DK174062B1 - Kombineret præparat til anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af myocardieinfarkt - Google Patents

Description

l DK 174062 B1

Den foreliggende opfindelse angår et præparat indeholdende: a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf og b. et thrombolytisk middel som et kombineret præparat til samtidig, separat eller sekventiel anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af myocardieinfarkt og/eller blodsammenklumpninger.

5 Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk præparat omfattende: a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf og b. et thrombolytisk middel i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærervehikel.

Den indledende begivenhed ved mange myocardieinfarkter (hjerteanfald) er blødningen ind i artherosclerotisk plaque. En sådan blødning resulterer ofte i dannelsen af en throm-10 be (eller blodsammenklumpning) i den koronare arterie, som leverer til infarktzonen (dvs. et område med koagulationsnekrose, som er et resultat af en obstruktion af blodkredsløb). Denne thrombe er sammensat af en kombination af fibrin og blodplader. Dannelsen af en fibrin-blodpladesammenklumpning har alvorlige kliniske udløbere.

Graden og varigheden af okklusionen som forårsages af fibrin-blodpladesammenklump-15 ningen afgør massen af infarktzonen og graden af skade.

A. Behandling for mvocardieinfrakt

Det primære mål ved den for tiden anvendte behandling for myocardieinfarkt involverer den hurtige opløsning af den tilstoppende thrombe og genoprettelsen af blodstrøm ("genperfusion"). Foratvære effektiv skal en behandling med et gunstigt resultat være i 20 stand til at skelne mellem en fibrin-blodpladesammenklumpning og fibrinforstadiet, fi brinogen. Brugen af et middel som ikke er i stand til at udvise en sådan specificitet kan forøge risikoen for generel blødning hos patienten. En behandl ing med et gunstigt udfald skal være i stand til forlænget virkning, således at gendannelse af sammenklumpningen ikke forekommer efterbehandlingens ophør. Hvisfibrin-blodpladesammenklumpningen 25 er i stand til at gendannes, da kan den angrebne arterie blive gentilstoppet.

2 DK 174062 B1

Dannelsen affibrin-blodpladesammenklumpninger i andre dele af kredsløbssystemet kan delvisforhindresvedbrugenafanti-koagulationsmidler(såsom heparin). Uheldigvis har heparin ikke vist sig at være universelt effektivt til forhindring af genokklusion hos myokardieinfarktofre, hvor graden af blodkarokklusion (graden af "stenose") er større end 5 eller lig med 70%, især hos sådanne patienter med alvorlig residual koronar stenose.

H vis et individ har dannet en fibrin-blodpladesammenklumpning før tilgængel igheden af medicinsk assistance, kan sammenklumpningen opløses ved brug af thrombolytiske midler. Et thrombolytisk middel er et lægemiddel, som er i stand til at lyse fibrin-blodpladethromben og derved lade blodet strømme igen igennem det angrebne 10 blodkar. Sådanne midler omfatter streptokinase, prourokinase, urokinase og plasminoge- naktivator af vævstype (W. Ganzet al., J. Amer. Coll. Cardiol. 1:1247-1253 (1983), KP. Rentrop et al., Amer. J. Cardiol. 54:29E-31E (1984); H K. Gold et al., Amer. J. Cardiol. 53:122C-125C (1984).

Behandl ing med thrombolytiskemidler kan ofte med held genoprette koronar blodstrøm 15 hurtig nok til at afbryde myocardieinfarkt. Uheldigvis har den opløste ftbrinbiodplade-sammenklumpning vist sig at gendannes efter ophør af sådan thrombolytisk behandling hos en lang række patienter. Denne gendannelse kan resultere i genokklusion i de angrebne blodkar og giver derfor anledning til alvorlig bekymring (H.K. Gold et al., Amer. J.

Cardiol. 53:122C-125C (1984); H.K. Gold et al., Circulation 68:1-50-1-54 (1983)). Selv 20 om streptokinasebehandling således har vist sig at have etgunstigt udfald ved oplosning af fibrinsammenklumpningerhos ca. 85% af de undersøgte tilfælde, har genokklusion af de angrebne kar vist sig at forekomme hos ca. 25% af de undersøgte patienter (H.K. Gold et al., Circulation, 68:150-154 (1983)).

Plasminogenaktivator af vævstype (t-PA) anses for at være et mere hensigtsmæssigt 25 thrombolytisk middel end både streptokinase og urokinase på grund af, at det udviser større (selv om ikke fuldstændig) specificitet for fibrin end både det ene og det andet af disse midler gør (M. Verstrate et al., Lancet, 1:142 (1985)). Plasminogenaktivator af 3 DK 174062 B1 vævstype (t-PA) er et sammenklumpningsspecifikt tlirombolytisk middel med en hurtig dispositionsgrad fra plasma. Plasminogenaktivatoraf vævstype (t-PA) har vist sig at være et effektivt tlirombolytisk middel hos patienter med akut myokardieinfarkt frembringen-de koronargenstrøm (dvs. formindskende stenose) i 45-75 min. hos ca. 70% af de under-5 søgte patienter (H.K. Gold et al., Circulation 73:347-352 (1986)).

Plasminogenaktivator af vævstype indgives ved en infusion i en mængde på ca. I -2 mg/kg patientvægt/90 min. På grund af at t- PA i høj koncentration er i stand til at nedbryde fibrinogen, har brugen af højere doser været forbundet med en forøget mulighed for generel blødning. Forøge t-PA-doser har ikke vist sig ensartet at forøge graden af 10 sammenklumpningsopløsning.

Fordelen ved at benytte t-PA modvirkes signifikant ved den spontane grad af akut genok-klusion som følger ophøret af t-PA-behandling. Η. K. Gold og medarbejdere har fundet, at ophør af t-PA-behandl ing resulterede i genokklusion af angrebne blodkar hos ca. 45% af de undersøgte patienter (Circulation 73:347-352 (1986)). Forøgede t-PA-doser har 15 ikke vist sig at formindske tendensen for koronararteriegenokklusion. Muligheden for thrombinsammenklumpningsgendannelse er signifikant nært beslægtet med graden af residual koronar stenose (dvs. udstrækningen af blodkarblokade). Således er genokklusion mere sandsynlig hos individer, hvor der er forekommet en høj grad af stenose (dvs. større end 70% kvantitativ stenose eller mere end 80% ikke-kvantitav stenose).

20 Genokklusionenafblodkarharvistsigatinhiberesaffortsatinfusionaft-PA (H.K. Gold et al., Circulation 73:347-352 (1986)). Uheldigvis kan den relativ korte biologiske hal veringstid af t-PA og muligheden for forøgelse af tendensen for al vorlig blødning hos nogle patienter gøre forsat infusion af t-PA upraktisk for mange hjerteanfaldsofre.I sammendrag har kl iniske undersøgelser vist, at den opløste thrombe ofte gendannes efter 25 ophør af t-PA-infusion (H.K. Gold et al., Circulation 73:347-352 (l 986)), men at frekvensen af sådan genokklusion kan minimeres ved tilvejebringelse af en anden ("opretholdelse") t-PA-infusion i en i alt væsentligt lavere dosis, men i en alt væsentligt længere periode. Heparin er for tiden anerkendt som den passende ledsagende behandling for 4 DK 174062 B1 patienter, som modtager en sådan opretholdelsesinfusion. Behandling af koronararteri-ethrombosis (sammenklumpning) med t-PA kræver derfor en kontinuerlig infusion i en stor mængde for at opnå hurtig genperfusion og en opretholdelsesinfusion ved en lavere dosis for at forhindre genokklusion hos patienter med en høj grad af residual stenose.

5 B. Mekanisme af fibrinsammenklumpningsdannelse

Blodsammenklumpninger er sammensat af både fibrin og blodplader i forskellige forhold. Den fundamentale reaktion ved bl odstørkning involverer omdannelsen af et opløseligt plasmaprotein (fibrinogen) til uopløseligt fibrin. Omdannelsen af fibrinogen til fibrin katalyseres af enzymet thrombin, som er en serinprotease. Den generelle mekanisme for 10 blodsammenklumpningsdannelse eller blodstørkningsdannelse beskrives af W.F. Ganong (i: Review of Medical Physiology, 9. udg., Lange, Los Altos, Californien, side4l 1-414 (1979)). Blodplader er pladeformede strukturer, som er til stede i blod. De bidrager til sammenklumpningsdannelse i kraft af både deres inkorporering med fibrin til en uopløselig masse og i kraft af deres forøgelse af omdannelsesgraden af fibrinogen til fibrin.

15 Blodplader bidrager til sammenklumpningsdannelse ved myocardieinfarkt og er en hovedkomponent af sammenklumpninger som gentilstopper koronare arterier, som er blevet genperfuscret ved behandling med et thrombolytisk middel. Dannelsen af blodpladeaggregatet afhænger af en reaktion mellem fibrinogen (og muligvis von Wille-brand's faktor eller fibronectin) og et receptormolekyle til stede på blodplademes over-20 flade. Denne blodpladefibrinogenreceptor har vist sig at være et kompleks af to mem-branglycoproteiner benævnt GPTIb og GPIIIa (R.L. Nachman et al., J. Cl in. Invest. 69:263-269 (1982); B.S. Coller et al., J. Clin. Invest. 72:325-338 (1983)). Den specifikke rolle for GPIIb/GPIIIa-receptorkomplekset blev belyst af B.S. Coller og medarbejdere ved deres isolering af et murint monoklont antistof (kendt som monoklont antistof 25 10E5), som viser sig atvære i stand til at binde til glycoproteiner Ilbog Illa og fuldstæn dig blokere bindingen af fibrinogen til blodplader. Forat undgå potentielle kompl ikatio-ner på grund af muligheden af, at det monoklone antistofs Fc-fragmentregion muligvis 5 DK 174062 B1 inhiberer aggregation ikke-specifikt, anvendte Coller et al. Fiab^-fragmentet af 10E5-antistoffet i deres forsøg. (B.S. Coller et al., J. Clin. Invest. 72:325-338 (19S3)). F(ab')2-fragmentet af et antistof omfatter kun sådanne regioner af antistoffet, som er ansvarlige for antistoffets specificitet og antigen-bindingskapacitet. Naturen af 5 F(ab')2-fragmenter og fremgangsmåder til fremstilling deraf er beskrevet af H.N. Eisen (i: Microbiology, 3. udg., B.D. Davis et al., N.Y. Harper&Row, side 342-349 (1980)).

Et yderligere monoklont antistof (betegnet 7E3) viste sig at blokere bindingen af fibrinogen til blodplader, og at binde til GPIIb/GPIIIa(B.S. Coller, J. Clin. Invest., 76; 101 -108 (1985)). Dette monoklone antistof adskilte sig fra antistof 10E5 ved, at det bandt meget ] 0 hurtigere til aktiverede blodplader end til ikke-aktiverede blodplader og var i stand til at binde til canine såvel som humane blodplader (B.S. Coller, J. Clin. Invest, 76:101 -108 (1985); B.S. Coller et al., J. Lab. Clin. Med., 107:384-392 (1986); idet begge referencer er inkorporeret ved henvisning heri). F(ab')2-fragmenteme af monoklont antistof 7E3 viste sig at være i stand til at gribe forstyrrende ind i blodpladeaggregation og antydede 15 dermed en potentiel terapeutisk anvendelse ved behandling af thrombotisk sygdom (B.S.

Coller et al., Blood 66:1456-1459 (1985)). F(ab')2-fragmentet af monoklont antistof 7E3 viste sig også at være effektivt ved blokering af akkumuleringen af flere lag af blodplader uden at frembringe en uacceptabel risiko for blødning og antydede dermed en potentiel anvendelse til undgåelse af den totale okklusion af blodkar, som kan forekom-20 me ved myocardieinfarkt og slagtilfælde (B.S. Coller et al., Blood 66:1456-1459 (1985)).

C. Mekanisme for sammenklumpninaslvse og naturlig inhibering deraf

Sammenklumpningslyse formidles af plasmin in vivo. Under naturlige betingelser omdannes plasminogen til plasmin ved hjælp afvævsplasminogenaktivator(t-PA). Aktivering 25 foregår på fibrinoverfladen, hvorved proteolytisk aktivitet begrænses til det passende sted. Efter at plasmin er sat fri i cirkulationen, kombineres det hurtigt med naturlige inhibitorer. Inaktivering af plasmin er det afsluttende og nødvendige trin ved processen 6 DK 174062 B1 til beskyttelse over for uønsket proteolyse. Sådanne plasmininhibtorer omfatter α-2-antiplasmin, α-2-makro-globulin og α-1-antitrypsin, alle glycoproteiner. α-2-anti-plasmin har en meget højere affinitet for plasmin end α-2-makroglobulin og binder specifikt til plasmin i et I: l -forhold. Den større pool af α-makroglobulin virker som en 5 reservoirinhibitor. K.K. Kane, Ann. Clin. Lab. Sci. 14:443-449 (1984). Således er sammenklumpningslyse ved indgivelse af t-PA begrænset af den hurtige og irreversible inaktivering af plasmin af plasmininhibitorer.

α-2-antiplasmin har tre funktionelle områder: det reaktive sted for plasmin, plasminogen) eller LBS-bindingsstedet [komplementært til LBS (lysin-bindingssted) hos 10 plasmin(ogen)], og tværbindingsstedet for fibrin. J. Mimuro et al., Blood 69:446-453 (1987). Mimuro et al. beskriver antistoffer for α-2-antiplasmin, hvoraf et (JPTI-1) var specifikt for det reaktive sted hos α-2-antiplasmin og forhindrede dannelse af α-2-antiplasmin-plasmin-kompIekseroginhiberede derved antiplasminaktivitet. Mimuro et al. beskriver imidlertid ikke indgivelse af JPTI-1-antistoffet til fremme af 15 sammenklumpningslyse. Andre antistoffer specifikke for α-2-antiplasmin er beskrevet afE.F. Plow et al., i. Biol. Chem. 255:2902-2906 (1980); B.Wimen et al., Scan. J. Clin.

Lab. Invest. 43:27-33 (1983); E. Hattey et al., Thromb. Res. 45:485-495 (1987); Collen, US-patentskriftnr. 4.346.029(1980); og Collen, US-patentskrift nr. 4.198.335 (1980).

I Kumada et al., Thromb. Res. 36, 153-163, 1984, beskrives anvendelsen af polyklonale 20 antistoffer til inducering af α-2-plasmin-inhibitor-underskud hos rotter ved immuno-udtømning (eng.: immuno-depletion). Udtømning af α-2-pIasmin-inhibitor resulterede i en markant acceleration af urokinase-induceret plasmasammenklumpningslyse, men også i en mild blødningstendens ved stederne for venepunktur.

D. Resumé 25 Et væsentligtmål for behandlinger rettet modbehandling af myocardieinfarkt involverer begrænsning af nekrose ved at tillade tidlig genperfusion og ved forhindring af genokklu- 7 DK 174062 B1 sion. På nuværende tidspunkt er dette mål delvis opnået ved indgivelsen afthrombolytiske midler, som er i stand til at opløse de potentielt livstruende fibrinblod-pladesam-menklumpninger. Den mulige fordel ved anvendelse af sådanne midler modsvares imid-l ertid signifikant af deres mangel på fibrinspecificitet (som i tilfældet med streptokinase 5 og urokinase) eller af deres relativ korte biologiske halveringstid forårsaget af plas-mininhibitorer (som kan resultere i gendannelse af fibrinsammenklumpningen og den ledsagende genokklusion af de angrebne blodkar). Således eksisterer der et behov for en forbedring inden for thrombolytisk behandling, som forøger sammenklumpningslyse samtidig med, at fibrinogennedbrydning m inimeres og genokkl usion forhindres hos den 10 angrebne koronare arterie.

Den foreliggende opfindelse angår præparat indeholdende: a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til a-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasmin; og b. et thrombolytisk middel i en mængde, som er tilstrækkelig til enten (i) at opløse en 15 fibrin-blodpladesammenklumpning eller(ii) at inhibere dannelsen afen fibrin-blodplade- sammenklumpning, hvilket middel er forskellig fra antistoffet eller fragmentet deraf i (a); som et kombineret præparat til samtidig, separat eller sekventiel anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af myocardieinfarkt og/eller blodsammenklumpninger.

20 Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk præparat omfattende: a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til a-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasmin; og b. et thrombolytisk middel i en mængde, som er tilstrækkelig til enten (i) at opløse en fibrin-blodpladesammenklumpningeller(ii) at inhibere dannelsen af en fibrin-blodplade- 25 sammenklumpning, hvilket middel er forskellig fra antistoffet eller fragmentet deraf i (a); 8 DK 174062 B1 i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærervehikel.

Opfindelsen angår endvidere et sæt, som er opdelt i rum med tæt op til hinanden liggende rum til modtagelse af to eller flere beholdere deri, og som omfatter: (1) en første beholder indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af et monoklonalt 5 antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til α-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasm in, og (2) en anden beholder indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af et thrombolytisk middel (b).

Fig. I viser en grafisk afbildning af den procentivise inhibering af antiplasmin som en 10 funktion af RWR-koncentration.

Fig. 2 viser en grafisk afbildning afden procentvise sammenklumpningslyse af plasm in som en funktion af RWR-koncentration.

Fig. 3 viser en grafisk afbildning af den procentvise sammenklumpningslyse af t-PA som en funktion af RWR-koncentration.

15 Fig. 4 viser en grafisk afbildning af den procentvise sammenklumpningslyse, hvor RWR tilsættes før eller efter sammenklumpning som en funktion af t-PA-koncentration.

Fig. 5 viser en grafisk afbildning, derviser de synergistiske virkninger af t-PA og RWR ved plasmasammenklumpningslyse.

Fig. 6 viser et isobologram, som viser virkningerne af kombinationer af RWR og t-PA 20 på plasmasammenklumpningslyse.

Den foreliggende opfindelse angår præparat indeholdende.

9 DK 174062 B1 a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til a-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasmin; og b. et thrombolytisk middel i en mængde, som er tilstrækkelig til enten (i) at opløse en fibrin-blodpladesammenklumpning eller (ii) at inhibere dannelsen af en fibrin-blodplade- 5 sammenklumpning, hvilket middel er forskellig fra antistoffet eller fragmentet deraf i 00; som et kombineret præparat til samtidig, separat eller sekventiel anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af myocardieinfarkt og/eller blodsammenklumpninger.

Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk præparat omfattende: 10 a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til a-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasmin; og b. et thrombolytisk middel i en mængde, som er tilstrækkelig til enten (i) at opløse en fibrin-blodpladesammenklumpning eller (ii) at inhibere dannelsen af en fibrin-blodplade-sammenklumpning, hvilket middel er forskellig fra antistoffet eller fragmentet deraf i 15 (a); i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærervehikel.

Et "hapten-bindende molekyle” er ment at referere til et hvilket som helst molekyle, som er i stand til at binde til en plasmininhibitor. Sådanne molekyler kan omfatte antistoffer, antistoffragmenter (såsom, f.eks. F(ab')2- eller F(ab)- molekyler), såvel som en hvilken 20 som helst ligand, der er i stand til at binde til en plasmininhibitor.

Blodsammenklumpninger, som kan behandles med præparaterne ifølge opfindelsen omfatter, men er ikke begrænset til pulmonarthromboemboli, dybdevenethrombosis, cerebralemboli, nyrevene og periferal arteriel thrombosis og lignende.

I0 DK 174062 B1

Ved udtrykket "co-administration" er ment at omfatte, at hver af det hapten-bindende molekyle og thrombolytiske middel vil blive indgivet i løbet af en tidsramme, hvor de respektive perioder for farmakologisk aktivitet lapper over hinanden. De to midler kan indgives samtidig eller på hinanden følgende.

5 De hapten-bindende molekyler ifølge opfindelsen kan være monoklone antistoffer eller fragmenter deraf. Det foretrækkes at anvende F(ab')2-fragmentet af et sådant antistof til dette formål forat minimere eventuel immunologisk reaktion, som forårsages afFc-de-len af immunoglobulinet. Fremgangsmåder til fremstilling af monoklone antistoffer er beskrevet afH. Kaprowski et al. (US-patentskriftnr. 4.172.124) og Kollier et al. (Nature 10 256:495-497 (1975)). Fremstillingen af monoklone antistoffer, som er i stand til at forhindre inhibering af plasmin er beskrevet af J. Mimuro et al., Blood 69:446-453 (1987) og beskrevet i de følgende eksempler.Som anvendt heri, er et "hapten" et molekyle, som er i stand til at blive bundet af et antistof. For at kunne anvendes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, skal det hapten-bindende molekyle være i stand 15 til at binde til en plasmininhibitor og derved forhindre en sådan inhibitor fra at danne inhibitor-plasmin-komplekser. Selv om et hvilket som helst sådant hapten-bindende molekyle kan anvendes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse foretrækkes det at anvende et hapten-bindende molekyle, som er i stand til at binde til plasminbin-dingsstedet hos α-2-antiplasmin. Et særligt foretnikket monoklont antistof til dette 20 formål er antistoffet RWR, som beskrevet mere udførligt herefter.

Udtrykket "thrombolytisk middel" er ment at referere til et hvilket som helstmiddel, der er i stand til enten at opløse en fibrin-blodpladesammenklumpning eller inhibere dannelsen af en sådan sammenklumpning. Eksempler på thrombolytiske midler omfatter streptokinase, prourokinase, urokinase, og vævstype- plasminogenaktivator. Brugen af t-PA 25 til disse formål er særlig foretrukken. Selv om naturlig t-PA kan anvendes, foretrækkes det at anvende rekombineret t-PA. Opfindelsen kan endvidere udnytte hybrider, fysiologisk aktive fragmenter el I er mutantform er af de oven for nævnte thrombolytiske midler. Udtrykket "plasminogenaktivator af vævstype" som anvendt heri, er ment at omfatte sådanne hybrider, fragmenter og mutanter, såvel som både naturl igt hidrørende og rekom- binant hidrørende plasminogenaktivator af vævstype.

DK 174062 B1 li 1 en udførelsesform er det hapten-bindende molekyle og det thrombolytiske middel ifølge den foreliggende opfindelse ment at blive co-administreret til modtageren. Det 5 foretrækkes at give det hapten-bindende molekyle til patienten før indgivelsen af det thrombolytiske middel. Det er mest foretrukket at give det hapten-bindende molekyle 45 min., fortrinsvis 30 min., før indgivelsen af det thrombolytiske middel.

Det hapten-bindende molekyle ifølge den foreliggende opfindelse gives med det formål at forhindre inhibering af plasmin af en plasmin-inhibitor. Det er uventet blevet opdaget, 10 at co-administration af det hapten-bindende molekyle sammen med et thrombolytisk middel forårsager en synergistisk virkning og derved fremmer sammeklumpningslyse i en større udstrækning end det ville forventes, hvis virkningerne af indgivelse af hapten-bindende molekyle og indgivelse af thrombolytisk middel blot var additive.

Når anvendt alene, er en mængde af hapten-bindende molekyle, som er i stand til at 15 hindre inhibering af plasmin og derved fremme sammenklumpningslyse, når indgivet til en patient en "terapeutisk effektiv" mængde. For at fremme sammenklumpningslyse og forhindre sammenklumpningsgendannelse er det ønskeligt at give mellem 3 til 100 nmol hapten-bindende molekyle pr. kg patientvægt. Denne dosis kan i en udførelsesform indgives i løbet af et tidsrum på mellem 60 og 480 min. ved stadig intravenøs infusion 20 ved en hastighed på 0,10-1,0 mg/kg min. Alternativt er det muligt at give det hapten-bindende molekyle i form af en intravenøs injicerbar bolus i en dosis på mellem 3 til 100 nmol/kg, og mest foretrukket mellem 3 til 6 nmol (af hapten-bindende molekyle) pr. kg patientvægt. Hvis det hapten-bindende molekyle gives på denne måde, er en enkelt bolus tilstrækkelig til at forhindre potentiel sammenklumpningsgendannelse. Det hap-25 ten-bindende molekyle ifølge den foreliggende opfindelse kan opløses i en hvilken som helst fysiologisk tolererbar væske for at kunne fremstille en injicerbar bolus. Det fore- 12 DK 174062 B1 trækkes at fremstille en sådan bolus ved opløsning af det hapten-bindende molekyle i en normal saltopløsning.

Når det hapten-bindende molekyle, som er i stand til at forhindre inhibering af plasmin, co-administreres sammen med et thrombolytisk middel, er det ønskeligt at give 3 til 6 5 nmol hapten-bindende molekyle pr. kg patientvægt. Denne dosis kan i en udførelsesform indgives i løbet af et tidsrum på 60 til 480 min. ved kontinuert intravenøs infusion. Alternativt er detmuligt at give det hapten-bindende molekyle i en intravenøst injicerbar bolus i en dosis på mellem 3 til 6 nmol/kg og mest foretrukket mellem l til 3 nmol/kg patientvægt. En mængde thrombolytisk middel, som er i stand til at forårsage en sådan 10 lyse, er en "terapeutisk effektiv" mængde. Det thrombolytiske middel ifølge den foreliggende opfindelse gives fortrinsvis i en dosis på mellem 0,5 til 1,0 mg pr. kg patientvægt.

I en udførelsesform gives det thrombolytiske middel over et forlænget tidsrum (dvs. fra ca. 180 til ca. 1440 min.). I en foretrukken udførelsesform gives det thrombolytiske middel ifølge den foreliggende opfindelsesom en intravenøs injiceret bolus indeholden-15 de mellem 0,5 til 1,0 mg/kg, og mest foretrukket mellem 0,5 til 0,75 mg/kg. Det thrombolytiske middel ifølge den foreliggende opfindelse kan være opløst i en hvilken som helst fysiologisk tolererbar væske for at kunne fremstille en injicerbar bolus. Det foretrækkes imidlertid at fremstille en sådan bolus ved opløsning af det thrombolytiske middel i normal saltopløsning.

20 En patient, som er behandlet med den foretrukne udførelsesform vil derfor modtage en intravenøst injiceret bolus af det hapten-bindende molekyle i kombination med en intravenøst injiceret bolus af det thrombolytiske middel. Denne foretrukne behandling minimerer mængden af t-PA, som er nødvendig for thrombolyse og reducerer således udstrækningen af fibrinogennedbrydning og formindsker enhver tendens til general blød-25 ning. Væsentligt resulterer brugen af den foretrukne behandling i opløsningen af den tilstoppende thrombe ved en hastighed, som i høj grad overstiger hastigheden ved throm-beopløsning, når enten det hapten-bindende molekyle eller det thrombolytiske middel gives ved infusion. Endvidere er risikoen for genokklusion væsentligt reduceret.

13 DK 174062 B1

Disse uventede resultater er vigtige, fordi det tidligere ikke har været muligt at accelere hastigheden af sammenklumpningslyse uden at forøge tendensen til blødning. Den foretrukne udførelsesform tilvejebringer derfor en metode til behandling, hvor administrationen af en bolus af et hapten-bindende molekyle i kombination med administrationen 5 af en bolus af et thrombolytisk middel er i stand til at opløse en tilstoppende thrombe ved en hurtigere hastighed end der kan opnås, når enten den ene eller den anden forbindelse indgives alene. Endvidere opnås dette mål ved den foretrukne udførelsesform samtidig med,atbådefibrinogennedbrydningogrisikoenforgenokklusionminimeres.Somdetvil være indlysende for en fagmand inden for området, vil den nødvendige dosis af det hap-10 ten-bindende molekyle eller thrombolytiske middel afhænge af alvoren af patientens tilstand og af sådanne kriterier, som patientens højde, vægt, køn, alder og medicinske historie.

Det hapten-bindende molekyle eller thrombolytiske middel ifølge den foreliggende opfndel se kan sammensættes ved hjælp af kendte metoder til fremstill ing af farmaceuti-15 ske egnede midler, såsom ved blanding med en farmaceutisk acceptabel bærervehicle. Passende vehicler og deres formulering er beskrevet i f.eks. Remington’s Pharmaceutical Sciences (16. udg., Osol, A. (udg.), Mack, Easton PA (1980). Til dannelse af et farmaceutisk acceptabelt middel, som er egnet til effektiv administration, vil sådanne midler indeholde en effektiv mængde af det hapten-bindende molekyle eller thrombolytiske 20 middel enten alene eller sammen med en passende mængde bærervehicle.

Yderligere farmaceutiske metoder kan benyttes til at regulere virkningsvarigheden. Præparater med reguleret frigivelse kan opnås ved brugen af polymerer til kompleksdannelse med eller absorption af det hapten-bindende molekyle el ler thrombolytiske midler ifølge den foreliggende opfindelse. Den regulerede udlevering kan udføres ved valg af 25 passende makromolekyl er (f.eks. polyestere, pol yarn inosyrer, polyvinylpyrrolidon, ethy- lenvinylacetat, methyicelluiose, carboxymethylocellulose, ellerprotaminsulfat). Hastigheden af lægemiddelfrigivelse kan også reguleres ved ændring af koncentrationen af sådanne makromolekyler. En anden mulig metode til regulering af virkningsvarigheden 14 DK 174062 B1 omfatter inkorporation af de terapeutiske midler i partikler af et polymert stof, såsom polyestere, polyaminosyrer, hydrogeler, poly(mælkesyre) eller ethylenvinylacetatcopo-lymerer. Alternativt er det muligt at omslutte de terapeutiske midler i mikrokapsler, som f.eks. er fremstillet ved samlingsteknikker eller ved grænsefladepolymerisering, f.eks.

5 ved brugen af henholdsvis hydroxymethylcellulose- eller gelatine-mikrokapsler eller poly(methylmethacrylat)mikrokapsler eller i et kolloidt lægemiddeludleveringssystem, f.eks. liposomer, albuminmikrospherer, mikroemulsioner, nanopartikler, nanokapsler eller i makroemulsioner. Sådanne beskrivelser er omhandlet i Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

10 Det thrombolytiske middel eller hapten-bindende molekyle kan gives til en patient ved hjælp af midler, som er velkendte inden for området. Sådanne midler til introduktion omfatter orale midler, intranasale midler, subkutane midler, intramuskulære midler, intravenøse midler, intra-arterielle midler eller parenterale midler. I den mest foretrukne behandlingsmetode for myocardieinfarkt gives en patient en bolus (intravenøst injiceret) 15 indeholdende mellem 0,5 til 1,0 mg/kg.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af et antistof rettet mod α-2-antiplasmin.

A. Materialer 20 Aprotinin- og protein-A-Sepharose blev leveret fra Sigma (St. Louis, MO). S2251 (H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid- dihydrochlorid) blev leveret fra Helena Labs (Beaumont, TX). Human α-2-antiplasmin (a2 AP) blev opnået fra American Diagnostica,

Inc. (Greenwich, CT). PD-10-søjler blev leveret fra Pharmacia (Uppsala, Sverige). Mi-krotiterplader blev leveret fra Becton Dickinson Labware (Oxnard, CA). Affinitetsopren- 15 DK 174062 B1 set gede anti-muse (Fab')2 IgG blev leveret fra Cappel Labs (Cochranville, PA). Et murint antistofisotypesæt blev leveret fra Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).

B. Fremstilling af murine monoklone antistoffer specifikke for α-2-antiplasmin 5 A/J-mus blev immuniseret i.p. og s.c. med 10 pg human a2AP i Freund's fuldstændige adjuvans. Musene blev boostet 1 måned senere med 2 pg protein i Freund's ufuldstændige adjuvans. To måneder efter indledende immunisering, blev der udtaget blod fra en halevene hos musene og antistoftitrene blev bestemt. Musen, som havde den højeste titre, blev hyperimmuniseret med 5 pg i.v. (vandig) og 10 pg i.p. af a2AP i Freund’s ufuldstændige 10 adjuvans fire dage før og 5 pg (vandig) i.v. 3 dage før fusion. Splenocyter og murine SP2/0-celler blev sammensluttet som beskrevet (Kohier et al., supra). Hybridomaer blev udvalgt ved hjælp af radioimmunoanalyse i fast fase for a2AP, immobiliseret i brønde af polyvinylchloridmikrotiterplader. Specifikt bundet antistof blev påvist under anvendelse af affinitetsoprenset gede-anti-muse F(ab')2 IgG. Enogtyve hybridomaer bandt specifikt 15 antigen. Disse hybridomaer blev subklonet til monoklonalitet ved begrænset fortynding.

Syv hybridomaer blev ekspanderet i ascites under anvendelse af konventionelle teknikker. Antistof blev oprenset fra filtreret ascites under anvendelse af affinitetskromatografi med protein-A-sepharose.

Isotypebestemmelse blev udført under anvendelse af en kanin anti-muse, anti-idiotyp 20 antistoffer koblet til peroxidase.

En bestemt hybridoma, som fremstillede et antistof (RWR) specifik for α-2-antiplasmin af isotypen IgGl-K.

] 6 DK 174062 B1

Eksempel 2

Inhibering af α-2-antiplasmin af RWR

A. Materialer oa metoder lodering af proteiner blev udført under anvendelse af Iodogen-metoden. P.J. Fraker og 5 J.C. Speck, Biochem. Biophys. Res. Comm. 80:849-857 (1978). Den specifikke aktivitet af RWR var 20,0 pCi/pg.

B. Inhiberingsundersøgelser

Inhiberingsundersøgelservar af flere typer. Først blev der anvendt en chromogen substratanalyse til at undersøge RWR's evne til at inhibere inaktivering af plasmin med antiplas-10 min. Under anvendelse af et tidligere beskrevet analyseformat (B. W’iman, Meth. Enzy-mol. 80:1395-1403 (l 981)), blev der konstrueret en standardkurve forantiplasminaktivi-tet, som beskrevet. Antiplasmin (0 til 25 nM) blev blandet med 0,3 mM S2251 og plasmin (100 nM) i 0,1 M, pH-værdi 7,3 phosphatpuffer til i alt 1000 pi. Ændringshastigheden af optisk densitet ved 405 nanometer blev automatisk optaget hver 10. sekund på et 15 Hewlett-Packard 8451A spektrofotometer. Der blev konstrueret en standardkurve, som satte antiplasminkoncentration i relation til hastigheden af produktdannelse på en lineær måde (r = 0,98). Dernæst blev antiplasmin (25 nM) blandet med RWR (0,875 til 350 nM) og inkuberet med 0,3 mM S2251 i 0,1 M, pH-værdi 7,3 phosphatpuffer i 2 timer ved 25 °C. Plasmin (100 nM) blev hurtigt tilsat og den optiske densitet iagttaget. Hastigheds-20 ændringen af optisk densitet blev anvendt til at beregne mængden af inhibering af anti-plasminaktivitet ved en given mængde antistof.

Somvistifig. 1 forekom 55%'s inhibering af α-2-antiplasmin ved en antistofkoncentration på 20 nmol. Immunoaftryk under ikke-denaturerende betingelser viste, at RWR binder 70.000 Mr typerne af a2AP og ikke den 55.000 Mr ikke-plasminogenbindende 17 DK 174062 B1 form. Endvidere binder RWR ikke væsentligt til denaturede eller reducerede former af a2AP.

Eksempel 3

Forøgelse af sammenklumpningslyse med RWR eller t-PA

5 Friskfrossent sammenbragt (8 tilfælde donorer) human plasma blev anvendt. Til fremstilling af sammenklumpninger blev plasma blandet med små mængder Ibrin. 175x 12 mm testrør, bl ev 25 μΐ plasma omhvirvlet med 25 μΐ opløsning af bovin thrombin (1 U/ml) og calciumchlorid(4mM) i 50 mM tris-pufret saltopløsning pH-værdi 7,4. Rør blev anbragt i et vibrerende vandbad ved 37°C for at lette sammenklumpning. Rørene blev derefter 10 optalt i en γ-tæller for at bestemme grundliniemængden af 125-1 mærket Fibrin incor-poreret i sammenklumpningen. Forskellige mængder RWR og plasmin blev sat til hver rørsammenklumpning og det samlede volumen blev bragt op til 1 ml med 50 mMol tris, 0,11 M NaCl og 2 mMol CaC12. Den procentvise lyse blev bestemt ved måling af frigivelsen af radiomærket opløseligt fibrinpeptid. Ved de angivne tidsintervaller blev der 15 udtaget prøve af supematanten uden erstatning og optalt. Forsøg blev foretaget som tredobbelte forsøg og procentvis lyse blev beregnet under anvendelse af formlen:

Kumulativ procentvis lyse på tidspunkt i = L; = 1 00*(Si*TVi/SVi + Snm^n.ujSi) hvor Sj = supematanttællinger, TVj = samlet volumen tilbage i røret på tidspunkt i, SVj 20 = volumen af supernatant udtaget som prøve på tidspunkt i, og Σ Si repræsenterer sum men af tidligere supematantprøver taget uden erstatning.

Fig. 2 viser en graf for procentvis plasmasammenklumpningslyse som en funktion af RWR-koncentration. Som det kan ses fra fig. 2 forårsager RWR en dosis-afhængig signifikant forøgelse af sammenklumpningslyse af plasm in. Signifikant sammenklump ! 8 DK 174062 B1 ningslyse blev iagttaget selv ved en lav koncentration på 10 nmol (molforhold mellem Mab:a2AP på 0,4:1) i løbet af 4 timer. Således resulterer delvis inhibering af a2AP i en signifikant forøgelse i fibrinolyse af plasmin. I takt med at koncentrationen af RWR forøges, blev der iattaget væsentlig større sammenklumpningslyse.

5 Eksempel 4

Bestemmelse af den synergistiske virkning på sammenklumpningslyse af RWR og t-PA

Synergien mellem t-PA og RWR blev undersøgt som tidligere defineret (S. Loewe, Pharmacol. Rev. 9:237-242(1957); M.C. Berenbaum, Adv. Cancer 35:237-242(1981)).

10 Denne analyse nødvendiggjorde, at dosis-reaktion-kurveme for begge midler blev konstrueret (M.C. Berenbaum, J. Theor. Biol. 114:413-421 (1985)). Under anvendelse af denne, udvælges doser af t-PA og RWR, som er isoeffektive. Fraktionsdoser af de to midler kombineres derefter og deres samlede virkning på sammenklumpningslyse bestemmes. Der konstrueres en isobol, som grafisk afbilleder mængden af hvert middel 15 alene eller i kombination, som frembringer en ækvivalent mængde lyse i et givent tidsrum.

Alternativt kan disse typer af virkninger defineres algebraisk. Given isoeffektive doser af hvert separat middel A & B, kan de isoeffektive fraktionsdoser af hvert middel i kombination (ai og bi) karakteriseres som: synergistisk hvis ai/A + bi/B <: 1, additiv hvis 20 ai/A + Bi/B = 1, eller antagonistisk hvis ai/A + Bi/B > 1. For at bestemme dette empirisk, blev forskellige mængder t-PA og RWR tilsat separat og i kombination til testr ørmærkede sammenklumpninger (i tredobbelt forsøg som nedenfor beskrevet). Derefter blev den gennemsnitlige procentvise lyse bestemt som indikeret.

Frisk-frossen plasma blev blandet med 125-1 mærket fibrinogen og sammenklumpet.

25 Derefter blev varierende mængder RWR (0 til 250 nmol, slut) eller af kontrol antistof ] 9 DK 174062 B1 (anti-digoxin) (0 eller 250 nmol, si ut) sat til rørene indehol dende 0 eller l enheder t-PA.

Rørene blev inkuberet ved 37°C og den procentvise lyse blev bestemt ved frigivelsen af radiomærkede fibrinpeptider. I kontrolsammenklumpninger, på den angivne tid, var RWR alene ikke forskellig fra et kontrolantistof alene --et anti-digoxin Mab 40-160 (M.

5 Mudgett-Hunter, et al., Mol. Immunol. 22:477-488 (1985)) -i mængden aflyse induceretuden t- PA. Ved tilstedeværelse af t-PA, udviste RWR imidlertid en dosisafhængig forøgelse af sammenklumpningslyse, som var større end den, som sås ved sammenklumpninger af undersøgt med t-PA alene. Fig. 3 viser virkningen af forskellige koncentrationer af t-PA og RWR på sammenklumpningslyse.

10 Ca. 30% antiplasmin tværbindes til Fibrin med faktor 13. Hvis tværbundet antiplasmin ikke er tilgængelig for antistoffet for binding, ville dette signifikant formindske antistoffets virkning på graden af sammenklumpningslyse. Som sådanne skulle sammenklumpninger dannet med antistof allerede bundet til a2AP lyse hurtigere end sådanne, hvortil antistoffet blev tilsat efter kloning, dvs. efter tværbindingen af a2AP til fibrin. For at 15 undersøge denne hypotese, blev den tids-afhængige lyse i sammenklumpninger dannet efter præinkubering af plasmaet med RWR sammenlignet med den for dannede sammenklumpninger, hvortil RWR blev efterfølgende tilsat (Fig. 4).

Frisk-frossen plasma blev blandet med radiomærket fibrinogen. Derefter blev RWR (25 nmol, slut) blandet med plasma og sammenklumpet. I andre forsøg blev RWR sat til 20 allerede dannede plasmasammenklumpninger. Sammenklumpninger blev derefter inkuberet i puffer i 24 timer ved 4°C. Derefter blev t-PA (0, 0,1 eller I u) tilsat og de inkuberede sammenklumpningervar ved 37 °C. Graden aflyse blev bestemt som ovenfor beskrevet. Det kan ses i fig. 4, at der kun er en mindre forøgelse i graden af lyse for sammenklumpninger, som var udsat for RWR før dannelse. Dette antyder, at antiplasmin 25 er funktionelt tilgængelig for MAb i tværbundet fibrin.

For at fastlægge virkningen af kombinationer af t-PA og RWR på lyse, blev en isobol konstrueret som anbefalet ved tidligere undersøgel ser (Loewe, 1957;Berenbaum, 1981).

20 DK 174062 B1 Først blev isoeffektive doser af t-PA og RWR bestemt. Radiomærkede plasmasammenklumpninger blev inkuberet ved 37° C med forskellige mængder t-PA (0 til 0,03 enheder) eller RWR (0 til 500 nmol). Den procentvise lyse ved 48 timer blev bestemt (fig. 5). Kontrol sammenklumpninger (uden nogen af midleme)havde 9,36 + 0,38% lyse 5 ved denne undersøgelse. I dette forsøg frembragte 0,03 t-PA og 500 nmol RWR en ækvivalent mængde lyse (35,5 + 3,1 mod 34,3 + 5,1, gennemsnit + SEM).

1 det samme forsøg blev forskellige empiriske fraktionskombinationer af RWR og t-PA også undersøgt. Fraktionsdosiskombinationer af begge midlersom udviste ækvivalent lyse sammenlignet med 500 nmol RWR eller 0,03 U t-PA er optegnet (X) på fig. 6.

10 Dosiskombinationer af RWR og t-PA, som frembragte den samme mængde lyse (34,2%, 34,9%) som disse midler alene er vist ved X. Dosiskombinationer som havde højere gennemsnitlig lyse (41,3% til 100%) er vist ved O. På grund af at de ækvipotente kombinationer af t-PA og RWR er en lille fraktion af hvert middel alene (dvs. de ligger meget under linien for additivitet vist ved den kontinuerte linie i fig. 6), er der tegn på stærk 15 synergi mellem disse to midler.

Efter nu fuldstændigt at have beskrevet opfindelsen, vil det forstås af fagmænd indenfor området, at opfindelsen kan udøves inden for en lang række ækvival ente parametre med hensyn til sammensætning, betingelser og administrationsmåder, uden at afvige fra ånden eller omfanget af opfindelsen eller en hvilken som helst udførelsesform deraf.

Claims (10)

1. 2. Farmaceutisk præparat omfattende: a et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til a-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasmin; og 15 b et thrombolytisk middel i en mængde, som er tilstrækkelig til enten (i) at opløse en fibrin- bl odpi adesamm enk l umpn ing el I er (i i) at inhibere dannelsen af en fibrin-bl odplade-sammenklumpning, hvilket middel er forskellig fra antistoffet eller fragmentet deraf i (3); i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærervehikel.
2. 3. Præparat ifølge krav l eller 2, hvor både antistoffet eller fragmentet deraf (a) og det thrombolytiske middel (b) er tilpasset til at blive administreret til en patient ved intravenøs infusion. 22 DK 174062 B1
3. 4. Præparat ifølge krav l eller 2, hvor både antistoffet eller et fragment deraf (a) og det thrombolytiske middel (b) er tilpasset til at blive administreret til en patient ved en intravenøst injiceret bolus.
4. 5. Præparat ifølge krav l eller 2, som er tilpasset til at blive administreret oralt.
5. 6. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene l til 5, hvor fragmentet af antistoffet er et F-(ab’)2-fragment.
6. 7. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6, hvor det thromolytiske middel omfatter streptokinase, prourokinase, urokinase, og/eller fortrinsvis vævstypepi asm inogen-akti vator.
7. 8. Anvendelse af: a. et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til a-2-antiplasmin og forhindre inaktivering af plasmin; og b. et thrombolytisk middel i en mængde, som er tilstrækkelig til enten (i) at opløse en fibnn-blodpladesammenklumpning eller (ii) at inhibere dannelsen af en fibrin-blodplade- 15 sammenklumpning, hvilket middel er forskellig fra antistoffet eller fragmentet deraf i 00; til fremstillingen af et lægemiddel til behandling af myocardieinfarkt eller blodsammenklumpninger.
8. 9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor: 20 (1) antistoffet eller fragmentet deraf (a) er tilpasset til at blive givet til en patient i en dosis på 3 til 6 nmol pr. kg patientvægt; og (2) det thrombolytiske middel (b) er tilpasset til at blive givet til en patient i en dosis på 0,5 til 1,0 mg pr. kg patientvægt, og fortrinsvis i en dosis på mellem 0,5 og 0,75 mg pr. kg patientvægt. 23 DK 174062 B1
9. 10. Lægemiddelsæt, som er opdelt i rum med tæt op til hinanden liggende mm til modtagelse af to eller flere beholdere deri, og som omfatter: (1) en første beholder indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, som er i stand til at binde til α-2-antiplasmin og forhin- 5 dre inaktivering af plasmin; og (2) en anden beholder indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af etthrombolytisk middel (b).
10. 11. Sæt ifølge krav 10, hvor det thrombolytiske middel omfatter streptokinase, prouro-kinase, urokinase og/eller fortrinsvis vævstype-plasminogen-aktivator. 10 12. Sæt ifølge krav 10 eller 11, hvor fragmentet af antistoffet er et F(ab’)2-fragment.