CN113759109A - 双抗原夹心法检测抗ss-b抗体化学发光免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双抗原夹心法检测抗SS‑B抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括anti‑SS‑B抗体质控品、化学发光底物液，其特征在于：还包括SS‑B抗原包被磁珠，以及SS‑B抗原标记的化学发光标记物。本发明使用双抗原夹心法，避免了反应过程中的非特异性反应，两步反应均为特异性反应，规避不必要的非特异性反应，有效解决夹心法存在的反应平台，灵敏度能高于间接法。并且通过增加样本加样量，不需要进行样本稀释，保证CV更好。
Description
技术领域
本发明涉及一种双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，属于医学免疫领域。
背景技术
化学发光试剂目前针对自免项目主要的检测方法学为间接法(磁珠偶联抗原，化学发光标记物偶联抗人IgG)。
间接法优点在于具有普遍性，对于检测抗体的自免项目来说，仅需一个特定的抗原与磁珠进行偶联，而化学发光标记物偶联二抗即可。
间接法缺点是样本需要进行稀释后检测，并且化学发光标记物偶联的二抗，会出现非特异性反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，避免了反应过程中的非特异性反应。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括anti-SS-B抗体质控品、化学发光底物液，其特征在于：还包括第一SS-B抗原包被磁珠，以及第二SS-B抗原标记的化学发光标记物。
优选的，包被磁珠的第一SS-B抗原与包被化学发光标记物的第二SS-B抗原非同一抗原。
优选的，所述化学发光标记物为吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺或吖啶酯三氟甲基磺酰胺。
优选的，所述化学发光标记物为吖啶酯。
优选的，所述第一SS-B抗原包被磁珠的磁珠为羧基化、粒径在1um-3um的磁微粒。
优选的，所述anti-SS-B抗体校准品为用标准品缓冲液将anti-SS-B抗体分别配置成浓度为300AU/ml、150AU/ml、75AU/ml。
优选的，所述化学发光底物液包括化学发光预激发剂和化学发光激发剂。
优选的，所述第一SS-B抗原包被磁珠的制备方法为：取羧基化的磁珠悬浮液，磁分离去上清，MES缓冲液重悬，加入EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入第一SS-B抗原，室温下混悬，磁分离去除上清，用2％BSA溶液重悬，室温混悬后，磁分离去除上清，用含BSA的Tris缓冲液重悬，得到第一SS-B抗原包被的磁微粒。
优选的，所述第二SS-B抗原标记的化学发光标记物的制备方法为：取第二SS-B抗原，加入PBS缓冲液,混匀，并加入化学发光标记物，室温下避光反应，加入赖氨酸溶液，避光室温反应，用离心脱盐柱脱盐处理，最后收集离心管中液体至离心管中，并加入等体积甘油，得到第二SS-B抗原标记的化学发光标记物。
本发明使用双抗原夹心法，避免了反应过程中的非特异性反应，两步反应均为特异性反应，规避不必要的非特异性反应，有效解决夹心法存在的反应平台，灵敏度能高于间接法。并且通过增加样本加样量，不需要进行样本稀释，保证重复性更好。本发明能检测自免总抗体，而不限于IgG。在磁珠和化学发光标记物上采用不同的抗原，相对同一抗原能进一步提高夹心法的灵敏度。
附图说明
图1为条件二评价23份阳性样本测值与对照试剂的相关性对比图。
图2为条件五评价23份阳性样本测值与对照试剂的相关性对比图。
具体实施方式
实施例1:SS-B抗原包被磁珠制备
取1ug羧基化的磁微粒(粒径1um-3um)悬浮液，磁分离去上清，用200ul0.1MpH5.0-7.0MES缓冲液重悬，加入5-10ul新配制的10mg/ml的EDC水溶液，室温混悬30分钟，磁分离后加入200ul 0.1M pH5.0-7.0MES缓冲液重悬，加入2-10ugSS-B抗原1，室温混悬3-5h，磁分离去上清，用含2％BSA的溶液重悬至200ul，室温混悬2h,用含2％BSA的0.1MpH7.2-8.0Tris缓冲液重悬至200ul，得到SS-B抗原1包被的磁微粒，4℃保存。
实施例2样本稀释液的制备方法
缓冲系统为0.02M pH7.2Tris-Hcl,含有0.03％NaCl,和0.5％牛血清白蛋白。
实施例3SS-B抗原1与吖啶酯结合物的制备方法
取50ug SS-B抗原，加入250ul 0.1M pH7.0-8.0PBS,混匀，并加入1-10ul 5mM吖啶酯，避光室温混悬30min,加入100ul 1％赖氨酸溶液，避光室温混悬30min。用离心脱盐柱脱盐处理，最后收集离心管中液体至离心管中，并加入等体积甘油，得到800ul SS-B抗原标记的吖啶酯，-20℃避光保存。
实施例4、以全自动化学发光分析仪为检测工具，采用本发明的试剂盒检测样本，检测步骤如下：
步骤一：加入100ul样本稀释液至反应杯中。
步骤二:加入10ul校准品或质控品或待测样本。
步骤三：加入50ul 0.04-0.4mg/ml SS-B抗原1包被的磁微粒，混匀后37℃温育15分钟，进行磁分离去上清。
步骤四：加入300ul清洗液，混匀，进行磁分离后去上清。
步骤五：重复步骤四。
步骤六：加入100ul 0.0625ug/ml SS-B抗原1，标记的吖啶酯至反应杯中，混匀，37℃温育10分钟。
步骤七：重复步骤四4遍
步骤八：分别加入100ul预激发剂和激发剂，检测发光值。
实施例5分别对三个不同来源的SS-B抗原进行交叉验证。
条件一：抗原1包被磁珠，抗原1标记吖啶酯。
条件二：抗原1包被磁珠，抗原2标记吖啶酯。
条件三：抗原1包被磁珠，抗原3标记吖啶酯。
条件四：抗原2包被磁珠，抗原1标记吖啶酯。
条件五：抗原2包被磁珠，抗原2标记吖啶酯。
条件六：抗原2包被磁珠，抗原3标记吖啶酯。
条件七：抗原3包被磁珠，抗原1标记吖啶酯。
条件八：抗原3包被磁珠，抗原2标记吖啶酯。
条件九：抗原3包被磁珠，抗原3标记吖啶酯。
2、比较九种试剂的灵敏度
| 条件一 | 条件二 | 条件三 | 条件四 | 条件五 | 条件六 | 条件七 | 条件八 | 条件九 | |
| 试剂一原料 | 抗原1 | 抗原1 | 抗原1 | 抗原2 | 抗原2 | 抗原2 | 抗原3 | 抗原3 | 抗原3 |
| 试剂三原料 | 抗原1 | 抗原2 | 抗原3 | 抗原1 | 抗原2 | 抗原3 | 抗原1 | 抗原2 | 抗原3 |
| 校准品1 | 264532 | 329086 | 44512 | 289818 | 1037470 | 9867 | 17040 | 38385 | 14853 |
| 校准品2 | 127709 | 184301 | 20529 | 154978 | 516216 | 6851 | 21799 | 5453 | 16152 |
| 校准品3 | 63828 | 84269 | 14780 | 82589 | 205392 | 6854 | 18636 | 5247 | 14254 |
| 阴性校准品 | 1938 | 1428 | 9726 | 3961 | 5489 | 5614 | 3245 | 5163 | 7954 |
| 临床血1 | 8023 | 3860 | 7762 | 4981 | 4964 | 5314 | 7773 | 4708 | 9563 |
| 临床血2 | 3528 | 4152 | 9122 | 5397 | 6500 | 8462 | 4510 | 9605 | 8221 |
| 临床血3 | 5924 | 3153 | 8918 | 6714 | 3775 | 8633 | 13043 | 9729 | 7813 |
注：1、以上数值为发光值强度。
2、阴性校准品为新生牛血清溶液。
3、临床血样为普通人血清(直接加入人血清及人血清抗SS-B抗体阴性样本)。
4、通过对校准品发光值强度的比较，发现条件二和条件五的反应性最强，且对临床血的反应性又低。因此认为条件二和条件五灵敏度相对较高。
实施例6
比较条件二和条件五对阳性样本的灵敏度
对以上两个条件用23份从北京大学国际医院购买的抗SS-B抗体阳性且具有对照试剂浓度的样本进行比较相关性及特异性。结果如图1-2所示。
图1为条件二评价23份阳性样本测值与对照试剂的比较。
图2为条件五评价23份阳性样本测值与对照试剂的比较。
通过图1和图2，可以看出条件二样本浓度与对照试剂浓度相比，相关性在0.97，明显优于条件五。并且条件二评价阳性样本的浓度普遍高于条件五。因此选择条件二的搭配，更贴近对照试剂的水平。
三个抗原来源：抗原1和抗原2均为天然抗原，来源均为小牛胸腺。抗原1纯化方式为亲和层析法，抗原2纯化方式为SDS电泳纯化。抗原3为重组抗原，人源，序列为15-244、244aa。
Claims (9)
1.一种双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括anti-SS-B抗体质控品、化学发光底物液，其特征在于：还包括第一SS-B抗原包被磁珠，以及第二SS-B抗原标记的化学发光标记物。
2.根据权利要求1所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包被磁珠的第一SS-B抗原与包被化学发光标记物的第二SS-B抗原非同一抗原。
3.根据权利要求2所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光标记物为吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺或吖啶酯三氟甲基磺酰胺。
4.根据权利要求3所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光标记物为吖啶酯。
5.根据权利要求1或2所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述第一SS-B抗原包被磁珠的磁珠为羧基化、粒径在1um-3um的磁微粒。
6.根据权利要求1或2所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述anti-SS-B抗体质控品为用标准品缓冲液将anti-SS-B抗体分别配置成浓度为300AU/ml、150AU/ml、75AU/ml。
7.根据权利要求1或2所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光底物液包括化学发光预激发剂和化学发光激发剂。
8.根据权利要求5所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述第一SS-B抗原包被磁珠的制备方法为：取羧基化的磁珠悬浮液，磁分离去上清，MES缓冲液重悬，加入EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入第一SS-B抗原，室温下混悬，磁分离去除上清，用2％的BSA溶液重悬，室温混悬后，磁分离去除上清，再用含BSA的Tris缓冲液重悬，得到SS-B抗原包被的磁微粒。
9.根据权利要求8所述的双抗原夹心法检测抗SS-B抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述第二SS-B抗原标记的化学发光标记物的制备方法为：
取第二SS-B抗原，加入PBS缓冲液,混匀，并加入化学发光标记物，室温下避光反应,加入赖氨酸溶液，避光室温反应，用离心脱盐柱脱盐处理，最后收集离心管中液体至离心管中，并加入等体积甘油，得到第二SS-B抗原标记的化学发光标记物。
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