CN112540174A - 一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒及其制备方法。属于生物检测技术领域。该试剂盒包括定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述抗试剂为异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白；所述二抗试剂为碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体；所述磁微粒试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体与磁微粒偶联制得；所述发光底物为经过发光底物缓冲液稀释的ALPS发光底物。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：稳定性良好，检测试剂盒的效期可至一年以上；检测灵敏度高，特异性能好、变异小；目前该检测试剂盒已获得多个医院临床验证，其符合相关性高达90％以上。

Description

一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCOV)，因2019年病毒性肺炎病例而被发现，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。
人首次感染新型病毒后，机体的免疫系统会对病毒进行免疫防御，产生特异性的抗体。一般1～2周出现IgM抗体，约4周左右产生IgG抗体。新型冠状病毒IgM/IgG抗体试剂的使用，为临床提供了血清学的证据，可与核酸检测方法联合使用，从而为新型冠状病毒的诊断提供更全面、准确的信息。
现阶段，新型冠状病毒IgG(2019-nCOV-IgG)检测临床上主要以核酸检测和CT检测为主，检测速率慢，专业操作要求高。
综上，如何提供一种对新型冠状病毒IgG(2019-nCOV-IgG)检测具有谱筛性高、可靠性强、检测速率快的免疫学检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒性能可靠、灵敏度高，可配合半自动、全自动仪器使用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，包括以下组分：定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；
所述抗试剂为异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白；
所述二抗试剂为碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体；
所述磁微粒试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体与磁微粒偶联制得；
所述发光底物为经过发光底物缓冲液稀释的ALPS发光底物。
技术原理为：样本、定标品或质控品中的新型冠状病毒(NCP)抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的新型冠状病毒Spike蛋白结合，随后加入包被着抗荧光素抗体的磁微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗人IgG抗体，形成磁微粒－Spike抗原－新型冠状病毒(NCP)抗体－酶标二抗夹心免疫复合物。再次清洗后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用化学发光测定仪检测反应的发光强度，与计算的Cutoff值相比较，确定样本中相应抗体存在与否。
所取得的有益效果：(1)以碱性磷酸酶(AP)为标记酶，并经过纯化后得到碱性磷酸酶溶液与抗人IgG标记抗体，提高反应的灵敏度；(2)以免疫磁微粒为固相，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联磁性微球，作为通用的分离试剂，不仅使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度；(3)发光底物ALPS为底物，该底物是辉光性底物，而且快速达到平台期，有利于信号的检测，提高了最终试剂盒的灵敏度和特异性性能；并进一步优化了化学发光增强体系，保证了终产品的信号灵敏度高和稳定性好、变异小；(4)ALPS底物的优点在于灵敏度高和平台稳定期长。
优选的，所述定标品、阳性对照品的制备方法为：采用校准品缓冲液溶解重组新型冠状病毒IgG抗体至浓度为0.5mg/mL，之后用校准品缓冲液稀释至不同浓度点，标定后得到所述定标品和阳性对照品；所述阴性对照品即为校准品缓冲液；
所述校准品缓冲液为含新生牛血清的缓冲液。
所取得的有益效果：使重组新型冠状病毒IgG抗体更为稳定的保存。
优选的，所述抗试剂的制备方法如下：
(1)使用抗试剂缓冲液配制浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，之后对其进行稀释，使其在495nm处的吸光度值在0.95～1.05之间；
(2)将上述步骤(1)制备的异硫氰酸荧光素溶液与新型冠状病毒Spike蛋白混合，二者体积比为95:5，室温下搅拌1～2小时；
(3)纯化，得到异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白；
(4)将所述异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中得到抗试剂；所述异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白在所述抗试剂中的质量浓度为0.8～2.0μg/mL；
所述抗试剂缓冲液中Tris、氯化钠、吐温20、绵羊血清和新生牛血清的质量浓度依次为0.1M、0.9％、1％、10％和10％；
所述Tris盐缓冲液中Tris和氯化钠的质量浓度依次为0.1M和0.9％。
所取得的有益效果：使异硫氰酸荧光素溶液与新型冠状病毒Spike蛋白更充分的结合。
优选的，所述二抗试剂的制备方法如下：
(1)使用抗试剂缓冲液配制浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，之后对其进行稀释，使其在280nm处的吸光度值在0.95～1.05之间；
(2)将上述步骤(1)制备的碱性磷酸酶溶液与抗人IgG标记抗体按摩尔比1:2～1:10的比例混合，室温下搅拌4～5小时；
(3)纯化，得到碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体；
(4)将所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中得到二抗试剂；所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体在所述二抗试剂中的质量浓度为0.15～0.3μg/mL。
所取得的有益效果：使碱性磷酸酶溶液与抗人IgG标记抗体更充分的结合。
优选的，所述表面活性剂选自Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，所述表面活性剂在Tris盐缓冲液中的质量浓度为1％。
优选的，所述磁微粒试剂的制备方法如下：
(1)清洗：将磁珠浓缩液充分混匀后至于反应容器中，将反应容器置于磁场15min，待磁珠全部沉降后吸去上清；继续加入磁珠2～5倍体积的磷酸缓冲液进行清洗，混匀20～30min后再置于磁场中15min，待磁珠全部沉降后吸去上清；重复清洗步骤后将磁珠溶液定容到10～50mg/mL；
(2)连接反应：按照磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的质量比100:1将二者混合，保持混匀状态下2～8℃反应18小时；
(3)使用磷酸缓冲液清洗后用磁微粒缓冲液定容至10mg/mL，制得磁微粒试剂，2～8℃保存待用；
所述磁微粒缓冲液中Tris、氯化钠和甲基纤维醚的质量浓度依次为0.1M、0.9％和5％。
所取得的有益效果：使磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体更充分的结合。
优选的，所述发光底物是将ALPS发光底物与发光底物缓冲液按体积比1:4～1:10稀释；
所述发光底物缓冲液中Tris、氯化钠和光泽精的质量浓度依次为0.1M、0.9％和0.3％。
所取得的有益效果：使底物的稳定性增强。
优选的，还包括清洗浓缩液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)该新型冠状病毒检测试剂盒的各试剂组分包括定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物的稳定性良好，检测试剂盒的效期可至一年以上；(2)检测灵敏度高，特异性能好、变异小；(3)操作简便；(4)目前该检测试剂盒已获得多个医院临床验证，其符合相关性高达90％以上。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例所用试剂的购买渠道和配置方法如下：
重组新型冠状病毒IgG(2019-nCOV-IgG)抗体采购自Fitzgerald公司；
新型冠状病毒Spike蛋白采购自Fitzgerald公司；
抗人IgG标记抗体采购自Fitzgerald公司；
磁珠浓缩液购自北京泽诚生物技术有限公司，为四氧化三铁形成的纳米级磁微球。
本实施例中所述的各种缓冲液的配方如表1～5所示：
表1 Tris盐缓冲液(pH8.0)
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82
4M盐酸 Sigma pH7.5 约20mL
表2校准品缓冲液
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
新生牛血清 Sigma 100％ 1000mL
四环素 Sigma 0.01％ 10mg
硫酸新霉素 Sigma 0.01％ 10mg
表3抗试剂剂缓冲液
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82
绵羊血清 广州蕊特 10％ 100mL
新生牛血清 广州蕊特 10％ 100mL
表4磁微粒缓冲液
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82
甲基纤维醚 Sigma 5％ 50g
表5发光底物缓冲液
Figure BDA0002812423480000051
Figure BDA0002812423480000061
未提及的药剂采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒：
一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，包括以下组分：定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。
A、定标品、阴性对照品、阳性对照品的制备方法为：采用校准品缓冲液溶解重组新型冠状病毒IgG抗体至浓度为0.5mg/mL，之后用校准品缓冲液稀释至不同浓度点，标定后得到所述定标品、阴性对照品、阳性对照品。定标品、阴性对照品、阳性对照品的定性如表6所示。
表6定标品、阴性对照品、阳性对照品的定性
试剂名称 阴阳性
定标品 阴
阴性对照品 阴
阳性对照品 阳
B、抗试剂的制备方法如下：
(1)使用抗试剂缓冲液配制浓度为5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，之后对其进行稀释，使其在495nm处的吸光度值在0.95～1.05之间；
(2)将上述步骤(1)制备的异硫氰酸荧光素溶液与新型冠状病毒Spike蛋白(0.5mg/mL)混合，二者体积比为95:5，室温下搅拌2小时；
(3)纯化，得到异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白；
(4)将所述异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白按照终浓度0.8ug/mL的比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中得到抗试剂。
所述表面活性剂为Tween20，表面活性剂在Tris盐缓冲液中的质量浓度为1％。
C、二抗试剂的制备方法如下：
(1)使用抗试剂缓冲液配制浓度为5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，之后对其进行稀释，使其在280nm处的吸光度值在0.95～1.05之间；
(2)将上述步骤(1)制备的碱性磷酸酶溶液与抗人IgG标记抗体按摩尔比1:5的比例混合，室温下搅拌5小时；
(3)纯化，得到碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体；
(4)将所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体按照终浓度0.15ug/mL的比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中得到二抗试剂。
所述表面活性剂为Tween20，表面活性剂在Tris盐缓冲液中的质量浓度为1％。
D、磁微粒试剂的制备方法如下：
(1)清洗：将磁珠浓缩液充分混匀后至于反应容器中，将反应容器置于磁场15min，待磁珠全部沉降后吸去上清；继续加入磁珠2～5倍的磷酸缓冲液进行清洗，混匀30min后再置于磁场中15min，待磁珠全部沉降后吸去上清；重复清洗步骤后将磁珠溶液定容到50mg/mL；
(2)连接反应：按照磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的质量比100:1将二者混合，保持混匀状态下2～8℃反应18小时；
(3)使用磷酸缓冲液清洗后定容至10mg/mL，制得磁微粒试剂，2～8℃保存待用。
E、发光底物是将ALPS发光底物与发光底物缓冲液按1:10的比例稀释。
F、清洗浓缩液的配方如表7所示。
表7清洗浓缩液
试剂名称 生产商 规格 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82
Tween-20 Sigma 5％ 50mL
曲拉通-100 Sigma 5％ 50mL
实施例2
一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒的制备：
(1)按实施例1的方法制备定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、清洗浓缩液；
(2)将各试剂独立地置于一个包装容器内，以组成本实施例的新型冠状病毒IgG(2019-nCOV-IgG)检测试剂盒套组。
实施例3
一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)每次测定前准备下列试管，做好标记并放置在试管架上：
各浓度校准品用试管各2支；
待测样本(样本的采集参照常规操作：将采集的静脉血加入至试管或肝素抗凝管中，离心，取上清部分进行实验)、质控品用试管各1支；
(2)测定前将各试剂放至室温(18～25℃)，加样前充分混匀；
(3)设定好37℃水浴锅；
(4)分别加15μL新型冠状病毒IgG(2019-nCOV-IgG)定标品、阴性对照品、阳性对照品、待测样本至对应试管底部；
(5)加30μL抗试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴15分钟；
(7)加30μL磁微粒试剂至每一试管中；
(8)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴5分钟；
(9)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(10)加300μL清洗浓缩液至每一试管中，用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s，至彻底混匀，重复上一步操作1次；
(11)重复上一步操作1次；
(12)重复上一步操作1次；
(13)加100μL二抗试剂至每一试管中；
(14)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴15分钟；
(15)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(16)加300μL清洗浓缩液至每一试管中，用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s，至彻底混匀，重复上一步操作1次；
(17)重复上一步操作1次；
(18)重复上一步操作1次；
(19)把试管从磁分离器上去下，加200μL发光底物溶液至每一试管中，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。
(20)判定标准：所测样本发光值小于1.2倍定标液发光值为阴性，大于1.2倍定标液所测发光值为阳性
如使用全自动检测仪器，则上述手动操作步骤将由仪器自动操作所代替，请严格按照仪器使用说明书进行检测。
实验1
利用本发明的新型冠状病毒IgG检测试剂盒与临床诊断结果的测试性能对比。
结果如表8所示。
表8新型冠状病毒IgG检测试剂盒与临床诊断结果(医测核酸结果)的测试性能对比
Figure BDA0002812423480000091
Figure BDA0002812423480000101
Figure BDA0002812423480000111
表8附表
Figure BDA0002812423480000112
Figure BDA0002812423480000121
对表8结果进行统计分析，结果见表9。
表9统计分析结果
Figure BDA0002812423480000122
由表8、表9结果可知，目前该检测试剂盒已获得多个医院临床验证，其符合相关性高达90％以上。
实验2
对本发明试剂盒的稳定性进行测试，测试方法如下：
将配制好的抗试剂及校准品分装15套，2-8℃保存，第一天在37℃水浴锅内放置1套试剂，此后每天相同时间放置一套，到第11天将此前放置的试剂取出测试，第一天放置的试剂为37℃加速破坏十天的研究对象，以此类推，经测试得到温育破坏1天至10天的测试数据，此方法在同行业中普遍共识37℃温育1天，相当于2-8℃保存45天左右。
结果如表10所示。
表10新型冠状病毒IgG检测试剂盒37℃水浴稳定性表。
Figure BDA0002812423480000131
由表10结果可知，本发明制备的试剂盒具有良好的稳定性。
实验3
检测速率由实验仪器决定，在CIA600仪器上此项目测试速率为30T/h，在CIA1200仪器上为50-60T/h，在CIA2800仪器上为90T/h。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；
所述抗试剂为异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白；
所述二抗试剂为碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体；
所述磁微粒试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体与磁微粒偶联制得；
所述发光底物为经过发光底物缓冲液稀释的ALPS发光底物。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，所述定标品、阳性对照品的制备方法为：采用校准品缓冲液溶解重组新型冠状病毒IgG抗体至浓度为0.5mg/mL，之后用校准品缓冲液稀释至不同浓度点，标定后得到所述定标品和阳性对照品；所述阴性对照品即为校准品缓冲液；
所述校准品缓冲液为含新生牛血清的缓冲液。
3.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂的制备方法如下：
(1)使用抗试剂缓冲液配制浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，之后对其进行稀释，使其在495nm处的吸光度值在0.95～1.05之间；
(2)将上述步骤(1)制备的异硫氰酸荧光素溶液与新型冠状病毒Spike蛋白混合，二者体积比为95:5，室温下搅拌1～2小时；
(3)纯化，得到异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白；
(4)将所述异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中得到抗试剂；所述异硫氰酸荧光素标记的新型冠状病毒Spike蛋白在所述抗试剂中的质量浓度为0.8～2.0μg/mL；
所述抗试剂缓冲液中Tris、氯化钠、吐温20、绵羊血清和新生牛血清的质量浓度依次为0.1M、0.9％、1％、10％和10％；
所述Tris盐缓冲液中Tris和氯化钠的质量浓度依次为0.1M和0.9％。
4.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，所述二抗试剂的制备方法如下：
(1)使用抗试剂缓冲液配制浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，之后对其进行稀释，使其在280nm处的吸光度值在0.95～1.05之间；
(2)将上述步骤(1)制备的碱性磷酸酶溶液与抗人IgG标记抗体按摩尔比1:2～1:10的比例混合，室温下搅拌4～5小时；
(3)纯化，得到碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体；
(4)将所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中得到二抗试剂；所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG标记抗体在所述二抗试剂中的质量浓度为0.15～0.3μg/mL。
5.如权利要求3或4所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自Tween 20、Triton X-100、Bronidox中的一种或多种，所述表面活性剂在Tris盐缓冲液中的质量浓度为1％。
6.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备方法如下：
(1)清洗：将磁珠浓缩液充分混匀后至于反应容器中，将反应容器置于磁场15min，待磁珠全部沉降后吸去上清；继续加入磁珠2～5倍体积的磷酸缓冲液进行清洗，混匀20～30min后再置于磁场中15min，待磁珠全部沉降后吸去上清；重复清洗步骤后将磁珠溶液定容到10～50mg/mL；
(2)连接反应：按照磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的质量比100:1将二者混合，保持混匀状态下2～8℃反应18小时；
(3)使用磷酸缓冲液清洗后用磁微粒缓冲液定容至10mg/mL，制得磁微粒试剂，2～8℃保存待用；
所述磁微粒缓冲液中Tris、氯化钠和甲基纤维醚的质量浓度依次为0.1M、0.9％和5％。
7.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物是将ALPS发光底物与发光底物缓冲液按体积比1:4～1:10稀释；
所述发光底物缓冲液中Tris、氯化钠和光泽精的质量浓度依次为0.1M、0.9％和0.3％。
8.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgG检测试剂盒，其特征在于，还包括清洗浓缩液。
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