CN102175858A - 一种ev71病毒的化学发光免疫成像检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是基于磁性微球分离和化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法，该方法主要是：将EV71病毒兔抗多克隆抗体与磁性微球偶联；在微孔板中加入待检样品和磁性微球，使待检样品中的病毒与病毒多克隆抗体结合；再加入生物素化的EV71病毒VP1蛋白兔抗多克隆抗体，使其与待检样品特异性反应；加入SA-HRP，使其与生物素结合，最终形成磁性微球－多克隆抗体－病毒－多克隆抗体－HRP复合物；加入化学发光底物，检测化学发光强度。本发明中化学发光强度和待测病毒浓度成正比，可以得出化学发光强度和待测EV71病毒浓度之间的线性关系。本发明具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点，能更好地满足EV71病毒临床检测的需要。

Description

一种EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法

技术领域

本发明涉及一种手足口病主要致病病原EV71病毒的检测方法，属于免疫检测技术领域和化学发光免疫分析技术领域。肠道病毒EV71-HB0803株由中国典型培养物保藏中心保藏（地址：武汉大学生命科学学院，武汉市武昌珞珈山，430072），保藏日期是2010年9月30日，保藏号是CCTCC NO：V201020。

背景技术

肠道病毒71型( Enterovirus 71，EV71) 为手足口病( hand-foot-mouth disease，HFMD) 主要病原体，属于小RNA 病毒科，肠道病毒属成员，其基因组为约7408个核苷酸的单股正链RNA。EV71病毒常在婴幼儿中引起手足口病的大范围暴发流行，并能导致重症、甚至死亡病例的发生。1998年中国台湾地区129106例的手足口病例及78例死亡主要由EV71引起，2008年和2009年以EV71感染为主引起的手足口病在中国大陆多个省市流行，并导致数百名儿童死亡。这些手足口病疫情使越来越多的研究针对EV71的病原检测、致病机制、病毒变异与毒力以及疫苗开发。国家卫生部于2008年5月首次将手足口病列入《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病进行管理，并于5月下发了《手足口病实验室检测方案(试行) 》，其中介绍了病毒分离、双份血清标本的中和抗体滴度测定、逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR) 等3种检测方法。

化学发光(Chemiluminescence，简称CL)，即化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化后，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，可以利用发光测量仪测量光量子产额。它具有灵敏度高、线性范围宽和仪器设备简单等特点。20世纪60年代初，Yallow和Berson创建了具有划时代意义的放射免疫分析技术(Radioimmunoassay, 简称RIA)，因其高灵敏度和高特异性，开创了生物医学的微量物质分析的新领域。但该方法也存在一些弱点，如污染环境，影响工作人员健康等。化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，简称CLIA）是在RIA 基本理论的基础上，以标记发光试剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。经过多年的发展，研究者利用许多新材料、新技术、新工艺，加速了CLIA 的完善。目前，化学发光法作为一种研究和应用比较活跃的分析方法，具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单以及易于实现自动化等特点。作为一种高灵敏的分析方法，其选择性却较差，往往受到较大的干扰。故在实际应用中，常常选择与其它分离技术或具有特异性的反应相结合。CLIA结合了化学发光的高灵敏度和免疫反应的高特异性的特点，已广泛应用于多种药物、激素、病原微生物、抗原及其他生物活性物质的测定。如CLIA法检测甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、克伦特罗、氯霉素、 肝类表面抗原和其它物质。

卫生部在《手足口病实验室检测方案(试行) 》中介绍了病毒分离、双份血清标本的中和抗体滴度测定、逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR) 3种检测方法。我国目前已经申请的EV71病毒检测相关的专利技术有8项，包括了EV71病毒核酸的RT- PCR检测方法、利用单克隆抗体的ELISA检测方法等，还未见本发明所述的基于磁性微球分离化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法。现有的病毒检测技术存在以下几个弱点：一是样品处理难度大，比如病毒核酸的提取，特别是病毒RNA的提取，对实验条件和操作人员的要求很高，否则很容易引起核酸的降解，从而导致检测结果的假阴性。二是实验所需时间较长，病毒核酸检测至少要数小时甚至更长。三是实验操作复杂且需要特殊的仪器设备。对比卫生部公布的参考检测方法和已经申请的专利技术，本发明所述基于磁性微球分离化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法有十分明显的优势，比如样品处理简单、操作要求不高、快速、灵敏度高等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：为克服现有技术的缺陷，提供一种基于磁性微球富集作用与化学发光检测于一体的、特异性强、检测方法更加可靠的适用于检测EV71病毒的方法，

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的是一种基于磁性微球分离和化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法，该方法包含以下步骤：

（1）在磁性微球的表面偶联EV71病毒的兔抗多克隆抗体；

（2）将偶联有抗体的磁性微球加入检测样品，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；

（3）加入生物素化的EV71 VP1重组蛋白的兔抗多克隆抗体，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；

（4）加入SA-HRP，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤后转移微球至新的微孔板中；

（5）加入HRP化学发光底物，把反应后待检测的磁性微球置放于凝胶成像仪中进行测量，考察化学发光强度的对数与待测样品抗体浓度的对数之间的线性关系；

经过上述步骤，实现EV71病毒的化学发光免疫成像的检测。

在上述步骤（1）中，所述兔多克隆抗体由EV71病毒株HB0803  CCTCC NO：V201020免疫家兔，抗血清经硫酸铵沉淀和proteinA纯化得到。

在上述步骤（3）中，所述VP1重组蛋白的兔抗多克隆抗体可以通过以下方式获得：

先根据EV71病毒标准株BrCr-TR株基因组GenBank: AB204852.1设计一对引物VP1-F和VP1-R，然后以EV71病毒株HB0803  CCTCC NO：V201020基因组为模板，扩增VP1基因，重组蛋白由VP1基因克隆至PET-32a载体中以后原核表达，免疫家兔后，所得抗血清经硫酸铵沉淀和proteinA纯化得到；

VP1-F引物的序列：GAGAGTTCTATAGGGGACAGT；

VP1-R引物的序列：AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA。

在上述步骤（2）和步骤（3）中，所述PBSTB缓冲液可以采用含有0.01 M PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.4的缓冲液。

在上述步骤（1）中，所述兔抗多克隆抗体采用以下方法获得：利用RD细胞扩增EV71病毒株HB0803，然后经收集后超速离心浓缩病毒，免疫健康家兔，制备高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经proteinA过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。

本发明使用凝胶成像系统检测化学发光成像信号，并对病毒进行定量分析，该方法是：把反应后的磁性微球转移至黑色聚苯乙烯微孔板中，并于凝胶成像仪中进行测量。加入50 μL 化学发光液，选择化学发光高灵敏模式(Chemi Hi Sensitivity), 2 min后开始曝光，曝光时间设定为5 min。获得的图片用仪器自带的Quantity One软件进行处理，其化学发光强度值为扣除空白对照后的平均光密度值。

所述磁性微球为商品化的羧基化磁性微球(Dynabeads MyOne, 1 μm) 购买于Invitrogen公司。

本发明与现有技术相比具有以下的主要优点：

（1）操作简便、所需时间短，整个操作仅需2小时。

（2）灵敏度高，特异性强，并适合病毒定量检测。采用本方法对EV71病毒标准样本进行检测，在0.1-10³ TCID₅₀ /mL范围内，化学发光强度的对数与病毒蛋白浓度的对数呈良好的线性关系，检出限为0.1TCID₅₀ /mL ，与PCR检测符合率为95％。与其他同源性较高的其他肠道病毒没有交叉性。

附图说明

图1 是本发明实施例中EV71病毒VP1基因扩增结果。

图2是本发明重组菌的SDS- PAGE检测结果。

图3是本发明实施例抗体制备中westernblot结果。

图4是本发明实施例化学发光成像检测结果。

图5是实施例偶联抗体的磁性微球用量优化结果。

图6是实施例生物素化二抗浓度优化结果。

图7是实施例SA-HRP浓度优化结果。

图8是实施例线性范围和灵敏度。

图9是实施EV71病毒特异性检测化学发光成像结果。

图10是实施EV71病毒特异性检测化学发光强度结果。

具体实施方式

本发明提供的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，是一种基于磁性微球分离和化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法，该方法主要是：将EV71病毒兔抗多克隆抗体与磁性微球偶联；在微孔板中加入待检样品和磁性微球，使待检样品中的病毒与病毒多克隆抗体结合；再加入生物素化的EV71病毒VP1蛋白兔抗多克隆抗体，使其与待检样品特异性反应；加入SA-HRP，使其与生物素结合，最终形成磁性微球－多克隆抗体－病毒－单克隆抗体－HRP复合物；加入化学发光底物，检测化学发光强度。化学发光强度的对数和待测病毒浓度的对数成正比，可以得出化学发光强度和待测EV71病毒浓度之间的线性关系。

下面结合实施例及附图对本发明做进一步描述。

实施例1

1. EV71全病毒兔抗多克隆抗体及病毒VP1蛋白兔抗多克隆抗体的制备：

根据EV71病毒BrCr-TR株基因组VP1基因序列( GenBank: AB204852.1) 设计一对引物，VP1-F：GAGAGTTCTATAGGGGACAGT，VP1-R：AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA，扩增片段为891bp。为便于PCR 产物的克隆，上、下游引物分别添加一个BamHI和SalI酶切位点。该引物由上海生工生物工程有限公司合成。提取EV71病毒HB0803株RNA，反转录后进行PCR扩增，得到VP1基因（见图1）。将获得的用DNA 凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司生产）回收的PCR 产物，与载体pMD-18T（购自大连TaKaRa 公司）连接后，转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒。经序列测定，说明PCR 扩增获得DNA片段为本发明需要的目的片段。用BamHI和SalI分别酶切重组质粒和表达载体pET-32a，回收VP1片段和线性化的pET-32a，经T4DNA 连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α。用碱裂解法（黄培堂，译.[美]J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，分子克隆试验指南[M]，第3版，北京，科学出版社，2002年版）提取重组质粒，测序鉴定。

将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落，于37 ℃培养至对数生长期( OD600 = 0.6～1.0)，加入异丙基-B-D 硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1.0 mmol/l，继续诱导培养3h，收集菌体。同时设空白载体pET-32a 转化子作对照。参照文献（Marshak DR等, Strategies for Protein purification and Characterization : A Laboratory Course Manual . New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1996）提取包涵体。具体步骤如下：用40000赫兹超声波裂解上述的大肠杆菌菌体，离心取沉淀后再用0.2 %十二烷基肌氨酸钠裂解，然后用氧化型与还原型谷胱甘肽进行变性和复性（具体操作步骤参见：邓小红等，葡萄球菌肠毒素B突变体( K172E) 的制备和抗肿瘤活性分析，细胞与分子免疫学杂志，2004, 20(3)，360-362）。菌体裂解液和包涵体提取物用10 %的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE 电泳（参照芮琪等，用凝胶电泳法研究小麦叶片衰老期间的内肽酶同工酶，南京农业大学学报 2002 , 25 (3) : 85～88）。结果发现，在含有表达载体的转化子的裂解物中出现一条大小约30kD 的蛋白带，与预期的VP1的分子量相符，该表达产物以包涵体形式存在(见图2)。

兔抗全病毒及VP1蛋白多克隆抗体的制备：参见何昭阳等主编，《动物免疫学实验技术》 长春：吉林科学技术出版社，2002中的方法：利用浓缩的EV71 HB0803株病毒及纯化的VP1重组蛋白免疫健康家兔，制备高特异性、高效价的兔抗EV71 HB0803株病毒及VP1蛋白高免血清。 对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经proteinA过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。具体步骤如下：

（1）取2ml分离的血清至15ml离心管内，加2ml Binding buffer, 再逐滴加入硫酸铵饱和溶液1ml，边加边搅拌，充分混合后，静置30min，3000rpm/min 离心20min，弃沉淀，除去纤维蛋白；（2）在上清液中再加入硫酸铵饱和溶液3ml，使之成为百分之五十饱和溶液，充分混合，4度静置3小时；（3）3000rpm/min 离心20min，弃上清；（4）加2ml Binding buffer ,使沉淀溶解，再加入饱和硫酸铵溶液1ml，充分混合后，静置30min；（5）3000rpm/min，离心20min，弃上清，除去白蛋白；重复步骤（5）两到三次，得到高免血清。

然后，将高免血清用1ml Binding buffer 溶解沉淀，装入透析袋，4度，24小时，离心除去沉淀，上清液即为粗提抗体。

proteinA纯化粗提的蛋白步骤如下：稀释粗提抗体至大约1mg/ml，20倍体积的Washing buffer 洗柱子。粗提抗体过柱子，然后用20倍体积的Washing buffer 洗柱子。加1ml Elution buffer A洗脱蛋白，收集洗脱液。用适当体积的Elution buffer 洗脱蛋白，收集洗脱液。立即添加等量的Neutralization buffer 中和洗脱液。最后用westernblot来验证纯化过的抗体，证明所获得抗体有很高的效价和特异性（见图3）。

2. 磁性微球的处理：

参照文献（Oster J等, Polyvinyl-alcohol- based magnetic beads for rapid and efficient separation of specific or unspecific nucleic acid sequ

3. 磁性微球偶联抗体：

磁性微球上偶联抗体的方案为两步法反应。

（1）用EDC和NHS活化羧基化磁性微球：取3 mg微球，用300 μL MES缓冲液洗涤两次。分别加入50 μL 50 mg/mL的EDC和NHS(用4 ℃ 的MES缓冲液用前配制)，混匀后于培养箱中25 ℃振荡孵育30 min以活化羧基。孵育后用300 μL MES缓冲液洗涤两次。

（2）偶联抗体：加入100 μL 150 μg EV71病毒多克隆抗体(溶于MES缓冲液)于活化后的微球中，混匀后于培养箱中25 ℃振荡孵育30 min。孵育后用Tris缓冲液洗涤四次，再加入300 μL Tris缓冲液于25 ℃振荡反应15 min，处理未反应的活化羧基（Tris(去活化用)：50 mM Tris, pH 7.4）。最后，把偶联上病毒多克隆抗体的磁性微球悬浮于150 μL PBS缓冲液中，并加入0.1% BSA，置于4 ℃冰箱待用。

4.所述夹心免疫的反应过程：

取100 μL EV71病毒样品，加入3 μL 60 μg偶联病毒多克隆抗体的磁性微球，37℃孵育30 min，轻轻振荡。孵育后，用磁铁分离除去上清液，再用200 μL PBSTB缓冲液（PBSTB洗涤液：0.01 M PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.4）洗涤三次，然后加入100 μL 10 μg/mL的生物素化二抗，37 ℃孵育30 min并轻轻振荡。孵育后，除去上清液，用200 μL PBSTB缓冲液洗涤三次，然后加入100 μL 200 ng/mL的SA-HRP，37℃孵育30 min并轻轻振荡。孵育后，除去上清液，用200 μL PBSTB缓冲液洗涤五次后转移微球至新的微孔板中，用200 μL PBS洗涤一次。

5.化学发光成像检测：

把反应后待检测的磁性微球放置于凝胶成像仪中进行测量。加入50 μL HRP化学发光底物（A液与B液用前按体积比1：1混合：A液为0.4 mM luminol, 2 mM PIP, B液为2 mM H₂O₂, pH 8.4），选择化学发光高灵敏模式（Chemi Hi Sensitivity），手动曝光2 min。获得的数据用仪器自带的Quantity One软件进行处理，其信号值为减去空白对照后的平均光密度值（见图4）。

6. 实验条件优化：

为了达到较好的检测效果，实验考察了影响免疫反应和化学发光成像检测的一些因素。如偶联有病毒多克隆抗体的磁性微球用量、生物素化抗体浓度及SA-HRP浓度等。

（1）偶联抗体的磁性微球用量：

考察了20-70 μg范围内偶联抗体的磁性微球用量。实验发现：在20-60 μg范围内，随着磁性微球用量的增加，化学发光强度随之增强，而在60-70 μg范围内时，化学发光强度基本保持不变。为取得较高的发光强度及节约试剂用量考虑，实验时磁性微球的用量选择60 μg(见图5)

（2）生物素化EV71 VP1蛋白多克隆抗体浓度：

考察了0.1-20 μg/mL浓度范围内生物素化VP1蛋白多克隆抗体浓度对化学发光强度的影响。如图6所示，当抗体浓度为10 μg/mL时，化学发光强度达到最大。继续增大生物素化抗体的浓度，信号开始下降，故选择10 μg/mL的生物素化多克隆抗体进行后续实验。

（3）SA-HRP浓度：

考察了20-400 ng/mL 范围内SA-HRP对化学发光强度的影响。由于SA-HRP的非特异吸附比较明显，所以，洗涤一定要彻底，才能保证较低的背景和检测的灵敏度。如图7所示，当浓度小于200 ng/mL，随着SA-HRP浓度增大，化学发光强度明显增强；当浓度大于200 ng/mL时，化学发光强度基本保持不变。而且SA-HRP浓度越大，空白值上升越明显，需要洗涤的次数和时间也要增加。为了保证本方法具有较高的化学发光信号、较低的背景值及操作的简便性，选择200 ng/mL的SA-HRP浓度较为理想。

7. 线性范围和灵敏度：

在上述优化条件下，考察了化学发光强度与EV71病毒的浓度关系。如图8所示，在0.1-10³ TCID₅₀ /mL范围内，化学发光强度的对数与病毒蛋白浓度的对数呈良好的线性关系，检出限为0.1TCID₅₀ /mL。

8. 特异性实验；

为了评价本方法的特异性，选择并比较了几种常见的流感病毒亚型。图9和图10中1－8分别为水、CA16、CA21、EV71、科萨奇B5、POLIO 1、E6、E30等样品，从图9和图10可以看出，本方法只对EV71病毒有明显作用，而对其它几种常见肠道病毒如CA16、CA21、科萨奇B5、POLIO 1、E6、E30没有响应，说明本方法具有很高的特异性。

9. 实际样品分析：

把本发明建立的检测方法应用于实际样品的检测以检验该方法的准确性。20份临床样本由北京302医院提供，经PCR核酸检测，确定为EV71病毒阳性样本。取20 μL 样品，用PBS缓冲液稀释5倍，按本实验操作步骤进行检验。其判断标准为化学发光值(取三次实验平均值)大于或等于空白值与三倍标准偏差之和，即判断为阳性。结果表明， 19份样品均为阳性，与PCR检测结果符合率为95％。

本发明提供的上述方法与现有技术相比，不仅操作更加简便，具有更好的灵敏度，且特异性强，适合对样品进行高通量检测，能更好地满足EV71病毒临床检测的需要。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征是一种基于磁性微球分离和化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法，该方法包含以下步骤：

（1）在磁性微球的表面偶联EV71病毒的兔抗多克隆抗体；

（2）将偶联有抗体的磁性微球加入检测样品，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；

（3）加入生物素化的EV71 VP1重组蛋白的兔抗多克隆抗体，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；

（4）加入SA-HRP，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤后转移微球至新的微孔板中；

（5）加入HRP化学发光底物，把反应后待检测的磁性微球置放于凝胶成像仪中进行测量，考察化学发光强度的对数与待测样品抗体浓度的对数之间的线性关系；

经过上述步骤，实现EV71病毒的化学发光免疫成像检测。

2.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（1）中所述兔多克隆抗体由EV71病毒株HB0803  CCTCC NO：V201020免疫家兔，抗血清经硫酸铵沉淀和proteinA纯化得到。

3. 根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（3）中所述VP1重组蛋白的兔抗多克隆抗体通过以下方法获得：

先根据EV71病毒标准株BrCr-TR株基因组GenBank: AB204852.1设计一对引物VP1-F和VP1-R，然后以EV71病毒株HB0803  CCTCC NO：V201020基因组为模板，扩增VP1基因，重组蛋白由VP1基因克隆至PET-32a载体中以后原核表达，免疫家兔后，所得抗血清经硫酸铵沉淀和proteinA纯化得到，

VP1-F引物的序列：GAGAGTTCTATAGGGGACAGT，

VP1-R引物的序列：AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA。

4.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（2）和步骤（3）所述PBSTB缓冲液为含有0.01 M PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.4的缓冲液。

5.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（1）中所述兔抗多克隆抗体采用以下方法获得：利用RD细胞扩增EV71病毒株HB0803，然后经收集后超速离心浓缩病毒，免疫健康家兔，制备高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经proteinA过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。

6.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于使用凝胶成像系统检测化学发光成像信号，并对病毒进行定量分析，该方法是：把反应后的磁性微球转移至黑色聚苯乙烯微孔板中，并于凝胶成像仪中进行测量；加入50 μL 化学发光液，采用化学发光高灵敏模式, 2 min后开始曝光，曝光时间设定为5 min；获得的图片用仪器自带的Quantity One软件进行处理，其化学发光强度值为扣除空白对照后的平均光密度值。

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