CN102445540A - 一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,由96孔过滤板、标准品、样品稀释液、微球悬浮液、酶结合物、底物A、底物B、20×洗涤液、不干胶封片和使用说明书组成。本发明中的试剂盒将固相载体由传统的微孔板改为聚苯乙烯微球,抗原抗体的反应发生在液相中,不仅有利于二者保持生物活性和正确的空间构象,还可消除传统反应模式的表面张力和空间障碍对抗原抗体反应的影响,以上两点均有利于二者之间的反应,可以有效缩短反应时间与洗涤次数,同时本发明具有操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低的特点,对丙型肝炎病毒感染者“窗口期”的诊断具有重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测血清中丙型肝炎病毒核心抗原浓度的试剂盒,尤其涉及一种应用丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)抗体特异性包被聚苯乙烯微球定量检测人血清中丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)浓度的试剂盒。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染引起的,主要经过输血进行传播,是一种呈全球性分布、传染性很强的疾病,其感染最显著的临床特征就是引起慢性感染,约有70%的丙肝有可能发展成慢性肝炎,20%发展成肝硬化,12%发展成肝癌,危害十分地严重。全世界约有1.7亿人携带HCV,预计我国HCV感染者3800万,而且每年的新发病例数不断上升,感染率约为3.2%。目前,国内外公认的治疗方法是干扰素联合利巴韦林的治疗方式,但该疗法的有效率不到50%。目前尚未有其他有效的治疗方式,因此早发现、早诊断、早治疗对于丙肝患者有十分重要的意义。
目前用于临床诊断HCV感染的方法主要有三类:PCR方法检测HCV RNA及酶联免疫法检测HCV抗体和HCV核心抗原。PCR方法直接用来检测HCV RNA,它在患者感染HCV病毒10天的时候就能检出HCV病毒,是目前最灵敏的检测方法,也适用于丙型肝炎病毒感染的早期诊断,但在临床实际操作时,存在RNA易降解,易污染等问题,且检测成本高,不能大规模的应用于临床诊断。酶联免疫法检测HCV抗体一种快速简单且已很成熟的检测方法,是目前较为普遍的检测手段,但丙肝感染存在一段50~70天的“窗口期”(即从病毒感染起直到可以检出该病毒标志物前的时期),不利于实现对HCV感染的早发现、早治疗的目的。美国ORTHO公司于2000年推出了HCV Ag的酶联免疫诊断试剂盒,该产品有很高的灵敏度和特异性,能检出“窗口期”14天的患者,同时在国内仅有湖南景达制药有限公司于2003年推出的丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原检测试剂盒(酶联免疫法),但这两个试剂盒均存在检测成本高、实验时间长等局限性。
近年来免疫微粒技术广泛应用于免疫诊断中,免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体,包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体),使其致敏为免疫微粒,用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。现已制成聚苯乙烯胶乳微粒、羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒,数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等致敏方法形成免疫微粒,广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。微粒因具有更大的表面积和独特的测定动力,因此有助于提高灵敏度和信号放大效果。在检索的结果中,目前尚未见应用聚苯乙烯微球为固相载体,以液相杂交为反应模式,制备检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒以定量检测血清中HCV-cAg浓度的报道。
发明内容
针对现有技术的局限性,本发明要解决的问题是提供一种应用HCV-cAg抗体特异性包被聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,以实现快速、高效、简便、可靠的定量检测人血清中HCV-cAg浓度。
本发明所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,由96孔过滤板、标准品、样品稀释液、微球悬浮液、酶结合物、底物A、底物B、20×洗涤液组成,其特征在于:所述96孔过滤板是底部有渗透性的滤膜并能通过抽真空进行洗涤的一种微孔板;所述标准品为浓度为50ng/ml的HCV-cAg蛋白冻干粉;所述样品稀释液为每升含10%小牛血清、0.1% Proclin 300、0.5% TritonX-100的0.01M pH7.4 PBS;所述微球悬浮液为使用每升含0.1%BSA、0.03%Tween、0.1% Proclin 300的0.01M pH7.4 PBS悬浮5.0×106个表面已偶联有2株HCV-cAg一抗的聚苯乙烯微球溶液;所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的2株HCV-cAg二抗;所述底物A为3mmol/L鲁米诺与1mmol/L对碘苯酚的混合液;所述底物液B为3mmol/L的双氧化脲溶液;所述20×洗涤液为每升含160g氯化钠、72.64g十二水合磷酸氢二钠、4g磷酸二氢钾、氯4.8g化钾、10ml Tween 20的水溶液。
上述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒中,所述包被抗体HCV-cAg一抗或酶标记抗体HCV-cAg二抗均为单克隆抗体。其中,所述2株包被抗体HCV-cAg一抗为Mab1和Mab2,其中Mab1包含HCV核心区20~35氨基酸位置,Mab2包含HCV核心区35~50氨基酸位置;所述酶标记抗体HCV-cAg二抗为Mab3和Mab4,其中Mab3包含HCV核心区100~115氨基酸位置,Mab4包含HCV核心区115~130氨基酸位置。
上述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,优选由1块96孔过滤板、2瓶标准品、1瓶样品稀释液、1瓶微球悬浮液、1瓶酶结合物、1瓶底物A、1瓶底物B、1瓶20×洗涤液、5片不干胶封片和1份使用说明书构成。
上述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒的应用,步骤是:
(1)标准品的稀释:每瓶标准品临用前以样品稀释液稀释至1ml,浓度为50ng/ml,静置10min后,反复颠倒混匀,再做系列稀释,分别为:50ng/ml、12.5ng/ml、3.12ng/ml、0.78ng/ml、0.05ng/ml、0.013ng/ml,样品稀释液作为0ng/ml;
(2)加样:微球使用前中速振荡混匀,每孔加入10μl微球悬浮液,其中含50000±400个表面已偶联有2株HCV-cAg一抗的聚苯乙烯微球,用100μl洗涤液真空抽滤洗涤2~3次后,每孔分别加标准品或待检测样本50μl,另设一空为空白,混匀,37℃振荡30min;
(3)洗板:使用真空泵抽滤,洗涤液洗涤3~4次;
(4)加酶结合物:加入50μl酶结合物,混匀,37℃振荡30min;
(5)洗板:同(3)洗涤3~4次;
(6)加底物:每孔先后加入底物液A、底物液B各50μl,避光显色10min;
(7)测定:避光显色10min后在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU);
(8)标准曲线的制作:以标准品的浓度为横坐标,样品的相对发光度RLU值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的相对发光度(RLU)由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的相对发光度(RLU)代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
本发明所述的聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度试剂盒的应用原理是:将抗2株HCV-cAg一抗交联在聚苯乙烯微球上,在液相环境中与被测样本反应以后,再与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记的2株HCV-cAg二抗反应,形 成双抗体夹心复合物,然后再同发光底物反用,通过化学发光检测仪检测其相对发光强度(RLU),根据标准曲线确定被检测样本中HCV-cAg的浓度,即测知丙型肝炎病毒感染者血清中的HCV-cAg浓度。
与现有技术相比,本发明具有以下突出优点:
(1)耗时短:本发明的固相载体是直径只有几微米的聚苯乙烯微球,其比表面积大,表面偶联容量大;抗原抗体的反应发生在液相环境中,克服了传统ELISA模式在检测时存在的表面张力和空间障碍对抗原抗体反应动力学的影响,而且液相环境更有利于保持抗原抗体的天然构像和活性,更有利于二者充分反应,从而有效的缩短了反应时间,减少了洗涤次数;
(2)灵敏度高:本发明的最低检出限为4.3pg/ml,优于目前国内市场上的HCV-cAgELISA试剂盒(其灵敏度一般为50pg/ml);
(3)检测线性范围宽:标准曲线的线性范围在0.013ng/ml~50ng/ml,可以达到3~5个数量级,而一般的ELISA试剂盒检测范围仅有1~2个数量级,比常规的ELISA方法高10倍以上;
(4)成本低:本发明所用的检测试剂、消耗品价格不高,此外可以利用临床现有的化学发光检测仪的资源,无需再增加新的设备,有利于其普及与推广。
具体实施方式
实施例1
步骤一微球悬浮液的制备
(1)微球的活化:将聚苯乙烯微球分散均匀后,取5.0×106微球加入100μl洗涤缓冲液(PBS,0.05%Tween),高速振荡15s,清洗后用80μl活化缓冲液悬浮微球,加入10μl碳二亚胺(EDC,50mg/ml),再迅速加入10μL Sulfo-NHS(50mg/ml),高速振荡30s,室温避光振摇20min,然后用500μl 0.01M pH7.4PBS洗涤2次,每次12000r/min离心3min,弃上清,最后用100μL 0.01M pH7.4 PBS悬浮微球。
(2)微球的交联:取抗-HCV-cAg单克隆抗体100μg加入到活化后的微球中,用0.01M pH7.4 PBS定容至500μl,锡箔纸包裹,室温避光振摇4h,15000r/min离心5min,弃上清,再用500μl PBS洗1次,15000r/min离心5min,弃上清。用1ml封闭液(PBS,1%BSA,0.1% Proclin 300)悬浮微球,中速振荡15s,室温避光振摇45min,15000r/min离心5min,弃上清;加入1.5ml微球储存液(0.01M pH7.4 PBS,0.1%BSA,0.03%Tween,0.1% Proclin 300),洗涤微球2次,每次15000r/min离心7min,弃上清,最后用1ml微球储存液悬浮包被上了HCV-cAg单抗的微球,计数后4℃避光保存。
步骤二标准品的制备
标准品为50ng/ml的HCV-cAg重组抗原冻干粉。使用前用样品稀释液溶解并稀释至设定浓度。
步骤三样品稀释液、底物A、底物B、洗涤液的配制
(1)样品稀释液:
小牛血清 100ml
Proclin 300 1ml
Triton X-100 5ml
0.01M pH7.4 PBS定容至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
(2)底物A:
鲁米诺 0.53g
对碘苯酚 0.22g
0.01M pH7.4 PBS定容至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
(3)底物B:
过氧化脲 0.282g
0.01M pH7.4PBS定容至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
(4)20×洗涤液
纯化水定容至1000ml,并调pH至7.4,过滤除菌,4℃保存。
实施例2
1.聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒
试剂盒由1块96孔过滤板、2瓶标准品、1瓶样品稀释液、1瓶微球悬浮液、1瓶酶结合物、1瓶底物A、1瓶底物B、1瓶20×洗涤液、5片不干胶封片和1份使用说明书构成。
2.聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒的应用
(1)标准品的稀释:每瓶标准品临用前以样品稀释液稀释至1ml,浓度为50ng/ml,静置10min后,反复颠倒混匀,再做系列稀释,分别为:50ng/ml、12.5ng/ml、3.12ng/ml、0.78ng/ml、0.05ng/ml、0.013ng/ml,样品稀释液作为0ng/ml。
(2)加样:微球使用前中速振荡混匀,每孔加入10μl约含50000个包被HCV-cAg单抗的微球,用100μl洗涤液真空抽滤洗涤2~3次后,每孔分别加标准品或待检测样本50μl,另设一孔为空白,混匀,37℃振荡30min。
(3)洗板:使用真空泵抽滤,洗涤液洗涤3~4次。
(4)加酶结合物:加50μl酶结合物,混匀,37℃振荡30min。
(5)洗板:同(3)洗涤3~4次。
(6)加底物:每孔先后加入底物液A、底物液B各50μl,避光显色10min。
(7)测定:避光显色10min后在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)。
(8)标准曲线的制作:以标准品的浓度为横坐标,RLU值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的RLU由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的RLU代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
实施例3
对聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的检测试剂盒的评价:
(1)线性范围:用样品稀释液将HCV-cAg抗原以2倍梯度稀释以下系列浓度: 50ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml、0.39ng/ml、0.10ng/ml、0.025ng/ml、0.013ng/ml、0.007ng/ml、0ng/ml进行检测,每个浓度样本重复检测3次,以样本浓度为横坐标,相对发光强度为纵坐标作图,经过统计学分析,线性范围在0.013ng/ml~50ng/ml。
(2)最低检出限:将去除HCV-cAg的零值血清分成20份进行检测,测定其浓度,计算平均值及标准差,计算平均值与标准差的2倍之和,在标准曲线上查出本发明的最低检测线为4.3pg/ml。
(3)精密度:
a:每10μl微球的精密度评价:微球储存液中速振荡混匀后,使用微量移液器连续20次吸取微球,每次10μl,计数,计算其平均值和方差,计算精密度CV为0.89%,即若每次混匀后,准确取样,则每10μl储存液中微球数为49939±445个。
b:本发明试剂盒精密度评价:测定HCV-cAg抗原浓度为1.56ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml的质控血清,重复检测3次,每次重复10孔,进行批内精密度测定。结果见表1。
3份样本每日测定1次,连续测定20天,进行批间精密度测定。结果见表2.
表1批内精密度测定结果
表2批间精密度测定结果
(4)回收率:取3份临床样本分别加入HCV-cAg 1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml浓度的血清样本测定样品的回收率,回收率计算公式为:回收率(%)=(回收样本血清浓度(ng/ml)-基础样本浓度(ng/ml))/加入的样本血清浓度(ng/ml)×100%。
结果显示回收率分别为103.1%、96.9%、98.7%,平均回收率为99.6%。
(5)特异性:取10份阴性质控血清检测无假阳性。
Claims (5)
1.一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,由96孔过滤板、标准品、样品稀释液、微球悬浮液、酶结合物、底物A、底物B、20×洗涤液组成,其特征在于:所述96孔过滤板是底部有渗透性的滤膜并能通过抽真空进行洗涤的一种微孔板;所述标准品为浓度为50ng/ml的HCV-cAg蛋白冻干粉;所述样品稀释液为每升含10%小牛血清、0.1% Proclin 300、0.5% TritonX-100的0.01M pH7.4 PBS;所述微球悬浮液为使用每升含0.1%BSA、0.03%Tween、0.1% Proclin 300的0.01M pH7.4PBS悬浮5.0×106个表面已偶联有2株HCV-cAg一抗的聚苯乙烯微球溶液;所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的2株HCV-cAg二抗;所述底物A为3mmol/L鲁米诺与1mmol/L对碘苯酚的混合液;所述底物液B为3mmol/L的双氧化脲溶液;所述20×洗涤液为每升含160g氯化钠、72.64g十二水合磷酸氢二钠、4g磷酸二氢钾、氯4.8g化钾、10ml Tween 20的水溶液。
2.如权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,其特征在于:所述包被抗体HCV-cAg一抗或酶标记抗体HCV-cAg二抗均为单克隆抗体。
3.如权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,其特征在于:所述2株包被抗体HCV-cAg一抗为Mab1和Mab2,其中Mab1包含HCV核心区20~35氨基酸位置,Mab2包含HCV核心区35~50氨基酸位置;所述酶标记抗体HCV-cAg二抗为Mab3和Mab4,其中Mab3包含HCV核心区100~115氨基酸位置,Mab4包含HCV核心区115~130氨基酸位置。
4.如权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由1块96孔过滤板、2瓶标准品、1瓶样品稀释液、1瓶微球悬浮液、1瓶酶结合物、1瓶底物A、1瓶底物B、1瓶20×洗涤液、5片不干胶封片和1份使用说明书构成。
5.权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中HCV-cAg浓度的试剂盒的应用,步骤是:
(1)标准品的稀释:每瓶标准品临用前以样品稀释液稀释至1ml,浓度为50ng/ml,静置10min后,反复颠倒混匀,再做系列稀释,分别为:50ng/ml、12.5ng/ml、3.12ng/ml、0.78ng/ml、0.05ng/ml、0.013ng/ml,样品稀释液作为0ng/ml;
(2)加样:微球使用前中速振荡混匀,每孔加入10μl微球悬浮液,其中含50000±400个表面已偶联有2株HCV-cAg一抗的聚苯乙烯微球,用100μl洗涤液真空抽滤洗涤2~3次后,每孔分别加标准品或待检测样本50μl,另设一空为空白,混匀,37℃振荡30min;
(3)洗板:使用真空泵抽滤,洗涤液洗涤3~4次;
(4)加酶结合物:加入50μl酶结合物,混匀,37℃振荡30min;
(5)洗板:同(3)洗涤3~4次;
(6)加底物:每孔先后加入底物液A、底物液B各50μl,避光显色10min;
(7)测定:避光显色10min后在化学发光仪上读出各孔相对发光度;
(8)标准曲线的制作:以标准品的浓度为横坐标,样品的相对发光度RLU值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的相对发光度由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的相对发光度代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
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