány dárcovskou protilátkou nebo konsensuálními sekvencemi z určité podskupiny. 27 ·♦ ·· ·· ···· ♦ · · · » · * ♦ · · · · · • · · t « · ···· ···· ·· ··

Kromě toho, konstantní region může být pozměněn tak, aby se zvýšily nebo snížily selektivní vlastnosti molekul podle předkládaného vynálezu. Například, dimerizace, vazba na Fc receptory nebo schopnost vazby a aktivace komplementu (viz například Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105 - 108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem. 269: 3469 - 3474 (1994), Winter et al., EP-307434-B).

Pozměněná protilátka, která je chimérická protilátka, se liší od humanizovaných protilátek popsaných výše tím, že obsahuje úplné variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce non-lidské dárcovské protilátky, včetně regionů pracovního rámečku, v asociaci s konstantními regiony lidského imunogl obul inu pro oba řetězce. Předpokládá se, že chimérické protilátky, které mají další non-lidské sekvence vzhledem k humanizovaným protilátkám podle předkládaného vynálezu, mohou vyvolávat signifikantní imunitní odpověď u lidí.

Takové protilátky jsou použitelné pro prevenci a léčbu trombotických a embolických onemocnění, jak je popsáno dále. Výhodně jsou sekvence variabilních lehkých a/nebo těžkých řetězců a CDR mAb BC2 nebo jiné vhodné dárcovské protilátky, např. BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI a jejich kódující nukleotidové sekvence, použity při konstrukci pozměněných protilátek, výhodně humanizovaných protilátek, podle předkládaného vynálezu v následujícím procesu. Stejné nebo podobné techniky mohou být také použity pro vývoj jiných provedení předkládaného vynálezu. 28 ·· ·· ·· MM ·· ·· • · · · ♦· · · · » · • · · · · · · » · * * · · · · · ······ • · ♦ · · · ··

Hybridom produkující vybranou dárcovskou protilátku, například myší protilátku BC2, je konvenčně klonován a DNA jejích variabilních regionů lehkých a těžkých řetězců je získána technikami známými odborníkům v oboru, například technikami popsanými v Sambrook et al., "Molecular Clining: A Laboratory Manual", 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) . Variabilní regiony těžkého alehkého řetězce BC2 obsahující alespoň CDR kódující regiony a ty části regionů pracovního rámečku variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb, které jsou nutné pro zachování vazebné specificity dárcovské mAb, stejně jako zbylé od imunoglobulinu-odvozené části protilátkového řetězce odvozené od lidského imunoglobulinu jsou získány za použití polynukleotidového primeru a reversní transkriptasy. CDR kódující regiony jsou identifikovány za použití známé databaze a srovnáním s ostatními protilátkami.

Myší/lidská chimérická protilátka může být potom připravena a může být testována na vazebnou schopnost. Taková chimérická protilátka obsahuje úplné VH a Vl regiony non-lidské protilátky v asociaci s konstantními regiony lidského Ig pro oba řetězce.

Homologní regiony pracovního rámečku variabilního regionu těžkého řetězce z idské protilátky jsou identifikovány za použití počítačové databaze, například KABATR a lidská protilátka mající homologii s BC2 je vybrána jako akceptorová protilátka. Sekvence syntetických variabilních regionů těžkého řetězce obsahující BC2 CDR-kodující regiony v pracovních rámečkách lidské protilátky jsou navrženy s volitelnou nukleotidovou náhradou v regionech pracovního rámečku pro vložení restrikčních míst. Tato navržená sekvence je potom syntetizována za použití dlouhých syntetických ·· ·· ·· ···· • 9 ·· • · · t ♦ · · • · • · • · • · · • · • · • · • · · · · ··· ··· • · • · · · • • ···· ···· ·· ·· ·· ·# oligomerů. Alternativně může být navržená sekvence syntetizována pomoci přesahujících oligonukleotidů, amplifikováných polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) a s opravenými chybami. Vhodný variabilní region pracovního rámečku lehkého řetězce může být navržen stejným způsobem.

Humanizovaná protilátka může být odvozena od chimérické protilátky, nebo výhodně, může být vyrobena synteticky insercí CDR regionů z lehkých a těžkých řetězců dárcovské mAb do vybraných pracovních rámečků lehkého a těžkého řetězce. Alternativně může být humanizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu připravena za použití standartních technik mutagenese. Tak vzniklá humanizovaná protilátka obsahuje lidské regiony pracovního rámečku a CDR kódující regiony dárcovské mAb. Potom může proběhnou následná manipulace se zbytky pracovního rámečku. Vzniklá humanizovaná protilátka může být exprivována v rekombinantní hostitelské buňce, například COS, CHO nebo myelomové buňce. Jiné humanizované protilátky mohou být připraveny za použití této techniky na jiných vhodných non-lidských protilátkách specifických pro faktor IX nebo pro jiný koagulační faktor, s neutralizační aktivitou s vlastním omezením a vysokou afinitou.

Konvenční expresní vektor nebo rekombinantní plasmid je produkován umístěním těchto kódujících sekvencí pro pozměněnou protilátku v operativním spojení s konvenčními regulačními kontrolními sekvencemi schopnými kontroly replikace a exprese v, a/nebo sekrece z, hostitelské buňky. Regulační sekvence zahrnují promotorové sekvence, například CMV promotor, a signální sekvence, které mohou být odvozeny od známých protilátek. Podobně může být produkován druhý expresní vektor mající DNA sekvenci, 00 ·· ·· Mil ·· 00 • · • · • · · • · 0 0 • • • · · • 0 0- · • • • · · · · • 0 0 • · · • • • · · · 0 • ···· ···· ·· ·· • 0 • · která kóduje lehký a těžký řetězec komplementární protilátky. Výhodně je tento druhý expresní vektor identický jako ten první, kromě kódujících sekvencí a selektovatelných markérů, aby se co možná nejlépe zajistila funkční exprese každého polypeptidového řetězce. Alternativně mohou být kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec pozměněné protilátky umístěny v jednom vektoru.

Vybraná hostitelská buňka je ko-transfektována běžnými technikami první a druhým vektorem (nebo je jednoduše transfektována jediným vektorem) za vzniku transfektováné hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu obsahující buď rekombinantní, nebo syntetické lehké a těžké řetězce.

Transfektováná buňka je potom kultivována běžnými technikami za produkce zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu. Humanizovaná protilátka, která obsahuje asociaci rekombinantního těžkého a/nebo lehkého řetězce je vyšetřována v kultuře vhodným testem jako je ELISA nebo RIA. Podobné konvenční techniky mohou být použity pro konstrukci jiných pozměněných protilátek a molekul podle předkládaného vynálezu.

Vhodné vektory pro kroky klonování a subklonování použité ve způsobech a v konstrukci přípravků podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem. Například, může být použita pUC serie klonovacích vektorů, jako je pUCl9, který je komerčně dostupný od dodavatelských firem, jako je Amersham nebo Pharmacia. Kromě toho, pro klonování může být použit jakýkoliv vektor, který je schopen snadné replikace, má dostatek klonovacích míst a selektovatelných genů (např. pro antibiotickou resistenci) a umožňuje snadnou manipulaci. Proto není výběr klonovacího vektoru limitujícím faktorem v tomto vynálezu. 31 ·· ·· «··· ·· t* • · · · · · · ···· • t · · · · · t t • · · · · · · ··· ··· ·· ···· t · ···· ···· ·· «· ·· ··

Podobně, vektory použité pro expresi zpraovaných protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem z jakýchkoliv běžných vektorů. Vektory také obsahují vybrané regulační sekvence (jako jsou CMV promotory) , které řídí replikaci a expresi heterologních DNA sekvencí ve vybrané hostitelské buňce. Tyto vektory obsahují výše popsané DNA sekvence, které kódují zpracovanou protilátku nebo pozměněný imunoglobulinový kódující region. Kromě toho, vektory mohou obsahovat vybrané imunoglobulinové sekvence modifikované insercí požadovaných restrikčních míst pro snadnou manipulaci.

Expresní vektory mohou také být charakterizovány geny vhodnými pro amplifikační expresi heterologních DNA sekvencí, například savčího genu pro dihydrofolat reduktasu (DHFR). Další výhodné vektorové sekvence obsahují póly A signální sekvence, jako je sekvence z hovězího růstového hormonu (BGH) a promotorové sekvence pro betaglobin (betaglopro). Expresní vektory zde použitelné mohou být syntetizovány technikami, které jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Složky takových vektorů, například replikony, selekční geny, enhancery, promotory, signální sekvence a podobně, mohou být získány z komerčních nebo přírozdních zdrojů nebo mohou být syntetizovány známými postupy pro použití v řízení exprese a/nebo sekrece produktu rekombinantní DNA ve vybraném hostiteli. Jiné vhodné expresní vektory, kterých je mnoho známo v oboru pro expresi v savčích, hmyzích, bakteriálních, kvasinkových buňkách a houbách, mohou být také vybrány pro tento účel. Předkládaný vynález také obsahuje buněčné linie transfektováné rekombinantním plasmidem obsahujícím kódující sekvence ·· M 94 9999 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • 9 9 9 9- 9 • • 9 9 9 9 9 • 99 • 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9999 99 99 99 99 zpracovaných protilátek nebo jejich pozměněných iraunoglobulinových molekul. Hostitelské buňky užitečné pro klonování a jiné manipulace s těmito klonovacími vektory jsou také běžné. Nicméně, nej výhodněji jsou buňky kmenů E. coli použity pro replikaci klonovacích vektorů a v dalších krocích v konstrukci pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu.

Vhodné hostitelské buňky nebo buněčné linie pro expresi zpracovaných protilátek nebo pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu jsou výhodně savčí buňky jako je CHO, COS, fibroblasty {například 3T3) a.myeloidní buňky. Mohou být použity lidské buňky, což umožňuje lidský charakter glykosylace. Alternativně mohou být použity jiné eukaryotické buněčné linie. Výběr vhodných savčích hostitelských buněk a způsoby pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, vyšetřování a produkci produktu a přečištění jsou v oboru dobře známé. Viz například Sambrook et al., výše.

Bakteriální buňky mohou sloužit jako hostitelské buňky vhodné pro expresi rekombinantních Fab podle předkládaného vynálezu (viz například Pluckthun, A. Immunol. Rev. 130: 151 - 188 (1992)). Nicméně, vzhledem k tendenci proteinů exprivovaných v bakteriálních buňkách být v neskládané nebo nesprávně skládané formě nebo v neglukosylováné formě by měl být jakýkoliv rekombinantní Fab produkovaný v bakteriálních buňkách vyšetřován na zachování své antigenní vazebné schopnosti. Pokud bude molekula exprivovaná v bakteriální buňce produkována ve správně složené formě, pak bude bakteriální buňka vhodným hostitelem. Například, různé kmeny E. coli použité pro expresi jsou dobře známé jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologie. Mohou být také použity různé kmeny B. subtilis, Streptomyces nebo jiných 33 ·* »» ·# ··»· 99 99

« ♦ · · 9 9 « · # · I • · · » » ·. · « 9 ♦ C> · 9 9 99 999 9·· 9 9 «9 9 9 9 9 9999 9999 99 94 99 99 bacilů a podobně.

Pokud je to žádoucí, mohou být také kvasinky použity jako hostitelské buňky, jak je odborníkům známo, stejně jako hmyzí buňky, např. Drosofilové a Lepidopterové a virové expresní systémy. Viz například Miller et al., Genetic Engeneering 8: 277 - 298, Plenům Press (1986) a odkazy zde citované.

Obecné metody, kterými mohou být konstruovány vektory podle předkládaného vynálezu, transfekční metody nutné pro produkci hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu a kultivační metody nezbytné pro produkci pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu z takových hostitelských buněk jsou všechno běžné techniky. Podobně, po produkci může být pozměněná protilátka podle předkládaného vynálezu přečištěna z obsahu buněčné kultury standartními technikami, včetně srážení síranem amonným, afinitních kolon, chromatografie na koloně, gelové elektroforesy a podobně. Takové techniky jsou v oboru známé a neomezuj i tento vynález.

Ještě jiná metoda pro produkci humanizovaných protilátek může využívat expresi v transgenním zvířeti, jak je popsáno v U.S: patentu č. 4873316. Tento patent se týká expresního systému využívajícího zvířecího kaseinového promotoru který, pokud je transgenně inkorporován do savce, umožňuje samicím produkovat požadovaný rekombinantní protein v jejich mléce.

Po expresi vhodnou metodou je zpracovaná protilátka potom vyšetřována na svou in vitro aktivitu za použití vhodného testu. V současnosti jsou běžné ELISA testové formáty použity k hodnocení kvalitativní a kvantitativní vazby zpracované 34 ·» »i ·♦ · · · · «(i é# v · * % ♦ o * ···# • · ♦ * · * · · 8 • t # # 4 · » ······ * · ♦ * · · » λ ···**··« «.I# V · « · · · protilátky na faktor IX nebo na jiný vhodný koagulační faktor. Kromě toho, mohou být použity také jiné in vitro testy pro ověření neutralizační účinnosti před následnými klinickými studiemi na lidech, které jsou provedeny pro hodnocení přetrvávání zpracované protilátky v těle při obvyklých mechanismech klírens protilátky.

Podle postupů popsaných pro humanizované protilátky připravené z BC2 může odborník v oboru také konstruovat humanizované protilátky z jiných dárcovských protilátek, sekvencí variabilních regionů a CDR peptidů, které jsou zde popsány. Zpracované protilátky mohou být produkovány s pracovními rámečky variabilních regionů potenciálně rozpoznávanými jako "vlastní" příjemcem zpracované protilátky. Mohou být provedeny drobné modifikace pracovních rámečků variabilního regionu, které způsobí velké zvýšení vazby antigenu bez významného zvýšení imunogenicity pro příjemce. Takové zpracované protilátky mohou být účinně použity při léčbě lidí s nemocemi způsobenými koagulačními faktory. Takové protilátky mohou být také užitečné v diagnostice takových stavů.

Tento vynález se také týká způsobů pro inhibici trombosy u zvířat, zejména u lidí, které obsahují podání účinné dávky monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením. Výhodně je koagulační faktor z vnitřní nebo ze společné koagulační dráhy. Nejvýhodněji je monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru anti-faktor IX, anti-faktor IXa, anti-faktor X, anti-faktor Xa, anti-faktor XI, anti-faktor Xla, anti-faktor VIII, anti-faktor Vlila, anti-faktor V, anti-faktor Va, anti-faktor VII, anti-faktor Vila nebo anti trombinová protilátka. mAb může zahrnovat jednu nebo 35 ·· #4 * * »t»« · * ·« * · * · ♦ · · ¢1 * * · « · «.··· ú · ψ · C. # t ····«· * · # · « · * · • •O ···· |« ·· tu více zpracovaných protilátek nebo pozměněných protilátek zde popsaných nebo jejich fragmentů.

Alternativně může být kyselina acetylsalicylová podána v kombinaci s monoklonální protilátkou proti koagulačnímu faktoru, v některých případech snižuje kombinovaná terapie terapeuticky účinnou dávku monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru.

Terapeutická odpověď produkovaná použitím molekul podle předkládaného vynálezu je produkována vazbou na příslušný koagulační faktor a následnou inhibicí koagulační kaskady, která má vlastní omezení. Proto jsou molekuly podle předkládaného vynálezu, v přípravcích a formulacích vhodných pro terapeutické použití, vysoce žádoucí pro osoby náchylné k abnormální srážlivé aktivitě nebo u kterých proběhla abnormální srážlivá aktivita asociovaná s, ale bez omezení, infarktem myokardu, nestabilní angínou pectoris, fibrilací síní, mrtvicí, poškozením ledvin, plicní embolií, trombosou hlubokých žil a arteficiálními orgány a protesami.

Pozměněné protilátky, protilátky a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být také použity spolu s jinými protilátkami, zejména s lidskými mAb reaktivními s jinými markéry (epitopy) odpovědnými za stavy, pro které je zpracovaná protilátka podle předkládaného vynálezu určena.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu by měla být vhodná pro léčbu abnormálních stavů srážení krve od 1 dne do asi 3 týdnů, nebo podle potřeby. Toto představuje významnou výhodu oproti v současnosti používaným antikoagulanciím heparinu a warfarinu. Dávka a trvání léčby souvisí s relativním přetrváváním molekul podle předkládaného vynálezu v lidské cirkulaci a může být upravena odborníkem na základě určitého léčeného stavu a celkového stavu pacienta.

Způsob podání terapeutického činidla podle předkládaného vynálezu může být jakýkoliv způsob vhodný pro podání činidla pacientovi. Pozměněné protilátky, protilátky, zpracované protilátky a jejich fragmenty a farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro parenterální podání, t.j. subkutání, intrámuskulární, intravenosní nebo intranasální podání.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být připravena jako farmaceutické přípravky obsahující účinné množství zpracované (například humanizované) protilátky podle předkládaného vynálezu jako aktivní složky ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Alternativně může farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu také obsahovat kyselinu acetylsalicylovou. V profylaktickém činidle podle předkládaného vynálezu je preferována vodná suspense nebo roztok obsahující zpracovanou protilátku, výhodně pufrovaný na fyziologické pH, ve formě připravené pro injekci. Přípravky pro parenterální budou obyčejně obsahovat zpracovanou protilátku podle předkládaného vynálezu nebo jejich směs rozpuštěnou ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Mohou být použity různé vodné nosiče, například 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky musí být sterilní a prosté jakýchkoliv příměsí. Tyto roztoky mohou být sterilizovány jakýmikoliv běžnými, dobře známými sterilizačními technikami (například filtrací). Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné substance, které jsou nutné pro přiblížení se 37 ·· ·9 * · ···· 4· * * • · · i · ♦ · # · « · 9 ♦ * · · ft. · · » 9 · » * * 9 9 ··«··· • ♦ *··# «9 «····*·· 99 ««i ·« «9 fyziologickým podmínkám, jako jsou činidla upravující pH a pufrovací činidla atd. Koncentrace protilátky podle předkládaného vynálezu v takové farmaceutické formulaci se může velmi lišit, t.j. od méně než asi 0,5%, obvykle alespoň 1%, až do 15% nebo 20% hmotnosti a bude určena hlavně na základě objemů kapaliny, viskozity atd., podle určitého vybraného způsobu podání.

Proto, farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu pro intramuskulární injekci bude připraven tak, aby obsahoval 1 ml sterilní pufrované vody a okolo 1 ng až asi 100 mg, například od asi 50 ng do asi 30 mg nebo, výhodně, od 5 mg do 25 mg, zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu. Podobně, farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu pro intravenosní infusi bude připraven tak, aby obsahoval asi 250 ml sterilního Ringerova roztoku a okolo 1 mg do asi 30 mg a, výhodně, od 5 mg do 25 mg, zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu. Současné způsoby pro přípravu přípravků pro parenterální podání jsou dobře známé nebo budou známé odborníkům v oboru a jsou podrobněji popsány, například, v "Remington's Pharmaceutical Science", 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Je výhodné, aby terapeutické činidlo podle předkládaného vynálezu, pokud je ve farmaceutické přípravku, bylo v jednotkové dávkové formě. Vhodná terapeuticky účinná dávka může být odborníkem v oboru snadno určena. Pro účinnou léčbu trombotických nebo embolických onemocnění u lidí nebo u jiných zvířat by měla být jedna dávka asi 0,1 mg až asi 20 mg na kg tělesné hmotnosti proteinu nebo protilátky podle předkládaného vynálezu podána parenterálně, výhodně i.v. nebo i.m. Taková dávka může být, pokud je to nutné, opakována ve vhodných časových intervalech určených ošetřujícím lékařem v průběhu odpovědi na terapii.

Protilátky, pozměněné protilátky nebo jejich fragmenty zde popsané mohou být lyofilizované pro uskladnění a rekonstituované ve vhodném nosiči před použitím. Tato technika byla ukázána jako účinná pro běžné imunoglobuliny a mohou být použity v oboru známé techniky pro lyofilizaci a rekonstituci. Předkládaný vynález bude nyní popsán s ohledem na následující specifické, nelimitující příklady. Příklady provedení vynálezu Příklad 1 Příprava a vyšetřování monoklonálních protilátek proti

faktoru IX

Samicím Balb/c myší byl injekčně podán lidský faktor IX přečištěný jak je popsáno v Jenny, R. et al., Prep. Biochem. 16: 227 - 245 (1986). Typicky dostala každá myš počáteční injekci 100 /*g proteinu rozpuštěného v 0,15 ml fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS) ve směsi s 0,15 ml kompletního Freundova adjuvans. Dosycovací imunizace 50 μg proteinu v 0,15 ml PBS s 0,15 ml inkompletního Freundova adjuvans byly podávány přibližně dvakrát týdně v průběhu 2-3 měsíců. Po konečné dosycovací dávce bylo myším podáno 50 μg faktoru IX v PBS tři dny před fúsí buněk sleziny/myelomových buněk. Buňky sleziny byly izolovány z imunizovaných myší a fúsovány s NS-1 myelomovými buňkami (Kohler, G. et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 - 295, (1976)), za použití polyethylenglykolu jak popisuje Oi, V.T. et 39 • » • · · · · # • · 39 • » • · · · · # • · • · • · · * • · 9 9 9 9 ·«·· 9 · • · * φ

• <* · I •·» 9 3 9 9 9 ·♦ Ψ9 al., v "Selected Methods in Cellular Itranunology", Mishell, B.B. a Shigii, S.M. vyd., Freeman Press, San Francisko. Po fúsi byly buňky re suspendovány v RPMI 1640 mediu obsahujícím 10% fetální telecí sérum a aliquoty byly umístěny do každé jamky 24-jamkové plotny obsahující 0,5 ml kondicionovaného media pro buňky peritoneální laváže. Následující den bylo do každé jamky dodáno 1,0 ml 2 x 10-4 M hypoxantinu, 8 x 10-7 M aminopterinu a 3,2 x 10_s M thymidinu v RPMI 1640 mediu obsahujícím 10% fetální telecí sérum. Buňky byly vyživovány po dobu 3-4 dní odstraněním poloviny media a nahrazením této poloviny čerstvým mediem obsahujícím 1 x 10~4 M hypoxantinu a 1,6 x 10_s M thymidinu. Přibližně o dva týdny později byl 1,0 ml hybridomního media odebrán z každé jamky a byl testován na protilátky proti faktoru IX za použití ELISA testu jak je popsán v Jenny, R.J. et al., v Meth. Enzymol. 222: 400 - 416 (1993). Stručně, faktor IX je imobilizován v plastových jamkách 96-jamkových mikrotitračních ploten. Hybridomní supernatanty nebo ředění přečištěné protilátky jsou potom inkubovány v jamkách. Jamky jsou potom promyty a přítomnost komplexů protilátka/antigen je potom detekována kozí anti-myší imunoglobulinovou druhou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou a chromogenním substrátem o-dianisidinem.

Jamky obsahující protilátky proti faktoru IX byly subklonovány limitujícím ředěním a byly kultivovány v 96-jamkových plotnách. Supematant z klonovaných hybridomních buněčných kultur byl potom vyšetřován na protilátku k faktoru IX ELISA testem popsaným výše a buňky z pozitivních hybridomů byly expandovány, zmrazený, uskladněny v kapalném dusíku a potom kultivovány v ascitických tumorech na myších. 40 « · 9 * 0 · * · * · ·# »· • · t ♦ • ♦ * • f • « • • • ♦ • • I • é • • • * · • * • * · • · · • • • · * 0 0 • • IM • 0 0 0 • * • · Příklad 2

Omezený účinek protilátek proti koagulačním faktorům v koagulaci Účinek zvyšujících se koncentrací protilátek proti koagulačním faktorům na aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) lidské plasmy byl určen fibrometrem (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) za použití Baxterova refemčního postupu LIB0293-J, revise 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey). Před začátkem pokusu byly 2 - 3 ml 0,02-M CaCl2 v 5 ml tubě umístěny do zahřívací komůrky fibrometru. Vzorky lidské plasmy byly buď čerstvě odebrány a uchovávány na ledu nebo byly rekonstituovány podle návodu výrobce z Homeostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut) .

Nefrakcionováný heparin z prasečí střevní sliznice (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) , nízkomolekulární heparin z prasečí střevní sliznice (LovenoxR, enoxaparin sodný, Rhone-Poulac Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) nebo mAb antikoagulancia byla připravena jako přibližně 50 μΜ zásobní roztok a byla sériově ředěna přímo do testované plasmy. Prázdná plasma bez antikoagulancia byla vzata jako referenční vzorek.

Dvě fibroTubeR fibrometrové zkumavky byly naplněny 100 μΐ testované plasmy nebo 100 μΐ testované plasmy s antikoagulanciem a 125 μΐ aktinem aktivovaného cefaloplastinového činidla (Actin reagens, z králičího mozkového cefalinu v kyselině ellagové, 41 41 «« Μ·· «I «» • · · · ·· I # · · « • · · · ·- · « · • · ®· · ·# ···«»·* * · « · ·. · « » **····*· Μ «· · · * dostupné od Baxter Scientifics), v příslušném pořadí a byly umístěny do jamek fibrometru při 37 °C.

Po jedné minutě bylo 100 μΐ aktinového činidla přeneseno do zkumavky obsahující plasmu a obsah byl několikrát promíchán pipetou. Po třech minutách inkubace bylo přidáno 100 μΐ CaCl2, předehřátého na 37 °C, do směsi plasma - aktinové činidlo za použití Automatic Pipette/Timer-trigger (Becton-Dickinson). Byly zaznamenávány časy srážení a výsledky na obrázku 1 jsou presentovány jako časy srážení jako funkce konečné koncentrace antikoagulancia v celkovém testovaném objemu 300 μΐ. Nominální koncentrace faktoru IX v testu je 30 - 40 nM. Výsledky na obrázku 1 ukazují účinek zvyšujících se koncentrací myších mAb BC1 a BC2 proti faktoru IX na APTT čas.

Obě mAb inhibují srážení prodloužením APTT a obě mAb dosahují konečného saturačního účinku na APTT. ICso hodnoty jsou podobné při asi 35 nM a asi 50 nM pro BC1 a BC2, v příslušném pořadí, ale rozdíl v maximální odpovědi na tyto dvě protilátky je značný. Saturační koncentrace BC1 zvyšuje APTT o asi 50% na asi 40 s. BC2, na druhé straně, zvyšuje APTT na 3,5 - násobek na asi 90 s. Terapeutická cílová zóna použita při antikoagulační terapii heparinem je zvýrazněna. Výsledky naznačují, že dvě mAb mají stejné terapeutické APTT rozmezí jako heparin.

Vlastnosti mAb BC1 a BC2 jsou shrnuty v tabulce 1. Obě BC mAb rozpoznávají zymogen, faktor IX, stejně jako aktivní proteasu, faktor IXa, ale pouze BC2 je schopná blokovat aktivaci zymogenu stejně jako aktivitu proteasy. Byla zjištěna zkřížená reaktivita BC1 a BC2 s faktorem IX makaka cynomolgous. Kromě toho, BC2 také zkříženě reaguje s krysím faktorem IX.

Tabulka 1: Shrnutí in vitro vlastností mAb proti faktoru IX ' BC1 BC2 Vazba na faktor IX ano ano Vazba na faktor IXa ano ano Inhibice konverse IX na IXa ne ano Inhibice aktivity IXa v Xasovém komplexu ano ano Nutnost kofaktoru APTT max. ne dvojmocné kovy Ca.z* > Mn2^ ---------- x 100% APTT norm. 150 350 IC , nM asi 35 asi 50 Mezidruhová zkřížená reaktivita opice opice, krysa Izotyp igGi IgG2a Výsledky na obrázku 2 ukazují účinek zvyšujících se koncentrací raAb 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 proti faktoru IX na APTT čas. Plasma pro test byla ředěna na jednu polovinu normální koncentrace s počátečním APTT 45 sekund. Obě mAb inhibují srážení prodloužením APTT a obě mAb dosahují konečného saturačního účinku 43 ·· ·· ·* ···· ·« ·* • · ♦ «· * ···# • · ♦ · · «. « · » • · ·· · · * ····«* • · · t * ♦ * · ··· ···· a· «· ·· ·» na APTT. Saturační koncentrace 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 zvyšují APTT na asi 90 až 100 s pro 9E4(2)F4 a na asi 80 sekund pro 11G4 (1) B9. Výsledky ukazují, že dvě tnAb jsou na horní hranici terapeutické rozmezí pro heparin. Výsledky na obrázku 3 ukazují účinek zvyšujících se koncentrací mAb HFXLC (proti epitopu lehkého řetězce) , HFXHC (proti epitopu těžkého řetězce) proti faktoru X a mAb HFXI proti faktoru XI na APTT čas. Tyto mAb byly získány od Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). mAb HFXLC a HFXI inhibují srážení prodloužením APTT a obě mAb dosahuj í konečného saturačního účinku na APTT. IC hodnota pro HFXLC je asi 40 nM; saturační koncentrace zvyšuje APTT na asi 60 sekund. IC__o hodnota pro HFXI je asi 20 nM; saturační koncentrace zvyšuje APTT na asi 100 sekund. Výsledky ukazují, že HFXLC je v terapeutickém rozmezí pro heparin, zatímco HFXI je při horní hranici terapeutického rozmezí pro heparin.

Omezené prodloužení APTT bylo také pozorováno u protilátek proti faktoru VIII, kofaktoru faktoru IXa. Například, protilátka proti lidskému faktoru VIII, SAF8C-Ig, zakoupená od Affinity Biologicals lne., zvyšuje APTT na maximum 65 sekund. Polovina maximálního prodloužení APTT byla dosažena při použití asi 100 nM protilátky. Příklad 3 Účinost myších mAb proti faktoru IX v krysím modelu trombosy

Pro hodnocení účinnosti protilátek proti faktoru IX v prevenci arteriální trombosy byl adaptován krysí model trombosy arteria 44 ** *f V i • * · ♦ · · • * · · • · « · ♦ · ·· ► · · 4 • · · · · · a carotis, jak jej popisuje Schumacher et al. v J. Cardio Pharm. 22: 526 - 533 (1993). Tento model se skládá ze segmentálního poškození endotelu karotidy kyslíkovými radikály gnerovanými FeCl3 roztokem aplikovaným na povrch arteria carotis.

Stručně, krysy jsou uvedeny do anestesie pentobarbitonem sodným, jugulární véna je kanylována pro intravenosní injekci a levá femorální arterie je kanylována pro měření krevního tlaku a pulsu. Arteria carotis je izolována aseptickou technikou chirurgickou incisí na krku a je zde přiložena magnetická průtoková sonda pro měření průtoku krve. Po stabilizaci jsou stanoveny základní hodnoty pro následující proměnné: průtok arterií carotis, arteriální tlak, puls, aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) a protrombinový čas (PT) . Potom je předem změřený Whatmanův filtrační papír namočený v 50% roztoku FeCl3 umístěn na arteria carotis na dobu 15 minut pro kompletní poškození spodních endotelových buněk. Po odstranění papíru namočeného v FeCl3 pokračuje pokus po dobu 60 minut. Na konci pokusu se z arteria carotis extrahuje trombus a zváží se. Všechna činidla byla podána 15 minut před začátkem poškození karotidy. Byly testovány následující léčby a byly srovnávány s mAb BC2 proti faktoru IX. 1. Heparin: 15, 30, 60 nebo 120 U/kg bolusově, a potom infuse 0,5, 1, 2 nebo 4 U/kg/min, v příslušném pořadí, po dobu 60 minut. 2. Kyselina acetylsalicylová (ASA, aspirin): 5 mg/kg bolus. 3. mAb BC2 proti faktoru IX: 1, 3 nebo 6 mg/kg bolusově, potom infuse 0,3, 1 nebo 2 ^g/kg/min, v příslušném pořadí, po dobu 60 45 45 • · ·· «» • · · · • · minut. 4. Heparin: 30 U/kg bolus + 1 U/kg/min + ASA 5 mg/kg. 5. mAb BC2 proti faktoru IX: 1 mg/kg + 0,3 /xg/kg/min + ASA 5 mg/kg.

Obrázek 4 a 5 ukazuje srovnávací farmakologii antikoagulačních/trombotických režimů ukázáním účinku heparinu, ASA a mAb BC2 proti faktoru IX na APTT (obrázek 4) a PT (obrázek 5) .

Klíčový index pro krvácivou diatesu, APTT, byl použit jako primární kriterium pro hodnocení účinnosti oproti riziku krvácení pro antikoagulační/antitrombotická činidla použitá ve studii. Výsledky na obrázku 4 ukazují na dávce závislé prodloužení APTT heparinem s maximálním prodloužením srážecího času, nad limity testu, při dvou nejvyšších dávkách. ASA samotná nezvyšuje signifikantně APTT, ale v kombinaci s heparinem je pozorován značný synergistický účinek. mAb proti faktoru IX měly mírný účinek na APTT a i při nej vyšších dávkách nepřesáhlo zvýšení času srážení 3-násobek standartního antikoagulačního klinicky používaného limitu. Nejpozoruhodnější je, že nízké dávky mAb BC2 proti faktoru IX v kombinaci s ASA neměnily APTT.

Na obrázku 5 data ukazují, že PT byl také signifikantně prodloužen heparinem, při dvou nejvyšších dávkách, a kombinací ASA + heparinu, ale nikoliv dávkou samotné mAb proti faktoru IX ani její kombinací s ASA. Účinek heparinu, ASA a mAb proti faktoru IX na oklusy arteria *· ·· ··· · *· ·· 46 *· ·· ··· · *· ·· 46 • · • · « carotis je ukázán na obrázku 6. Výsledky ukazuji, že arterie carotis všech myší ošetřených vehikulem se uzavřely v důsledku poškození. Heparin inhiboval oklusy arterie carotis v závislosti na dávce. Při nejvyšší dávce heparin zcela bránil oklusy arterie carotis; nicméně, při této dávce nemohla být žádná koagulace identifikována. ASA samotná měla pouze malý vliv na oklusy karotidy. ASA v kombinaci s heparinem také selhala v úplném zabránění okluse arteria carotis. mAb proti faktoru IX plně blokovala oklusy arteria carotis při dvou nejvyšších dávkách, které neprodlužovaly koagulaci nad klinicky požadované cílové rozmezí. Nižší dávka mAb proti faktoru IX, která zcela selhávala v zajištění průchodnosti, pokud byla podána samostatně, vykazovala úplnou inhibici okluse arterie carotis při podání v kombinaci s ASA. Účinek heparinu, ASA a mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu je ukázán na obrázku 7. Heparin redukuje hmotu trombu v arteria carotis způsobem závislým na dávce. Nicméně, určitý residuální trombus byl stále nacházen v arteria carotis i přes kompletní blokádu koagulace. ASA samotná nebo v kombinaci s heparinem (režim 30 U/kg) měla pouze částečný účinek na hmotnost trombu. mAb proti faktoru IX redukovala hmotu trombu způsobem závislým na dávce a vyšší dávky zcela bránily tvorbě trombu. Kromě toho, kombinace nízké dávky mAb proti faktoru IX a ASA, t.j. režim, který zcela bránil oklusi arteria carotis bez nežádoucího ovlivnění koagulačních testů, zcela bránila tvorbě trombu.

Studie provedené na krysím kodelu trombosy arteria carotis jasně ukazují účinnost mAb proti faktoru IX v prevenci trombosy v modelu vysoce trombogenního arteriálního poškození.

Nejvýznamnější je, že účinost mAb proti faktoru IX byla prokázána v požadovaném terapeutickém antikoagulačním cílovém rozmezí definovaném APTT. Kromě toho, heparin v současnosti standartní antikoagulans, dosahoval účinosti srovnatelné s mAb proti faktoru IX pouze v dávkách, které významně narušují koagulaci tím, že produkují nesrážlivou krev. Zajímavé je, že pozorovaná potenciace a synergie získaná současnou léčbou ASA a heparinem byla také prokázána tehdy, když byla ASA podána s mAb proti faktoru IX. Nicméně, oproti kombinaci heparinu a ASA, která vede k potenciaci antitrombotických i antikoagulačních účinků vede kombinace ASA a mAb proti faktoru IX k potenciaci antitrombotického účinku bez významného ovlivnění koagulačních parametrů krve ex vivo. Dohromady data ukazují vyšší antitrombotickou kapacitu mAb proti faktoru IX ve srovnání s heparinem, ASA nebo s kombinací heparinu a ASA. Příklad 4

Skenovací elektronová mikroskopie modelu krysí trombosy

Segmenty krysí arteria carotis byly odebrány od tří skupin (kontrolní, chlorid železitý a chlorid železitý + 6 mg/kg protilátky proti faktoru IX), 15 minut po aplikaci chloridu železitého. Arterie byly fixovány perfusí formaldehydem a byla provedena ligace nad a pod poškozenou oblastí. Fixované arterie byly dehydratovány, inkubovány v hexamethyldisilazanu a sušeny v desikátoru. Sušené arterie byly rozříznuty po délce, umístěny do nástavců pro skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) potažených zlatém rozprášeným ve vakuu. SEM kontrolních arterií ukázala v podstatě normální endotel s rozptýlenými destičkami. Bylo zde několik poškození endotelu, ·· · 48 ·· · · · ·

·· Μ • · • * · pravděpodobně v důsledku mechanického poškození během chirurgického zákroku a bazální membrána v těchto oblastech byla pokryta vrstvou destiček. Žádné náznaky tvorby trombu nebyly pozorovány u kontrolních krys. SEM arterií ošetřených chloridem železitým odhalila rozsáhlé nástěné tromby, které zabíraly značnou část lumen cévy. Tromby byly složeny z agregovaných destiček, červených krvinek a amorfního a vláknitého proteinového materiálu. Endotel arterií byl téměř zcela pokryt velkými tromby. Tam, kde byl viditelný, byl endotel v oblasti ošetřené chloridem železitým pokryt množstvím adherentních destiček a amorfního proteinového materiálu. SEM arterií ošetřených chloridem železitým od krys ošetřených také protilátkou proti faktoru IX ukázala lumen cév v podstatě bez trombu. Endotel v oblasti ošetřené chloridem železitým vykazoval rozsáhlé poškození a některé oblasti byly pokryty adherujícími destičkami a agregáty destiček, ale bez nebo s minimálním množstvím proteinového materiálu. Příklad 5

Analýza sekvence cDNA lehkého a těžkého řetězce mAb BC2 proti

faktoru IX

Celková RNA byla přečištěna za použití TriReagent (Molecular Research Center, lne., Cincinnati, OH) podle návoduu výrobce. RNA byla vysrážena isopropanolem a rozpuštěna v 0,5% SDS a upravena na 0,5 M NaCl. Póly A* RNA byla izolována za použití Dynabeads Oligo (dT)2s (Dynal A.S., Lake Success, NY) podle návodu výrobce. Póly A* RNA byla eluována z korálků a resuspendována v TE pufru. Dvanáct aliquot 100 ng RNA bylo reversně transkribováno za použití RC-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim katalogové č. 1483-188) za použití dT oligo pro "priming”. Pro těžký řetězec byla PCR amplifikace 6 RNA/DNA hybridů provedena ve 25 cyklech za použití primeru pantové oblasti myšího IgG2a (SEQ ID NO: 1) a primeru signální sekvence těžkého řetězce (SEQ ID NO: 2). Podobně, pro lehký řetězec byla PCR amplifikace 6 RNA/DNA hybridů provedena ve 25 cyklech za použití myšího kappa primeru (SEQ ID NO: 3) a degenerovaného primeru signální sekvence lehkého řetězce (SEQ ID NO: 4).PCR produkty z každé ze 12 amplifikací byly ligovány do PCR2000 vektoru (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) . Kolonie rekombinantních klonů byly náhodně seškrábnuty a minipřípravky plasmidové DNA byly připraveny za použití postupu alkalické extrakce jak jej popisuje Bimboim a Doly v Nucl. Acids Res. 7: 1513 (1979) . Izolovaná plasmidová DNA byla trávena EcoRI a byla analyzována na 0,8% agarosovém gelu. Dvouřetězcové DNA inserty vhodné velikosti, t.j. okolo 700 bp pro těžký řetězec a okolo 700 bp pro lehký řetězec, byly sekvencovány modifikací Sangerovi metody. Sekvence všech 12 těžkých a lehkých řetězců byly srovnávány pro vytvoření konsensuální sekvence variabilního regionu těžkého řetězce BC2 (SEQ ID NO: 5) a konsensuální sekvence variabilního regionu lehkého řetězce BC2 (SEQ ID NO: 6).

Analýza sekvence cDNA variabilního regionu těžkého řetězce BC2 ukázala otevřený čtecí rámeček o 363 nukleotidech kódující sekvenci 121 aminokyselin (SEQ ID NO: 7) . Sekvence CDR 1, 2 a 3 těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10, v příslušném pořadí. 50 50 ·· ···· • · ·· ·· • *· · I I · · • · · · · · · · · • · ·· · · · ······ • · ···· · » »··« ···· ·· «· ·« ·»

Analýza sekvence cDNA variabilního regionu lehkého řetězce BC2 ukázala otevřený čtecí rámeček o 321 nukleotidech kódující sekvenci 107 aminokyselin (SEQ ID NO: 11) . Sekvence CDR 1, 2 a 3 těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 14, v příslušném pořadí. Příklad 6

Humanizované protilátky Šest humanizovaných protilátek označených SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB249417, SB 257731 a SB 257732 bylo navrženo tak, aby obsahovaly myší CDR popsané výše v pracovním rátrtečku lidské protilátky. SB 249413

SB 249413 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-0 a lehký řetězec F9HZLC 1-0. Syntetický variabilní region humanizovaného těžkého řetězce F9HZHC 1-0 byl navržen za použití prvních tří regionů pracovních rámečků těžkého řetězce získaného z imunoglobulinu RF-TS3'CL (Capra, J.D. et al., J. Clin. Invest 86: 1320 - 1328 (1990), identifikovaného v Kabat databasi jako Kabpro:Hhci0w) a CDR těžkého řetězce BC2 popsaných dříve. Nebyly provedeny žádné aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které by mohly ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány čtyři syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NOť 17 a SEQ ID NO: 18), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region těžkého řetězce včetně CDR (SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 20). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR prinierů (SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 22) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Spěl, KpnI restrikčního trávení. Druhý DNA fragment kódující "campath" signální sekvenci obsahující prvních pět aminokyselin variabilního regionu (SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 24) byl vyroben PCR amplifikací vhodného regionu konstruktu kódujícího humanizovaný těžký řetězec protilátky proti respiračně syncitiálnímu viruy (SEQ ID NO: 25) se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Spěl. Dva generované fragmenty byly ligovány do EcoRI, KpnI tráveného pFHZHC2-6pCD expresního vektoru pro savčí buňky, který obsahoval zbývající lidský konsensuální pracovní rámeček 4 a konstantní region IgGl. Vektor obsahoval jednu aminokyselinovou mutaci vektoru pFHZHC2-3pCD vektoru popsaného v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/05690. Konečný zbytek pracovního rámečku 2 (zbytek 49) byl mutován ze Ser na Ala trávením pFHZHC2-3pCD Xbal a EcoR5 a insercí linkeru generovaného ze dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 28 a SEQ ID NO: 29). Sekvence F9HZHC 1-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 31.

Syntetický variabilní region humanizovaného lehkého řetězce F9HZLC 1-0 byl navržen za použití regionů pracovních rámečků lidského lehkého řetězce získaného z imunoglobulinu LS8'CL (Carmack et al., J. Exp. Med. 169: 1631 - 1643 (1989), identifikovaného v Kabat databasi jako Kabpro:Hkl318) a CDR lehkého řetězce BC2 popsaných dříve. Nebyly provedeny žádné aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které by mohly ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva syntetické přesahující se oligonukleotidy (SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO: 33), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region lehkého řetězce 52 ·· »» • · · · • · • · · • · ·· » · ···« t* ·ΙΜ • · · • · · * · · · • · · I ·· ·· M «· • · · · • - ♦ · · • · · · · ·

(SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 35). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 36 a SEQ ID NO: 37) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Seal, SacII restrikčního trávení. Druhý DNA fragment kódující "campath" signální sekvenci obsahující první dvě aminokyseliny variabilního regionu (SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 39) byl vyroben PCR amplifikací vhodného regionu konstruktu kódujícího humanizovaný těžký řetězec protilátky proti respiračně syncytiálnímu viru (SEQ ID NO: 25) se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 40) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Dva generované fragmenty byly ligovány do EcoRI, SacII tráveného pFHzLCl-2pCN expresního vektoru pro savčí buňky, který obsahoval zbývající lidský konsensuální pracovní rámeček 4 a konstantní region IgGl. Vektor obsahoval jednu aminokyselinovou mutaci vektoru pFHZLCl-lpCN vektoru popsaného v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/05690. Zbytek pracovního rámečku 2 byl mutován ze Ser na Pro trávením pFHZLCl-pCN Smál a KpnI a insercí linkeru generovaného ze dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 42) . Sekvence F9HZLC 1-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 44. SB 249415 SB 249415 obsahuje těžký řetězec F9HZHC l-l a lehký řetězec F9HZLC l-l. Tyto konstrukty lehkého a těžkého řetězce jsou založeny na F9HZHC 1-0 a F9HZLC 1-0, v příslušném pořadí, nicméně, mají aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR. F9HZHC 1-1 má tři aminokyselinové substituce v pracovním 53 ·· ·υ ·% ·«·« ·· «t « « « · · · « ♦··· • · ·· t ·.··· • · · » · · · «»··«· • · · * · · · 9 ···· ··· ·· ·· 9· *· rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva syntetické přesahujíc! se oligonukleotidy (SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 46), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující pozměněnou část variabilního regionu těžkého řetězce (SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 48). Tento synteticky gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 49 a SEQ ID NO: 50) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze EcoNI, KpnI restrikčního trávení. Tento fragment byl ligován do EcoNI, KpnI tráveného F9HZHC 1-0 (SEQ ID NO: 30) vektoru. Sekvence F9HZHC 1-1 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 51 a SEQ ID NO: 52. F9HZLHC 1-1 má čtyři aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 54), které, pokud jsou tepelně zpracovány, mají KpnI a BamHI lepivé konce a kódují aminokyseliny představující pozměněnou část variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 55). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) byl tráven restrikčními enzymy KpnI a BamHI a byl ligován do syntetické cDNA. Sekvence F9HZLC 1-1 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 56 a SEQ ID NO: 57. SB 249416 SB 249416 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (popsaný výše) (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 1-2. Konstrukt lehkého řetězce je založen na F9HZLC 1-1, nicméně, má jednu další aminokyselinovou substituci v pracovním rámečku, která může ovlivňovat presentaci CDR. 54 54 • · ·· • » · * « · · ' · • · · · · · » · • · · » Q· 9« $· ···· • · · · · · • · « · * • Φ · · * 9 • 6 · · · » ······· ·· * ·

Byly generovány dva syntetické přesahující se oligonukleotidy (SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 59), které, pokud jsou tepelně zpracovány, mají BamHI a Xbal lepivké konce a kódují aminokyseliny představující pozměněnou část variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 60). Vektor F9HZLC 1-1 (SEQ ID NO: 56) byl tráven restrikčními enzymy BamHI a Xbal a byl ligován do syntetické DNA. Sekvence F9HZLC 1-2 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 62. SB 249417 SB 249417 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (popsaný výše) (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 2-0. Syntetický variabilní region humanizovaného lehkého řetězce F9HZLC 2-0 byl navržen za použití regionů pracovních rámečků lehkého řetězce získaného z imunoglobulinu REI (Palm a Hilschmann, Z. Physiol. Chem. 354: 1651 - 1654, (1973), identifikovaného v Rabat databasi jako

Kabpro:HKL111) a CDR lehkého řetězce BC2 popsaných dříve. Bylo vloženo pět aminokyselinových substitucí v lidské konsensuální sekvenci. Bylo provedeno šest substitucí v aminokyselinách myšícho pracovního rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva překrývajícíc se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 63 a SEQ ID NO: 64), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region lehkého řetězce (SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 66). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 68), ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Rit, Invitrogen, katal. č. R2000-01) a byl izolován ze Seal, SacII restrikčního trávení. Druhý DNA fragment kódující "campath" signální sekvenci obsahující prvních pět aminokyselin variabilního regionu (SEQ ID NO: 38) byl vyroben 4* < 4 • · 44 44 4 4 4 4 4 · • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • • 4 • 4 4 4 - 4 * 4 < » · 4 ♦ 4 444 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4444 • · · · 4 · 4 4 4 4 4 4 PCR amplifikací vhodného regionu konstruktu kódujícího humanizovaný těžký řetězec protilátky proti respiračně syncytiálnímu viruy (SEQ ID NO: 25) se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Třetí DNA fragment kódující zbývající lidský pracovní rámeček 4 (SEQ ID NO: 70) a mající SacII a Narl lepivé konce byl generován tepelným zpracováním dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 71 a SEQ ID NO: 72). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) byl tráven restrikčními enzymy EcoRI a Narl a byl ligován do tří DNA fragmentů. Sekvence F9HZLC 2-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 73 a SEQ ID NO: 74. SB 257731 SB 257731 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 1-3, F9HZLC 1-2 s jednou mutací aminokyseliny (SEQ ID NO: 62). F9HZLC 1-2 byl amplifikován PCR se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 69) a byl tráven restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Byl izolován 64 bp fragment (SEQ ID NO: 75 a SEQ ID NO: 76) . Fragment byl ligován do EcoRI, Seal tráveného vektoru F9 HZLC 1-2 za zisku konstruktu lehkého řetězce označeného F9HZLC 1-3. Sekvence F9HZLC 1-3 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 77 a SEQ ID NO: 78. SB 257732 SB 257732 obsahuje syntetický variabilní region humanizovaného těžkého řetězce F9HZHC 3-0 a lehký řetězec F9HZLC 3-0.

Byly generovány čtyři překrývajícíc se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 a SEQ ID NO: 82), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují ·· *· ·· • · · · m 9 • · • · 9 · « • * 9 · 9 .· · · • * • · 9 4 · · · « · • · · · 9 9 # · · ·· · » * • • í 9 9 aminokyseliny představující pozměněný variabilní region těžkého řetězce (SEQ ID NO: 83 a SEQ ID NO: 84). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 85 a SEQ ID NO: 86) , ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Stul, KpnI restrikčního trávení. Izolovaný fragment byl ligován do Stul, KpnI tráveného F9HZHC1-1 (SEQ ID NO: 52) vektoru. Tento vektor byl potom tráven EcoRI, Spěl pro odstranění signální sekvence. DNA fragment kódující "campath" signální sekvenci (SEQ ID NO: 23) obsahující prvních pět aminokyselin variabilního regionu (SEQ ID NO: 38) byl vyroben PCR amplifikací F9HZHC 1-1 se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 87) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Spěl. Generovaný fragment byl ligován do vektoru.

Sekvence F9HZHC 3-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 88 a SEQ ID NO: 89.

Byly generovány čtyři překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 a SEQ ID NO: 93), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region lehkého řetězce (SEQ ID NO: 94 a SEQ ID NO: 95). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 96 a SEQ ID NO: 97) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Seal, Narl restrikčního trávení. Izolovaný fragment byl ligován do Seal, Narl tráveného F9HZLC 1-3 (SEQ ID NO: 77) vektoru. Sekvence F9HZLC 3-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 98 a SEQ ID NO: 99.

Humanizované mAb proti faktoru IX byly exprivovány v CHO buňkách. DG-447 buněčná linie adaptovaná pro suspensní kultivaci 57 • 9 • · ·♦ ·· ·· »4 • 9 • « I * • • • · 9 « • · • • • • · • · • • • · • * • ··· ··· • • • • * · • • ·· • ···· * · ·· v mediu bez séra byla kultivována ve 100 ml bezproteinového media obsahujícího lx nukleosidů a 0,05% F68 ve 250 ml sterilních erlenmeyerových baňkách na jedno použití (Corning) na Innova 2100 deskové třepačce (New Brunswick Scientific) při 150 rpm při 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s 5% C02, 95% vzduchem. Tyto buňky byly pasážovány při 4 x 10s buněk/ml dvakrát týdně. 15 μ% každého pCN-Lc-lehký řetězec a pCD-Hc-těžký řetězec vektorů byl linearizován trávením Notl, byly společně vysráženy za sterilních podmínek a byly re suspendovány v 50 μΐ IX TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) . DNA byla elektroporována za použití Bio-Rad Gene Pulser (Bio Rad Laboratories) do Acc-098 buněk za použití techniky popsané Hensley et al.ř v J. Biol. Chem. 269: 23949 - 23958 (1994) . 1,2 x 10Ύ buněk bylo promyto jedenkrát v 12,5 ml ledově chladného PBSacharosa (PBS, 272 mM sacharosy, 7 mM fosforečnanu sodného, pH 7,4, 1 mM MgCl2) , re suspendováno v 0,8 ml PBS, přidáno k 50 μΐ DNA roztoku a bylo inkubováno na ledu po dobu 15 minut. Buňky byly podrobeny pulsům při 380 V a 25 , a potom byly inkubovány na ledu po dobu 10 minut. Buňky byly umístěny do 96-jamkových kultivačních ploten při hustotě 5 x 10s buněk na plotnu v udržovacím mediu na dobu 24 hodin před selekcí. Buňky byly selektovány podle resistence na 400 μg/ml G418 (Geneticin, Life Technologies, lne.) v udržovacím mediu. 24 hodin před testem byly buňky vyživovány 150 μΐ udržvacího media.

Kondicionované medium z jednotlivých kolonií bylo testováno za použití elektrochemoluminiscenční (ECL) detekční metody na Origen analyzátoru (IGEN, lne.) (viz Yang et al., Biotechnology 12: 193 - 194 (1994) . Všechny roztoky nezbytné pro provedení testů (testovací pufry) a pro provoz analyzátoru (čistič buněk) byly získány od IGEN. 58 *· »· ·· »··· «9 «9 ♦ · 9 · ♦ · · · 9 9 9 t * · · 9 «999 • * 9 9 · 9 9 999 ··· • · 9 9*9 · · 9999 9999 '4· 4# %9 te

Protilátky (anti-lidský igG (specifické pro g řetězec), Sigma Chemicals a F(ab')2 fragment k lidskému IgG (H+L), Kirkegaard and Perry Laboratories lne.) byly značeny TAG-NHS-esterem (IGEN, lne.) v molárním poměru TAG:proteinu 7:1, zatímco protein A (Sigma) byl značen Biotin-LC-Sulfo-NHS-esterem (IGEN, lne.) v molárním poměru Biotin:protein 20:1, oboje podle doporučení IGEN. Streptavidinem potažené magnetické korálky (M-280) byly získány od Dynal.

Imunotesty byly provedeny za použití následujícího protokolu: na vzorek bylo 50 μΐ Streptavidinem potažených korálků (konečná koncentrace 600 /ig/ml v PBS, pH 7,8, s 1,25% Tween) smíseno s 50 μΐ Biotin-Protein A (konečná koncentrace 1 μg/ v PBS, pH 7,8 s 1,25% Tween) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě s třepáním, bylo přidáno 50 μΐ TAG protilátek (směsi s konečnou koncentrací 1,25 μg/ml F(ab')2 fragmentu k lidskému IgG (H+L) a 0,25 μg/ml anti-lidský IgG (specifické ke g-řetězci) v PBS, pH 7,8, s 1,25% Tween), roztok byl potom přidán ke 50 μΐ kondicionovaného media a byla provedena inkubace s třepáním při pokojové teplotě po dobu l hodiny. Do reakční směsi bylo přidáno 200 μΐ testového pufru a reakční směs a vzorek byly analyzovány na Origen I analyzátoru pro měření ECL. Výsledky ukazují, že přibližně 20-37% testovaných kolonií secemuje více než 15 ng/ml protilátky s průměrnou expresí okolo 150 ng/ml.

Humanizované mAb proti faktoru IX byly přečištěny z kondicionovaného media za použití Procep A pro krok zachycení následovaný iontovou výměnou chromatografií pro redukci nadbytečné DNA. Procep A absorbentní materiál (Bioprocessing Ltd., Durham, England) byl použit pro přípravu s poměrem průměru k výšce 1:1. Projasněné kondicionované medium bylo zavedeno do 59 •· »1 ·· ···· «· 4t • · « A · ♦ · ····

• · · · * · ·'· I • 9 · · · 99 999999 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 9999 99 99 99 99 kolony při asi 150 cm/h. Kolona byla sekvenčně promyta fosfátem ufrovaným salinikým roztokem (PBS) , PBS obsahujícím 1 M NaCl a nakonec PBS. Navázaný materiál byl získán elucí 0,1 M kyselinou octovou. pH eluatu bylo upraveno na 5,5 a eluat byl ředěn vodou (1:4). naředěný roztok byl zaveden na S-Sepharosovou kolonu (2,5 x 13 cm) , která byla předem ekvilibrována 20 mM octanu sodného, pH 5,5 při 80 cm/h. Kolona byla promývána acetatovým pufrem, dokud nebylo dosaženo rovnovážného základního stavu a navázaný protein byl eluován 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,4 při 25 cm/h. Eluovaný materiál byl filtrován přes 0,4 mikronovou membránu a byl uskladněn při 4 °C. Příklad 7

Myší-lidská chimérická protilátka 100 ng BC2 RNA bylo reversně transkribováno za použití RT-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim katalogové č. 1483-188) za použití dT oligo pro "priming" a byla provedena PCR amplifikace se syntetickými Seal (SEQ ID NO: 100) a Narl (SEQ ID NO: 101) primery pro produkci variabilního regionu lehkého řetězce BC2 se Seal, Narl konci (SEQ ID NO: 102 a SEQ ID NO: 103) . Tato DNA byla ligována do Seal, Narl tráveného F9HZHC 1-3 (SEQ ID NO: 77) a byla trávena Seal, Narl za produkce myšího-lidského chimérického lehkého řetězce F9CHLC (SEQ ID NO: 104 a SEQ ID NO: 105).

100 ng BC2 RNA bylo reversně transkribováno za použití RT-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim katalogové č. 1483-188) za použití dT oligo pro "priming" a byla provedena PCR amplifikace se syntetickými Spěl (SEQ ID NO: 106) a Nhel (SEQ ID 60 60 ·· ···· »· ♦· • · # ♦ · · · ♦ · · • « · · · ·«.·· • · · · · f # ··· ··· • · ««·· · · ···««·#» «· ·· |» ·# NO: 107) primery pro produkci variabilního regionu těžkého řetězce BC2 se Spěl, Nhel konci (SEQ ID NO: 108 a SEQ ID NO: 109). "Campath" signální sekvence byla amplifikována PCR z těžkého řetězce RSVZH19 (SEQ ID NO: 25) S EcoRI (SEQ ID NO: 26) a Spěl (SEQ ID NO: 87 primery. Tyto dva DNA fragmenty byly ligovány do EcoRI, Nhel tráveného IL4CHHCpcd vektoru popsaného v publikované mezinárodní patentové přihlášce č. WO 95/07301, za nahrazení IL4 variabilního regionu variabilním regionem myči BC2 proti faktoru IX, za produkce myšího-lidského chimérického těžkého řetězce F9CHHC (SEQ ID NO: 110 a SEQ ID NO: 111) .

Současná transfekce a přečištění myší-lidské chimérické protilátky chaFIX bylo provedeno stejně jak je popsáno výše pro humanizované konstrukty. Příklad 8 Účinost humanizovaných mAb proti faktoru IX v krysím modelu trombu

Pro hodnocení účinnosti humanizovaných protilátek proti lidskému faktoru IX v prevenci arteriální trombosy byl použit krysí model trombosy arteria carotis jak je popsán výše v příkladu 3. Základní parametry byly stanoveny pro průtok v arteria carotis, arteriální tlak, puls, průchodnost cévy a aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) . Patnáct minut poté bylo po dobu 10 minut provedeno poškození arteria carotis. Parametry byly určovány 60 minut po začátku poškození arteria carotis. Trombus byl také extrahován z arteria carotis a zvážen. Všechna činidla byla podána intravenosně 15 minut před 61 φφ ΦΦ #· ···· ·· ·♦ • · « ·# t ♦ · · ·

• · * · # · ·· I • · I · · · ♦ +····· • t ···· · ♦ φφφ ···· ·· ·· φφ ·· začátkem poškozené arteria carotis. Byly testovány následujíc! léčebné protokoly a byly srovnávány s mAb BC2 proti faktoru IX. 1. Vehikulum 2. chaFIX: 3 mg/kg bolus 3. SB 249413: 3 mg/kg bolus 4. SB 249415: 3 mg/kg bolus 5. SB 249416: 3 mg/kg bolus 6. SB 249417: 3 mg/kg bolus 7. SB 257731: 3 mg/kg bolus 8. Heparin: 60 U/kg bolus + 2 U/kg/min infusně APTT byl použit jako primární kriterium pro hodnocení účinnosti versus riziku krvácení pro antikoagulační/antitrombotické činidlo použité ve studii. Výsledky na obrázku 8 ukazují, že humanizované mAb proti faktoru IX SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 a SB 257731 měly mírný účinek na APTT při použití dávky 3,0 mg/kg, kde tento účinek je v klinicky přijatelném rozmezí. Účinek mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu je ukázán na obrázku 9. Výsledky ukazují, že všechny humanizované protilátky jsou stejně účinné v redukci hmoty trombu.

Studie provedené na krysím modelu trombosy arteria carotis jasně ukazují účinnost humanizovaných mAb proti faktoru Ix v prevenci trombosy v modelu vysoce trombogenního arteriálního poškození. Nejvýznamnější je, že účinnost všech humanizovaných mAb proti faktoru IX byla demonstrována v požadovaném terapeutickém rozsahu pro antikoagulační terapii definovaném APTT. 62

• · · · · < • · t *

Příklad 9

Biochemické a biofyzikální vlastnosti protilátek

Molekulová hmotnost SB 249417 byla určena MALD-MS jako 148000 Da. Analytická ultracentrifugace SB 249417 dávala stejnou hodnotu. Za přítomnost faktoru IX a Ca2* sedimentovala protilátka odvozená od BC2 s hmotností 248000 Da, což odpovídá společné hmotnosti mAb a dvou molekul faktoru IX. nebyly pozorovány žádné důkazy agregátů vyššího řádu za přítomnosti nebo za absence faktoru IX.

Kinetika vazby faktoru IX na SB 249417 byla testována BIAcore analýzou s protilátkou navázanou na povrch s imobilizovaným proteinem A. Byl použit rekombinantní lidský faktor IX (rhFIX, Genetics Institute) při 49 nM a měření bylo provedeno za přítomnosti 5 mM Ca2*. Interakce byla charakterizována rychlou asociací, kaee = 2,0 x 10s M-1s_:L a relativně pomalou disociací, kůiae = 4,1 x 10-s-. Vypočítaná pro vazbu na faktor IX byla 1,9 nM.

Tabulka 1 shrnuje biofyzikální vlastnosti SB 249417. • · ·· #· ···* • · « * • · · · • · • • · • · • · ♦ · • • · '· · • « • · · • · • · · «·« • « • · • • ···· ···« • · • · • ♦ 1 ·

Tabulka 1 - Shrnutí biofyzikálních vlastností SB 249417

Izotyp Čistota podle SDS-PAGE Molekulová hmotnost Hmotností spektrometrie Analytická ultracentrifugace

IgGl, kappa >95% (za redukčních podmínek) 148000 Da 148000 Da

Stochiometrie vazby na faktor IX Izotermální titrační kalorimetrie Vazebná afinita k faktoru IX Izotermální titrační kalorimetrie Biosensor 1,5 molů faktoru IX: 1 mol mAb Kd = 4 nM při 25 °C K = 2 nM d

Kinetika vazby na faktor IX Biosensor k = 2,0 x 10s M_:LS_:L ase k = 4 x 10-4 s-1

Tabulka 2 shrnuje vazebné vlastnosti mAb podle předkládaného vynálezu na faktor IX. Vypočítané disociační konstanty byly v podstatě stejné, v mezích experimentálních chyb. #· ···· 64

Tabulka 2 - Kinetika vazby faktoru IX na mAb proti faktoru IX mAb k ase (M-1s χ) k diee (s-1) vypočítaná KD (nM) SB 249417 2,0 X 10s 4,1 X 10-4 1,9 BC2 4,8 X 10s 9,1 X <ř 1 O r-í 1,9 Chf 9 2,4 X 10s 3,0 X 10~4 1,3 SB 249413 6,5 X 105 2,8 X 10"3 3,7 - 5,1 SB 249415 7,5 X 105 1,8 X o 1 * 1,1 - 2,3 SB 249416 5,2 X 10s 4,1 X H o 1 0,8 SB 257731 9,2 X 10s 9,9 X h* O 1 1,1 SB 257732 1,1 X 10e 1,2 X 10~3 1,5

Interakce mezi rhFIX a SB249417, BC2 a jinými humanizovanými konstrukty byly charakterizovány titrační mikrokalorimetrií, která měří vazebné interakce v roztoku z vnitřního tepla vazby. Bylo provedeno devět injekcí 106 μΜ FIX do kalorimetru obsahujícího 2 μΜ mAb SB 249417. Vazba byla detekována v prvních čtyřech injekcích jako exotermická tepelná energie. Při posledních 5 injekcích byla vazebná místa mAb saturována FIX a bylo pozorováno pouze základní teplo směsi. Výsledky ukazují, že rovnováha nastává při molámím vazebném poměru okolo 2 FIX na mAb, jak bylo očekáváno. Nelineární analýzou nejmenších čtverců se získá vazebná afinita. rhFIX afinity mAb byly měřeny v rozmezí teplot od 34 do 44 °C v 10 mM HEPES, 10 mM CaCl2, 150 raM NaCl, pH 7,4. Tato data umožňují přímé určení afinity při 37 °C a při 25 °C výpočtem z van't Hoffovi rovnice. Data v tabulce 3 ukazují, že afinity SB 249417, BC2 a jejich dalších humanizovaných konstruktů jsou v mezích stejné chyby (faktor 2).

Tabulka 3 - Výsledky titrační kalorimetrie pro anti-FIX mAb mAb Kd, nM při 25 °C Kd, nM při 37 °C Molární vazebný poměr FIX/mAb BC2 10 20 1,4 SB 249413 6 12 1,9 SB 249415 3 7 1,7 SB 249417 4 12 1,5 SB 257732 4 9 1,8 mAb SB 249413, SB 249415, SB 249417 a SB 257732 všechny vykazovaly velmi podobné termální stability podle diferenciální scanning kalorimetrie. Jejich rozkladná Tms v rozmezí od 70 do 75 °C naznačují vysokou stabilitu proti termálně indukované denaturaci. Příklad 10

Mechanismus inhibice faktoru IX způsobené protilátkou

Byla konstruována knihovna chimérických konstruktů složených ze sekvencí faktoru IX sestřižených do pracovního rámečku homologního proteinu faktoru VII a byla použita pro mapování epitopu pro mAb BC2 proti faktoru IX. Viz Cheung et al., Thromb. Res. 80: 419 - 427 (1995). Vazba byla měřena za použití BiaCore 2000 přístroje pro povrchovou plasmonovou resonanci. BC2 protilátka byla navázána přímo na čip za použití NHS/EDC reakce. 66

«· ·· ····

Vazba byla měřena 2 minutovým kontaktním časem při 20 μΐ/min s 200 nM každého z daných konstruktů v 25 mM MOPS, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl2. Disociace byla monitorována po dobu 3 minut za použití stejného pufru bez proteinu. Žádná vazba nebyla detekována na přirozený konstrukt za přítomnosti 50 mM EDTA. Data jsou předložena v tabulce 4.

Tabulka 4 - Shrnutí vazby konstruktů faktoru IX na protilátku BC2

Konstrukt Stupeň vazby

Plasmatický IXa vazba r-IX vazba Plasmatický VII bez vazby IX LC/VII HC vazba IX-A/VII vazba VII gla/IX bez vazby VII-A/IX bez vazby VII gla (IX 3-11)/IX vazba VII gla (IX 3-6)/IX velmi slabá vazba VII gla (IX 9-11)/IX velmi slabá vazba IX K5A vazba

Tyto data ukazují, že konstrukt obsahující lehký řetězec faktoru IX a těžký řetězec faktoru VII (IX LC/VII HC); gla faktoru IX a aromatické šachtové domény (IX-A/VII); zbytky 3 - 11 gla domény faktoru IX v gla doméně faktoru VII (VII gla (IX 3-11)/IX); a faktor IX mající substituci lysinu na alanin ve zbytku 5 (IX K5A) vykazují vazbu na BC2. VII gla (IX 3-11)/IX 67 67 ·· ·· • · · ·

···· ·· ·· • • • · • · • Φ • · • · • • · • M • · · • • · • • ·· ·· • · konstrukt vykazoval vazbu s BC2 stejnou jako přirozený faktor IX (plasmatický OXa a r-IX). Proto, BC2 protilátka se váže na epitop obsažený ve zbytkách 3-11 gla domény faktoru IX. Předkládaný vynález může být prováděn v jiných specifických formách, bez odchýleni se od rozsahu vynálezu nebo od jeho základních rysů, a v souladu s tím by měly být odkazy prováděny spíše na připojené nároky, než na uvedený popis, protože ty ukazují rozsah vynálezu. 68 ·· «I ·« ««Μ • · · · · · · • · · · · • « · · · · • · · · · · ········ · · « ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace: (i) Přihlašovatel: Blackburn, Michael

Church, William Gross, Mitchell Feuerstein, Giora Nichols, Andrew Padlan, Eduardo Patel, Arunbhai Sylvester, Daniel (ii) Název vynálezu: Antikoagulační činidla použitelná pro léčbu trombosy (iii) Počet sekvencí: 111 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: SmithKline Beecham Corporation (B) Ulice: 709 Swedeland Road (C) Město: King of Prussia

(D) Stát: PA

(E) Země: USA (F) ZIP: 19406 (v) Počítačová čtecí forma: (A) Typ media: Disketa (B) Počítač: IBM kompatibilní

(C) Operační systém: DOS (D) Software: FastSEQ verse 1.5 69 69 ·· *· ·♦ MM *| ·· ···· · · · * t f * • · ··· ···· • · « · · « · »····· • · ···· · · ···» ···· ·· ·· ·· ·· (vi) Údaje o současné přihlášce: (A) Čislo přihlášky: (B) Datum podání: 16.1.1997 (C) Klasifikace: (vii) Předchozí data přihlášky: (A) Číslo přihlášky: 60/029119 (B) Datum podání: 24.10.1996 (viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Baumeister, Kirk (B) Registrační číslo: 33833 (C) Reference/číslo rejstříku: P50438 (ix) Telekomunikační informace: (A) Telefon: 610-270-5096 (B) Telefax: (C) Telex: (2) Informace pro SEQ ID NO: 1: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 20 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne 70 70 ·· «· • * · · • · • t * · • · i ·· ·» ·· ·* • · · * • · # . · • »· * · · • · ·· *· (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1: CATCCTAGAG TCACCGAGGA 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineami

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2: AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 36 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: j ednoduchý 71 • · · · • · • · » · • · * · * · ·· • · · (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3: CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTGTTGAC AATGGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 4: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:

GATTTTCARG TGCAGAT7TT C 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 363 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: j ednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5: CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60 TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120 CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 180 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT 240 TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG 300 AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT 360 GCA 363 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 321 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina 73 ·· ♦·

·· ·· • # · · • · · · • ··· ··· • · (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 6: CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA 120 TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180 TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA 240 GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC 300 ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní 74 ·· ·· • · · · • · · · · · • · ···· ····

• · · · · Μ ·· (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID : NO: 7: Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys C-ly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala .2) Informace pro SEQ ID NO: 8 i (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: 75 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 8:

Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 9:

Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15

Gly (2) Informace pro SEQ ID NO: 10: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ·· ·· • · · · • · · · • · · · · · • ·

7S ·« ·« ·· ···· • · · · · * · • · · · · • · · · · t « · · ♦ · · ·«·····» * · ·· (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 10:

Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 11:

Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 40 45 35 77 77 ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · ···· • · · # · · · · · • · ·· · · · ·····# • · ···· · · ········ ·· ·· ·· ··

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: j ednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 12:

Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His 5 10 1 78 78

«· ·· • · · · • · • · • · ···· ···· Μ ···· (2) Informace pro SEQ ID NO: 13: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 13:

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní 79 • φ ®· • # ® · # # φ · · φ φ φφφφ φφφφ

φφ ► φ » · φφ φ φ φ φ φ φ φ (vi) Původní zdroj : (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 14:

Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 1 5 (2) informace pro SEQ ID NO: 15: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 104 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 15: 60

CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 16: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 108 párů basí 104 80

• ·· ·· • Φ · · · • · · I φ φ ΦΦΦ ΦΦΦ Φ · · ΦΦ ·· (Β) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 16: TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG 60 AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG 108 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 17: GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT 60 CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG 107 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 91 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 18:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G (2) Informace pro SEQ ID NO: 19: (i) Charakteristiky sekvence: {A) Délka: 337 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: 82 ·· ·· ·· 0000 ·· 00 0 0 0 0 ·· · ···· • 0 0 0 0 0 0 0 0 • I t · I « · 000000 • · 0··· 0 · ···· ···· ·Ι 0 0 ·· 0· (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...337 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 19: A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 49 Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 1 1 5 10 n 5 GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC 97 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 20 25 ' 30 TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA 145 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile 35 40 45 AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGG CGG 193 Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg 50 55 60 TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC 241 Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile 65 70 75 80 AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAA 289 Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu 85 90 95 GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 337 Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 83 ·»·· Μ·· • · · • ·

·· ·· • * · · · • · · · · ·· · · · * · · • · · ·· ·· ·· • · · · (2) Informace pro SEQ ID NO: 20: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 112 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu 1 5 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 20 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin 35 40 Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr 50 55 Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr 85 Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro 100 NO: 20:

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 10 15

Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 25 30

Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile 45

Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg 60

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile 75 80

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu 90 95

Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 84 • · · · ··· • · · • · « ♦ · • · * 9 · w · · · · ······· ·· ♦· • # • * *· « · · · « ·· · · · · ·· ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 21: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 33 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 21: 33

GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC 85 a a

• · · · ♦ · ········ · · · * a a • a ·ο (2) Informace pro SEQ ID NO: 22: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 30 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 22: 30

TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 23: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 97 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne 86 «· ··· · (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj : (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...95 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 23: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

MeC Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTA GT 97

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu 10 15 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: «· Μ·· 87 • · • · • »

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 24:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Val Gin Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 110 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 25: GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC 60 TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG 110 (2) Informace pro SEQ ID NO: 26: (i) Charakteristiky sekvence: 88 88 « · • · · · ···· ·« · · • · · · · · · ···· • · · · · ···· • φ · · · * t ······ » · · · · · · · ···· ···· ·· ·# ·· ·· (A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 26: GGAGACGCCA TCGAATTCTG A 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 27: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 30 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 27: 30

GATTGCAC7A GTTGGACCTG GGAGTGGACA (2) Informace pro SEQ ID NO: 28: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 77 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 28: CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG ACGGGCCGGT TCACGAT (2) Informace pro SEQ ID NO: 29: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 73 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA 90 • · # ·

• · · I # · * • · · · · • · · · · • · · · • · * · ♦ · · ······· ·· ·· ·· ·· (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SBQ ID NO: 29: ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC 60 TCTGCGACCC ACT 73 (2) Informace pro SEQ ID NO: 30: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 363 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kóduj ící sekvence (B) Umístění: 1...363 (D) Další informace: F9HZHC 1-0 91 ·· ·« • · · · • · • · • · ···· · · · · ·« »··· • · · • * ♦ • · · • * t · ·· ·· ·· ·· • · · ♦ • ♦ · · «»· · ·· • » • · Μ (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 30: CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG 144 Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 240 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT 288

Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336

Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 3 63

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 31: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 121 aminokyselin 92 ·· ·· • · • * · « · * t · • · ··· ···· • ♦ · · · · · «»· ··· • · · · · · · · · + ···»·· ·· ·» ·0 ·· (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 31:

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly. Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys S "S 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 32: 93 93 • m

• · · · · ·· i (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 165 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 32: AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC 60 CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC 120 TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT 165 (2) Informace pro SEQ ID NO: 33: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 146 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: 94

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 33

CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC AGAAGCCAGG 7TACTAGTGG CATAGA 60 120 146 (2) Informace pro SEQ ID NO: 34: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 280 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...280 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 34: A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 1.5 10 15 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 95 ·· ·#·· » · · ♦ · ·· • · · · • · t · ·«·· ···· » · · I ·· ·· TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACT 145 Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT 241 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 280 GCG GTT 7AT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG Ala Val Tvr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 (2) Informace pro SEQ ID NO: 35: !i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 93 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne 96 ·· ·· • · t · • · • · • · »··« ·«-·· »« *·«♦ • · • · • · • · · ·· • · • · * « · « · • • · ·♦ ··· • • • • ·· • 9 (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 35:

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 1 5 10 15 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 (2) Informace pro SEQ ID NO: 36: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 27 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne • Φ « t *· 97 • · · · · · · • · · · · * Φ Φ Φ Φ φ • « Φ Φ Φ Φ ΦΦΦΦΦΦΦΦ φ φ ·9 (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 36: TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27 (2) Informace pro SEQ ID NO: 37: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 27 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 37: 27

GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA (2) Informace pro SEQ ID NO: 38: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 94 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...92 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 38:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val 10 15 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 39: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý 99 99 • · · · • · * • ♦ · ·* ·♦ Μ Ι»Μ • · · « · · • Ο · · · • · ·* · * · • · · · * · ······· · · ·· (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptičl (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 39:

Met Glv Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Glu Ile Val 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 40: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 30 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 40:

SACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA 30 • · • · 100

(2) Informace pro SEQ ID NO: 41: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 55 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 41:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC (2) Informace pro SEQ ID NO: 42: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 51 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: 101

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 42: CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51 (2) Informace pro SEQ ID NO: 43: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 321 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (D) Další informace: F9HZLC 1-0 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 43: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT 144

His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 102 ·»·· ···· GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG' TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA 321 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 44: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 44: 103 ·· ·· ► · t « • · · · · ·

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Glr. Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Tle Asn Pro Arg Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 45: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 134 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ f ragmentu : (vi) Původní zdroj: 104

·· ·· • ♦ · § • · · · ··· ··· « · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 45: CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATAT 120 CTACAGATCA GCAG 134 (2) Informace pro SEQ ID NO: 46: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 134 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: j ednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 46: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60 GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC 120 AGAGGAGTCT AGAG 134 105 ···« ···· ♦· ·♦·· ·· ·· • · · · · ··

(2) Informace pro SEQ ID NO: 47: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 255 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...225 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 47: CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA 48 Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly 1 5 10 15 AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA 96 Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu 20 25 30 GAC •TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT 144 Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala 35 40 45 106 ·· ···· «· ♦ · · · » • · · · * ♦ · · · · ··· • · · · · ·· ·♦ ·♦ GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly 50 55 60 192 TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 225 (2) Informace pro SEQ ID NO: 48: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 75 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 48

Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Tle Asn Thr Arg Asn Gly 1 5 10 15 Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala 35 40 45 Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly 50 55 60 Tvr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 107 107 • · ·· ♦··· ·* *t • · · · ···· • ·· · ··.·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 49: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 27 páni basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 49:

TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG (2) Informace pro SEQ ID NO: 50: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 24 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 108 »· ·* • ♦ · · • · • · · · · · « ·· ···· ·# «· • · · · · · · • · · · ·· · • · · · ·♦· ··· • · · · · · ·· ·· ·· ··

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 50: TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 51: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 363 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...363 (D) Další informace: F9HZHC 1-1 109 ·· ·♦ ·· ···· ·· ·· • · · · • • • • · • · • · • • • • · • · • · • · • • · • 1»· • · • • • · • • ····#··· • · ·· ·· • · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 51: CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 48

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Giu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG 144

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 GGA TGG AT A AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192

Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 240

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT 288

Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe 100 105 CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 110 CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 363

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 120 115 ♦ · »9 110 ♦ · ·· * · · · • · • · • · ··· · · *1 · ♦ ·* ♦··* * · · • · · • · · · • « · · ·· ·· • ψ · · • ·.· · • ··· «·* * « ·· ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 52: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

Gin (xi) Val Popis Gin Leu sekvence:SEQ ID NO: Val Gin Ser Gly Ser Glu 52 : Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 2) τ *115 Informace pro 12-0 1 SEQ ID NO: 53: (i) Charakteristiky sekvence: 111 »· · · · · · ·· ·· • · ·

* · · ·

(A) Délka: 82 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 53: CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC 60 GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82 (2) Informace pro SEQ ID NO: 54: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 90 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 54:

GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC (2) Informace pro SEQ ID NO: 55: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 27 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 55:

Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser 1 5 10 15

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 20 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 56: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 321 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina 113 • · φ φ Φ Φ Φ Φ φ φ φ « Φ Φ Φ Φ ΦΦ ΦΦ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦ ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (D) Další informace: F9HZLC 1-1 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 56: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 114 ·· · · ·· ··· · ···· ···· GCC ACG AGT Ala Thr Ser 50 GGG TCT GGG Gly Ser Gly 65 GAT TTT GCG Asp Phe Ala TTC GGC GGA Phe Gly Gly

AAC CTG GCT

Asn Leu Ala ACA GAT TTC Thr Asp Phe 70 GTT TAT TAC Val Tyr Tyr 85 GGG ACC AAG Gly Thr Lys 100 AGC GGC GTC Ser Gly Val 55 ACT CTC ACC Thr Leu Thr TGT CAG CAG Cys Gin Gin GTG GAG ATC Val Glu IIe 105 CCA GCC AGG Pro Ala Arg 60 ATC AGC AGT Ile Ser Ser 75 TGG AGT ATT Trp Ser Ile 90 AAA CGA Lys Arg

TTC AGT GGA

Phe Ser Gly CTA GAG CCT Leu Glu Pro AAC CCG CGG Asn Pro Arg 95 TCC 192 Ser GAA 240

Glu 80 ACG 288

Thr 321 (2) Informace pro SEQ ID NO: 57: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: j ednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: ·· *· ·· • · «··· 115 ·· *· ·· • · «··· 115 • · · · ♦ · # « · * « • ♦ ··« « · · · • · ·· · · · ···#·· • · · * · · · · ···· ·♦♦· ·· «| Μ ·« (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 57:

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 1S

His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

Asp Phe Ala Val Tyr' Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 io5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 58: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 41 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: • · • · · · · · • · « · 116 ♦ · · · ··· ·· · • · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 58: 41

GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T (2) Informace pro SEQ ID NO: 59: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 41 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 59:

CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G (2) Informace pro SEQ ID NO: 60: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý 117 «· »« ·* ··«· ♦ ♦ ♦* • · · · « · · ···· • · · · · · · Φ · • ·«·· ·♦······ • · · · · · · · ···· ·«·· ·Φ ♦ ♦ ·· ·· (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 60:

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 61: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 321 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (D) Další informace: F9HZLC 1-2 118 ♦ ♦ »* • * · · • ♦ • · ♦ · ···♦ ·»·· #· ···· • · · · · ♦ ♦ • · · · · *· · * · ·· ······ ♦ · · · · · ·· »· ·· *» (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 61: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48 Glu· Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT 144 His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA 240 Cy Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC .CCG CGG ACG 288 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA 321 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 62: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj : (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 62:

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20 His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly 35 40 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 50 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 65 70 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 25 30

Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 45

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 60

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 75 80

Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 90 95

Ile Lys Arg 105 120 ·· Φ« ·· ···· ·· ···· ·· » · • · · · · · • ···· ···· • · · · · · ···· MM Μ Μ ·· ·· · • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 63: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 165 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 63: AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC 60 CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC 120 TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT 165 (2) Informace pro SEQ ID NO: 64: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 161 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne 121 ·· ·· Μ ··»· ·· ·· ···· ·· · · · · · • · ··· ···· • · · · · ·« ······ • · · · t · · · ·*»· MM ·· ·· ·· ·» (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 64: CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT 60 GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC 120 AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G 161 (2) Informace pro SEQ ID NO: 65: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 280 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...280 (D) Další informace: 122 .*·.···· • · · · # «*· ·· • ; · · * · · · ♦ · · • · · » · · ···· ···· n* »·« *·*# ·.* (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 65 - A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49 Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 4 J. 1 5 10 15 GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC GCC ACT 145 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC GGT AGC 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAT ATC 241 Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG 280 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 123 ·· Μ • · · ·· ···· ·· e · • · · • · • 4 • # · • · • 4 2 ! · · ·#· • · · • · * · • • *· ·· • · • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 66: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 93 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 66:

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg 85 90 124 ·* ·« ·· · · · · • · · · · · · • · ♦ · · « « « « · · • · · · · · ··«····· c · ·» «· ·# • · · · • · · · • ·· · · ♦ * • · a · « · (2) Informace pro SEQ ID NO: 67: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 27 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 67:

TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 68: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 27 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne 125 ·· ·· ·· ···· *« Μ • · 9 ·· · ···«> • · ··· ···· • #'#· « * · ······ • · « # · · * · ··· ··*· «· ·« ·· ·« (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 68: 27

TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 69: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 33 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 69:

CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT 33 (2) Informace pro SEQ ID NO: 70: 126 126 • 9 t · • · • · · · ·· ·· • • · • · • • · • · • • • * • • · • · « <· * · · • · • · · • · · « • • · • * • • ·· · « · · · • ú « · • · • ♦ (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 70:

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 15 10 15

Ala (2) Informace pro SEQ ID NO: 71: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 48 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne 127 ·· ·* «····· Μ ·· • · · * · * · #··· • · ·*· · · · * • · % · » · r4 ····»· • « «··· · · ···· ··#· ·· ♦♦ ·» «» (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 71: GGACGTTCGG CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 48 (2) Informace pro SEQ ID NO: 72: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 52 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 72:

CGCCGCCACA GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC (2) Informace pro SEQ ID NO: 73: (i) Charakteristiky sekvence: 52 • t · · * · MM M • · • · · · · • • • · • · • · · 4 • • · • · 1 · · · 0 • « • ·· ··» • · · • • · • • ···· ···· ·· • 4 • · • · (A) Délka: 321 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: j ednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (D) Další informace: F9HZLC 2-0 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 73: CAG ATA GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT 48 Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC 144 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGT AGC GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80 129 *· ·* « · ··*· * * «· * · * · ·* · ···· • · · · « ·.«·· • · · · · W · ······ • · * * · · ·· ··· · ··♦· «· ·* *» «« GAT ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 2 88

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG 321

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 74: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid 130 ·· Μ t· ·♦·· Μ Μ • · · · * « 9··· • · · · · · · · · • « · * · · « ·»···· • · » * I t · | ······· · « Μ ·« «» (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 74:

Gin 11 e Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 75: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 94 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý 131 • · »« ·· * *·* • · · · • · » · t · · · 9 • · · # « ··· « · « ·

» * • · (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 24...94 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 75: gaattctgag cacacaggac ctcacc atg gga-tgg agc tgt atc ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CT 94

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Ile Val Leu 10 15 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 76: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 23 aminokyselin 132 ·· *é ·« »··· ·· ·· ··*« « · · «··· • · · · · ·.«·· • · · · · · · ······ • · ···· · · (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 76:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Ile Val Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 77: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 401 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: 133 ·· ·♦ β · · • · « • · « * ·· ·· • · · ♦ • · · · (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódujícx sekvence (B) Umístění: 27...401 (D) Další informace: F9HZLC 1-3 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 77: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG 101

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Ile Val Leu Thr Gin 10 15 20 25 TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 30 TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr 45 50 CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile 60 65 AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 75 80 ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 90 95 GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC 149 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 35 40 ATG CAC TGG TAC CAA CAG AGA 197

Met His Trp Tyr Gin Gin Arg 55 TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT 245 Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala 70 TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC 293 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 85 GAA GAT TTT GCG GTT TAT TAC 3 41

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 100 105 ·· ·« «« ···· ·· ·· •i *3A ···♦ · ♦ · · «· · -L -3 * · » · · · ·.··· • · · · · · « ·«« «·· • · ··»· · · ········ «· ·· ·· ·· TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG 3 89

Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 401 GTG GAG ATC AAA Val Glu Ile Lys 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 78: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 125 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: 135 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 78:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45

Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro 50 55 60

Trp Ile Tyx Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 85 90 95

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn 100 105 110

Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 79: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 81 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne 136 136 Μ ·· • · ·

·· ·· ·· ··« * · · · · · (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 79: AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC 60 AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81 (2) Informace pro SEQ ID NO: 80: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 99 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 80: TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC 60 TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99 (2) Informace pro SEQ ID NO: 81: (i) Charakteristiky sekvence:

137 ·· ·· ► · ♦ I ··· • · (A) Délka: 87 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 81:

GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 82: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 86 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj:

138 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 82: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60 GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT 86 (2) Informace pro SEQ ID NO: 83: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 278 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 3____278 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 83: AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 47

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly MeC Asn Trp Val Arg 15 10 15 CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC,ACC AGA 95

Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp lit Asn Thr Arg

2C ·· ΦΦ ·« ΦΦΦΦ φ Φ ♦ · Φ · • Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φφ ΦΦΦΦ φφ φφ Φ φ φ φ φ Φ φ φ φ φ φ Φ φφφ φφφ φ Φ φ φ ΦΦ φφ φφ 25 30 139 ·· ·· ·· • · · · · · • · · · • ♦ · · · • · · · ···· ···· ·· ···« 99 ·· • • · 9 9 • • -· 9 9 9 9 ♦ ·· 999 9 9 ♦ 9 9 9 ·· 99 AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 143 Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe 35 40 45 rpQrn ČTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 191 Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu 50 55 60 AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 239 Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met 65 70 75 GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 278 Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 80 85 90 (2) Informace pro SEQ ID NO: 84: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 92 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní 140 140 ** ···» • 9 r · • ♦ * · » · · » • t ·· · · # · · • · · · · · · ··· ··· • · ···· » « ·«·· ·»·· ·· ♦· *♦ »· (vi) Původní zdroj: xi) Podís sekvence:SE0 ID NO: 84:

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 1 5 Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 20 Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp 35 40 Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala 50 55 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 65 70

Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr 85

Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin 10 15

Met Gly Trp Tle Asn Thr Arg Asn 25 30

Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser 45

Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys 60

Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp 75 80 ?rp Gly Gin Gly Thr 90 (2) Informace pro SEQ ID NO: 85: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 30 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA 141 (ii i) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 85: AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG (2) Informace pro SEQ ID NO: 86: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 26 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 86:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG 142 142 9· 9 • 9 9 9 • 9 · * • 9 99 « · • · 9 9 • 9 9 9 « «* • ft ♦ • 9 ' · • · * * « 1 ♦ * 9 999 • · · • 9 • » 9 9 9 9 • « · · • · · 9 ·· *-'ě ri9 99 (2) Informace pro SEQ ID NO: 87: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 37 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 87: CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG 37 (2) Informace pro SEQ ID NO: 88: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 446 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: 143 • · · · ·#9* ♦» ···· • » • · · * » • · · «Ο < · *· • · » # • · · · * ·'·♦ ··· • · # · *1 (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódujici sekvence (B) Umístění: 27...446 (D) Další informace: F9HZHC 3-0 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 88:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATC CAA CTA GTG CAA 101 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Ile Gin Leu Val Gin 10 15 20 25 TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC 149 Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 30 35 40 AAG GCC TCT GGA TA C ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 197 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg 45 50 55 CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA 245 Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg 60 65 70 AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 293 Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe 75 80 85 TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 341 Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu 90 95 100 105 AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 389 Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met 110 115 120 144 *4 ·♦ • Mt ·· • · · · • · · * ♦ • 9 » * • 1 . » 9 * • » * 9 0 • * « ♦ · • · • « · * t • • 4 · · ♦ · ·· GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp 125 130 GTC TCC TCT Val Ser Ser 140 GGC CAG GGT ACC CTG GTC ACC 437 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 135 446 (2) Informace pro SEQ ID NO: 89: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 89:

Met Gly Trp Ser Cys Xle Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 145 145 ···* ·· ·· * * t · • 1 · 4 · * * # +'«· • # · · ♦ ·· M «· • ·

Ct t| • ·♦ ♦ • · • ·

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val 65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr 115 120 125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 (2) Informace pro SEQ ID NO: 90: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 90 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne 146 ·· f · *·· • « · • · · 4» t · » · • ♦ * ♦ • «' ·♦ t ·♦ · (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 90: AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT (2) Informace pro SEQ ID NO: 91: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 108 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 91: CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG 60 CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC 108 (2) Informace pro SEQ ID NO: 92: (i) Charakteristiky sekvence: 147 » • · · ψ • · · • * 9 · • · 9 · • · • * • « m ( * • 1* • « # 1 . · » é * * Λ Ψ • · · *·* • · ♦ · » • • * « <· * * 9 » (A) Délka: 108 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 92: TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC 60 TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG 108 (2) Informace pro SEQ ID NO: 93: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 102 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 93: GGCGCCGC CA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA 60 ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT 102 (2) Informace pro SEQ ID NO: 94: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 330 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...328 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 94: A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 15 10 15 GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp 20 25 30 99 • 999 «9 99 • 9 • 9 9 • • · 9 9 9 9 9 9 • 9 9 %' 9 9 9 9 9 • 9 9 • 9 9 9 99 9 9 TAC CAA CAG AAA CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG 145 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT 241 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 GCG ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC 289 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser -Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly 85 90 95 GGA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCG GCG CC 330 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 95: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 109 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý 150 • * · • · » * 9 Λ · 9 ♦ (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: NO: 95:

(xi) Popis sekvence:SEQ ID

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser 1 5 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 85 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 10 15 Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Axa Thr 45 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 60 Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 75 80 Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly 90 95 Arg Thr Val Ala Ala 105 151 ψ * M • · ···· ·· *· • · » · • · Φ • · Φ • · • · Φ • - · • • * · • * 9 • · · · • · « · • * « · • * · · · · · · · • · • « « · • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 96: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 26 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 96:

CAAGTACTC-A CACAGTCTCC ATCCTC 26 (2) Informace pro SEQ ID NO: 97: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 26 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: 152 « * ···· «· ·* ♦ * · « t ·

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 97: AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC (2) Informace pro SEQ ID NO: 98: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 412 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...412 (D) Další informace: F9HZC 3-0 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 98: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG 101

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Ile Val Leu Thr Gin 10 15 20 25 153 ··» ··* • · *· ·· TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT 149 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 30 35 40 TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA 197 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys 45 50 55 CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT 245 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala 60 65 70 AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC 293 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 75 80 85 ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC 341 Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 90 95 100 105 TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG 389 Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 110 115 120 CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GC 412 Leu Glu Ile Lys 125 Arg Thr Val Val 1 CA «**· ·· · ··*» · · · ♦ · · · · · « · t · · ·» ·*···♦ « · · · · * · i ···» *··· #· ·· *· ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 99: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 129 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (ví) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 99:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45 Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 50 55 60 Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 85 90 95 Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn 100 105 110 Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val 115 120 125

Val 155 155 «* ·««· «« ·· • · · · # * • · · ' · · · • * · ·Μ ··· • · · · · ·· ·« * · ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 100: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 25 párů basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 100:

CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC (2) Informace pro SEQ ID NO: 101: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 41 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA 156 156 ·· ·# • · · '9 · · • · · # · · • · • · · · «· ·· ·· ··♦· • · · · · · · • · * ♦ ♦ • · « · · · * # · ♦ · · · ·«···♦·· ·· ·· (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 101: GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41 (2) Informace pro SEQ ID NO: 102: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 335 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...335 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 102: Μ 157 Μ 157 ··«· • · • · ·· CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 48 Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT 144 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT GTT GCG GCG CC 335 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 158 ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ Φ· ♦· ΦΦΦΦ Φ Φ · Φ · · · • φ Φ Φ Φ Φ '· Φ · • φ « φ · Φ Φ ΦΦΦ *♦· Φ φ φφφφ · ♦ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ Φ· ·· ·♦ (2) Informace pro SEQ ID NO: 103: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 112 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 103:

Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110

I 159 ·· ···· ·· ·· • · · · · • _ · _ ·

• · · ·♦ ♦ ♦ # (2) Informace pro SEQ ID NO: 104: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 318 pána basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...318 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 104: CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 48

Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15 GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 9 6

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 160 ·· *· • ♦ · · • · • ' ♦ · • · ♦······· ·· ··»· • · ·» • ♦ ♦ · • • • • ·· • • • » ♦·· • · * • · • ·· • · • · • · CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC o o o AAA CCC TGG ATT TAT 144 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Xle Tyr 35 40 45 GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Xle Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Xle Lys .100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 105: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 106 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 105:

Gin Γ1 e Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Iie Lys 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 106: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 30 párů basí 162 fl ···· »« ·· • · · · · · · • · · * '· · · ·· · · · »·· · · · • · · · · · ·· «· · · ·» (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 106: CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 3 0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 107: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 32 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 107:

TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32 163 ·· ·· ·· • » · 9 i · ♦ 9·· • 9 9 9 9 9 9 · · 9999 9999 ·· 9·Μ »9 ·· • 9 9 9 9 9 · · · · • · 999 999 9 9 9 9 ·· 99 ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 108: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 369 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...369 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 108: CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro 1 5 ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro 35 40 GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys 50 55 GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 48 Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 10 15 GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 30 GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG 144 Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 45 TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 60 164 ·· ···· 164 ·· ···· I * · I ·# Μ Μ ·· • * · · • «

• « I • · ···« ·9·« • · ·♦ • · * * • · · · • ΙΜ Μ« • « ι· ·· AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT 288 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCT AGC 369 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser 115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 109: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 123 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineám! <·· 165 ·· ··

(ií) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 109:

Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 6.0 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala •Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly* Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser 115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 110: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 363 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: (vi) Původní zdroj: (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...363 (D) Další informace: (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 110: CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 48 Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 167 ♦ 167 ♦ ··

·· «9 ·· ···· >999. % « · • · · · · • · · * · * • · * ♦ ♦ · »······· » · ♦ · TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT 288 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 363 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 111: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj: 168 t« Μ « · « · Α·« ··· ·· ···♦ ► · « » · · » · ♦ ♦ > · · ♦ ·« ··

• » · · · · • ♦ (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 111:

Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Leu Gin Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tvr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

Claims (38)

169 169 ·· ·· • # * · • ·· • · « · • · · *··· ··

·♦·· ·· ♦♦ • ♦ # · ♦ · # · ·♦· ··· ♦ t Patentové nároky 1. Farmaceutický přípravek pro inhibici trombosy u zvířete,vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením.

2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje kyselinu acetylsalicylovou v kombinaci s monoklonální protilátkou proti koagulačnímu faktoru.

3. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje koagulační faktor, který je z vnitřní nebo ze společné koagulační dráhy.

4. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku proti koagulačnímu faktoru, kterou je anti-faktor IX, anti- faktor IXa, anti-faktor X, anti-faktor Xa, anti--faktor XI, anti-faktor Xla, anti-faktor VIII, anti-faktor Vlila, anti-faktor V, anti-faktor Va, anti-faktor VII, anti-faktor Vila nebo anti-trombinová.

5. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku proti koagulačnímu faktoru, kterou je anti-faktor IX.

6. Farmaceutický přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku proti faktoru IX, která má identifikační charakteristiky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 2249417, 170 ·· ·♦ ···· • · · * • ·· • · · · • · · ···· ··

» ♦ · ♦ ► ♦ · » «#· ··· SB 257731 nebo SB 257732.

7. Farmaceutický přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku proti faktoru IX, která má identifikační charakteristiky SB 249417.

8. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou látku, u které APTT je prodlouženo bez signifikantního prodloužení PT.

9. Farmaceutický přípravek podle nároku 4, v y z n a -čující se tím, že obsahuje účinnou látku, u které APTT je 35 až 100 sekund.

10. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2, proti trombose spojené s infarktem myokardu, nestabilní angínou pectoris, fibrilací síní, mrtvicí, poškozením ledvin, plicní embolií, trombosou hlubokých žil, perkutánní transluminální koronární angioplastikou, disseminovanou intravaskulární koagulací, sepsí, artificiálními orgány, zkraty nebo protézami, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou látku podle nároku 1 nebo 2.

11. Monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

12. Monoklonální protilátka podle nároku 11, kde koagulační faktor je z vnitřní nebo ze společné koagulační dráhy.

13. Monoklonální protilátka podle nároku 12, kde 170a monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru je anti-faktor IX, anti- faktor IXa, anti-faktor X, anti-faktor Xa, anti-faktor XI, anti-faktor Xla, anti-faktor VIII, anti-faktor Vlila, anti-faktor V, anti-faktor Va, anti-faktor VII, anti-faktor Vila nebo anti-trombinová. 171 171 • · ·· « · · « • · • « * t · · ·· «· # · · · • # · · * ··· ···

14. Monoklonálni protilátka podle nároku 12, kde monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru je anti-faktor IX.

15. Monoklonálni protilátka podle nároku 14 majíc! identifikační charakteristiky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 2249417, SB 257731 nebo SB 257732.

16. Monoklonálni protilátka podle nároku 14 mající identifikační charakteristiky SB 249417.

17. Hybridom mající identifikační charakteristiky buněčné linie 9E4(2)F4 nebo 11G4(1)B9.

18. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment produkovaný delecí Fc regionu monoklonálni protilátky podle nároku 11.

19. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment produkovaný přeskupením řetězců, kde je Fd těžký řetězec monoklonálni protilátky podle nároku 11 exprivován ve filamentosní fágové Fab zobrazovací knihovně pro myší lehký řetězec.

20. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab,)2 fragment produkovaný přeskupením řetězců, kde je lehký řetězec monoklonálni protilátky podle nároku 11 je exprivován ve filamentosní fágové Fab zobrazovací knihovně pro myší těžký řetězec.

21. Komplementaritu určující region imunoglobulinového těžkého 172 ·· ····

»· ·* >······· řetězce, jehož aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny Skládající se z SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10.

22. Molekula nukleové kyseliny kódující komplementaritu určující region imunoglobulinu podle nároku 21.

23. Komplementaritu určující region imunoglobulinového lehkého řetězce, jehož aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny Skládající se Z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 14.

24. Molekula nukleové kyseliny kódující komplementaritu určující region imunoglobulinu podle nároku 23.

25. Pozměněná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde regiony pracovních rámečků uvedeného těžkého a lehkého řetězce jsou odvozeny od alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů každého uvedeného řetězce jsou odvozeny od monoklonální protilátky podle nároku 11.

26. Pozměněná protilátka podle nároku 25, která je humanizovaná.

27. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52 nebo SEQ ID NO: 89.

28. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78 nebo SEQ ID NO: 99. 173 «9 #* • 9 # 9

• 999 9 9 99 99 9 9 9 9 .9 9 9 · 999 #99 9 9 9 9 9 * 9 9

29. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44.

30. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57.

31. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 62.

32. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 74.

33 .Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78.

34. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.

35. Chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde uvedená protilátka je charakterizována omezenou inhibicí funkce koagulačních faktorů vnitřní nebo společné dráhy, kdy je inhibována trombosa a je produkována omezená modulace koagulace, ve které jsou konstantní regiony uvedeného těžkého a lehkého řetězce odvozeny od alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence variabilních regionů každého uvedeného 174

• « • * •··· «···

Μ ··

• · · « • · řetězce jsou odvozeny od monokonální protilátky podle nároku 11.

36. Protilátka podle nároku 35, ve které jsou konstantní regiony vybrány z lidských imunoglobulinů.

37. Farmaceutický přípravek obsahující pozměněnou protilátku podle nároku 26 nebo 35 a farmaceuticky přijatelný nosič.

38. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, který dále obsahuje kyselinu acetylsalicylovou.