CZ297216B6

CZ297216B6 - Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich smesi nebo deriváty a jejich pouzití a bunky,které je exprimují

Info

Publication number: CZ297216B6
Application number: CZ20000057A
Authority: CZ
Inventors: Subkowski@Thomas; Hornberger@Wilfried
Original assignee: Abbott Gmbh & Co. Kg
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-06-23
Publication date: 2006-10-11
Also published as: WO1999002564A3; AU748841B2; WO1999002564A2; AU8540698A; NO20000079D0; CN1262690A; EP1000087A2; US6365155B1; CA2295218A1; JP2002511880A; BR9810574A; NO20000079L; ZA986064B; DE19729544A1; CZ200057A3; KR20010021649A; IL133224A0

Abstract

Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich smesi nebo deriváty, které se vází na ankrod a inhibují jeho aktivitu, mají vazební aktivitu v oblasti 1 x 10.sup.-7.n. az 1 x 10.sup.-12.n. M a zlepsený neutralizacní úcinek oproti polyklonálnímprotilátkám z koz o minimálne 100 %. Jsou tvorenyprotilátkou typu IgG, výhodne protilátkou vylucovanou bunkami ulozenými u DSMZ pod císly DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319 nebo jejich smesmi. Bunky, které exprimují monoklonální protilátku, fragmenty protilátky, jejich smesi nebo deriváty jsouprednostne tvoreny hybridomovými bunkami, zejménabunkami DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319. Jsou vhodné pro lécení poruch srázlivosti.

Description

Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty, které se váží na ankrod a inhibují jeho aktivitu, mají vazební aktivitu v oblasti 1 x 10‘⁷ až 1 x ΙΟ¹² M a zlepšený neutralizační účinek oproti polyklonálním protilátkám z koz o minimálně 100 %. Jsou tvořeny protilátkou typu IgG, výhodně protilátkou vylučovanou buňkami uloženými u DSMZ pod čísly DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319 nebo jejich směsmi. Buňky, které exprimují monoklonální protilátku, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty jsou přednostně tvořeny hybridomovými buňkami, zejména buňkami DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319. Jsou vhodné pro léčení poruch srážlivosti.

Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty a jejich použití a buňky, které je exprimují

Oblast techniky

Vynález se týká monoklonálních protilátek, fragmentů protilátek, jejich směsí nebo derivátů a jejich použití ve farmaceutických přípravcích nebo v diagnostice a rovněž farmaceutických přípravků, které obsahují tyto protilátky, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty.

Dále se vynález týká buněk, které tyto protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty exprimují.

Dosavadní stav techniky

Ankrod (obchodní označení Arwin®, Arvin®) je enzym zjedu malajské zmije (agkistrodon rhodostoma). Je vysoko glykosylizovanou serinovou proteázou se střední MW 38000, která má antikoagulační vlastnosti a rovněž schopnost k rozpouštění krevních sraženin.

Běžná krevní sraženina nastává vlivem trombinu tím, že trombin štěpí z fibrinogenových molekul fibrinopeptidy A a B a tak vede ke vzniku fibrinu (EP-B-0 556 906), hlavní složce trombinu vedle například červených krevních tělísek nebo destiček. Ankrod štěpí v protikladu k trombinu jen arginin-glycinové vazby v a-(„A“)-řetězci fíbrinogenní molekuly a uvolňuje přitom fíbrinopeptidy A, AP a AY (Cole a kolektiv, J. Vascular. Surgery, svazek 17, 1993, str. 288 až 292). β(B)-řetězec fíbrinogenní molekuly není ankrodem napadán a tím se nerozpadá. Úlomky (des„A“-fibrinové monomery) vznikající po štěpení fibrinopeptidů, způsobeném ankrodem, mohou následně polymerizovat na tenké fílamenty. Vznikající atypický, rozpustný fibrin se čistí pomocí tělesného plazminu a/nebo se oddělí pomocí retikuloendoteliálního systému (=RES). Další štěpení des-„A“-fíbrinogenní molekuly trombinem na přírodní fibrin nenastává, poněvadž vznikající molekula není substrát trombinu.

Ankrod snižuje v závislosti na dávkování koncentraci fibrinogenu v krvi. Terapeuticky indukovanou a řízenou hypofibrinogenemií se zmenšuje plazmová viskozita a agregační sklony erytrocytenu tak, že se zlepšuje tekutost krve. Tím se vytvoří předpoklad pro silnější prokrvení zúžených cév.

Ankrodem se v současnosti léčí například chronická periferní arteriální poškození prokrvení a rovněž se provádí studie klinické fáze III u záchvatu mrtvice.

Ankrod se výhodně subkutánně injektuje. Léčení se může provádět stacionárně nebo, jestliže je zajištěna pravidelná kontrola koncentrace fibrinogenu, potřebná ke kontrole terapie, také ambulantně. Intravenózní dávka ankrodu je možná, může však nastat jen ve výjimečných případech za stacionárního ošetřování.

Ankrod se zásadně dávkuje individuálně. Rozhodující je poměr koncentrace fibrinogenu v závislosti na dávce ankrodu. Je snížena pomalu na 70 až 100 mg/100 ml plazmy (= terapeutický rozsah). Během celé doby léčení je koncentrace fíbrinogenů nastavena na hodnotu uvnitř tohoto rozsahu. Tekutost krve je za těchto podmínek dostatečně dobrá. Doba terapie činí zpravidla 3 až 4 týdny, může se však, pokud je to potřeba, prodloužit přes tento interval.

Při subkutánním použití se podává v prvních 4 dnech denně 70 I.E. (= mezinárodní jednotky, 1 ml) a od pátého dne se podle poměru koncentrace fibrinogenu podává 70 až 140 I.E. Jestliže leží koncentrace fibrinogenu v terapeutickém rozsahu, vstřikuje se najednou 2 až 3 krát týdně 210 až 280 I.E.

- 1 CZ 297216 B6

Intravenosně se zpočátku vstřikují 2 až 3 l.E./kg tělesné hmotnosti během 8 hodin. Následně se ankrod dodatečně dávkuje v závislosti na docílené koncentraci fibrinogenu. Zpravidla dostačuje pomalu vstříknout každých 12 hodin další 1 l.E./kg tělesné hmotnosti.

Počáteční poločas rozpadu ankrodu při cirkulaci činí 3 až 5 hodin, zpomaluje se ale s klesající koncentrací, takže po 4 dnech se během této doby eliminuje zpravidla 90 % vstříknutého ankrodu, poločas rozpadu se prodlouží na 9 až 12 dní.

io Jelikož se s ankrodem v protikladu například k heparinu a warfarinu objeví malé problémy s nespecifickými krváceními během ošetřování (viz Z. S. Latallo, „Retrospective Study on Complications and Asverse Effect of Treatment with Trombin-Like Enzymes - A Multicenter Trial“, Thromb. Haemostatsis, 50, str. 604 až 609, 1983), je potřebné a žádoucí cílené ošetřování takovýchto krvácení.

Kontraindikace při léčení ankrodem jsou například hemoragická diatéza, nebezpečí krvácení při zraněních, po operacích a porodech, při ulcerózních intestinálních onemocněních, neoplazmy, špatně nastavitelný vysoký tlak, akutní infarkt mozku a aktivní tuberkulosa plic, funkční porušení RES, poruchy vstřebávání sraženin, například při stavech s vysokými horečkami, těžká onemoc20 není jater, při zjevných nebo hrozících šokových stavech nebo těhotenství.

Jak je shora popsáno, je riziko krvácení s ankrodem relativně malé, když koncentrace fibrinogenu pomalu klesá a v průběhu terapie se nastaví na 70 až 100 mg/100 ml. Pacienti, u nichž existují latentní sklony ke krvácení, například při ledvinových kamenech nebo nedostatečnosti ledvin, se 25 musí zvláště pečlivě kontrolovat. Je třeba zamezit tepenným punkcím a intramuskulámím injekcím jiných léčiv. Je třeba vyvarovat se současného podávání RES blokujících a rovněž ulcerózních léčiv, antikoagulantů, antifibrinolytika, trombolytika a medikamentů, které inhibují agregaci destiček a rovněž intramuskulámího podávání ankrodu. Resorpce ze svalu nastává zpravidla velmi rychle, takže dochází mnoho monomerů des-„A“-fibrinu a existuje nebezpečí trombo30 embolických komplikací.

Ve studii se 429 pacienty (Crit. Rev. Oncol. Hematol. 15 (1993), 22-23), kterým byl bez předchozí trombolytické terapie aplikován ankrod, se krvácení projevuje u 9,8 % (4,2 % interní krvácení, 5,6 % externí krvácení).

V současné době se používá k neutralizaci enzymatické aktivity ankrodu antidot, který je založen na imunoglobulinovém přípravku z kozího séra (firemní materiál Knoll AG, červen 1983, označení Arwin®). Tento z polyklonálních látek sestávající antidod se používá při těžkých krvácivých komplikacích nebo zvýšeném nebezpečí krvácení, například při poraněních úrazem nebo z důvo40 du náhlé indikace k operaci. V návaznosti na neutralizaci ankrodu se musí podat 4 až 5 g humánních fibrinogenu. Jestliže se humánní fibrinogen, plazma nebo krev aplikují bez předchozí neutralizace ankrodu antidotem, existuje nebezpečí akutního rozšířeného srážení.

Stocker a kolektiv (Trombosis Research, svazek 6, 1975: 189-194) prozkoumali tvorbu trombinu 45 v přítomnosti samotného Arwinu® a v přítomnosti polyklonálního antidotu a mohou doložit působení antidotu.

Vedle tohoto použití polyklonálních protilátek z koz jsou popsány vEP-B-0 395 375, EP-B0 556 906 a Burkhardtem a kolektivem (FEBS, svazek 297, č. 3, 1992, str. 297 až 301) mono50 klonální nebo polyklonální protilátky k detekci exprese ankrodových genů, k průkazu fibrinogenů v krvi pomocí ankrodu a ankrodových protilátek nebo čištění ankrodu pomocí protilátek.

Nevýhodou u jako ankrodový antidot použitých polyklonálních protilátek z koz například je, že sestávají ze směsi protilátek, z nichž mnoho nemá žádný účinek z hlediska neutralizace ankrodu.

Toto velké množství různých protilátek může vést k rychlé imunitní reakci a kromě toho vede . 2 .

k relativně nízké kapacitě neutralizace ankrodu. Vedle toho jsou v antidotu obsaženy protilátky s různou afinitou vzhledem k ankrodu. Polyklonální protilátky lze, protože se získávají ze zvířat, jen těžko standardizovat, to znamená existují výkyvy v různých výrobních šaržích.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je vyvinout antidot proti ankrodu, která nemá shora uvedené nevýhody a lze ho jednoduše techniky produkovat.

Tento úkol je vyřešen monoklonálními protilátkami podle vynálezu, fragmenty protilátek, jejich směsmi nebo deriváty, které vážou ankrod a inhibují jeho aktivitu, přičemž vazební afinita leží v oblasti 1 x 10“⁷ až 1 x 10”¹² M a neutralizační účinek ve srovnání s polyklonálními protilátkami z koz se zlepší o alespoň 100 %.

Protilátky použité podle vynálezu jako antidot ankrodu se s výhodou vyznačují řadou zlepšených vlastností. Tvoří například homogenní, dobře charakterizovatelný produkt z protilátky nebo subtřídy protilátky, který nemá žádné výkyvy uvnitř různých produkčních šarží. Jsou vyrobitelné v libovolném množství a při jejich produkci, poněvadž se nepřipravují ve zvířeti, neexistuje riziko virových nebo bakteriálních kontaminací. Protilátky podle vynálezu, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty jsou specifické epitopem a mají vysokou vazební a neutralizační aktivitu. Mohou se proto při léčení podávat v malých množstvích. Homogenita produktu spolu s malými použitými množstvími vedou vlivem vysoké vazební a neutralizační aktivity k tomu, že se zřetelně redukuje riziko imunitní reakce v pacientech. Ve vazební a neutralizační aktivitě se nevyskytují uvnitř různých protilátek, fragmentů protilátek nebo derivátů výkyvy jako u polyklonálních protilátek. Smícháním různých monoklonálních protilátek, fragmentů protilátek nebo derivátů s vazební aktivitou proti různým epitopům ankrodu, ho lze velmi efektivně neutralizovat.

Protilátky podle vynálezu, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty mají výhodně vazební afinitu vzhledem k ankrodu v rozsahu 1 x 10⁷ až 1 x 10 ¹² M, přednostně 1 x 10“⁸ až 1 x 10”, zvláště přednostně 1 x 10 ⁹ až 5 x 10“’° M.

Antidot podle vynálezu má oproti polyklonálním protilátkám z koz o minimálně 100 % zlepšenou účinnost neutralizace ankrodu, přednostně o 250 %, zvláště o 500 % zlepšenou účinnost. Také in vitro vykazují monoklonální protilátky značně lepší účinek než polyklonální protilátky.

Pod monoklonálním látkami nebo jejich fragmenty se v principu rozumí všechny imoglobulinové třídy jako IgM, IgG, IgD, IgE, IgA nebo jejich subtřídy jako subtřídy IgG nebo jejich směsi. Přednostní jsou IgG a jeho subtřídy jako například IgG], IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ nebo IgG_M. Zvláště přednostní jsou IgG subtypy lgG]_/K nebo IgG₂b/K- Jako fragmenty se uvádí všechny zkrácené nebo změněné fragmenty protilátky s jedním nebo dvěma vazebními místy komplementárními s antigenem, které mají vysokou vazební a neutralizační aktivitu vzhledem k ankrodu, jako části protilátky s vazebními místy tvořenými podle protilátek lehkým a těžkým řetězcem jako Fv- Fab- nebo F(ab')₂- Tyto fragmenty se mohou získat například enzymatickou cestou odštěpením Fc části protilátky enzymem jako papain nebo pepsin, chemickou oxidací nebo genovou manipulací s geny protilátky. Výhodně se mohou použít také genově manipulované nezkrácené fragmenty.

Protilátky nebo fragmenty se mohou použít samostatně nebo ve směsích.

Geny protilátky lze pro genové manipulace izolovat pro odborníka známým způsobem například z hybridomových buněk. K tomu se odeberou buňky produkované protilátkou a mRNA se z buněk izoluje známým způsobem při dostatečné optické tloušťce buněk pomocí buněčné analýzy thiokyanatanem guanidinu, okyselením octanem sodným, extrakcí fenolem, chloro

-3CZ 297216 B6 form/izoamylalkoholem, vysrážením izopropanolem a praním ethanolem. Následně se pomocí reverzní transkripce syntetizuje z mRNA cDNA. Syntetizovaná cDNA se může přímo nebo po genetické manipulaci, například pomocí „site directed matagenesis“, zavedením inzerce, inverze, deletace nebo výměnou bází inzerovat na vhodné zvířecí, houbové, bakteriální nebo virové vek5 tory a exprimovat na příslušné organismy. Přednostní jsou ke klonování genů bakteriální nebo kvasinkové vektory jako pBR322, pUC18/19, pACYC184, lambda nebo kvasinkové mu-vektory a exprese na bakteriích jako e. coli, respektive na kvasinkách jako saccharomyces cerevisiae.

Dalším předmětem podle vynálezu jsou buňky, které syntetizují protilátky podle vynálezu. Těmi mohou být po transformaci, jak je shora uvedeno, zvířecí, houbové a bakteriální buňky nebo buňky kvasinek. Výhodně se jedná o hybridomové buňky nebo triomové buňky, přednostně se jedná o hybridomové buňky. Tyto hybridomové buňky lze připravit například známou cestou ze zvířat imunizovaných ankrodem a izolací jejich B-buněk produkujících protilátku, selekcí těchto buněk na ankrod vázající protilátku a následnou syntézou těchto buněk s například lidskými nebo 15 zvířecími, například myšími myelomovými buňkami, humánními lymfoblastoidovými buňkami nebo heterohybridomovými buňkami (Koehler a kolektiv, Nátuře 256, 1975, 496) nebo infekcí těchto buněk příslušnými viry na nesmrtelné buňky. Přednostní jsou hybridomové buňky připravené syntézou, zvláště přednostní jsou myší hybridomové buňky, zcela přednostní jsou hybridomové buňky, které vylučují protilátky MAK 1-2, MAK 2-29/3 nebo MAK 3-27 a byly uloženy 20 u DSMZ (Deutsche Sammlung fůr Mikroorganismen und Zellkulturen v Braunschweigu) pod čísly DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319.

Shora uvedené hybridomové buňky vylučují zvláště přednostně protilátky IgG typu. U vytvořených protilátek MAK 1-2, MAK 2-29/3 a MAK 3-27 se jedná o následující IgG subtypy IgGi/κ, 25 IgG₂b/K a IgGi/K- Tyto přednostní protilátky se váží na různých epitopech molekuly ankrodu, jaké ukazuje test na kompetitivní vazbu protilátek. Vazba zvláště přednostní protilátky MAK 1-2 na její epitop vede k silnější neutralizaci molekuly ankrodu, tím jsou pro neutralizaci enzymatického účinku potřebná menší množství protilátky. Monoklonální protilátka vykazuje zřetelně vyšší neutralizační účinek než obvyklý při ošetřování krvácení použitý antidot na bázi polyklonálních 30 protilátek, které se získaly z koz a jsou jako antidot prodávaný firmou Knoll AG (Ludwigshafen).

Jako deriváty monoklonálních protilátek podle vynálezu se uvádí peptidy, peptidomimetika, která se odeberou z oblastí protilátek, vázajících antigen, na pevných nebo tekutých nosičích jako polyethylenglykol, sklo, syntetické polymery jako polyakrylamid, polystyren, polypropylen, 35 polyethylen nebo přírodní polymery jako celulóza, separóza nebo agaróza vázající protilátku, fragmenty nebo peptidy nebo kojaguláty s enzymy, toxiny nebo radioaktivními nebo neradioaktivními označeními jako 3H, 1231, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc, 75Sc, fluorescenčními/chemiluminiscenčními označeními jako rodamin, gluorescein, izothiokyanatan, fykoerytrin, fykokyanin, fluoreskamin, kovové cheláty, avidin, streptavi40 din nebo biotin kovalentně vázající protilátku, fragmenty, nebo peptidy.

Protilátky podle vynálezu, fragmenty protilátky, jejich směsi a deriváty se mohou použít přímo, po sušení, například sušením vymrazováním, po vazbě na shora uvedené nosiče nebo po formulování jinými farmaceutickými účinnými a pomocnými látkami k výrobě farmaceutických pří45 pravků. Jako účinné a pomocné látky se uvádí například další protilátky, antimikrobiologicky účinné látky, které působí mikrobiocidně nebo mikrobiostaticky, jako antibiotika obecně nebo sulfonamidy, antitumorové prostředky, voda, pufr, solanka, alkoholy, tuky, vosky, inertní nosiče nebo obdobné parenterálně obvyklé látky jako aminokyseliny, zahušťovače nebo cukr. Tyto farmaceutické přípravky se používají při léčení nemocí, zejména při léčení poruch srážlivosti, 50 výhodně poruch periferního krevního systému nebo při mrtvici.

Protilátky podle vynálezu, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty se mohou použít přímo nebo po vazbě na pevných nebo tekutých nosičích, enzymech, toxinech, radioaktivních nebo neradioaktivních označeních nebo na fluorescenčních/chemiluminiscenčních označeních, 55 které jsou popsány shora, v diagnostice. Přitom ankrod se může prokázat v nejrůznějších těles

-4CZ 297216 B6 ných tekutinách z nejrůznějších orgánů jak člověka nebo zvířete nebo v nejrůznějších tekutinách například kultivačních médiích kvasinek, bakterií, hub nebo humánních nebo zvířecích buněčných kultur.

Příklady provedení vynálezu

1. Výroba hybridomových buněk

Imunizace, syntéza, selekce a charakterizace byly provedeny technikami popsanými v literatuře (například J. H. Peters, Monoklonální protilátky, výroba a charakterizace, Springer Verlag, A. M. Campbell, Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology, Verlag Elsevier, kapitola 2 až 7 a 8, 1991).

Myší samičí balb/c byl intraperitoneálně imunizován 100 pm ankrodu, který byl příčným zesilováním inaktivován z hlediska enzymatické aktivity, ve 2 až 3 týdenním rytmu podle následujícího schématu:

1. ve 100 pl PBS + 100 pl kompletního Freundschova adjuvans,

2. ve 100 pl PBS + 100 pl nekompletního Freundschova adjuvans,

3. -5. ve 200 pl PBS.

Tři dny po poslední aplikaci antigenu byla odebrána slezina, buňky byly prány a provedena syntéza lymfocytů s myelomovými buňkami SPA/0-Agl4 (= ATCC CRL 1581). Ktomu byly smíchány v poměru 5:1, inkubovány 1 min při 37 °C 1,5 ml roztokem PEG (polyethylenglykolu), zředěno PBS (fosforečnanem pufrovaná solanka), 1 ml během 30 s, 3 ml během 30 s, 16 ml během 60 s. Po praní byly buňky při 37 °C/7,5 % CO₂ kultivovány v selekčním médiu (DMEM (=dulbecco's modified eagle medium), 10% FCS (= telecí sérum), 10 % condimed H1 (Boehringer Mannheim), HAT přídavek (- hypoxanthin, aminopterin, přídavek thymidinu), ITS přídavek (= insulin, transferrin, přídavek selenitu), pyruvat, glutamin, streptomycin/penicilin).

Identifikace hybridomu, který sezemuje specifické antiankrodové protilátky, nastává v mikrotitrační desce následně:

- mikrotitrační desky se převrství 0,1 ml/well ankrodu, případně referenčních proteinů ke stanovení specifity (1 pg/ml 0,05 M NaHCO₃ pH 9,2) během 16 h/4 °C,

- nasycení 0,3 ml/well 1 % BSA/PBS během 0,5 až 1 h/23 °C (h = hodina),

- 3x praní pomocí PBS/0,05 % Tween® 20,

- inkubace přebytkem buněčných kultur (50 μΐ zředěno 50 μΐ PBS/0,1 % BSA (= albumin hovězího séra)/0,05 % Tween® 20) během 2 až 4 h/23 °C,

- praní jako shora,

- inkubace pomocí 0,1 ml/well biotinylické antimyší IgG protilátky v 0,1 % BSA/PBS během 2 až 4 h/23 °C,

- praní jako shora,

- inkubace pomocí 0,1 ml/well streptavidin-peroxidázového komplexu v 0,1 % BSA/PBS během 2 až 4 h/23 °C,

- praní jako shora,

- 0,1 ml/well peroxidázového substrátu,

- reakce se zastaví 0,1 ml/well 2 M H₂SO₄,

- měření absorpce při 450 nm.

-5CZ 297216 B6

Peroxidázový substrát: smíchá se 0,1 ml roztoku TMB (42 mM tetramethylbenzidinu v DMSO) a 10 ml substrátového pufru (0,1 M octanu sodného, pH 4,9), potom přídavek 14,7 μΐ H₂O₂. Hybridomy s pozitivní reakcí protilátky byly izolovány subklonováním a jednotlivé klony byly znovu testovány. Protilátky s nejvyšší reaktivitou byly použity v neutralizační zkoušce. Touto cestou může být izolováno množství pozitivních hybridomů, to znamená buňky tvoří protilátky proti ankrodu.

2. Produkce a charakterizace monoklonálních protilátek

Čištění monoklonálních protilátek se provádělo z bezsérových přebytků buněčné kultury. Proto byly postupně převáděny z DMEM/HAT/10 % FCS přes DMEM/HT/10 % FCS a DMEM/10 % FCS na bezsérové médium buněčné kultury (HT = hypoxanthin, aminopterin), jako například SF-3 (Cytogen), PFHM-1I (Gibco), HL-1 (Bio Whittaker), Ultra Doma PF (Bio Whittaker) nebo podobně. Pro následné čištění prostřednictvím afinitní chromatografie byly použity protein Aseparózy, respektive protein G-separózy.

Po nanesení přebytků buněčné kultury na chromatografický sloupec byly nespecificky vázané proteiny prány 3 M NaCl/1,5 glycinu, pH 8,9, aktivita antiankrodové protilátky byla eluována 500 mM NaCl/0,59 % kyseliny octové.

Stanovení subtypu protilátky bylo provedeno analogicky, jak je popsáno shora v postupu ELISA, přičemž však na místo biotinylické protilátky proti myší IgM byl použit následující biotinylický subtyp - specifická protilátka: IgM| proti myší, IgM proti myší, IgG_2a proti myší, « - proti myší, IgG_2b proti myší, lambda proti myší, IgG₃ proti myší.

Typy a supertypy protilátek izolovaných hybridomových buněk MAK 1-2, MAK 2-29/3 a MAK 3-27 (viz příklad 1) byly stanoveny IgG_l/K, IgG_]b/K a IgG_l/K.

Konstanty afinity monoklonálních protilátek byly zjištěny různými z literatury známými technikami, jako například rovnovážnou dialýzou, imunitní precipitací nebo postupem ELISA (například J. H. Peters, Monoklonale Antikórper, Herstellung und Charakterisierung, Springer Verlag, A. M. Cambell, Monoclonal Antobody and Immunosensor Technologie, Verlag Elsevier, kapitola 11, 1991).

Podle postupu ELISA (J. Immunol. Methods 77 (1985) 305 až 319) se obdrží následující afinity vzhledem k přírodnímu ankrodu (tabulka I):

Tabulka I: Afinity monoklonálních protilátek vzhledem k ankrodu

hybridom/proti látka	Řd
MAK 1-2	1,7 * 10 ⁹
MAK 2-29/3	3,1 * 10“⁹
MAK 3-27	4,4 * 10*’

3. Neutralizace ankrodu monoklonální protilátkou (=MAK) - přebytek buněčné kultury

Neutralizační kapacita protilátky byla kvantifikována pomocí ankrodem indikovaným fibrinovým zákalem. K tomu byly v mikrotitračních destičkách nasycených BSA inkubovány při 37 °C různé koncentrační poměry ankrodu k protilátce a následně byl přidán humánní fibrinogen (1,5 mg). Po inkubaci při 37 °C byl při 340 nm kvantifikován vznikající fíbrin (optická hustota OD).

S narůstajícím množstvím neutralizujících protilátek se může neutralizovat aktivita ankrodu. Toto se ukázalo na snižujících se optických hustotách.

-6CZ 297216 B6

Zvláště efektivně působila protilátka MAK 1-2, která také při vyšších koncentracích ankrodu vedla k úplné neutralizaci. Prázdná hodnota v tabulce II obsahovala všechny součásti kromě ankrodu. Nejvyšší hodnoty optické hustoty byly změřeny s různými dávkami ankrodu (50, 25 a 12,5 ng/ml ankrodu) bez přídavku různých monoklonálních protilátek (tabulka II).

MAK 2-29 a 3-27 mají podobně dobrou nebo lepší afinitu k ankrodu jako MAK 1-2 (tabulka I), vazba protilátky antigen však vedla k neutralizaci enzymatické aktivity teprve při vyšších dávkách protilátky vztaženo na množství ankrodu.

Tabulka II: Neutralizace ankrodu přebytkem buněčné kultury MAK

vsázka	optická hustota
prázdná hodnota	0,268
ankrod 50 ng/ml	1,45
ankrod 50 ng/ml + MAK 1-2	0,254
ankrod 50 ng/ml + MAK 2-29	1,354
ankrod 50 ng/ml + MAK 3-27	1,133
ankrod 25 ng/ml	0,939
ankrod 25 ng/ml + MAK 1-2	0,238
ankrod 25 ng/ml + MAK 2-29	0,333
ankrod 25 ng/ml + MAK 3-27	0,422
ankrod 12,5 ng/ml	0,67
ankrod 12,5 ng/ml + MAK 1-2	0,229
ankrod 12,5 ng/ml + MAK 2-29	0,281
ankrod 12,5 ng/ml + MAK 3-27	0,261

4. Neutralizace ankrodu pomocí vyčištěných monoklonálních protilátek in vitro

Vyhodnocení efektivity neutralizace vyčištěných monoklonálních protilátek in vitro bylo provedeno porovnáním 50 % hodnoty neutralizace ve zkoušce fibrinovým zákalem.

50% neutralizační hodnota se obdrží následně:

OD negativní kontroly + (OD pozitivní kontroly - OD negativní kontroly)/2

Negativní kontrola:	žádný přídavek ankrodu (žádný vznik fíbrinu)
Pozitivní kontrola:	ankrod + fibrinogen (maximální vznik fíbrinu)

Vlivem různých poměrů protilátka/ankrod se obdrží variující OD hodnoty, přičemž 50 % neutralizace byla při následujících koncentracích protilátky:

	MAK 1-2	polyklonální protilátka	poměr polyklon. proti látka/MAK
1 h předinkubace
1,25 ng ankrodu	310ng	625 ng	2,0
2,5 ng ankrodu	350 ng	800 ng	2,3
2 h předinkubace
1,25 ng ankrodu	80 ng	310 ng	3,9
2,5 ng ankrodu	150 ng	650 ng	4,3

Z poměrů množství protilátky potřebné k 50 % neutralizaci bylo možné odvodit, že za zvolených in vitro podmínek byla monoklonální protilátka MAK 1-2 při 1 hodině předinkubace alespoň o faktor 2, při 2 hodinách předinkubace alespoň o faktor 4 lepší než antidot na bázi polyklonálních protilátek z koz.

5. Kvantifikace ankrodu pomocí postupu „sandwich-ELISA“

Stanovení ankrodu ve zkouškách k diagnostickým účelům, například různých tekutostí, bylo provedeno kombinací dvou protilátek pomocí postupu sandwich-ELISA podle následujícího schématu:

- převrstvení mikrotitračních desek 5 pg/ml MAK 1-2, případně MAK 3-27 ve 100 pl/well, zředěno v 0,05 M NaHCO₃, pH 9,2, přes noc/4 °C,

- praní mikrotitračních desek pomocí PBS/0,05 % Tween® 20, 200 pl/well,

- nasycení 300 pl/well 1 % BSA/PBS, 0,5 h/23 °C,

- praní jako shora,

- 11 standardních zředění ve dvou krocích ankrodem, vysráženo 50 ng/ml vPBS/0,1% BSA/0,5 % Tween® 20, 100 pl/well, zkoušky se prováděly souběžně s tím v různých zředěních, inkubace 2 h/23 °C,

- praní jako shora,

- inkubace pomocí MAK 2-29, 1 pg/ml zředěno vPBS/0,1 % BSA/0,05 % Tween® 20, 100 pl/well, 2 h/23 °C,

- praní jako shora,

- inkubace pomocí biotinylické antimyší IgG₂b, zředěno 1:10000 vPBS/0,1 % BSA/0,05 % Tween® 20, 100 pl/well, 2 h/23 °C,

- praní jako shora,

- inkubace pomocí streptavidin-peroxidázového komplexu, zředěno 1:10000 vPBS/0,1% BSA/0,05 % Tween® 20, 100 pl/well, 0,5 h/23 °C,

- praní jako shora,

- přídavek 100 pl/well peroxidázového substrátu: (10 ml substrátového pufru (0,1 M octanu sodného pH 4,9) smícháno se 100 pl roztoku TMB (42 mM tetramethylbenzidinu v DMSO) a přídavek 14,7 pl H₂O₂ 3%),

- reakce se zastaví 100 pl/well 2 M H₂SO₄,

- měření absorpce při 450 nm.

Pro obě monoklonální protilátky MAK 1-2, respektive MAK 3-27 a použité kombinace se ukazuje, že ankrod lze kvantifikovat a prokázat v rozsahu koncentrací 3000 až 100 pg/ml. Absolutní prokazatelná hranice leží ještě pod těmito kvantifikovatelnými hodnotami (obr. 1).

6. Kompetitivní ELISA

K charakterizaci relativní polohy epitopu MAK vázajícího se na ankrod byla provedena kompetitivní ELISA:

- převrstvení mikrotitračních desek 1 pg/ml ankrodu 100 pl/well, zředěno v 0,05 M NaHCO₃, pH 9,2, přes noc/4 °C,

- praní mikrotitračních desek pomocí PBS/0,05 % Tween® 20, 200 pl/well,

- nasycení 300 pl/well 1 % BSA/PBS, 0,5 h/23 °C,

- praní jako shora,

- Na takto připravené mikrotitrační desky byly dány různé vsázky 10 ng/ml monoklonálních biotinylických protilátek MAK 1-2-biotin, MAK 2—29/3—biotin a MAK 3-27-biotin a vázány na ankrod, následně byly k vsázkám přidány podle použitých protilátek variabilní koncentrace (1 pg/ml - 1 ng/ml) každé z dalších protilátek (MAK 1-2, MAK 2-29/3 nebo MAK 3-27),

-8CZ 297216 B6 takže byly testovány všechny možné kombinace protilátek ve vztahu k jejich možným překrývajícím se vazebním místům. Vsázky s různými kombinacemi protilátek byly inkubovány v PBS/0,1 % BSA/0,05 % Tween® 20 dvě hodiny při 23 °C a následně byly ošetřeny, jak je dále uvedeno:

- praní jako shora,

- přídavek 100 μΐ/well peroxidázového substrátu: (10 ml substrátového pufru (0,1 M octanu sodného pH 4,9) smícháno se 100 μΐ roztoku TMB, (42 mM tetramethylbenzidinu v DMSO) a přídavek 14,7 μΐ H₂O₂ 3%),

- reakce se zastaví 100 μΐ/well 2 M H₂SO₄,

- měření absorpce při 450 nm.

V žádné z použitých kombinací protilátek nebyl pozorován úbytek OD, to znamená různé monoklonální protilátky se nevytlačují při vazbě na ankrod. Váží se na různé epitopy molekuly ankrodu. Může proto s ankrodem působit současně více protilátek. Pro rychlou optimální neutralizaci účinku ankrodu se proto mohou různé monoklonální protilátky použít, jestliže je to potřebné a žádoucí, v kombinaci.

4. Neutralizace ankrodu in vivo

Ankrod byl aplikován anestetizovaným krysám po 30 minut jako infuze 10 IU/kg tělesné hmotnosti do ocasní žíly. 10 minut po zahájení infuze ankrodu byly aplikovány různé testované substance - monoklonální, polyklonální protilátky nebo placebo - jako intravenózní bolus v množství 1 ml/kg tělesné hmotnosti. Krevní zkoušky (8 objemových dílů krev + 2 objemové díly 0,1 M citranu) byly z krční tepny před, případně 30 a 60 minut po zahájení infuze ankrodu. Odstředěním byla získána plazma a podle Claussgerinnungova postupu byl stanoven obsah fibrinogenu (kalibrační křivka přídavkem definovaných množství krysích fibrinogenů k defibrinogenované plazmě krys).

Ve skupině pro testovací substanci bylo použito 6 krys (tabulka III).

Tabulka III: Použitá množství testovací substance

MAK 1-2	(1,435 mg/kg tělesné hmotnosti)
polyklonální protilátka	(8,6 mg/kg tělesné hmotnosti, šarže antidotu A009)
polyklonální protilátka	(1,5 mg/kg tělesné hmotnosti, šarže antidotu A009)

Tabulka IV: Měření koncentrace fibrinogenů při různých protilátkách

čas (min)	koncentrace fibrinogenů (mg/dl)
	ankrod + kontrola	ankrod + MAK 1-2	ankrod + polyki. AK 8,6 mg/kg	ankrod + polyki. AK 1,5 mg/kg
0	289,7	263,4	292,4	281,8
30	63,8	155,9	129,0	91,5
60	32,1	152,7	164,0	55,8

Ukazuje se, že MAK 1-2 byl v použité koncentraci 1,435 mg/kg tělesné hmotnosti schopen 30 min po zahájení infuze ankrodu zastavit další snížení hladiny fibrinogenů. Polyklonální protilátky z koz vyžadují pro stejný efekt 8,6 mg/kg tělesné hmotnosti. V koncentraci 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti, tedy koncentraci srovnatelné s koncentrací MAK 1-2 nevykazuje antidot na bázi polyklonální protilátky žádný efekt (viz kontrola tabulka IV).

-9CZ 297216 B6

Na základě koncentrace fíbrinogenu, výsledné po 60 minutách, bylo možné odvodit, že in vivo MAK 1-2 za podmínek testu neutralizuje lépe o faktor 6, než polyklonální antidot. Jak se zdá, je neutralizační účinek MAK 1-2 ještě zřetelně vyšší.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty, které se váží na ankrod a inhibují jeho aktivitu, přičemž vazební afinita leží v oblasti 1 x 10~⁷ až 1 x ΚΓ¹² M a je zlepšený neutralizační účinek oproti polyklonálním protilátkám z koz o minimálně 100 %.
2. Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty podle nároku 1, které jsou tvořené protilátkou typu IgG.
3. Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty podle nároku 1 nebo 2, které jsou tvořené protilátkou vylučovanou buňkami uloženými u DSMZ pod čísly DSM ACC2317, DSM ACC23I8 a DSM ACC2319 nebo jejich směsmi.
4. Buňky, které exprimují monoklonální protilátku, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty podle jednoho z nároků 1 až 3.
5. Buňky podle nároku 4, které jsou tvořené hybridomovými buňkami.
6. Buňky podle nároku 4 nebo 5, které jsou tvořené hybridomovými buňkami uloženými u DSMZ pod čísly DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319.
7. Farmaceutické přípravky, vyznačující se tím, že obsahují monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty podle nároků 1 až 3.
8. Použití monoklonální protilátky, fragmentu protilátky, jejich směsí nebo derivátů podle nároků 1 až 3 k výrobě farmaceutických přípravků.
9. Použití monoklonální protilátky, fragmentu protilátky, jejich směsí nebo derivátů podle nároků 1 až 3 k výrobě prostředků k léčení poruch sráží ivosti.
10. Použití monoklonální protilátky, fragmentu protilátky, jejich směsí nebo derivátů podle nároků 1 až 3 pro přípravu farmaceutické komponenty pro léčení a prevenci akutní srážlivosti.

výkres

- 10CZ 297216 B6 [pg/ml]

Konec dokumentu