HU225784B1 - Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments and mixtures thereof, pharmaceutical preparations containing them and use of the same - Google Patents
Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments and mixtures thereof, pharmaceutical preparations containing them and use of the same Download PDFInfo
- Publication number
- HU225784B1 HU225784B1 HU0003029A HUP0003029A HU225784B1 HU 225784 B1 HU225784 B1 HU 225784B1 HU 0003029 A HU0003029 A HU 0003029A HU P0003029 A HUP0003029 A HU P0003029A HU 225784 B1 HU225784 B1 HU 225784B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- mixtures
- derivatives
- anchor
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 22
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title claims description 18
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title claims description 18
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 title abstract description 8
- 229960004233 ancrod Drugs 0.000 title abstract description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims abstract description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100023230 Serine/threonine-protein kinase MAK Human genes 0.000 description 37
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 20
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 20
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 20
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 14
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 11
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 10
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 10
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 8
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 8
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001454694 Clupeiformes Species 0.000 description 2
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 235000019513 anchovy Nutrition 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 208000012260 Accidental injury Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100387923 Caenorhabditis elegans dos-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000271064 Calloselasma rhodostoma Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000271532 Crotalus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101800003778 Fibrinopeptide B Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010051125 Hypofibrinogenaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000018525 Postpartum Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000504 antifibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 229940082620 antifibrinolytics Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003158 microbiostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 230000002966 stenotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
Abstract
Description
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 1 lap ábra)The length of the description is 10 pages (including 1 page figure)
HU 225 784HU 225 784
A találmány ankrodspecifikus monoklonális antitestekre, antitestfragmentumokra, keverékeikre vagy származékaikra vonatkozik, továbbá gyógyászati készítményekben vagy a diagnosztikában való alkalmazásukra. A találmány azokra a gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek ezeket az antitesteket, antitestfragmentumokat, keverékeiket vagy származékaikat tartalmazzák.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to anther-specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof, and to their use in pharmaceutical compositions or diagnostics. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising these antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof.
Vonatkozik továbbá a találmány olyan sejtekre, amelyek ezeket az antitesteket, antitestfragmentumokat, keverékeiket vagy származékaikat kifejezik.The invention further relates to cells expressing these antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof.
Az ankrod (kereskedelmi név: Arwin®, Arvin®) a maláj csörgőkígyó (Agkistrodon rhodostoma) mérgéből származó enzim. Ez az enzim egy nagymértékben glikozilált, közepes, körülbelül 38 000 átlagos molekulatömegű szerinproteáz, amely antikoaguláns tulajdonságokkal rendelkezik, továbbá képes a véralvadékok feloldására.Ankrod (trade name: Arwin®, Arvin®) is an enzyme derived from the venom of the Malay rattlesnake (Agkistrodon rhodostoma). This enzyme is a highly glycosylated, medium serine protease with an average molecular weight of about 38,000, which has anticoagulant properties and is capable of dissolving blood clots.
A normálvéralvadás trombin közreműködésével megy végbe, amikor is a trombin a fibrinogénmolekulából lehasítja az A és B fibrinopeptidet, és ez a fibrin képződéséhez vezet (EP-B-0 556 906), amely például a vörösvérsejtek és vérlemezkék mellett a trombusok fő alkotórésze. Az ankrod a trombinnal ellentétben a fibrinogénmolekula a-(„A)-láncában csak az argininlizin kötést hasítja, és így az A, AP és AY fibrinopeptideket szabadítja fel [Colé et al., J. Vascular. Surgery, 17, 288-292 (1993)]. A fibrinogénmolekula p-(B)-láncát az ankrod nem támadja meg, és így nem szabadítja fel. A fibrinopeptidek ankroddal való lehasítása után keletkező töredékek (dez-„A”-fibrin-monomerek) ezután vékony filamentumokká polimerizálódhatnak. A keletkezett atípusos, oldható fibrint a szervezetben lévő plazmin lizálja, és/vagy a retikuloendoteliális rendszer (RÉS, monocita-makrofág rendszer) eltávolítja. A dez„A”-fibrinogén-molekulát a trombin már nem hasítja természetes fibrinné, mivel a keletkezett molekula nem szubsztrátuma a trombinnak.Normal blood coagulation occurs by the action of thrombin, whereby thrombin cleaves fibrinopeptides A and B from the fibrinogen molecule, leading to the formation of fibrin (EP-B-0 556 906), which is a major component of thrombi in addition to red blood cells and platelets. In contrast to thrombin, the anode cleaves only the arginine lysine bond in the - ("A") chain of the fibrinogen molecule and thus releases the fibrinopeptides A, AP and AY [Cole et al., J. Vascular. Surgery 17: 288-292 (1993)]. The p- (B) chain of the fibrinogen molecule is not attacked and thus released by the anchor. Fragments formed after cleavage of the fibrinopeptides by the anode (des-"A" -fibrin monomers) can then polymerize into thin filaments. The atypical soluble fibrin produced is lysed by plasmin in the body and / or removed by the reticuloendothelial system (RÉS, a monocyte-macrophage system). The des "A" fibrinogen molecule is no longer cleaved by thrombin into natural fibrin because the resulting molecule is not a substrate for thrombin.
Az ankrod dózisfüggően csökkenti a vérben a fibrinogénkoncentrációt. A terápiásán indukált és szabályozott hipofibrinogenémia a plazma viszkozitását és a vörösvérsejtek aggregációra való hajlamát oly mértékben csökkenti, hogy a vér áramlási tulajdonságai határozottan javulnak, és ez megteremti a beszűkült (sztenózisos) erekben az erősebb vérátáramlás előfeltételét.Anchor decreases fibrinogen concentration in the blood in a dose-dependent manner. Therapeutically induced and controlled hypofibrinogenemia reduces the viscosity of the plasma and the tendency of red blood cells to aggregate to such an extent that the blood flow properties are markedly improved, providing a prerequisite for increased blood flow in narrowed (stenotic) blood vessels.
Jelenleg például a krónikus perifériás artériás vérkeringés! zavarokat ankroddal kezelik, továbbá II fázisú klinikai vizsgálatokat kezdtek el ankroddal agyvérzéssel (gutaütéssel) kapcsolatban.Currently, for example, chronic peripheral arterial circulation! disorders are treated with ankrodis, and Phase II clinical trials have been initiated with ankroddal for stroke (stroke).
Az ankrodot előnyösen szubkután adják be. A kezelés végezhető kórházban, vagy - amennyiben a terápia monitorozásához szükséges fibrinogénkoncentráció rendszeres ellenőrzése biztosított - ambuláns módon is végezhető. Az ankrod intravénás adása is lehetséges, ez azonban csak kivételes esetekben és kórházi ellenőrzés mellett történhet.The anchor is preferably administered subcutaneously. Treatment can be performed in a hospital setting or, provided that regular monitoring of the fibrinogen concentration needed to monitor therapy is in place, or in an outpatient setting. Intravenous administration of the ankrod is also possible, but only in exceptional cases and under hospital control.
Az ankrod alapjában véve individuálisan adagolandó. Mértékadó a fibrinogénkoncentráció alakulása az ankrod alkalmazásától függően. A koncentráció lassan 70-100 mg/100 ml plazma értékre csökkentendő (terápiás tartomány). A teljes kezelési idő alatt a fibrinogénkoncentrációt ezen a tartományon belüli értékekre kell beállítani. A vér áramlási tulajdonságai ilyen feltételek mellett megfelelően jók. A terápia rendszerint 3-4 hétig tart, szükség esetén azonban ezt az időtartamot meg lehet hosszabbítani.Basically, your anchor should be individually administered. Changes in fibrinogen concentration, depending on the use of the anchor, are of decisive importance. The concentration should be slowly reduced to 70-100 mg / 100 ml plasma (therapeutic range). During the entire treatment period, the fibrinogen concentration should be adjusted within this range. Blood flow properties under these conditions are good. Therapy usually lasts for 3 to 4 weeks, but may be extended if necessary.
Szubkután alkalmazásnál az első 4 napban naponta 70 NE-t (nemzetközi egység; 1 ml), az 5. naptól kezdve pedig a fibrinogénkoncentráció alakulása szerint 70-140 NE-t adunk be. Amennyiben a fibrinogénkoncentráció a terápiás tartományba esik, hetenként 2-3-szor 210-280 NE-t fecskendezünk be.For subcutaneous administration, 70 IU (International Units; 1 ml) is administered daily for the first 4 days, and 70-140 IU depending on trends in fibrinogen concentration from day 5 onwards. If the fibrinogen concentration falls within the therapeutic range, 210-280 IU are injected 2-3 times a week.
Intravénásán először 2-3 NE-t infundálunk testtömeg-kg-onként 8 órán belül. Ezután, az elért fibrinogénkoncentrációtól függően, az ankrodot utánadagoljuk. Általában elégséges minden 12 órában 1 NE/kgtesttömeg adagot lassan bevinni.For the first time, 2-3 IU / kg body weight should be infused over 8 hours. Subsequently, depending on the fibrinogen concentration achieved, the anode is dosed. It is usually sufficient to slowly inject 1 IU / kg body weight every 12 hours.
Az ankrod kezdeti felezési ideje a keringésben körülbelül 3-5 óra, ez azonban a koncentráció csökkenésével lassul úgy, hogy körülbelül 4 nap múlva, mely időn belül általában a beadott ankrod 90%-a eliminálódik, a felezési idő 9-12 napra hosszabbodik meg.The initial half-life of the anchor in the circulation is about 3 to 5 hours, but it slows down with a decrease in concentration such that after about 4 days, within which 90% of the administered anchor is generally eliminated, the half-life is extended to 9 to 12 days.
Jóllehet például a heparlnnal és warfarínnal ellentétben az ankroddal való kezelés folyamán aspecifikus vérzésekkel kevesebb probléma merül fel [lásd: Z. S. Latello, Thromb. Haemostasis, 50,604-609 (1983)], az ilyen vérzések célzott kezelése mégis szükséges és kívánatos.However, unlike heparin and warfarin, for example, there are fewer problems with non-specific bleeding during treatment with ankrod. See, Z. S. Latello, Thromb. Haemostasis 50: 604-609 (1983)], however, targeted treatment of such hemorrhages is still necessary and desirable.
Az ankroddal való kezelés kontraindikációi például a következők: haemorrhagiás diatézis (vérzésre való hajlam), valamint sérülések esetén, operációk után, szülésnél fennálló vérzés veszélye, fekélyes bélmegbetegedések, neoplazmák, rosszul beállítható magas vérnyomás, akut agyi Infarktus és tüdőtuberkulózis esetén, a RES-funkció zavarainál és az alvadéklebontás zavarainál, például magas lázzal járó állapotoknál, továbbá májmegbetegedéseknél, látható tünetekkel járó és fenyegető sokkos állapotok vagy terhesség esetén.Contraindications to treatment with an anode include, but are not limited to: haemorrhagic diathesis (predisposition to bleeding) and risk of postpartum haemorrhage after surgery, ulcerative bowel disease, neoplasms, poorly controlled hypertension, acute cerebral infarction and pulmonary tuberculosis, disorders such as high fever, liver disease, visible symptoms and imminent shock or pregnancy.
Mint fent leírtuk, a vérzés kockázata ankroddal viszonylag csekély, ha a fibrinogénkoncentráció lassan csökken, és a terápia alatt 70-100 mg/100 ml-re állítjuk be. Azokat a betegeket, akiknél latens vérzési hajlam áll fenn, például veseköveknél vagy veseelégtelenségnél, különösen gondosan kell eljárni. Elkerülendők az artériapunkciók és más gyógyszerek intramuszkuláris injekcióként való bevitele. Óvakodni kell a RES-blokkoló, valamint az olyan fekélyt okozó gyógyszerek, antikoagulánsok, antifibrinolitikumok, trombolitikumok és gyógyszerek egyidejű adásától, amelyek gátolják a vérlemezkék aggregációját, továbbá óvakodni kell az ankrod intramuszkuláris adásától. Az izomdepóból való felszívódás általában nagyon gyorsan megtörténik, úgyhogy túl sok dez-„A”-fibrin-monomer zúdul a szervezetre, és fennáll a tromboembóliával járó komplikációk veszélye.As described above, the risk of bleeding with an anchor is relatively low if the fibrinogen concentration decreases slowly and is adjusted to 70-100 mg / 100 ml during therapy. Patients with a history of latent bleeding, such as kidney stones or renal failure, should be treated with particular care. Arterial puncture and other drugs by intramuscular injection should be avoided. Caution should be exercised with concomitant administration of RES-blocking agents with ulcer drugs, anticoagulants, antifibrinolytics, thrombolytics and medicinal products that inhibit platelet aggregation and with intramuscular administration of the anchor. Absorption from muscle depression usually occurs very quickly, so that too much Des-A-fibrin monomer falls into the body and is at risk of thromboembolic complications.
Egy vizsgálatban, amelyet 429 betegen végeztek [Crit. Rév. Oncol. Hematol., 15, 23-33 (1993)], akiknél az ankrodot előzetes trombolitikus terápia nélkül alkalmazták, a vérzések összes előfordulása 9,8%-ot tett ki (4,2% belső vérzés; 5,6% külső vérzés).In a study conducted in 429 patients [Crit. Port. Oncol. Hematol., 15, 23-33 (1993)], in which an anchor was used without prior thrombolytic therapy, the total incidence of bleeding was 9.8% (4.2% internal bleeding; 5.6% external bleeding).
HU 225 784HU 225 784
Az ankrod enzimaktivitásának semlegesítéséhez jelenleg egy olyan antidotumot alkalmaznak, amely kecskeszérum-eredetű immunglobulin-készítményen alapul [Knoll AG által kiadott füzet (1983. június), címe: Arwin®]. Ezen poliklonális antitestből álló antidotumot súlyos vérzéses komplikációknál alkalmazzák, vagy ahol megnövekedett a vérzés veszélye, például baleseti sérüléseknél, vagy amikor hirtelen merül fel operáció indikációja. Az ankrod neutralizációját követően 4-5 g humán fibrinogént kell beadni. Amennyiben humán fibrinogént, plazmát vagy vért alkalmaznak az ankrod antidotummal való előzetes neutralizálása nélkül, úgy akut disszeminált alvadás veszélye áll fenn.An antidote is currently used to neutralize the enzyme activity of the ankrod, which is based on a goat serum immunoglobulin preparation (Knoll AG, June 1983, title: Arwin®). This polyclonal antibody antidote is used for severe bleeding complications, or where there is an increased risk of bleeding, such as accidental injury, or when surgery is suddenly indicated. After the anchovy is neutralized, 4-5 g of human fibrinogen should be injected. If human fibrinogen, plasma or blood is used without prior neutralization of the ankrod with an antidote, there is a risk of acute disseminated coagulation.
Stocker és munkatársai [Thrombosis Research, 6, 189-194 (1975)] vizsgálták a trombusképződést egyedül Arwin® jelenlétében és a poliklonális antidotum jelenlétében, és így tudták bizonyítani az antidotum hatását.Stocker et al., Thrombosis Research, 6, 189-194 (1975), examined thrombus formation in the presence of Arwin® alone and in the presence of a polyclonal antidote, and thus demonstrated the effect of the antidote.
A kecskékből származó poliklonális antitestek mellett az EP-B-0 395 375 és az EP-B-0 556 906 számú európai szabadalmi leírások említik, és Burkhardt és munkatársai [FEBS, 297, 297-301 (1992)] leírják, hogy monoklonális vagy poliklonális antitesteket használtak ankrodgének expressziójának kimutatására. Ismertették a fibrinogén kimutatását vérben ankrod és ankrod elleni antitestek segítségével vagy az ankrod tisztítását antitestek segítségével.In addition to polyclonal antibodies from goats, it is mentioned in EP-B-0 395 375 and EP-B-0 556 906 and in Burkhardt et al. (FEBS, 297, 297-301 (1992)) that monoclonal or polyclonal antibodies have been used to detect expression of anchor genes. Detection of fibrinogen in the blood using antibodies against ankrod and ankrod, or purification of ankrod using antibodies, has been reported.
A kecskeeredetű poliklonális antitestek ankrodantidotumként való alkalmazásának például az a hátránya, hogy ezek antitestek keverékéből állnak, amelyek közül soknak nincs ankrodneutralizáló hatása. A különböző antitestek sokasága gyors immunreakcióhoz vezethet, ezenkívül pedig viszonylag alacsony ankrodneutralizáló hatást eredményez. Ennélfogva az antidotum az ankrodhoz különböző affinitással rendelkező antitesteket tartalmaz. A poliklonális antitestek, mivel állatból származnak, csak rosszul standardizálhatok, azaz a különböző termelési sarzsok között ingadozások fordulnak elő.For example, the use of goat polyclonal antibodies as an ankrodantidum has the disadvantage that they consist of a mixture of antibodies, many of which have no anodrodneutralizing effect. The multitude of different antibodies can lead to a rapid immune response and, in addition, result in a relatively low anodneutralizing effect. Therefore, the antibody contains antibodies with different affinities to the anchor. Polyclonal antibodies, as they are derived from animals, can only be poorly standardized, i.e., fluctuations between different production batches occur.
A találmány célkitűzése az volt, hogy az ankrod ellen olyan antidotumot fejlesszen ki, amely nem mutatja a fent említett hátrányokat, és előállítása technikailag egyszerű.The object of the present invention was to develop an antidote against the anchor which does not show the aforementioned disadvantages and is technically simple to produce.
A feladatot olyan találmány szerinti monoklonális antitestekkel, antitestfragmentumokkal, ezek keverékeivel vagy származékaival oldjuk meg, amelyek kötődnek az ankrodhoz, aktivitását gátolják, és kötési affinitásuk 1x10_7-1x10~12 M tartományba esik. Neutralizációs hatásuk a kecskeeredetű poliklonális antitestekhez viszonyítva in vivő legalább 100%-kal jobb.The object is achieved by a monoclonal antibody, antibody fragments, mixtures thereof or derivatives of the invention which bind to ankrodhoz, inhibit the activity and binding affinity of 1x10 -1x10 ~ _7 12 M range. They have a neutralizing effect that is at least 100% better in vivo than goat polyclonal antibodies.
A találmány szerinti ankrodantidotumként alkalmazott antitestek előnyös módon egy sor javított tulajdonságuk révén tűnnek ki. Például: egy antitestből vagy egy antitestalcsoportból álló olyan homogén, jól jellemzett terméket képeznek, amely a különböző termelési sarasokon belül nem mutat eltéréseket. Ezeket az antitesteket tetszés szerinti mennyiségekben állíthatjuk elő, és mivel nem állatban történik az előállításuk, termelésük nem rejti magában a virális vagy bakteriális fertőzés kockázatát. A találmány szerinti antitestek, antitestfragmentumok, keverékeik vagy származékaik epitópspecifikusak, és magas kötési és neutralizációs aktivitást fejtenek ki. Ennélfogva a kezeléseknél kis mennyiségekben alkalmazhatók. A termék homogenitásának és magas kötési és neutralizációs aktivitásának köszönhetően a beadásra kerülő kis mennyiségeknek együttesen az a jelentősége, hogy jelentősen csökken a betegekben egy immunreakció kockázata. A különböző antitesteken, antitestfragmentumokon vagy származékaikon belül a kötési és neutralizációs aktivitásban ingadozások nem fordulnak elő a poliklonális antitesteknél kapott ingadozásokkal ellentétben. A különböző antitestek, antitestfragmentumok vagy származékok - ezek kötési aktivitása az ankrod különböző epitópjai ellen irányul - keveréke az ankrodot nagyon hatékonyan neutralizálja.Advantageously, the antibodies used as the ankrodantidum of the invention exhibit a number of improved properties. For example: they form a homogeneous, well characterized product consisting of an antibody or a group of antibodies that do not show differences within the various production bands. These antibodies can be produced in any amount, and since they are not produced in an animal, they do not carry the risk of viral or bacterial infection. The antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives of the invention are epitope specific and exhibit high binding and neutralizing activity. Therefore, they can be used in small amounts for treatments. Due to the homogeneity of the product and the high binding and neutralization activity, the small amounts administered together have the importance of significantly reducing the risk of an immune response in patients. In contrast to those obtained with polyclonal antibodies, variations in binding and neutralization activity do not occur within the various antibodies, antibody fragments or derivatives thereof. A mixture of different antibodies, antibody fragments, or derivatives, whose binding activity is directed against different epitopes of the anchor, is very effective in neutralizing the anchor.
A találmány szerinti antitesteknek, antitestfragmentumoknak, ezek keverékeinek vagy származékainak az ankroddal szembeni kötési affinitása előnyösen 1 x 10-7_1 xio-12 M tartományban van, előnyösebben 1 xi 0“8-1 χ10-11 M közé és különösen előnyösen 1 κΐ o-9-1 χ10-10 M közé esik.Antibodies, Antibody fragments, mixtures thereof or derivatives thereof of the invention, the binding affinity is preferably from 1 x ankroddal 10-7_1 Xio -12 M, more preferably from 1 xi 0 "8 M -1 χ10 between -11 and particularly preferably 1 κΐ p -9 -1 χ 10 -10 M.
A találmány szerinti antidotumnak, ellentétben a kecskeeredetű poliklonális antitestekkel, in vivő legalább 100%-kal jobb ankrodneutralizáló hatása van, előnyösen 250%-kal és különösen előnyösen 500%-kal jobb hatása van. A monoklonális antitestek in vitro is jelentősen jobb hatást mutatnak, mint a poliklonális antitestek.In contrast to goat polyclonal antibodies, the antidote of the present invention has at least 100% better anodrodneutralizing effect in vivo, preferably 250% and particularly preferably 500%. Monoclonal antibodies also show significantly better activity in vitro than polyclonal antibodies.
Találmány szerinti monoklonális antitestek vagy ezek fragmentumai alatt elvileg minden immunglobulinosztály, vagyis IgM, IgG, IgD, IgE, IgA vagy ezek alosztályai, mint az IgG alosztályai vagy ezek keverékei értendők. Előnyös az IgG és alosztályai, mint például az lgG1, lgG2, lgG2a, lgG2b, lgG3 vagy az lgG4. Különösen előnyösek az lgGI/κ vagy lgG2b/K IgG-szubtípusok. Fragmentumnak nevezünk egy vagy két antigénkomplementer kötőhellyel rendelkező minden olyan megrövidített vagy módosított antitestfragmentumot, amelyek ankroddal szemben magas kötő- és neutralizálóaktlvitást mutatnak, továbbá azokat az antitestrészeket, amelyek az antitestnek megfelelő, egy könnyű és nehéz láncból képzett kötőhelyet tartalmaznak, ilyenek az Fv-, Fab- vagy F(ab’)2 fragmentumok, vagy az egyszálú fragmentumok. Előnyben részesítjük a megrövidített kétszálú fragmentumokat, így az Fv-, Fabvagy F(ab')2 fragmentumot. Ezeket a fragmentumokat például enzimes kezeléssel, az antitest Fc részének enzimekkel - például papainnal vagy pepszinnel - való lehasításával, valamint kémiai oxidációval vagy az antitestgének géntechnológiai manipulációjával állíthatjuk elő. Génmanipulált, rövidítetlen fragmentumok is előnyösen alkalmazhatók.The monoclonal antibodies or fragments thereof of the invention are in principle intended to include all classes of immunoglobulins, i.e., IgM, IgG, IgD, IgE, IgA or their subclasses such as IgG subclasses or mixtures thereof. IgG and its subclasses such as IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 or IgG4 are preferred. IgG / κ or IgG2b / K IgG subtypes are particularly preferred. A fragment is defined as any truncated or modified antibody fragment having one or two antigen complementary binding sites which exhibit high binding and neutralizing activity to the anchor, and antibody portions containing an antibody corresponding to a light and heavy chain binding site, Fv, - either F (ab ') 2 fragments or single-stranded fragments. Preference is given to truncated double-stranded fragments such as Fv, Fab or F (ab ') 2 . These fragments may be produced, for example, by enzymatic treatment, cleavage of the Fc portion of the antibody by enzymes such as papain or pepsin, and by chemical oxidation or genetic engineering of the antibody genes. Gene-manipulated, non-truncated fragments are also advantageously used.
Az antitestek vagy a fragmentumok egyedül vagy keverékben alkalmazhatók.The antibodies or fragments may be used alone or in a mixture.
Géntechnológiai manipulációkhoz az antitestgének a szakemberek számára ismert módon, például hibridómasejtekből izolálhatok. Úgy járunk el, hogy az antitesttermelő sejteket tenyésztjük, majd az mRNS-t ismert módon izoláljuk, azaz a megfelelő optikai sűrűsé3For genetic engineering manipulations, antibody genes may be isolated from those known to those skilled in the art, such as hybridoma cells. The procedure involves culturing the antibody-producing cells and isolating the mRNA in a known manner, e.g.
HU 225 784 gű tenyészetből a sejteket guanidlnium-tiocianáttal lizáljuk, fenollal, kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk, izopropil-alkohollal kicsapjuk és etanollal mossuk. Ezután az mRNS-ből reverz transzkriptáz segítségével cDNS-t szintetizálunk. A szintetizált cDNS-t közvetlenül vagy genetikai manipuláció után - például helyre irányuló mutagenezissel („site directed mutagenesis”), inszerciók, inverziók, deléciók vagy báziscserék bevezetésével - megfelelő állati vagy gombaeredetű vagy bakteriális vagy virális vektorokba építjük be, és a megfelelő gazdasejtekben fejezzük ki. Gének klónozásához és baktériumokban, például E. coliban, illetve élesztőben, például Saccharomyces cerevisiae-ben való kifejezéshez előnyösek a következő bakteriális vagy élesztővektorok: pBR322, pUC18, pACYC184, lambda vagy élesztő-mu-vektorok.The cells were lysed from guanidium thiocyanate, extracted with phenol, chloroform / isoamyl alcohol, precipitated with isopropyl alcohol and washed with ethanol. The cDNA is then synthesized from the mRNA by reverse transcriptase. The synthesized cDNA is incorporated directly or after genetic manipulation, such as site-directed mutagenesis, insertions, inversions, deletions, or base exchanges into appropriate animal or fungal or bacterial or viral vectors and expressed in appropriate host cells. . Bacterial or yeast vectors pBR322, pUC18, pACYC184, lambda or yeast are preferred for cloning genes and expressing in bacteria such as E. coli or yeast such as Saccharomyces cerevisiae.
A találmány tárgyát képezik továbbá azok a sejtvonalak, amelyek a találmány szerinti antitesteket szintetizálják. A szintézis, mint fent említettük, állati vagy gombaeredetű vagy bakteriális vagy élesztősejtek transzformációja után mehet végbe. Előnyös, ha hibridómasejteket vagy triómasejteket alkalmazunk. Előnyösek a hibridóma-sejtvonalak. Ilyen hibridóma-sejtvonalakat ismert módon, például a következőképpen állítunk elő: ankroddal immunizált állatokból antitesttermelő B-sejteket izolálunk, a sejteket ankrodkötő antitestekre nézve szelektáljuk, majd ezeket a sejteket, például emberi vagy állati eredetű, például egér-mielómasejtekkel, humán limfoblasztoidsejtekkel vagy heterohibridómasejtekkel való fuzionálás [Koehler et al., Natúré, 256, 496 (1975)] révén vagy e sejtek megfelelő vírusokkal való megfertőzése révén örökéletűvé tesszük. Előnyösek a fúzióval előállított hibridóma-sejtvonalak, különösen előnyösek az egér-hibridómasejtvonalak, egészen különlegesen előnyösek azok a hibridóma-sejtvonalak, amelyek a MÁK 1-2, MÁK 2-29/3 vagy MÁK 3-27 antitesteket szekretálják, és amelyek a DSMZ intézményben (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig) DSM ACC2317, DSM ACC2318 és DSM ACC 2319 számon vannak letétbe helyezve (MAK=monoklonale Antikörper=monoklonális antitestek).The invention further provides cell lines that synthesize antibodies of the invention. The synthesis, as mentioned above, can be accomplished after transformation of animal or fungal or bacterial or yeast cells. It is preferable to use hybridoma cells or trioma cells. Hybridoma cell lines are preferred. Such hybridoma cell lines are prepared in a known manner, for example, by producing antibody-producing B cells from animals immunized with an anodode, selecting the cells for anchor binding antibodies, and then, such as human or animal cells such as mouse myeloma cells, human lymphoblastoid cells or fusion (Koehler et al., Naturre, 256, 496 (1975)) or by infecting these cells with appropriate viruses. Hybridoma cell lines produced by fusion are preferred, mouse hybridoma cell lines are particularly preferred, and hybridoma cell lines secreting MAK 1-2, MÁK 2-29 / 3 or MÁK 3-27 antibodies are particularly preferred, and which are secreted by DSMZ. (DSM ACC2317, DSM ACC2318 and DSM ACC 2319 (MAK = Monoclonal Antibody = Monoclonal Antibodies)).
A fent említett hibridóma-sejtvonalak a különösen előnyös IgG típusú antitesteket szekretálják. A képződött MÁK 1-2, MÁK 2-29/3 és MÁK 3-27 sejtvonalak a következő IgG-altípusokhoz tartoznak: lgGI/κ, lgG2b/K és lgGI/κ. Ezek az előnyös antitestek az ankrodmolekula különböző epitópjait kötik meg, mint ezt az antitestek egymás közötti kompetitív kötési vizsgálatai mutatták. A különösen kedvező MÁK 1-2 antitest epitópjához való kötődése az ankrodmolekula leghatásosabb neutralizálását eredményezi, ezáltal az enzimhatás neutralizálásához a legkisebb antitestmennyiség szükséges. A monoklonális antitestek jelentősen nagyobb neutralizálóhatást mutatnak, mint a vérzések kezelésénél rendszerint alkalmazott poliklonális antitest alapú antidotum, amelyet kecskéből nyertek, és amelyet a Knoll AG (Ludwigshafen) antidotumként forgalmaz.The above hybridoma cell lines secrete particularly preferred IgG antibodies. The resulting MAK 1-2, MAK 2-29 / 3 and MAK 3-27 cell lines belong to the following IgG subtypes: IgG / κ, IgG2b / K and IgG / κ. These preferred antibodies bind to different epitopes on the anchor molecule, as shown by competitive binding studies between the antibodies. Binding of the particularly favorable MAK 1-2 to the epitope of the antibody results in the most efficient neutralization of the anode molecule, thus requiring the lowest amount of antibody to neutralize the enzyme effect. Monoclonal antibodies show a significantly greater neutralizing effect than the polyclonal antibody-based antidote commonly used in the treatment of bleeding, which is obtained from Knoll AG (Ludwigshafen) as an antidote.
Találmány szerinti monoklonális antitestek származékainak nevezzük az olyan peptideket és peptidmimetikumokat, amelyek az antitest antigénkötő területéről származnak, továbbá a szilárd vagy folyékony hordozóhoz - ilyenek a polietilénglikol, üveg, a szintetikus polimerek, mint a poliakrilamid, polisztirol, polipropilén, polietilén, vagy a természetes polimerek, mint a cellulóz -, a Sepharose-hoz vagy Agarose-hoz kötött antitesteket, fragmentumokat vagy peptideket vagy az enzimekkel, toxinokkal képzett konjugátumokat vagy a radioaktív vagy nem radioaktív markerekhez - például 3H 123|, 125| 1311, 32p 35S> 14C> 51Cr> 36C|f 57Co_ δδρθ, 59pe, 90γ mTc, 75Se -, a fluoreszcens/kemilumineszcens markerekhez - mint a rodamin, fluoreszceinizotiocianát, fikoeritrin, fikocianin, fluoreszkamin -, fémkelátokhoz, avidinhez, sztreptavidinhez vagy biotinhez kovalensen kötött antitesteket, fragmentumokat vagy peptideket.Derivatives of monoclonal antibodies of the invention include peptides and peptide mimetics derived from the antigen-binding region of the antibody, as well as solid or liquid carriers such as polyethylene glycol, glass, synthetic polymers such as polyacrylamide, polystyrene, polypropylene, polyethylene, such as cellulose, antibodies, fragments or peptides bound to Sepharose or Agarose, or conjugates with enzymes, toxins, or to radioactive or non-radioactive markers, for example 3 H 123 |, 125 | 1311, 32p 35 S> 14 C> 51 Cr> 36 C | f 57 Co _ δδρθ, 59p e , 90γ mTc, 75 Se -, for fluorescent / chemiluminescent markers such as rhodamine, fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, phycocyanin, fluorescein, metal chelates, avidin, streptavidin or biotin, covalent antibodies.
A találmány szerinti antitesteket, antitestfragmentumokat, ezek keverékeit és származékait, közvetlenül vagy szárítás, például liofilizálás után, a fent említett hordozókra való kötésük után vagy más gyógyszerészeti hatóanyagokkal és segédanyagokkal való formulálásuk után gyógyászati készítmények előállításához használhatjuk. Hatóanyagként és segédanyagként említhetők például további antitestek, antimikrobiális hatóanyagok, amelyek mikrobiocid- vagy mikrobiosztatikus hatásúak, mint általában az antibiotikumok. Továbbá említhetők például a szulfonamidok, tumorellenes szerek, víz, pufferek, sóoldatok, alkoholok, zsírok, viaszok, inért hordozók vagy egyéb, a parenterális készítményekben szokásos anyagok, mint az aminosavak vagy cukrok. Ezek a gyógyászati készítmények betegségek leküzdésénél, főképpen alvadási zavarok, leginkább a perifériás vérkeringés zavarainak leküzdésénél vagy szélhűdésnél kerülnek alkalmazásra.The antibodies, antibody fragments, mixtures and derivatives thereof of the invention can be used directly or after drying, for example, after lyophilization, after binding to the aforementioned carriers, or after formulation with other pharmaceutically active substances and excipients. Examples of active ingredients and excipients are additional antibodies, antimicrobial agents which have a microbiocidal or microbiostatic action, such as antibiotics in general. Other examples include sulfonamides, antineoplastic agents, water, buffers, saline solutions, alcohols, fats, waxes, inert carriers, or other substances customary in parenteral formulations, such as amino acids or sugars. These pharmaceutical compositions are used in the treatment of diseases, in particular in the treatment of coagulation disorders, in particular in the treatment of peripheral circulatory disorders or in the case of chills.
A találmány szerinti antidotum orálisan vagy parenterálisan - szubkután, intramuszkulárisan, intravénásán vagy intraperitoneálisan - alkalmazható, kedvező az intramuszkuláris vagy intravénás adás.The antidote of the invention may be administered orally or parenterally, either subcutaneously, intramuscularly, intravenously or intraperitoneally, with intramuscular or intravenous administration being preferred.
A találmány szerinti antitesteket, antitestfragmentumokat, ezek keverékeit vagy származékait közvetlenül vagy szilárd vagy folyékony hordozókhoz, enzimekhez, toxinokhoz, radioaktív vagy nem radioaktív markerekhez vagy fluoreszcens/kemilumineszcens markerekhez való kapcsolásuk után - mint fent leírtuk - in vitro diagnosztikában alkalmazhatjuk, amikor is az ankrodot különböző szervezetekből - emberből vagy állatból származó testfolyadékokban vagy a legkülönbözőbb egyéb folyadékokban, például élesztő-, baktérium-, gombatenyészetek táptalajában vagy emberi vagy állati eredetű sejttenyészetekben mutatjuk ki.The antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof of the present invention can be used directly or directly to solid or liquid carriers, enzymes, toxins, radioactive or non-radioactive markers or fluorescent / chemiluminescent markers, as described above, when the anode is organisms, whether in human or animal body fluids or in a variety of other fluids, such as yeast, bacterial, fungal media or human or animal cell cultures.
1. példaExample 1
Hibridóma-sejtvonalak előállítása tkz immunizálást, fuzionálást, szelektálást és vizsgálatokat a szakirodalomban leírt technikákkal végeztük [például: J. H. Peters: „Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung”, Springer Verlag; A. M. Campbell: „Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology”, Elsevier, 2-7. és 8. fejezet (1991)].Preparation of Hybridoma Cell Lines Immunization, fusion, selection and assays were performed using techniques described in the literature [e.g., J. H. Peters, "Monoclonal Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer Verlag; A. M. Campbell: Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology, Elsevier, 2-7. and Chapters 8 (1991)].
HU 225 784HU 225 784
Nőstény Balb/c egereket 100 pg ankroddal amelynek az enzimaktivitását térhálósítással inaktiváltuk - immunizáltunk 2-3 hetes időközönkénti intraperitoneális oltással, a következő oltási séma szerint:Female Balb / c mice were inactivated by cross-linking with 100 µg of anode whose enzyme activity was inoculated at 2-3 week intervals following the following vaccination schedule:
1. 100 μΙ PBS-ben+100 μΙ komplett Freund-adjuváns.1. 100 μΙ in PBS + 100 μΙ complete Freund's adjuvant.
2. 100 μΙ PBS-ben+100 μΙ inkomplett Freund-adjuváns.2. 100 μΙ in PBS + 100 μΙ incomplete Freund's adjuvant.
3-5. 200 μΙ PBS-ben.3-5. 200 μΙ in PBS.
Az utolsó antigénadás után 3 nappal a lépet kivettük, a sejteket mostuk, szétválasztottuk, és a limfocitákat az SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581) mielóma-sejtvonallal fuzionáltuk. Ezeket a sejteket 5:1 arányban kevertük össze, 1,5 ml PEG-oldattal (=polietilénglikol-oldat) 1 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd PES-t adtunk (1 ml-t 30 másodperc alatt, 3 ml-t 30 másodperc alatt és 16 ml-t 60 másodperc alatt) hozzá. Egy mosási lépés után a sejteket szelektáló táptalajban [10% FCS (fetális borjúszérum), 10% Condimed H1 (Boehringer Mannheim), HAT-kiegészítő (hypoxantin-, aminopterin-, timidinkiegészítés), ITS-kiegészítő (inzulin-, transzferrin-, szelenitkiegészítés), piruvát, glutamin, sztreptomicin/penicillin tartalmú DMEM (Dulbecco által módosított Eagle-táptalaj)] 37 °C-on, 7,5% CO2-ot tartalmazó atmoszférában tenyésztettük.Three days after the last antigen injection, the spleen was harvested, the cells were washed, separated, and the lymphocytes fused with the myeloma cell line SP2 / 0-Ag14 (ATCC CRL1581). These cells were mixed at a ratio of 5: 1, incubated with 1.5 ml of PEG solution (= polyethylene glycol solution) for 1 min at 37 ° C, and then PES (1 ml for 30 seconds, 3 ml) was added. 30 seconds and 16 ml in 60 seconds). After a washing step, the cells in the selection medium [10% FCS (fetal calf serum), 10% Condimed H1 (Boehringer Mannheim), HAT supplement (hypoxanthine, aminopterin, thymidine supplement), ITS supplement (insulin, transferrin, selenite supplement) ), pyruvate, glutamine, streptomycin / penicillin-containing DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)] were grown at 37 ° C in 7.5% CO 2 .
A specifikus antiankrodantitestet szekretáló hibridómák azonosítását specifikus ELISA-val, mikrotitrálólemezen végeztük a következőképpen:The identification of hybridomas secreting specific anti-anchodant antibody was performed by specific ELISA on a microtiter plate as follows:
- Mikrotitrálólemezeket tartályonként 0,1 ml ankroddal, illetve a specificitás meghatározásához referenciaproteinekkel fedünk (1 pg/ml 0,05 M nátrium-hidrogén-karbonát, pH 9,2) 16 óra alatt, 4 °C-on.- Microtiter plates were coated with 0.1 ml of anchor per well and with reference proteins (1 pg / ml 0.05 M sodium bicarbonate, pH 9.2) for 16 hours at 4 ° C.
- Telítés 0,3 ml/tartály 1% BSA/PBS-sel 0,5-1 órán át 23 °C-on (BSA=marhaszérum-albumin).- Saturation with 0.3 ml / well of 1% BSA / PBS for 0.5-1 h at 23 ° C (BSA = Bovine Serum Albumin).
- Mosás háromszor 0,05% Tween 20-tartalmú PBS-sel.- Wash three times with PBS containing 0.05% Tween 20.
- Inkubálás sejttenyészet-felülúszókkal (50 μΙ; hígítva 50 μΙ 0,1% BSA/0,05% Tween 20 tartalmú PBS-sel) 2-4 órán át 23 °C-on.- Incubation with cell culture supernatants (50 μΙ; diluted with 50 μΙ in PBS containing 0.1% BSA / 0.05% Tween 20) for 2-4 hours at 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Inkubálás 0,1 ml/tartály biotinezett antiegér IgG antitesttel (0,1% BSA/PBS-ben) 2-4 órán át 23 °C-on.- Incubation with 0.1 ml / well biotinylated anti-mouse IgG antibody (0.1% in BSA / PBS) for 2-4 hours at 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Inkubálás 0,1 ml/tartály sztreptavidin-peroxidáz komplexszel (0,1% BSA/PBS-ben) fél órán át 23 °C-on.- Incubation with 0.1 ml / well of streptavidin-peroxidase complex (0.1% in BSA / PBS) for half an hour at 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- 0,1 ml/tartály peroxidázszubsztrátum.- 0.1 ml / well of peroxidase substrate.
- A reakció leállítása 0,1 ml/tartály 2 M kénsavval.- Stop the reaction with 0.1 ml / well of 2 M sulfuric acid.
- Abszorpciómérés 450 nm-en. Peroxidázszubsztrátum: 0,1 ml TMB-oldat (42 mM tetrametil-benzidin DMSO-ban), plusz 10 ml szubsztrátpuffer (0,1 M nátrium-acetát; pH 4,9), összekeverni, majd hozzáadni 14,7 μΙ hidrogén-peroxidot (DMSO=dimetilszulfoxid).- Measurement of absorbance at 450 nm. Peroxidase substrate: 0.1 ml of TMB solution (42 mM tetramethylbenzidine in DMSO) plus 10 ml of substrate buffer (0.1 M sodium acetate, pH 4.9), mixed with 14.7 μΙ hydrogen peroxide (DMSO = dimethylsulfoxide).
A pozitív antitestreakciót adó hibridómákat szubklónozással választottuk szét, és az egyedi kiónokat újból teszteltük. A legmagasabb reaktivitású antitesteket használtuk in vitro neutralizációs vizsgálatban. Ilyen módon számos pozitív hibridóma, azaz ankrod elleni antitestet termelő sejt izolálható.Positive antibody hybridomas were separated by subcloning and individual clones were retested. The antibodies with the highest reactivity were used in the in vitro neutralization assay. In this way, a number of positive hybridoma cells, i.e., cells producing antibody to ankrod, can be isolated.
2. példaExample 2
Monoklonális antitestek termelése és vizsgálataProduction and assay of monoclonal antibodies
A monoklonális antitesteket szérummentes sejttenyészet-felülúszókból tisztítottuk. Ennek érdekében a hibridómákat lépésenként a DMEM/HAT/10% FCS táptalajból DMEM/HT/10% FCS és DMEM/10% FCS táptalajon keresztül szérummentes sejttenyésztő táptalajra - ilyen például az SF-3 (Cytogen), PFHM-II (Gibco), HL-1 (Bio-Whittaker), Ultra-Doma PF (Bio-Whittaker) vagy hasonlók - vittük át (HT=hipoxantin, aminopterin). Ezt követően az affinitáskromatográfiás tisztításhoz Protein A-, illetve Protein G-Sepharose-t használtunk.Monoclonal antibodies were purified from serum-free cell culture supernatants. To this end, hybridomas are stepwise from DMEM / HAT / 10% FCS to DMEM / HT / 10% FCS and DMEM / 10% FCS to serum-free cell culture media such as SF-3 (Cytogen), PFHM-II (Gibco), HL-1 (Bio-Whittaker), Ultra-Doma PF (Bio-Whittaker) or the like (HT = hypoxanthine, aminopterin). Subsequently, Protein A and Protein G-Sepharose were used for affinity purification.
Miután a sejttenyészet-felülúszókat felvittük a kromatografálóoszlopokra, az aspecifikusan megkötött proteineket 3 M nátrium-klorid/1,5 M glicin (pH 8,9) oldattal mostuk ki; az antiankrodantitest-aktivitást 500 mM nátrium-klorid/0,5% ecetsav oldattal eluáltuk.After loading the cell culture supernatants onto the chromatography columns, the non-specifically bound proteins were washed with 3 M sodium chloride / 1.5 M glycine, pH 8.9; the antiancrodant antibody activity was eluted with 500 mM sodium chloride / 0.5% acetic acid.
Az antitest szubtípusának meghatározását a fent leírt ELISA technikával analóg módon végeztük, itt azonban a biotinezett antiegér IgG antitest helyett a következő biotinezett szubtípusspecifikus antitesteket alkalmaztuk: antiegér lgG1, antiegér IgM, antiegér IgG2a, antiegér-κ, antiegér lgG2b, antiegér-λ és antiegér lgG3.The antibody subtype was determined in an analogous manner to the ELISA technique described above, but the biotinylated anti-mouse IgG antibody used was the following biotinylated subtype-specific antibody: anti-mouse IgG1, anti-mouse IgM, anti-mouse IgG2a, anti-mouse-Ig, .
Az izolált MÁK 1-2, MÁK 2-29/3 és MÁK 3-27 hibridóma-sejtvonalak antitesttípusának és -szubtípusának (lásd az 1. példát) a vizsgálata mindenkor a következő eredményt adta: lgGI/κ, lgG2b/x és lgGI/κ.The antibody type and subtype of the isolated MAK 1-2, MAK 2-29 / 3 and MAK 3-27 hybridoma cell lines (see Example 1) always yielded the following results: IgGI / κ, IgG2b / x and IgGI / κ.
A monoklonális antitestek affinitáskonstansát különböző, az irodalomból ismert technikákkal állapítottuk meg, például egyensúlyi dialízissel, immunprecipitációval vagy ELISA-val [például: J. H. Peters: „Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung”, Springer Verlag; A. M. Campbell: „Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology”, Elsevier, 11. fejezet (1991)].The affinity constant of the monoclonal antibodies was determined by various techniques known in the art, such as equilibrium dialysis, immunoprecipitation, or ELISA [e.g., J. H. Peters, "Monoclonal Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer Verlag; A. M. Campbell, "Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology," Elsevier, Chapter 11 (1991)].
ELISA módszer szerint [J. Immunoi. Methods, 77, 305-319 (1985)] a természetes ankroddal szembeni affinitásra a következő értékeket kaptuk (1. táblázat).By ELISA [J. Immunol. Methods, 77, 305-319 (1985)] gave the following values for affinity for the natural anchor (Table 1).
1. táblázatTable 1
Monoklonális antitestek affinitása ankrodhozAffinity of monoclonal antibodies to anchor
3. példaExample 3
Ankrod „in vitro neutralizálása monoklonális antitestekkel, sejttenyészet-felülúszókkal (MAK=monoklonale Antikörper=monoklonális antitestek)In vitro neutralization of ankrod with monoclonal antibodies, cell culture supernatants (MAK = monoclonal antibody = monoclonal antibody)
Az antitestek neutralizálókapacitását ankroddal indukált fibrinzavarosság-módszerrel mértük. Ekkor aThe neutralizing capacity of the antibodies was measured by the anchor-induced fibrin confusion method. Then the
HU 225 784HU 225 784
BSA-val telített lemezekre az ankrodot és az antitesteket (sejttenyészet-felülúszókat, illetve tisztított antitesteket) különböző koncentrációarányokban mértük be. A lemezeket 37 °C-on inkubáltuk, majd humán fibrinogént (1,5 mg) adtunk a lemezekhez. A 37 °C-on való inkubálás után keletkezett fibrint 340 nm-en optikai sűrűség (OD)-méréssel határoztuk meg.Anchor and antibodies (cell culture supernatants and purified antibodies) were plated on BSA-saturated plates at various concentration ratios. The plates were incubated at 37 ° C and human fibrinogen (1.5 mg) was added to the plates. Fibrin formed after incubation at 37 ° C was determined by optical density (OD) measurement at 340 nm.
A neutralizálóantitestek növekvő mennyiségével neutralizálható volt az ankrodaktivitás, ami a csökkent optikai sűrűségben (OD; 2. táblázat) mutatkozott meg.Increasing amounts of neutralizing antibodies were able to neutralize ankrodactivity, which was manifested in reduced optical density (OD; Table 2).
Különösen hatásosnak mutatkozott a MÁK 1-2 antitest, amely magasabb ankrodkoncentrációknál is teljes neutralizációt eredményezett (2. táblázat, az OD a vak értéknek felel meg). A 2. táblázatban a vak érték minden alkotórészt tartalmaz az ankrodon kívül. A legmagasabb OD-értékeket mindenkor a különféle monoklonális antitestek hozzáadása nélküli különböző ankrodadagokkal (50, 25 és 12,5 ng/ml ankrod) mértük (2. táblázat).The MAK 1-2 antibody was particularly effective and resulted in complete neutralization even at higher anchor concentrations (Table 2, OD corresponds to the blank value). In Table 2, the blank value includes all components except the anchor. The highest OD values were always measured with different doses of anchovies (50, 25 and 12.5 ng / ml) without the addition of various monoclonal antibodies (Table 2).
A MÁK 2-29/3 és MÁK 3-27 antitesteknek hasonlóan jó vagy jobb az affinitásuk az ankrodhoz, mint a MÁK 1-2-nek (1. táblázat), az antitest-antigén kötés azonban csak az ankrodmennyiségekhez viszonyított nagyobb antitestmennyiségek adásánál vezetett az enzimaktivitás neutralizációjához.MAK 2-29 / 3 and MAK 3-27 have similar or better affinity for anchor than MAK 1-2 (Table 1), however, antibody-antigen binding only resulted in the administration of higher amounts of antibody relative to anchor quantities. to neutralize enzyme activity.
2. táblázatTable 2
Ankrod neutralizálása MÁK sejttenyészet-felülúszókkalNeutralization of anchor with MAK cell culture supernatants
4. példaExample 4
Ankrod „in vitro neutralizálása tisztított monoklonális antitestekkel A tisztított monoklonális antitestek in vitro neutralizálóhatékonyságának az értékelése az 50%-os neutralizációs értékek fibrinzavarosság-vizsgálatban való összehasonlításával végezhető el.In Vitro Neutralization of Ankrod with Purified Monoclonal Antibodies The evaluation of the neutralization efficiency of purified monoclonal antibodies in vitro can be accomplished by comparing the 50% neutralization values in the fibrin turbidity assay.
Az 50%-os neutralizációs értéket a következőképpen kapjuk: OD negatív kontroll+(OD pozitív kontroll-OD negatív kontroll)/2;A 50% neutralization value is obtained as follows: OD negative control + (OD positive control-OD negative control) / 2;
Negatív kontroll: nincs ankrodhozzáadás (nincs fibrinképződés);Negative control: no anchoring (no fibrin formation);
Pozitív kontroll: ankrod+fibrinogén (maximális fibrinképződés).Positive control: ankrod + fibrinogen (maximum fibrin formation).
Különböző antitest/ankrod hányadosok mellett változó OD-értékeket kaptunk, amikor is az 50%-os neutralizációs pontot a következő antitestkoncentrációknál értük el:Variable OD values were obtained at different antibody / anchor ratios, whereby the 50% neutralization point was reached at the following antibody concentrations:
Az 50%-os neutralizációhoz szükséges antitestmennyiségek viszonyából levezethető, hogy a választott in vitro feltételek mellett a MÁK 1-2 monoklonális antitest 1 órás előinkubálás mellett legalább kétszer jobb, 2 órás előinkubálás mellett körülbelül négyszer jobb, mint a kecskéből származó poliklonális antitest alapú antidotum.From the ratio of antibody to 50% neutralization, it can be deduced that, under the chosen in vitro conditions, the MAK 1-2 monoclonal antibody is at least twice as good at 1 hour pre-incubation and about 4 times better at 2 hours pre-incubation than goat-derived polyclonal antibody.
5. példaExample 5
Ankrod meghatározása „szendvics”-ELISA-valDetermine your anchor with a “sandwich” ELISA
Az ankrod diagnosztikai célra történő meghatározása mintákban, például testfolyadékokban, két antitest kombinációjával, szendvics-ELISA segítségével a következő séma szerint végezhető:The determination of the ankrod for diagnostic purposes in samples, such as body fluids, may be performed by a combination of two antibodies using a sandwich ELISA as follows:
- Mikrotitrálólemezeket fedünk tartályonként 100 μΙ-ben 5 pg/1 MÁK 1-2-vel, illetve MÁK 3-27-tel: hígítás 0,05 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, pH 9,2; egy éjszakán át 4 °C-on.- Coat microtiter plates in 100 μΙ / well with 5 pg / L of MAK 1-2 or MAK 3-27: dilution with 0.05 M sodium bicarbonate, pH 9.2; overnight at 4 ° C.
- A mikrotitrálólemezeket PBS/0,05% Tween 20-szal mossuk.- The microtiter plates were washed with PBS / 0.05% Tween 20.
-Telítés tartályonként 300 μΙ 1% BSA/PBS-sel; 0,5 óra/25 °C.- Saturation with 300 μΙ 1% BSA / PBS per well; 0.5 h / 25 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Ankrodból 11 standard felező hígítást készítünk 50 ng/ml-től kezdve, PBS/0,1% BSA/0,05% Tween 20-ban; a mintákat ezzel párhuzamosan, különböző hígításokban mérjük be; inkubálás 2 óra/23 ’C.11 standard dilutions of anchor were made at 50 ng / ml in PBS / 0.1% BSA / 0.05% Tween 20; weigh the samples in parallel at various dilutions; incubation for 2 hours / 23 'C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Inkubálás MÁK 2-29-cel; 1 pg/ml; hígítás PBS/0,1% BSA/0,05% Tween 20-szal; 100 μΙ/tartály; 2 óra/23 °C.- Incubation with MAK 2-29; 1 pg / ml; dilution with PBS / 0.1% BSA / 0.05% Tween 20; 100 μΙ / container; 2 hours / 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Inkubálás biotinilezett antiegér lgG2b-vel; 1:10 000-es hígítás PBS/0,1% BSA/0,05% Tween 20-szal; 100 μΙ/tartály; 2 óra/23 °C.- Incubation with biotinylated anti-mouse IgG2b; 1:10,000 dilution in PBS / 0.1% BSA / 0.05% Tween 20; 100 μΙ / container; 2 hours / 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Inkubálás sztreptavidin-peroxidáz komplexszel; 1:10 000-es hígítás PBS/0,1% BSA/0,05% Tween 20-szal; 100 μΙ/tartály; 0,5 óra/23 °C.- Incubation with streptavidin-peroxidase complex; 1:10,000 dilution in PBS / 0.1% BSA / 0.05% Tween 20; 100 μΙ / container; 0.5 h / 23 ° C.
HU 225 784HU 225 784
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Hozzáadunk 100 μΙ/tartály peroxidázszubsztrátumot [10 ml szubsztrátumpuffer (0,1 M nátriumacetát, pH 4,9) 100 μΙ TMB-oldattal (42 mM tetrametil-benzidin DMSO-ban) keverve] és 14,7 μΙ 3%-os hidrogén-peroxidot.- Add 100 μΙ / well of peroxidase substrate (10 mL of substrate buffer (0.1 M sodium acetate, pH 4.9) mixed with 100 μΙ of TMB solution (42 mM tetramethylbenzidine in DMSO)) and 14.7 μΙ of 3% hydrogen peroxide.
- A reakciót 100 μΙ/tartály 2 M kénsavval állítjuk le.- Stop the reaction with 100 μΙ / well 2 M sulfuric acid.
- Abszorpciómérés 450 nm-en.- Measurement of absorbance at 450 nm.
Mindkét monoklonális antitestnél - MÁK 1-2, illetve MÁK 3-27 - és az alkalmazott kombinációknál megmutatkozott, hogy az ankrod 3000-100 pg/ml koncentrációtartományban meghatározható és kimutatható. Az abszolút kimutathatósági határ ezen mérhető értékek alatt van (1. ábra).Both monoclonal antibodies - MAK 1-2 and MAK 3-27 - and the combinations used showed that the anchor could be detected and detected in the concentration range of 3000-100 pg / ml. The absolute limit of detection is below these measurable values (Figure 1).
6. példaExample 6
Kompetitlv ELISAKompetitlv ELISA
Az ankrodon a MAK-kötőepitópok relatív helyzetének vizsgálatára kompetitív ELISA módszert használtunk:A competitive ELISA was used to examine the relative position of the MAK binding epitopes on the ankrod:
- Mikrotitrálólemezeket fedünk tartályonként 100 μΙ-ben 1 μg/ml ankroddal - hígítás 0,05 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, (pH 9,2) egy éjszakán át 4 °C-on.- Coat microtiter plates in 100 μΙ / well with 1 μg / ml anchor - Dilute with 0.05 M sodium bicarbonate, pH 9.2, overnight at 4 ° C.
- A mikrotitrálólemezeket PBS/0,05% Tween 20-szal mossuk; 200 μΙ/tartály.The microtiter plates were washed with PBS / 0.05% Tween 20; 200 μΙ / tank.
-Telítés tartályonként 300 μΙ 1% BSA/PBS-sel; 0,5 óra/23 °C.- Saturation with 300 μΙ 1% BSA / PBS per well; 0.5 h / 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Az így előkészített mikrotitrálólemezek különböző sorozatához 10-10 ng/ml MÁK 1—2-biotin, MÁK 2-29/3-biotin biotinezett monoklonális antitestet adtunk és kötöttünk az ankrodhoz, majd az előzetesen rávitt antitestek után egy másik antitest (MÁK 1-2, MÁK 2-29/3 vagy MÁK 3-27) különböző koncentrációit (1 μg/ml-1 ng/ml) adtuk a sorozatokhoz úgy, hogy lehetséges egymást fedő kötőhelyeik vonatkozásában minden lehető antitestkombinációt teszteljünk. A különböző antitestkombinációkat tartalmazó sorozatokat PBS/0,1% Tween 20 oldatban két órán át 23 °C-on inkubáltuk, és a továbbiakban a következőképpen kezeltük:- To a different series of microtiter plates prepared in this manner, 10-10 ng / ml of MÁK 1-2-biotin, MÁK 2-29 / 3-biotin biotinylated monoclonal antibody were added and bound to the anode, followed by another antibody (MÁK 1- 2, MAK 2-29 / 3 or MAK 3-27) (1 μg / ml-1 ng / ml) were added to the series so that each possible antibody combination was tested for their overlapping binding sites. Sequences containing different antibody combinations were incubated in PBS / 0.1% Tween 20 for two hours at 23 ° C and subsequently treated as follows:
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Inkubálás sztreptavidin-peroxidáz komplexszel 1:10 000-es hígításban PBS/0,1% BSA/0,05% Tween 20-ban; 100 μΙ/tartály; 0,5 óra/23 °C.- Incubation with streptavidin-peroxidase complex at 1:10,000 dilution in PBS / 0.1% BSA / 0.05% Tween 20; 100 μΙ / container; 0.5 h / 23 ° C.
- Mosás, mint fent.- Wash as above.
- Hozzáadunk 100 μΙ/tartály peroxidázszubsztrátumot [10 ml szubsztrátumpuffer (0,1 M nátriumacetát, pH 4,9) 100 μΙ TMB-oldattal (42 mM tetrametil-benzidin DMSO-ban) keverve], és hozzáadunk 14,7 μΙ 3%-os hidrogén-peroxidot.- Add 100 μΙ / well of peroxidase substrate (10 mL of substrate buffer (0.1 M sodium acetate, pH 4.9) mixed with 100 μΙ of TMB (42 mM tetramethylbenzidine in DMSO)) and add 14.7 μΙ of 3% - hydrogen peroxide.
- A reakciót 100 μΙ/tartály 2 M kénsavval állítjuk le.- Stop the reaction with 100 μΙ / well 2 M sulfuric acid.
- Abszorpciómérés 450 nm-en.- Measurement of absorbance at 450 nm.
Egyik alkalmazott antitestkombinációnál sem észleltünk OD-csökkenést, azaz a különböző monoklonális antitestek nem szorultak ki az ankrodhoz való kötődésnél. Ezek az antitestek az ankrodmolekula különböző epitópjaihoz kötődnek. Ezért több antitest azonos időben tud az ankroddal kölcsönhatásba lépni. Az ankrod hatásának gyors, optimális neutralizálása végett a különböző monoklonális antitesteket ezért - amennyiben szükséges és megkívánt - kombináltan alkalmazhatjuk.No decrease in OD was observed with any of the antibody combinations used, i.e., the various monoclonal antibodies were not displaced upon binding to the anchor. These antibodies bind to different epitopes on the anode molecule. Therefore, several antibodies can interact with the anode at the same time. Therefore, various monoclonal antibodies can be used in combination, if necessary and desired, to rapidly neutralize the effect of the anchor.
7. példaExample 7
Az ankrod „In vivő” neutralizálásaNeutralizing the anchor of your anchor
Narkotizált patkányoknak 10 NE/testtömeg-kg ankrodot infundáltunk 30 perc alatt a farokvénába. Az ankrodinfúzió elkezdése után 10 perc múlva a különböző tesztanyagokat - monoklonális antitestek, poliklonális antitestek vagy placebo - 1 ml/testtömeg-kg mennyiségben intravénásán boluszként alkalmaztuk. Vérmintákat (8 térfogat vér+2 térfogat 0,11 M citrát antikoaguláns) vettünk az artéria carotisból (nyaki verőér) az ankrodinfúzió megkezdése előtt, illetve utána 30 és 60 perc múlva. A citrátos vérből centrifugálással nyertük a plazmát, és a fibrinogéntartalmat a Clauss-féle alvadási módszemel határoztuk meg (standardgörbe-készítés: patkányfibrinogén meghatározott mennyiségeinek hozzáadása fibrinogénmentesített patkányplazmához).Narcotized rats were infused with 10 IU / kg body weight of anode for 30 minutes into the tail vein. 10 minutes after the onset of an anodrinfusion, the various test substances, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or placebo, were administered as a bolus of 1 ml / kg body weight intravenously. Blood samples (8 volumes of blood + 2 volumes of 0.11 M citrate anticoagulant) were taken from the carotid artery (carotid artery) before, 30 and 60 minutes after the start of the anodine infusion. Plasma was obtained from the citrated blood by centrifugation and the fibrinogen content was determined by the Clauss clotting method (standard curve: addition of specific amounts of rat fibrinogen to fibrinogen-depleted rat plasma).
Tesztanyagcsoportonként 6 patkányt használtunk (3. táblázat).Six rats per test group were used (Table 3).
3. táblázatTable 3
Tesztanyagok és bevitt mennyiségekTest substances and amounts administered
4. táblázatTable 4
Fibrinogénkoncentráció-mérés a különböző antitestekkelFibrinogen concentration measurement with various antibodies
(AK=Antikörper=antitest)(K = Antikörper = antibody)
Látható, hogy a MÁK 1-2 az alkalmazott 1,435 mg/testtömeg-kg koncentrációban az ankrodinfúzió megkezdése után 30 perc múlva képes volt a fibrinogénszintek további csökkenését megállítani. A kecskeeredetű poliklonális antitestből hasonló hatás eléréséhez 8,6 mg/testtömeg-kg adására volt szükség. A MÁK 1-2-höz hasonló, vagyis 1,5 mg/testtömeg-kg mennyiségben a poliklonális alapú antidotum nem mutatott hatást (lásd a 4. táblázatban a kontrolloszlopot).It can be seen that MÁK 1-2 was able to stop a further decrease in fibrinogen levels 30 minutes after the start of an anodrinfusion at a concentration of 1.435 mg / kg body weight. To achieve a similar effect from a goat polyclonal antibody, 8.6 mg / kg body weight was required. A polyclonal based antidote had no effect similar to that of MAK 1-2, i.e. 1.5 mg / kg body weight (see control column in Table 4).
HU 225 784HU 225 784
A 60 perc után kapott fibrinogénkoncentrációk alapján azt a következtetést vonhattuk le, hogy a MÁK 1-2 a vizsgált feltételek mellett in vivő mintegy hatszor jobban neutralizál, mint a poliklonális antidotum. A MÁK 1-2 neutralizálóhatása valószínűleg jelentősen nagyobb.Based on the fibrinogen concentrations obtained after 60 minutes, it can be concluded that MAK 1-2 is approximately six times more neutral in vivo than the polyclonal antidote under the conditions tested. The neutralizing effect of MÁK 1-2 is probably significantly greater.
Claims (10)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19729544A DE19729544A1 (en) | 1997-07-10 | 1997-07-10 | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments, their mixture or derivatives and their use |
| PCT/EP1998/003834 WO1999002564A2 (en) | 1997-07-10 | 1998-06-23 | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0003029A2 HUP0003029A2 (en) | 2000-12-28 |
| HUP0003029A3 HUP0003029A3 (en) | 2003-01-28 |
| HU225784B1 true HU225784B1 (en) | 2007-09-28 |
Family
ID=38527893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0003029A HU225784B1 (en) | 1997-07-10 | 1998-06-23 | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments and mixtures thereof, pharmaceutical preparations containing them and use of the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU225784B1 (en) |
-
1998
- 1998-06-23 HU HU0003029A patent/HU225784B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0003029A2 (en) | 2000-12-28 |
| HUP0003029A3 (en) | 2003-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gordon et al. | Rapid fibrinolysis, augmented Hageman factor (factor XII) titers, and decreased C1 esterase inhibitor titers in women taking oral contraceptives | |
| US20200129600A1 (en) | Combination therapy using a factor xii inhibitor and a c-1 inhibitor | |
| CA2515453C (en) | Methods for preventing and treating tissue damage associated with ischemia-reperfusion injury | |
| KR100406072B1 (en) | Antithrombotic and Anti-von Willebrand Factor Monoclonal Antibodies | |
| AU2003300266B2 (en) | Methods and compositions for suppressing fibrocyte differentiation | |
| US20020168357A1 (en) | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof | |
| Zacharski et al. | Pathways of coagulation activation in situ in rheumatoid synovial tissue | |
| Saito et al. | Changes of plasma hemostatic markers during percutaneous transluminal coronary angioplasty in patients with chronic coronary artery disease | |
| HU225784B1 (en) | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments and mixtures thereof, pharmaceutical preparations containing them and use of the same | |
| US6365155B1 (en) | Ancrod-specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same | |
| CA2107340C (en) | Monoclonal antibodies against human tnf-binding protein i (tnf-bp i) | |
| MXPA04012301A (en) | Combinations of anti-tissue factor antibodies and anticoagulant and/or antiplatelet agents. | |
| PT91808B (en) | METHOD FOR PREPARING HIBRID MONOCLONAL ANTIBODIES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM | |
| MXPA99011382A (en) | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same | |
| Kashiwagi et al. | AS3288802, a highly selective antibody to active plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), exhibits long efficacy duration in cynomolgus monkeys | |
| WO2012110843A1 (en) | Methods and pharmaceutical compositions for promoting fibrinolysis and thrombolysis | |
| EP1227842A1 (en) | Inhibition of angiogenesis by antibodies against high molecular weight kininogen domain 5 | |
| Arnout et al. | 21 Antiphospholipid antibodies: prothrombotic mechanisms and laboratory diagnosis | |
| JPH08325298A (en) | Monoclonal antibody | |
| JPH04218389A (en) | Bi-specific antibody and antibody-containing medicine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Erratum | ||
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |