CZ200057A3 - Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty a jejich použití a buňky pro jejich exprimaci - Google Patents
Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty a jejich použití a buňky pro jejich exprimaci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200057A3 CZ200057A3 CZ200057A CZ200057A CZ200057A3 CZ 200057 A3 CZ200057 A3 CZ 200057A3 CZ 200057 A CZ200057 A CZ 200057A CZ 200057 A CZ200057 A CZ 200057A CZ 200057 A3 CZ200057 A3 CZ 200057A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ancrod
- antibody
- mixtures
- derivatives
- antibodies
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty a jejich použití a buňky pro jejich exprimaci
Oblast.....techniky
Vynález se týká monok1oná1 ních protilátek, fragmentů protilátek, jejich směsí nebo derivátů a jejich použití ve farmaceutických přípravcích nebo v diagnostice a rovněž farmaceutických přípravků, které obsahují tyto protilátky, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty.
Dále se vynález týká buněk, které tyto protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty exprimují.
Dosavadní stav......techniky
Ankrod (obchodní označení ArwinR, ArvinR) je enzym z jedu malajské zmije (agkistrodon rhodostoma). Je vysoko g1yko1 izovanou serinovou proteazou se střední MW 38000, která má antikoagu1ární vlastnosti a rovněž krevních sraženin.
schopnost k rozpouštění tělísek nebo thromb inu jen
Běžná krevní sraženina nastává vlivem thrombinu tím, že thrombin štěpí z fi br inogenových molekul fibrinopeptidy A a B a tak vede ke vzniku fibrinu (EP-B-0 556 906), hlavní složce thrombenu vedle například červených krevních destiček. Ankrod štěpí v protikladu k arginin-g1yci nové vazby v a-(“A)-řetezci fibrinogenní molekuly a uvolňuje přitom fibrinopeptidy A, AP a AY (Cole a kolektiv, J. Vascular. Surgery, svazek 17, 1993, str. 288 až 292).
β-(B)-řetězec fibrinogenní molekuly není ankrodem napadán a tím se nerozpadá. Úlomky ( desA-f i br i no vé monomery) vznikající po štěpení fibrinopeptidů, způsobeném ankrodem, mohou následně po 1ymerizovat na tenké filamenty. Vznikající atypický, rozpustný fibrin se lyseruje pomocí tělesného plasminu a/nebo * · · · · · • · · • · * • · · ·· · • ·♦ ·· « · « · · · »· · ·· · · se oddělí pomocí reti ku 1oendothe1 iá1ního systému (=RES). Další štěpení des-A“-fibrinogenní molekuly thrombinem na přírodní fibrin nenastává, poněvadž vznikající molekula není substrát t hromb i nu.
Ankrod snižuje v závislosti na dávkování koncentraci fibrinogenu v krvi. Therapeuticky indukovanou a řízenou hypofibrinogenemií se zmenšuje plasmová viskozita a agregační sklony erythrocytenu tak, že se zlepšuje tekutost krve. Tím se vytvoří předpoklad pro silnější prokrvení zúžených cév.
Ankrodem se v současnosti léčí například chronická periferní arteriální poškození prokrvení a rovněž se provádí studie klinické fáze III u záchvatu mrtvice.
Ankrod se výhodně subkutánně injektuje. Léčení se může je zajištěna pravidelná potřebná ke kontrole provádět stacionárně nebo, jestliže kontrola koncentrace fibrinogenu, therapie, také ambulantně. Intravenozní dávka ankrodu je možná, může však nastat jen ve výjimečných případech za stacionárního ošetřování.
Ankrod se zásadně dávkuje individuálně. Rozhodující je poměr koncentrace fibrinogenu v závislosti na dávce ankrodu. Je snížena pomalu na 70 až 100 mg/100 ml plasmy (= terapeutický rozsah). Během celé doby léčení je koncentrace fibrinogenů nastavena na hodnotu uvnitř tohoto rozsahu. Tekutost krve je za těchto podmínek dostatečně dobrá. Doba therapie činí zpravidla 3 až 4 týdny, může se však, pokud je to potřeba, prodloužit přes tento interval.
Při subkutanním použití se podává v prvních 4 dnech denně 70 I.E. ( = mez i národní jednotky, 1 ml) a od pátého dne se podle poměru koncentrace fibrinogenu podává 70 až 140 I.E. Jestliže leží koncentrace fibrinogenu v therapeutickém rozsahu, * · · · · · · « »·· · ·« « • « · « · · · • · «««·« Φ • * · · » · · • · ··· fc« · · vstřikuje se najednou 2 až 3 krát týdně 210 až 280 I.E.
Intravenosně se zpočátku vstřikují 2 až 3 I.E./kg tělesné hmotnosti během 8 hodin. Následně se ankrod dodatečně dávkuje v závidlosti na docílené koncentraci fibrinogenu. Zpravidla dostačuje pomalu vstříknout každých 12 hodin další 1 I.E./kg tělesné hmotnosti.
Počáteční poločas rozpadu ankrodu při cirkulaci činí 3 až 5 hodin, zpomaluje se ale s klesající koncentrací, takže po 4 dnech se během této doby eliminuje zpravidla 90 % vstříknutého ankrodu, poločas rozpadu se prodlouží na 9 až 12 dní .
Jelikož se s ankrodem v protikladu například k heparinu a warfarínu objeví malé problémy s nespecifickými krváceními během ošetřování (viz Z.S. Latallo, Retrospecti ve Study on Comp1 ications and Asverse Effect of Treatment with Thrombin-Like Enzymes - A Multicenter Tri a 1 , Thromb. Haemostasis, 50, str. 604 až 609, 1983), je potřebné a žádoucí cílené ošetřování takovýchto krvácení.
Kontra indikace při léčení ankrodem jsou například krvácení při zraněních, po ulcerosních intestinálních nastavitelný vysoký tlak, tuberkulosa plic, funkční hemoragická diathese, nebezpečí operacích a porodech, při onemocněních, neoplasmy, špatně akutní infarkt mozku a aktivní porušení RES, poruchy vstřebávání sraženin, například při stavech s vysokými horečkami, těžká onemocnění jater, při zjevných nebo hrozících šokových stavech nebo těhotenství.
Jak je shora popsáno, je relativně malé, když koncentrace a v průběhu therapie se nastaví riziko krvácení s ankrodem fibrinogenu pomalu klesá na 70 až 100 mg/100 ml.
nichž existují latentní sklony ke krvácení.
Pacienti, ♦ ·
- 4 například při ledvinových kamenech nebo nedostatečnosti ledvin, se musí zvláště pečlivě kontrolovat. Je třeba zamezit tepenným punkcím a intramuskulárním injekcím jiných léčiv. Je třeba vyvarovat se současného podávání R.ES blokujících a rovněž ulcerosních léčiv, antikoagu1antů, antifibri no 1ytika, thrombo1ytika a medikamentů, které inhibují agregaci destiček a rovněž intramusku1árního podávání ankrodu. Resorpce ze svalu nastává zpravidla velmi rychle, takže odchází mnoho monomerů des-A-fibri nu a existuje nebezpečí thromboembo1 ických kompli kácí.
Ve studii se 429 pacienty (Crit. Rev. Oncol. Hematol. 15 (1993), 22-23), kterým byi bez předchozí thrombo1ytické therapie aplikován ankrod, se krvácení projevuje u 9,8 % (4,2 % interní krvácení, 5,6 % externí krvácení).
V současné době se používá k neutralizaci enzymatické aktivity ankrodu antidot, který je založen na imunog1obu1 i novém přípravku z kozího séra 1983, označení ArwinR). sestávající antidod se komplikacích nebo zvýšeném materiál Knoll A6, červen z polyklonálních látek při těžkých krvácivých (f i remní Tento použí vá nebezpečí krvácení, například při poraněních úrazem nebo z důvodu náhlé indikace k operaci. V návaznosti na neutralizaci ankrodu se musí podat 4 až 5 g humánních fibrinogenů. Jestliže se humánní fibrinogen, plasma nebo krev aplikují bez předchozí neutralizace ankrodu antidotem, existuje nebezpečí akutního rozšířeného srážení.
Stocker a kolektiv (Thrombosis Research, svazek 6, 1975: 189-194) prozkoumali tvorbu thrombenu v přítomnosti samotného ArwinuR a v přítomnosti po 1yk1oná1 ní ho antidotu a mohou doložit působení antidotu.
Vedle tohoto jsou popsány v EP-B-0 použit í 395 375 polyklonálních protilátek z koz EP-B-0 556 906 a Burkhardtem a • · 9 · · 9 9 · « · V «4 • · 9 9 C 9 · » · « a
9 9 9 9 9 999·
9« «9 9 999 99 9
999 99 9 9999 »9 · «9 99« 9 9 «9
- 5 kolektivem (FEBS, svazek 297, č. 3, 1992, str. 297 až 301) monok1oná1 ní nebo polykionální protilátky k detekci exprese ankrodových genů, k průkazu fibrinogenů v krvi pomocí ankrodu a ankrodových protilátek nebo čištění ankrodu pomocí protilátek.
Nevýhodou u jako acrodový antidot použitých po 1yk1 ona 1 ních protilátek z koz například je, že sestávají ze směsi protilátek, z nichž mnoho nemá žádný účinek z hlediska neutralizace ankrodu. Toto velké množství různých protilátek může vést k rychlé imunitní reakci a kromě toho vede k relativně nízké kapacitě neutralizace ankrodu. Vedle toho jsou v antidotu obsaženy protilátky s různou afinitou vzhledem k ankrodu. Polykionální protilátky lze, protože se získávají ze zvířat, jen těžko standard isovat, to znamená existují výkyvy v různých výrobních šaržích.
Podstata.....vvnálezu
Úkolem předloženého vynálezu je vyvinout antidot proti ankrodu, která nemá shora uvedené nevýhody a lze ho jednoduše technicky produkovat.
Tento úkol je vyřešen monok1oná1 ní mi protilátkami podle vynálezu, fragmenty protilátek, jejich směsemi nebo deriváty, které vážou ankrod a inhibují jeho aktivitu, přičemž vazební afinita leží v oblasti 1 x 10~7 až 1 x 10~12 M a neutralizační účinek ve srovnání s po 1yk1oná1 ní mi protilátkami z koz se zlepší o alespoň 100 X.
Protilátky použité podle vynálezu jako antidot ankrodu se s výhodou vyznačují řadou zlepšených vlastností. Tvoří například homogenní, dobře charakter izovate1ný produkt z protilátky nebo subtřídy protilátky, který nemá žádné výkyvy uvnitř různých produkčních šarží. Jsou vyrobitelné v libovolném množství a při jejich produkci, poněvadž se nepřipravují ve
Φ « · φ · · zvířeti, nexistuje riziko virových nebo bakteriálních kontaminací. Protilátky podle vynálezu, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty jsou specifické epitopem a mají vysokou vazební a neutra 1 i začni aktivitu. Mohou se proto při léčení podávat v malých množstvích. Homogenita produktu spolu s malými použitými množstvími vedou vlivem vysoké vazební a neutralizační aktivity k tomu, že se imunitní reakce v pacientech. Ve aktivitě se nevyskytují uvnitř různých protilátek, fragmentů protilátek nebo derivátů výkyvy jako u po 1yk1oná1 ních Smícháním různých monok1oná1 ních protilátek, protilátek nebo derivátů s vazební aktivitou proti zřetelně redukuje riziko vazební a neutralizační proti látek f ragmentů různým epitopům ankrodu, ho lze velmi efektivně neutralizovat podle vynálezu, fragmenty protilátky, směsi nebo deriváty mají výhodně vazební k ankrodu v rozsahu 1 x 10“7
10-8 až 1 x 10“11, zvláště
Proti látky i e j i ch /zhl edem iřednostně 1 x iž 5 x 10-io m.
az af i n i t u x 10-12 m, přednostně 1 x 10~9
Antidot podle vynálezu protilátkám z koz o minimálně neutralizace ankrodu, přednostně zlepšenou účinnost.
má oproti po 1yk1oná1ním 100 % zlepšenou účinnost o 250 %, zvláště o 500 %
Také in vitro vykazují monoklonální protilátky značně lepší účinek než polyklonální protilátky.
Pod monok1oná1 ní mi látkami nebo jejich fragmenty se v principu rozumí všechny imogiobu1 i nové třídy jako IgM, IgG, IgD, IgE, IgA nebo jejich subtřídy jako subtřídy IgG nebo jejich směsi. Přednostní jsou IgG a jeho subtřídy jako například IgGi, Ig62, IgG2a, IgG2t>, IgG3 nebo IgGM. Zvláště přednostní jsou IgG subtypy IgGi/κ nebo IgG2b/K. Jako fragmenty se uvádí všechny zkrácené nebo změněné fragmenty protilátky s jedním nebo dvěma vazebními místy komplementárními s antigenem, které mají vysokou vazební a neutralizační
aktivitu vzhledem k ankrodu, jako části protilátky s vazebními místy tvořenými podle protilátek lehkým a těžkým řetězcem jako Fv-, Fab- nebo F(ab')2- Tyto fragmenty se mohou získat například enzymatickou cestou odštěpením Fc části protilátky enzymem jako papain nebo pepsin, chemickou oxidací nebo genovou manipulací s geny protilátky. Výhodně se mohou použít také genově manipulované nezkrácené fragmenty.
Protilátky nebo fragmenty se mohou použít samostatně nebo ve směsích.
Geny protilátky lze pro genové manipulace izolovat pro odborníka známým způsobem například z hybri domových buněk. K tomu se odeberou buňky produkované protilátkou a mRNA se z buněk izoluje známým způsobem při dostatečné optické tiouštce buněk pomocí buněčné analýzy thiokyanatanem guanidinu, okyselením octanem sodným, extrakcí fenolem, chloroform/isoamyla 1 koho 1em, vysrážením isopropano1em a praním ethanolem. Následně se pomocí reversní transkripce syntetizuje z mRNA cDNA. Syntetizovaná cDNA se může přímo nebo po genetické manipulaci, například pomocí site directed matagenesis, zavedením inzerce, inverze, deletace nebo výměnou bází inzerovat na vhodné zvířecí, houbové, bakteriální nebo virové vektory a exprimovat na příslušné organismy. Přednostní jsou ke klonování genů bakteriální nebo kvasinkové vektory jako pBR322, pUC18/19, pACYC184, lambda nebo kvasinkové mu-vektory a exprese na bakteriích jako e. coli, respektive na kvasinkách jako saccharomyces cerevisiae.
Dalším předmětem podle vynálezu jsou buňky, které syntetizují protilátky podle vynálezu, transformaci, jak je shora uvedeno, bakteriální buňky nebo buňky kvasinek
Těmi mohou být po zvi reci , Výhodně ho ubové se jedná hybridomové buňky hybridomové buňky nebo triomové buňky, přednostně se jedná
Tyto hybridomové buňky lze připravit • · φ ♦ · ·
- 8 • · « φ φ · · • φ φ φ φ φ φ · · φ · • · · φ φ φ φ φ φ · • φ · · · φ φ · φ φ φ ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 · · · · * 9 9 9 9 například známou cestou ze zvířat imunizovaných ankrodem a izolací jejich B-buněk produkujících protilátku, selekcí těchto buněk na ankrod vázající protilátku a následnou syntézou těchto buněk s například lidskými nebo zvířecími, například myšími myelomovými buňkami, humánními 1ymfob 1astoidovými buňkami nebo heterohybri domovými buňkami (Koehler a kolektiv, Nátuře 256, 1975, 496) nebo infekcí těchto buněk příslušnými viry na nesmrtelné buňky. Přednostní jsou hybridomově buňky připravené syntézou, zvláště přednostní jsou myší hybridomově buňky, zcela přednostní jsou hybridomově buňky, které sezerují protilátky MAK 1-2, MAK 2-29/3 nebo MAK 3-27 a byly uloženy u DSMZ (Deutsche Sammlung fiir Mi kroorgan i směn und Zellkulturen v Braunschweigu) pod čísly DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM
ACC2319.
Shora uvedené hybridomově buňky sezerují zvláště přednostně protilátky IgG typu. U vytvořených protilátek MAK 1-2, MAK 2-29/3 a MAK 3-27 se jedná o následující IgG subtypy IgGi/κ, IgG2b/K a IgGi/K. Tyto přednostní protilátky se váží na různých epitopech molekuly ankrodu, jaké ukazuje test na kompetitivní vazbu protilátek. Vazba zvláště přednostní protilátky MAK 1-2 na její epitop vede k silnější neutralizaci molekuly ankrodu, tím jsou pro neutralizaci enzymatického účinku potřebná menší množství protilátky. Monoklonální protilátka vykazuje zřetelně vyšší neutralizační účinek než obvyklý při ošetřování krvácení použitý antidot na bázi po 1yk1oná1 ních protilátek, které se získaly z koz a jsou jako antidot prodávány firmou Knoll AG (Ludwigshafen).
Jako deriváty monokioná1 ních protilátek podle vynálezu se uvádí peptidy, peptidomimet ika, která se odeberou z oblastí protilátek, vázajících antigen, na pevných nebo tekutých nosičích jako po 1yethylenglyko1, sklo, syntetické polymery jako po 1yakry1amid, polystyren, polypropylen, polyethylen nebo přírodní polymery jako celulóza, separoza nebo agaroza vázající • · ·
• 9
9· • 9 · ·
9 9 ·
9 9 9 *9 9
9 9 9
9 9 9 protilátku, fragmenty nebo peptidy nebo kojaguláty s enzymy, toxiny nebo radioaktivními nebo nerad ioaktivními označeními jako 3H, 1231, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc, 75Se, f1uorescenčηími/chemi1uminisceněními označeními jako rhodamin, fluorescein, isothiokyanatan, fykoerythrin, fykokyanin, f1uoreskamin, kovové cheláty, avidin, streptavidin nebo biotin kovalentně vázající protilátku, fragmenty, nebo peptidy.
Prot i látky podle jejich směsi a deriváty fragmenty protilátky, použít přímo, po sušení, vazbě na shora uvedené nebo mikrob i ostat icky, sulfonamidy, antitumorové které působí antibiotika mikrobiocidně obecně nebo vynalezu, se mohou například sušením vymrazováním, po nosiče nebo po formulování jinými farmaceutickými účinnými a pomocnými látkami k výrobě farmaceutických přípravků. Jako účinné a pomocné látky se uvádí například další protilátky, anti mikrobio 1ogicky účinné látky, jako prostředky, voda, pufr, solanka, alkoholy, tuky, vosky, inertní nosiče nebo obdobné parenterálně obvyklé látky jako aminokyse1 iny, zahušťovače nebo cukr. Tyto farmaceutické přípravky se používají při léčení nemocí, ze jména při léčení poruch srážlivosti, výhodně poruch periferního krevního systému nebo při mrtvici.
Protilátky podle vynálezu, fragmenty protilátky, jejich směsi nebo deriváty se mohou použít přímo nebo po vazbě na pevných nebo tekutých nosičích, enzymech, toxinech, radioaktivních nebo neradioaktivních označeních nebo na f1uorescenčních/chemi1uminiscenčních označeních, které jsou popsány shora, v diagnostice. Přitom anfcrod se může prokázat v nejrůznějších tělesných tekutinách z nejrůznějších orgánů jak člověka nebo zvířete nebo v nejrůznějších tekutinách například kulturních médiích kvasinek, bakterií, hub nebo humánních nebo zvířecích buněčných kultur.
- 10 • 9 9999 99
9 9 9 9 9
9 9 9 9
9 · 9 9 ·
9 9 9 9 •99 99 9
9 9
9 9 9
9 9 9
9 · 9 9
9 9 9
9 9 9
Příklady.......provedení........v.vná lezu
1. Výroba hybri domových buněk
Imunizace, synthéza, selekce a. charakterizace byly provedeny technikami popsanými v Peters, Monoklonální protilátky,
Springer Veriag, A.M. Campbeil,
Immunosensor Technology, Veriag Elsevier, kapitola 1991).
literatuře (například J.H. výroba a charakterizace, Ant i body and 2 až 7 a 8,
Monoc1 ona 1
Myší samičí balb/c byl intraperitoneá1 ně imunizován 100 pm ankrodu, který byl příčným zesíťováním inaktivován z hlediska enzymatické aktivity, ve 2 až 3 týdenním rytmu podle následujícího schématu:
1. ve 100 μΐ PBS +· 100 μΐ kompletního Freundschova adjuvans,
2. ve 100 μΐ PBS + 100 μΐ nekompletního Freundschova adjuvans,
3. -5. ve 200 μΐ PBS.
Tři dny po slezina, buňky byly myelomovými buňkami smíchány v poměru poslední aplikaci antigenu byla odebrána prány a provedena synthéza íymfocytů s SPA/0-Ag14 (= ATCC CRL 1581). K tomu byly 5:1, inkubovány 1 min při 37 °C 1,5 ml roztokem PEG (po 1yethy1eng1yko1u), zředěno PBS ( fosforečnanem pufrovaná solanka), 1 ml během 30 s, 3 ml během 30 s, 16 ml během 60 s. Po praní byly buňky při 37 °C/7,5 % CO2 kultivovavány v selekčním eagle medium), 10 % FCS (Boehringer Mannheim), aminopterin, transferr i n, médiu (DMEM (- dulbecco's modified (= telecí sérum), 10 % condimed H1
HAT přídavek (= hypoxanthin, přídavek thymidinu), ITS přídavek (= insulin, přídavek selenitu), pyruvat, glutamin, streptomyc i n/pen i c i 1 i n).
······ ·· · ♦ · • · · · · · · · « · · • · · · · · · · · · ··· ·♦· ······ • · · · ♦ · » · · · • · · ·· · · · · · ··
Identifikace hybridomenu, který sezernuje specifické antiankrodové protilátky, nastává v mi krotitrační desce nás 1edně:
- mikrotitrační desky se převrství 0,1 ml/well ankrodu, případně referenčních proteinů ke stanovení specifity (1 pg/ml 0,05 M NaHCOs pH 9,2) během 16 h/4 °C,
- nasycení 0,3 ml/well 1 % BSA/PBS během 0,5 až 1 h/23 °C (h - hod i na),
- 3x praní pomocí PBS/0,05 % TweenR 20,
- inkubace přebytkem buněčných kuitur (50 μΐ zředěno 50 μΐ
PBS/0,1 % BSA (= albumin hovězího séra)/ 0,05 % TweenR 20) během 2 až 4 h/23 °C,
- praní jako shora,
- inkubace pomocí 0,1 ml/well biotinylické antimysí IgG protilátky v 0, 1 & BSA/PBS během 2 až 4 h/23 °C,
- praní jako shora,
- inkubace pomocí 0,1 ml/well streptavidin~peroxidasového komplexu v 0,1 & BSA/PBS během 2 až 4 h/23 °C,
- praní jako shora,
- 0,1 ml/well peroxidasového substrátu,
- reakce se zastaví 0,1 ml/well 2 M H2SO4, měření absorpce při 450 nm.
• 9 · ··
9 9 ·
* * · · 9 ·9 • · · · 9 99 9
9 · 9 · 9 * ·· 999 99 9 · 9 9 9 9 9 • 9 9·· 99 99
Peroxidasový substrát: smíchá se 0,1 ml roztoku TMB (42 mM tetramethy1benzidi nu v DMSO) a 10 ml substrátového pufru (0,1 M octanu sodného, pH 4,9), potom přídavek 14,7 μΐ HsO2.
Hybridomy s positivní reakcí protilátky byly izolovány subk 1 ono vání m a jednotlivé klony byly znovu testovány.. Protilátky s nejvyšší reaktivitou byly použity v neutralizační zkoušce. Touto cestou může být izolováno množství positivních hybridomů, to znamená buňky tvoří protilátky proti ankrodu.
2. Produkce a charakterizace monok1oná1 ηích protilátek
Čištění monok1 ona i ních protilátek se provádělo z bezsérových přebytků buněčné kultury. Proto byly postupně převáděny z DMEM/HAT/10 % FCS přes DMEM/HT/10 % FCS a DMEM/10 % FCS na bezsérové médium buněčné kultury {HT - hypoxanthin, aminopterin), jako například SF-3 (Cytogen), PFHM-II (Gibco), HL-1 (Bio Whittaker), Ultra Doma PF (Bio Whittaker) nebo podobně. Pro následné čištění prostřednictvím afinitní chromatografie byly použity protein A-sepharosy, respektive protein G-sepharosy.
Po nanesení přebytků buněčné kultury na chromatografický sloupec byly nespecificky vázané proteiny prány 3 ,M NaCl/1,5 glycinu, pH 8,9, aktivita anitiankrodové protilátky byla eluována 500 mM NaCl/0,59 X kyseliny octové.
Stanovení subtypu protilátky bylo provedeno analogicky, jak je popsáno shora v postupu ELISA, přičemž však na místo biotinylické protilátky proti myší IgM byl použit následující biotinylický subtyp - specifická protilátka: IgMi proti myší, IgM proti myší, Ig62a proti myší, k- proti myší, IgG2b proti myší, lambda proti myší, IgGj proti myší.
Typy a supertypy protilátek izolovaných hybr i domových ·· ·· > · · a » 9 9 4 buněk MAK 1-2, MAK 2-29/3 a MAK 3-27 (viz příklad 1) byly stanoveny IgGi/κ, IgGib/κ a IgGx/κproti látek technikami, precipitací byl y jako ne bo
Konstanty afinity monok1oná1 ních zjištěny různými z literatury známými například rovnovážnou dialýzou, imunitní postupem ELISA (například J.H. Peters, Monoklonale Antikórper, Herstellung und Charakter isierung, Springer Verlag, A.M. Cambell, Monoclonal Antobody and Imrounosensor Verlag Elsevier, kapitola 11, 1991).
Technologie,
Podle postupu ELISA (3. Immunoi. Methods 77 (1985) 305 až 319) se obdrží následující afinity vzhledem k přírodnímu ankrodu (tabulka I):
Tabulka I: Afinity monok1oná1 ních protilátek vzhledem k ankrodu
hybridom/proti látka | Rd | ||
MAK 1-2 | 1,7 | * | 10-9 |
MAK 2-29/3 | 3, 1 | * | 10-9 |
MAK 3-27 | 4,4 | * | 10-10 |
3. Neutralizace ankrodu monoklonalní protilátkou (=MAK) přebytek buněčné kultury
Neutralizační kapacita protilátky byla kvantifikována pomocí ankrodem indikovaným fibrinovým zákalem. K tomu byly v mi krotitračních dětičkách nasycených BSA inkubovány při 37 °C různé koncentrační poměry ankrodu k protilátce a následně byl přidán humánní fibrinogen (1,5 mg). Po inkubaci při 37 °C byl při 340 nm kvantifikován vznikající fibrin (optická hustota OD) .
S narůstajícím množstvím neutralizujících protilátek
A Α AAAA AA A AA AA
AAA · · »· A A · · • A A AAA A A A A • A t A·· A A A A A A
AAA AAA AAAA
AA A AA AAA A A AA se může neutralizovat aktivita ankrodu. Toto se ukázalo na snižujících se optických hustotách.
Zvláště efektivně působila protilátka MAK 1-2, která také při vyšších koncentracích ankrodu vedla k úplné neutralizaci. Pražná hodnota v tabulce II obsahovala všechny součásti kromě ankrodu. Nejvyšší hodnoty optické hustoty byly změřeny s různými dávkami ankrodu (50, 25 a 12,5 ng/ml ankrodu) bez přídavku různých monokl ona 1 ních protilátek (tabulka II).
MAK 2-29 a 3-27 mají podobně dobrou nebo lepší afinitu k ankrodu jako MAK 1-2 (tabulka I), vazba protilátky antigen však vedla k neutralizaci enzymatické aktivity teprve při vyšších dávkách protilátky vztaženo na množství ankrodu.
Tabulka II: Neutralizace ankrodu přebytkem buněčné kultury MAK
vsázka | optická hustota |
prázdná hodnota | 0,268 |
ankrod 50 ng/ml | 1,45 |
ankrod 50 ng/ml + MAK 1-2 | 0,254 |
ankrod 50 ng/ml + MAK 2-29 | 1,354 |
ankrod 50 ng/ml + MAK 3-27 | 1,133 |
ankrod 25 ng/ml | 0,939 |
ankrod 25 ng/ml + MAK 1-2 | 0,238 |
ankrod 25· ng/ml + MAK 2-29 | 0,333 |
ankrod 25 ng/ml + MAK 3-27 | 0,422 |
ankrod 12,5 n g./ m 1 | 0,67 |
ankrod 12,5 ng/ml + MAK 1-2 | 0,229 |
ankrod 12,5 ng/ml +· MAK 2-29 | 0,28 1 |
ankrod 12,5 ng/ml + MAK 3-27 | 0,26 1 |
9 Λ 999 • · ♦ 9 9 9
9 9
9 9
9
99
9 » »
9 9 9
9 9 · • · · · • · « ·
4. Neutralizace ankrodu pomocí vyčištěných monok1oná1 ních prot i 1átek i n vitro
Vyhodnocení efektivity neutralizace vyčištěných monok1oná1 ních protilátek in vitro bylo provedeno porovnáním 50 X ní hodnoty neutralizace ve zkoušce fíbrinovým zákalem.
Žní neutralizační hodnota se obdrží následně:
OD negativní kontroly + (OD positivní kontroly ~ OD negativní kontro1y)/2
Negativní kontrola: žádný přídavek ankrodu (žádný vznik f i br i nu)
Positivní kontrola: ankrod + fibrinogen (maximální vznik f i br i nu)
Vlivem různých poměrů proti 1átka/ankrod se obdrží variující OD hodnoty, přičemž 50 Žní neutralizace byla při následujících koncentracích protilátky:
MAK 1-2 | po 1yk1oná1 η í proti látka | poměr polyklon. prot i 1átka/MAK | |
1 h předinkubace | |||
1,25 ng ankrodu | 3 10 ng | 625 ng | 2,0 |
2,5 ng ankrodu | 350 ng | 800 ng | 2,3 |
2 h předinkubace | |||
1,25 ng ankrodu | 80 ng | 3 10 ng | 3,9 |
2,5 ng ankrodu | 150 ng | 650 ng | 4,3 |
Z poměrů množství protilátky potřebné k 50 Ž neutralizaci bylo možné odvodit, že za zvolených in vitro podmínek byla monoklonální protilátka MAK 1-2 při 1 hodině předinkubace alespoň o faktor 2, při 2 hodinách předinkubace
4«
4
4 4
4
4 »4 *444 • 4
4 4
4 4
4
4 4 4
44 alespoň o faktor 4 lepší než antidot na bázi po iyk1oná1 ních prot i 1átek z koz.
5. Kvantifikace ankrodu pomocí postupu sandwich-ELISA”
Stanovení ankrodu ve zkouškách k diagnostickým účelům například různých tekutostí, bylo provedno kombinací dvou protilátek pomocí postupu sandwich-ELISA podie následujícího schématu:
- převrstvení mikrotitračních desek 5 pg/ml MAK 1-2, případně MAK 3-27 ve 100 μΐ/well, zředěno v 0,05 M NaHCCh , pH 9,2, přes noc/4 °C,
- praní mikrotitračních desek pomocí PBS/0,05 % TweenR 20, 200 μ 1 /we 1 l,
- nasycení 300 μΐ/well 1 % BSA/PBS, 0,5 h/23 «C,
- praní jako shora, ~ 11 standardních zředění ve dvou krocích ankrodem, vysráženo 50 ng/ml v PBS/0,1 % BSA/0,05 % TweenR 20, 100 μΐ/well, zkoušky se prováděly souběžně s tím v různých zředěních, inkubace 2 h/23 °C,
- praní jako shora,
- inkubace pomocí MAK 2-29, 1 μς/ml zředěno v PBS/0,1 %
BSA/0,05 X TweenR 20, 100 μΐ/well, 2 h/23 °C,
- praní jako shora,
- inkubace pomocí biotinylické antimyší IgG2t>, zředěno 1:10000 v PBS/0,1 BSA/0,05 X TweenR 20, 100 μΐ/weli, 2 h/23 °C, • ·
- praní jako shora,
- inkubace pomocí streptavidin-peroxidasového komplexu, zředěno
1:10000 v PBS/0,1 % BSA/0,05 % TweenR 20, 100 μΐ/well, 0,5 h/23 OC,
- praní jako shora,
- přídavek 100 μΐ/well peroxidasového substrátu: (10 ml substrátového pufru (0,1 M octanu sodného pH 4,9) smícháno se 100 μΐ roztoku TMB (42 mM tetramethy1benzidi nu v DMSO) a přídavek 14,7 μΐ Ife Oz 3«),
- reakce se zastaví 100 μΐ/well 2 Μ Hz SO4 ,
-měření absorpce při 450 nm.
Pro obě monoklonáiní protilátky MAK 1-2, respektive
MAK 3-27 a použité kombinace se ukazuje, že ankrod lze kvantifikovat a prokázat v rozsahu koncentrací 3000 až 100 pg/ml. Absolutní prokazatelná hranice leží ještě pod těmito kvant ifi kováte 1nými hodnotami (obr. 1).
6. Kompetitivní ELISA
K charakterizaci relativní polohy epitopu MAK vázajícího se na ankrod byla provedena kompetitivní ELISA:
- převrstvení mikrotitračních desek 1 pg/ml ankrodu 100 μΐ/well, zředěno v 0,05 M NaHCOz, pH 9,2, přes noc/4 °C,
- praní mikrotitračních desek pomocí PBS/0,05 % TweenR 20, 200 μ 1 / we1 1 ,
- nasycení 300 μΐ/well 1 % BSA/PBS, 0,5 h/23 °C,
- praní jako shora, ~ Na takto připravené mikrotitrační desky byly dány různé vsázky 10 ng/ml monok1oná1 ních biotinylických protilátek MAK 1-2-biotin, MAK 2-29/3-biotin a MAK 3-27-bioton a vázány na ankrod, následně byly k vsázkám přidány podle použitých protilátek variabilní koncentrace (1 pg/ml - 1 ng/ml) každé z dalších protilátek (MAK 1-2. MAK 2-29/3 nebo MAK 3-27), takže byly testovány všechny možné kombinace protilátek ve vztahu k jejich možným překrývajícím se vazebním místům. Vsázky s různými kombinacemi protilátek byly inkubovány v PBS/0,1 % BSA/0,05 % TweenR 20 dvě hodiny při 23 °C a následně byly ošetřeny, jak je dále uvedeno:
- praní jako shora,
- přídavek 100 μΐ/well peroxidasového substrátu: (10 mi substrátového pufru (0,1 M octanu sodného pH 4,9) smícháno se 100 μΐ roztoku TMB, (42 mM tetramethylbenzidinu v DMSO) a přídavek 14,7 μΐ řfe O2 reakce se zastaví 100 μΐ/well 2 M H2SO4, měření absorpce při 450 nm.
kombinací protilátek nebyl různě monoklonální protilátky
V žádné pozorován úbytek z použitých OD, to znamená se nevytlačují při vazbě na ankrod. Váží se na různé epitopy molekuly ankrodu. Může proto s ankrodem působit současně více protilátek Pro rychlou optimální neutralizaci účinku ankrodu se proto mohou různé monoklonální protilátky použít, jestliže je to potřebné a žádoucí, v kombinaci.
4. Neutralizace ankrodu in vivo
Ankrod byl aplikován anestetizováným krysám po 30 minut jako infuze 10 IU/kg tělesné hmotnosti do ocasní žíly. 10 minut po zahájení infuze ankrodu byly aplikovány různé testované substance - monok1oná1 ηí, polyklonální protilátky nebo placebo - jako intravenozní bo1us v množství 1 ml/kg tělesné hmotnosti. Krevní zkoušky (8 objemových dílů krev + 2 objemové díly 0,11 M citranu) byly z krční tepny před, případně 30 a 60 minut po zahájení infuze ankrodu. Odstředěním byla získána plasma a podle C1aussgerinnungova postupu byl stanoven obsah fibrinogenu (kalibrační křivka přídavkem definovaných množství krysích fibrinogenů k defibrinogenovaně plasmě krys).
Ve skupině pro testovací substanci bylo použito 6 krys (tabu 1ka 111) .
Tabulka III: Použitá množství testovací substance
MAK 1-2 | (1,435 mg/kg tělesné hmotnosti) |
polyklonální proti látka | (8,6 mg/kg tělesné hmotnosti, šarže antidotu A009) |
polyklonální proti látka | (1,5 mg/kg tělesné hmotnosti, šarže antidotu A009) |
Tabulka IV: Měření koncentrace fibrinogenu při různých proti 1átkách • · · ·
·♦ ·· ·· • · · · « · · · * · · · · • · · · • ·
čas (min) | koncentrace fibrinogenu (mg/dl) | |||
ankrod + kontrola | ankrod + MAK 1-2 | ankrod + po 1yk1. AK 8,6 mg/kg | ankrod τ po1yk1 . AK 1,5 mg/kg | |
0 | 289,7 | 263,4 | 292,4 | 281,8 |
30 | 63,8 | 155,9 | 129,0 | 91,5 |
60 | 32, 1 | 152,7 | 164,0 | 55,8 |
Ukazuje se, že MAK 1-2 byl v použité koncentraci 1,435 mg/kg tělesné hmotnosti schopen 30 min po zahájení infuze ankrodu zastavit další snížení hladiny fibrinogenu. Polyklonální protilátky z koz vyžadují pro stejný efekt 8,6 mg/kg tělesné hmotnosti. V koncentraci 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti, tedy koncentraci srovnatelné s koncentrací MAK 1-2 nevykazuje antidot na bázi polyklonální protilátky žádný efekt (viz kontrola tabulka IV).
Na základě koncentrace fibrinogenu, výsledné po 60 minutách, .by1 o možné odvodit, že in vivo MAK 1-2 za podmínek testu neutralizuje lépe o faktor 6, než polyklonální antidot. Jak se zdá, je neutralizační účinek MAK 1-2 ještě zřetelně
Claims (7)
1. Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty, které se váží na ankrod a inhibují jeho aktivitu, přičemž vazební aktivita leží v oblasti 1 x 10~7 až 1 x 1 0~ 1 2 M a je zlepšený neutralizační účinek oproti po 1yk1oná1 ním protilátkám z koz o minimálně 100 %.
2. Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou tvořeny protilátkou typu IgG.
3. Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jsou tvořeny protilátkou MAK 1-2, MAK 2-29/3 nebo MAK 3-27 nebo jejich směsemi.
4. Buňky, které exprimují monoklonální protilátek, fragmenty
tvořeny hybri domovými buňkami DSM ACC2317, DSM ACC2318 a DSM ACC2319.
7·.
Farmaceutické přípravky, protilátky, fragmenty proti deriváty podle nároků 1 až 3.
obsahující látek, jejich monoklonální směsi nebo
8. Použití monoklonální protilátky, fragmentu protilátky, jejich směsí nebo derivátů podle nároků 1 až 3 ve farmaceutických přípravcích.
- 22
9. Použití monoklonální protilátky, fragmentu protilátky, jejich směsí nebo derivátů podle nároků 1. až 3 k výrobě prostředků k léčení poruch srážlivosti.
10. Použití monoklonální protilátky, fragmentu protilátky, jejich směsí nebo derivátů podle nároků 1 až 3 v d iagnost i ce.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19729544A DE19729544A1 (de) | 1997-07-10 | 1997-07-10 | Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischung oder Derivate und deren Verwendung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ200057A3 true CZ200057A3 (cs) | 2000-05-17 |
CZ297216B6 CZ297216B6 (cs) | 2006-10-11 |
Family
ID=7835268
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20000057A CZ297216B6 (cs) | 1997-07-10 | 1998-06-23 | Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich smesi nebo deriváty a jejich pouzití a bunky,které je exprimují |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6365155B1 (cs) |
EP (1) | EP1000087A2 (cs) |
JP (1) | JP2002511880A (cs) |
KR (1) | KR20010021649A (cs) |
CN (1) | CN1262690A (cs) |
AU (1) | AU748841B2 (cs) |
BR (1) | BR9810574A (cs) |
CA (1) | CA2295218A1 (cs) |
CZ (1) | CZ297216B6 (cs) |
DE (1) | DE19729544A1 (cs) |
IL (1) | IL133224A0 (cs) |
NO (1) | NO20000079L (cs) |
WO (1) | WO1999002564A2 (cs) |
ZA (1) | ZA986064B (cs) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR079944A1 (es) * | 2010-01-20 | 2012-02-29 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpo neutralizante de la actividad de un anticoagulante |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3841736A1 (de) * | 1988-12-10 | 1990-07-05 | Basf Ag | Ancrod-proteine, ihre herstellung und verwendung |
CA2015127A1 (en) * | 1989-04-26 | 1990-10-26 | John G. Gray, Jr. | Novel dna sequences which encode ancrod-like polypeptides and compositions comprising the expression products thereof |
ES2090835T3 (es) * | 1992-02-17 | 1996-10-16 | Akzo Nobel Nv | Calibrador y su uso en un ensayo inmunologico. |
US5523292A (en) * | 1992-10-14 | 1996-06-04 | Schwartz; Robert | Method of preventing restenosis following coronary angioplasty |
-
1997
- 1997-07-10 DE DE19729544A patent/DE19729544A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-06-23 IL IL13322498A patent/IL133224A0/xx unknown
- 1998-06-23 CZ CZ20000057A patent/CZ297216B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-06-23 JP JP50805199A patent/JP2002511880A/ja not_active Ceased
- 1998-06-23 KR KR1020007000207A patent/KR20010021649A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-06-23 AU AU85406/98A patent/AU748841B2/en not_active Ceased
- 1998-06-23 US US09/446,983 patent/US6365155B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-23 WO PCT/EP1998/003834 patent/WO1999002564A2/de active IP Right Grant
- 1998-06-23 BR BR9810574-4A patent/BR9810574A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-06-23 EP EP98936383A patent/EP1000087A2/de not_active Withdrawn
- 1998-06-23 CA CA002295218A patent/CA2295218A1/en not_active Abandoned
- 1998-06-23 CN CN98807040A patent/CN1262690A/zh active Pending
- 1998-07-09 ZA ZA9806064A patent/ZA986064B/xx unknown
-
2000
- 2000-01-07 NO NO20000079A patent/NO20000079L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1999002564A2 (de) | 1999-01-21 |
NO20000079L (no) | 2000-03-07 |
WO1999002564A3 (de) | 1999-04-01 |
AU748841B2 (en) | 2002-06-13 |
IL133224A0 (en) | 2001-03-19 |
CN1262690A (zh) | 2000-08-09 |
NO20000079D0 (no) | 2000-01-07 |
BR9810574A (pt) | 2000-09-19 |
DE19729544A1 (de) | 1999-01-14 |
ZA986064B (en) | 2000-01-10 |
KR20010021649A (ko) | 2001-03-15 |
EP1000087A2 (de) | 2000-05-17 |
AU8540698A (en) | 1999-02-08 |
CZ297216B6 (cs) | 2006-10-11 |
US6365155B1 (en) | 2002-04-02 |
JP2002511880A (ja) | 2002-04-16 |
CA2295218A1 (en) | 1999-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TW212184B (cs) | ||
Rossi et al. | Anti-idiotypes against autoantibodies and alloantibodies to VIII: C (anti-haemophilic factor) are present in therapeutic polyspecific normal immunoglobulins. | |
KR100406072B1 (ko) | 항혈전제 및 항-폰빌레브란트인자 모노클로날항체 | |
JPH0616717B2 (ja) | モノクロナ−ル抗体 | |
ES2283308T3 (es) | Anticuerpo monoclonal para el factor viii, que incluso cuando esta presente en exceso molar inactiva el factor viii solo en parte y metodo para producir dicho anticuerpo. | |
BR112014004297B1 (pt) | Uso de um inibidor de antitrombina iii no tratamento ou prevenção de sangramento | |
Silveira et al. | Application of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to von Willebrand factor (vWF) and its derivatives | |
Prydz et al. | Factor X | |
CN107118277B (zh) | 一种单克隆抗体 | |
CZ200057A3 (cs) | Monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, jejich směsi nebo deriváty a jejich použití a buňky pro jejich exprimaci | |
PT91808B (pt) | Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais hibridos e de composicoes farmaceuticas que os contem | |
Verstraete et al. | Biological effects of the administration of an equimolar streptokinase-plasminogen complex in man | |
JPH04228088A (ja) | 血小板因子4の生物学的作用を阻害するモノクローナル抗体 | |
ES2217492T3 (es) | Anticuerpo monoclonal, especifico para el factor de coagulacion vii activado y su utilizacion. | |
Sukenik et al. | Lupus anticoagulant and anticardiolipin antibodies in systemic lupus erythematosus | |
MXPA99011382A (en) | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same | |
JPS63210665A (ja) | コラゲナ−ゼインヒビタ−の酵素免疫学的定量法 | |
HU225784B1 (en) | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments and mixtures thereof, pharmaceutical preparations containing them and use of the same | |
Lechner | Immune reactive factor IX in acquired factor IX deficiency | |
JPH03200066A (ja) | 活性化ヒトプロテインcの測定方法 | |
JP2938214B2 (ja) | 血小板凝集阻害作用を持つ新規なモノクローナル抗体、およびその断片 | |
JPH01231893A (ja) | 抗ヒトプロテインsモノクローナル抗体およびその利用 | |
JP2001103966A (ja) | ハイブリッド細胞、モノクローナル抗体、製造方法および測定方法 | |
JPH02492A (ja) | 新規なモノクローナル抗体 | |
Gaudernack et al. | Studies on PIVKA-X |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20080623 |