CN115028716A

CN115028716A - 一种单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN115028716A
Application number: CN202210658322.XA
Authority: CN
Inventors: 付春辉; 韩华贤
Original assignee: Qingdao Henderson Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Henderson Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN115028716B

Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体包含的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9、10、11所示。本发明同时公开了编码所述单克隆抗体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体和宿主细胞。本发明的单克隆抗体特异性强，灵敏度高，且具有较高的亲和活性。

Description

一种单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单克隆抗体及其应用。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是一类介于病毒与细菌之间的无细胞壁的原核微生物，也是迄今为止能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核微生物。MP主要通过呼吸道传播，已成为儿童呼吸道感染最常见的病原体之一。肺炎支原体病毒引发的呼吸道感染并不是这种疾病的主要致病机制，主要在于它对宿主的肺部呼吸道口腔黏膜及肺上皮细胞组织进行了早期黏附及定向移植。肺炎感染的传播过程一般来说是由肺炎支原体的一种特殊细胞顶端附着结构所直接活动介导，称为附着细胞器(Adherent organelle，AO)。

目前血清学是诊断肺炎支原体感染最常用的方法。正常人体感染MP后，机体会产生对抗肺炎支原体表面黏附蛋白与糖脂的抗体。在发病初期体内IgM与IgG明显升高，随着时间的推移，又会逐渐的下降，当机体发生再次感染时，体内的IgM会疲于免疫应答。由于其变化不规律，无法作为血清学诊断的依据。探寻抗肺炎支原体的抗体逐渐被人们所重视。

因此制备一种特异性强、亲和力高的肺炎支原体单克隆抗体，对于肺炎支原体的快速检测是十分必要的。

发明内容

为弥补现有技术中存在的问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的单克隆抗体，可在感染初期进行检测，方便快捷，准确性高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含三个CDR的重链可变区和三个CDR的轻链可变区，其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，所述轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9、10、11所示。

进一步，所述重链可变区还包含四个FR的重链可变区框架区，轻链可变区还包含四个FR的轻链可变区框架区，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、5、6、7，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.12、13、14、15所示。

进一步，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。

进一步，所述单克隆抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

本发明的第二方面提供了一种包含编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子。

本发明的第三方面提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸分子的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体包括与单克隆抗体重链可操作地连接的第一信号肽或与单克隆抗体可操作地连接的第二信号肽。

本发明的第四方面提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的重组表达载体的宿主细胞。

本发明的第五方面提供了一种包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体或本发明第四方面所述的宿主细胞的产品。

本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的产品在抑制肺炎支原体感染或制备治疗肺炎支原体相关疾病的药物中的应用。

进一步，所述肺炎支原体相关疾病包含肺炎、支气管炎、感冒或咽炎。

进一步，所述肺炎支原体相关疾病是肺炎。

本发明的第七方面提供了一种通过使样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触，从而检测样品中的肺炎支原体的方法。

本发明的第八方面提供了本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的产品在检测肺炎支原体或制备诊断肺炎支原体相关疾病的产品中的应用。

进一步，所述肺炎支原体相关疾病是肺炎。

本发明的第九方面提供了一种胶体金产品，所述胶体金产品包含分析膜，分析膜上设有检测线T线，检测线T线包被本发明第一方面所述的单克隆抗体。

进一步，所述胶体金产品包含金标垫。

进一步，所述金标垫附着肺炎支原体抗体。

进一步，所述金标垫为硝酸纤维素膜。

进一步，所述胶体金产品还包括样品垫、吸水纸和底板。

进一步，所述分析膜上设有质控线C。

进一步，所述质控线C包被羊抗鼠抗体。

进一步，所述质控线C的包被浓度为1.0mg/ml。

进一步，所述质控线C的包被液为PBS。

进一步，所述检测线T的包被浓度为1.5mg/ml。

进一步，所述检测线T的包被液为PBS。

本发明的优点和有益效果：本发明提供的单克隆抗体抗体亲和活性高，抗原直接检测，快捷有效且准确率高，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是抗体亲和活性检测图。

具体实施方式

本发明提供了一种单克隆抗体，在本发明中，术语“抗体”意图包括但不限于任何特定的结合成员，免疫球蛋白类和/或同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)；及其生物学相关片段或特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv、和scFv(单链或相关实体)。除非另有说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。

术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均一的抗体获得的抗体，即，除了可能以较少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原性位点。此外，多克隆抗体制剂包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，与所述多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，因为单克隆抗体可以不被其它抗体污染地合成，所以单克隆抗体是有利的。修饰词“单克隆”表示该抗体的特征是从基本上均一的抗体群体获得，并且不被解释为抗体的生产需要通过任何特定的方法。该单克隆抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链包含恒定区和可变区(区域也称为“域”)。轻链和重链可变区包含四个框架区，被三个超变区打断，也称为“互补决定区”(CDR)。CDR主要负责结合到抗原的表位。各链的CDR通常为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始连续编号，通常也用特定CDR所处的链标识。

术语“可变区”(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))表示直接涉及抗体与抗原结合的轻链和重链对中的每一个。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构，且每个结构域包括四个构架(FR)区，其序列普遍是保守的，其通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)相连。所述构架区采用β-折叠构象，且CDR可以形成连接所述β-折叠结构的环。每个链中的CDR通过构架区保持其三维结构，且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。

本发明所述的单克隆抗体还包括该抗体的功能性变异体，所述功能性变异体可结合至肺炎支原体，且具有抗所述亚型或片段的中和活性。

具体地，功能性变异体包括但不限于：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化。

可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至肺炎支原体。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对肺炎支原体可具有升高或降低的结合亲和力。

优选的，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个CDR)和更保守的区域(所谓的构架区域(FR))。高可变区域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定点诱变和定点诱变)改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。

本领域技术人员还将理解的是，本发明涵盖所述抗肺炎支原体抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。抗肺炎支原体抗体之氨基酸序列变体是由向抗肺炎支原体抗体核酸中引入适当核苷酸变化或由肽合成制备。该等修饰包括(例如)抗肺炎支原体抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变抗肺炎支原体抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。

在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含与本发明列出的那种(或那些)CDR序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持以类似于或甚至高于其亲本抗体的水平与肺炎支原体特异性结合的1、2或3个CDR序列。

在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含与本发明中列出的那种(或那些)可变区序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持在类似于或甚至高于其亲本抗体对于肺炎支原体的特异性结合亲和力的水平的一或多个可变区序列。在一些实施例中，突变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。

本发明提供了一种包含编码上述单克隆抗体的核苷酸序列的核酸分子。

术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合形式，可包括RNA、cDNA、gDNA的有义链和反义链两者，以及上述各项的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核碱基可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或这两种类型核苷酸中任一者的修饰形式。按照惯例，核酸分子的核苷酸序列从该分子的5’端向3’端阅读。

术语“核酸分子”包括所有的多核苷酸，例如：单链和双链形式的DNA；单链形式的RNA；和双链形式的RNA(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义链和反义链两者。

核酸分子可以存在于完整的细胞中、存在于细胞溶胞物中、或者以部分纯化或基本纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术纯化除去其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“使得基本纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，而且可以含有或不含内含子序列。在一优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。

核酸分子可包括天然存在的核苷酸和/或经修饰的核苷酸，它们通过天然存在的核苷酸连接和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。如本领域技术人员易于理解的那样，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物置换天然存在的核苷酸中的一者或多者、核苷酸间修饰(例如不带电连接：例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如肽类；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；以及经修饰的连接：例如α异头核酸)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的、圆形的和挂锁形的(padlocked)构象。

本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。

此外，可以对本发明所涵盖的核酸分子和多肽进行修饰。例如，可以进行不会影响核酸所编码的多肽的核苷酸替代，因此编码超免疫血清反应性抗原或其片段的任何核酸分子都包含在本发明范围内。

本发明的核酸分子可以是通过克隆获得或通过化学合成技术产生或二者联合方法获得的RNA形式诸如mRNA或cRNA或DNA形式，其包括例如cDNA和基因组DNA。所述DNA可以是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为有义链，或者可以是非编码链，也称为反义链。

本发明还涉及本发明上述核酸分子的变体。核酸分子变体可以是天然存在的变体，诸如天然存在的等位基因变体，或者其可以是非天然存在的变体。通过诱变技术，包括应用于核酸分子、细胞或生物体的那些诱变技术，可以制备核酸分子的这些非天然存在变体。

在这方面的变体中，变体是通过核苷酸替代、缺失或添加而不同于上述核酸分子的变体。所述替代、缺失或添加可涉及一个或多个核苷酸。所述变体可以在编码区内或非编码区内或二者内都有所改变。在编码区中的改变可以产生保守或非保守性氨基酸替代、缺失或添加。

本发明提供了一种包含上述核酸分子的重组表达载体。如本文所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒和人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒(例如SV40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。术语“复制起点”是指当在载体中存在时其起始复制的序列。复制起点可被复制起始因子或替代地被DNA解螺旋酶识别。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。

载体可以是重组表达载体或克隆载体。本公开提供了载体(例如表达载体)，其含有编码抗肺炎支原体中和抗体的本文提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18 T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD Hyg GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF 1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF Bos。

“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且此外含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、所关注基因和转录终止子。

在某些实施方案中，重组表达载体是基于病毒的载体。在某些实施方案中，重组表达载体是慢病毒载体。在某些实施方案中，重组表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。

在某些实施方案中，编码本文提供的抗肺炎支原体中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列进行了密码子优化。术语“密码子优化”是指通过，用在所关注的脊椎动物(例如人)的基因中较频繁或最频繁使用的密码子置换至少一个、超过一个或大量天然序列的密码子，来改变核酸序列以增强在所述脊椎动物细胞中的表达，但核酸序列的改变不改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。各种物种对特定氨基酸的某些密码子呈现出特定的偏好。

在某些实施方案中，编码抗肺炎支原体中和抗体的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施方案中，编码抗肺炎支原体中和抗体的重链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施方案中，编码抗肺炎支原体中和抗体的轻链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施方案中，编码抗肺炎支原体中和抗体的重链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施方案中，编码抗肺炎支原体中和抗体的轻链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。

本发明提供了一种包含上述核酸分子或重组表达载体的宿主细胞。

术语“宿主细胞”是指来自任何生物体的细胞。优选的宿主细胞来源于植物、细菌、酵母菌、真菌、昆虫或其它动物。应理解，术语“宿主细胞”旨在不仅指特定的受试者细胞，而且指这一细胞的子代。因为由于突变或环境影响在后代中可能出现某些修饰，所以这类子代实际上可能与母细胞不同，但仍包括在本发明使用的术语“宿主细胞”的范围内。

在本发明的实施方案中，可将包含编码抗体的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。用于此目的的适合原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性(Gramnegative)或革兰氏阳性(Gram positive)生物体，例如肠内菌科(Enterobac teriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。

本发明提供了一种包含上述单克隆抗体核酸分子、重组表达载体或宿主细胞的产品。

在本发明的一些实施方案中，所述产品还包括但不限于药学上可接受的载体或药物组合物。

在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇；致湿剂如甘油、淀粉；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖。

本发明中的药物组合物包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

其中，稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

在本发明的一些实施方案中，所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒包括：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)或荧光免疫试剂盒。

作为一种可选择的实施方案，所述产品为芯片，所述芯片包括蛋白质芯片；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的上述单克隆抗体或其片段。

在本发明的一些实施方案中，本发明中的产品包括本发明所制备的抗体或其功能片段。在本发明的实施方案中，本发明的产品包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分试剂。标签可非共价地缀合至本发明的单克隆抗体。标签还可通过共价键直接缀合至单克隆抗体。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述单克隆抗体。用于将标签缀合至单克隆抗体的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由(但并不限于)酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括但不限于FITC，5-羧基荧光素，6-羧基荧光素；罗丹明类型的标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物。荧光标记可以使用本文公开的技术与靶分子中包含的醛基缀合。合适的发光物质包括鲁米诺，吖啶化合物，腔肠素和类似物，二氧杂环丁烷，基于过氧草酸的系统及其衍生物；合适的生物发光物质包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。

在本发明中，用于检测或测定肺炎支原体的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法。

在本发明的一些实施方案中，酶免疫测定法包括但不限于双抗夹心法、间接法ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA、抗体捕捉ELISA、斑点ELISA、布ELISA。

在本发明的具体实施方案中，用于检测的方法是双抗夹心法。

本发明还提供了上述单克隆抗体、核酸分子、重组表达载体、宿主细胞或产品在抑制肺炎支原体感染或制备治疗肺炎支原体相关疾病的药物中的应用。

术语“治疗”或“处理”或“减轻”可互换使用，并且指治疗性处理和防范性或预防性措施两者；其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理状况或病症。需要治疗的对象包括那些已经具有病症的对象以及那些易于具有病症的对象或那些要预防病症的对象。若在接受治疗量的依照本发明方法的抗体后，患者显示下列一项或多项的可观察到的和/或可测量的降低或缺乏，则受试者或哺乳动物是成功“治疗”疾病的。

本发明的实施方案中使用的术语“肺炎支原体相关疾病”是指由肺炎支原体感染而导致的疾病。肺炎支原体相关疾病的实例包括但不限于支原体肺炎、支气管炎、感冒、咽炎、哮喘、神经疾病以及泌尿生殖系统的感染，比如尿道炎或盆腔炎；严重的支原体感染，甚至会出现全身性的症状，比如败血症、关节疼痛或免疫综合症。

在本发明的一些实施方案中，所述肺炎支原体相关疾病包括肺炎、支气管炎、感冒或咽炎。

在本发明的具体实施方案中，所述肺炎支原体相关疾病是肺炎。

本发明还提供了一种通过使样品与上述单克隆抗体接触，从而检测样品中的肺炎支原体的方法。

检测方法通常涉及从患者获得生物样品(例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检)，以及分离肺炎支原体抗体或其片段或编码肺炎支原体抗体的核酸，以及测定生物样品中肺炎支原体抗体的存在。

在本发明中，术语“样品”或“测试样品”在本发明可互换使用，所述样品是体外样品，其将在体外进行分析，且不转移回体内。样品的实例包括但不限于流体样品，例如血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液和淋巴液，或固体样品，例如组织提取物、软骨、骨、滑膜和结缔组织。

本发明还提供了上述单克隆抗体、核酸分子、重组表达载体、宿主细胞或产品在检测肺炎支原体或制备诊断肺炎支原体相关疾病的产品中的应用。

本发明还提供了一种胶体金产品，所述胶体金产品包含分析膜，分析膜上设有检测线T线，检测线T线包被上述单克隆抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述胶体金产品包括样品垫、金标垫、分析膜、吸水纸和底板，底板上附吸水纸，吸水纸压分析膜2mm，附金标垫和样品垫，金标垫压分析膜2mm；分析膜上设有检测线T线和质控线C线，检测线T线包被上述单克隆抗体。

在本发明的实施方案中，所述胶体金产品是指以胶体金为显色媒介，利用抗原抗体结合特异性结合原理而制成的一类产品。在本发明的一些实施方案中，所述胶体金产品包括但不限于胶体金试纸条、胶体金检测卡；在本发明的具体实施方案中，所述胶体金产品是胶体金试纸条。

在本发明的一些实施方案中，所述肺炎支原体抗体是任何可以结合肺炎支原体的抗体。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1单克隆抗体的制备

1.1小鼠的免疫

表1小鼠免疫方法

1.2尾血效价检测及结果

1、抗原包被：抗原稀释至0.1μg/ml，100μl/孔，25℃，2h。

2、封闭：1％BSA封闭液，200μl/孔，25℃，1h。

3、一抗：收集小鼠尾血，高速离心得上清液，上清液从1000×开始做2倍梯度稀释，100μl/孔，25℃，30min。

4、二抗：二抗稀释浓度为10000×，100μl，25℃，30min。

5、显色液：100μl，25℃，20min。

6、终止液：50μl，酶标仪下双波长进行读数。

表2尾血效价检测结果

1.3小鼠细胞融合

1、用极速猝死法杀死小鼠，于75％酒精中完全浸泡3min。

2、超净台中剪取小鼠脾脏及腿部淋巴结细胞。

3、超净台中充分研磨脾脏及淋巴结，使细胞充分释放。

4、静置收集上清，尽量去除大的杂质，1000r/min，离心3min，去上清液，收集淋巴细胞。

5、加入5ml红细胞裂解液，轻轻捶打细胞5次，使细胞均匀悬浮，去掉细胞中的红细胞。加入等体积的DMEM培养基，1000r/min，离心3min，去上清，收集淋巴细胞，再用DMEM洗3遍，离心收集细胞。

6、取骨髓瘤细胞，使骨髓瘤细胞与淋巴细胞的比例在1：5，充分混匀，用DMEM洗3遍离心收集细胞。

7、融合：加PEG 1ml，1min加完，然后补加9ml DMEM培养基，5min加完。

8、离心收集杂交瘤细胞，补加HAT培养基，滴加到提前做好的饲养细胞中。1.4细胞融合母克隆及筛选结果

1、抗原包被：抗原稀释至0.1μg/ml，100μl/孔，25℃，2h。

2、封闭：1％BSA封闭液，200μl/孔，25℃，1h。

3、一抗：上清液，50μl/孔，25℃，30min。

4、二抗：二抗稀释浓度为10000×，100μl，25℃，30min。

5、显色液：100μl，25℃，20min。

6、终止液：50μl，酶标仪下双波长进行读数。

表3母克隆筛选结果

1.5亚克隆的检测

1、选择母克隆C6进行培养获得上清液。

2、抗原包被：抗原稀释至0.1μg/ml，100μl/孔，25℃，2h。

3、封闭：1％BSA封闭液，200μl/孔，25℃，1h。

4、一抗：细胞培养的上清液，50μl/孔，25℃，30min。

5、二抗：二抗稀释浓度为10000×，100μl，25℃，30min。

6、显色液：100μl，25℃，20min。

7、终止液：50μl，酶标仪双波长下进行读数。

表4亚克隆检测结果

1.6抗体的纯化

1、将腹水用滤纸、玻璃纤维与无纺布各两层进行过滤，测OD。

2、过滤后腹水用A液(20mMPB+0.3MNaCl PH＝7.5)1:1稀释。

3、稀释后样品混匀上样，上样速度为1ml/min，收集流出液，重复3遍。

4、上样后用A液平衡完全，平衡速度1ml/min。

5、A液平衡后，用B液(0.1M甘氨酸PH＝3)洗脱并接样，洗脱速度2ml/min。

6、接样过程中，用Tris(PH＝7.5)调PH到7.2。

7、然后过G50换液到10mMPBS，PH＝7.2缓冲液中(PBS：10mMPB+150mMNaCl)。

8、B液洗脱并平衡完全后，用A液平衡完全。

9、将样品分别跑电泳、测活性。

1.7抗体检测结果

1、抗原包被：抗原稀释至0.1μg/ml，100μl/孔，25℃，2h。

2、封闭：1％BSA封闭液，200μl/孔，25℃，1h。

3、一抗：稀释抗体至相应浓度，100μl/孔，25℃，30min。

4、二抗：二抗稀释浓度为10000×，100μl，25℃，30min。

5、显色液：100μl，25℃，20min。

6、终止液：50μl，酶标仪双波长下进行读数。

表5抗体纯化结果

1.8单克隆抗体序列

经测序，筛选的单克隆抗体序列如表6所示。

表6单克隆抗体的序列

实施例2抗体亲和活性检测及结果

1、包被：C线包被羊抗鼠，浓度为1.0mg/ml，包被液为0.01MPBS pH7.2。T线包被上述单克隆抗体，浓度为1.5mg/ml，包被液为0.01MPBS pH7.2。37℃烘干过夜。

2、金标垫制备：将肺炎支原体抗体用水稀释成1mg/ml，取10ml胶体金，加入1％碳酸钾180μl，混合均匀，加入肺炎支原体抗体100μl，混合均匀，室温反应10min，加入10％BSA10μl，室温反应5min，10000r/min离心5min，去上清，沉淀用重悬液(0.01M PBS+1％BSA+2％蔗糖)150μl重悬，紫外分光光度计532nm下测试吸光值，用重悬液将浓缩金标抗体稀释至10d/ml，取600μl均匀涂于0.5*30cm规格的玻璃纤维上，37℃烘干过夜。干燥保存备用。

3、组装：附吸水纸，吸水纸压NC膜2mm；附金标垫和样品垫，金标垫压NC膜2mm，装卡壳，备用。

4、测试：将质控品分别用稀释液稀释100×，1000×，10000×和100000×，稀释液作为阴性对照，加样量65μl。

5、测试结果：图1由左至右分别为阴性对照、稀释100×、10³×、10⁴×、10⁵×、106×、空白对照，从图1可以看到，抗体稀释至10⁴×时，该试纸条依然能检出抗体的亲和活性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 青岛汉德森生物科技有限公司

<120> 一种单克隆抗体及其应用

<141> 2022-06-10

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Glu Gly Tyr Gly Thr Trp Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Val Asp Asn Ser Ser Ala

20 25 30

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Val Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Asn

1 5 10 15

Asn Leu His Lys Gln Ser His Gly Glu Arg Leu Glu Trp Ile Gly

20 25 30

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Lys Ala Thr Leu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Val Asp Asn Ser Ser Ala Thr

20 25 30

Ala Tyr Met Glu Leu Arg Trp Val Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly

35 40 45

Asn Thr Phe Thr Asp Asn Asn Leu His Lys Gln Ser His Gly Glu Arg

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Tyr

65 70 75 80

Ser Gln Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Glu Gly Tyr Gly Thr Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

His Asp Ala Ser Asn Leu Glu

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu Leu Met

1 5 10

<210> 14

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr

20 25 30

Cys

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu Leu Met

35 40 45

His Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含三个CDR的重链可变区和三个CDR的轻链可变区，其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，所述轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9、10、11所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区还包含四个FR的重链可变区框架区，轻链可变区还包含四个FR的轻链可变区框架区，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、5、6、7，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.12、13、14、15所示；

优选的，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；

优选的，所述单克隆抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

3.一种包含编码权利要求1或2所述的单克隆抗体或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子。

4.一种包含权利要求3所述的核酸分子的重组表达载体；

优选的，所述重组表达载体包含与单克隆抗体重链可操作地连接的第一信号肽或与单克隆抗体可操作地连接的第二信号肽。

5.一种包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组表达载体的宿主细胞。

6.一种包含权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞的产品。

7.权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5所述的宿主细胞或权利要求6所述的产品在抑制肺炎支原体感染或制备治疗肺炎支原体相关疾病的药物中的应用；

优选的，所述肺炎支原体相关疾病包含肺炎、支气管炎、感冒或咽炎；

优选的，所述肺炎支原体相关疾病是肺炎。

8.一种通过使样品与权利要求1或2所述的单克隆抗体接触，从而检测样品中的肺炎支原体的方法。

9.权利要求和1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5所述的宿主细胞或权利要求6所述的产品在检测肺炎支原体或制备诊断肺炎支原体相关疾病的产品中的应用；

优选的，所述肺炎支原体相关疾病是肺炎。

10.一种胶体金产品，其特征在于，所述胶体金产品包含分析膜，分析膜上设有检测线T线，检测线T线包被权利要求1或2所述的单克隆抗体；

优选的，所述胶体金产品包含金标垫；

优选的，所述金标垫附着肺炎支原体抗体；

优选的，所述金标垫为硝酸纤维素膜；

优选的，所述胶体金产品还括样品垫、吸水纸和底板；

优选的，所述分析膜上设有质控线C；

优选的，所述质控线C包被羊抗鼠抗体；

优选的，所述质控线C的包被浓度为1.0mg/ml；

优选的，所述质控线C的包被液为PBS；

优选的，所述检测线T的包被浓度为1.5mg/ml；

优选的，所述检测线T的包被液为PBS。