CN106053827A - 一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法。本试剂盒包括PVC底板、样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按水平方向依次固定于PVC底板上。所述荧光结合垫上有包被的Vinculin抗原‑纳米荧光微球复合物、鸡IgY‑纳米荧光微球复合物；所述的硝酸纤维素膜上有Vinculin抗原构成的检测线和兔抗鸡IgY抗体构成的质控线。本发明利用双抗原夹心反应原理结合纳米荧光微球来检测Vinculin抗体，诊断肠易激综合症，相比一般的临床症状积分诊断方法，结果更可靠科学，为肠易激综合症的诊断提供普查甚至初期预防提供了更明确的指标与方法，具有广阔的推广前景；且运用纳米荧光微球技术检测背景值低、检测时间短、特异性和灵敏度较高、检测结果可量化计算，可提供更科学的病情评价。

Description

一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备 方法

技术领域

本发明涉及一种肠易激综合症以Vinculin抗体为识别物的干式免疫荧光试剂盒及诊断方法，本发明属于医疗产品领域。

背景技术

肠易激综合症(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的慢性胃肠道疾病，以腹痛、腹部不适和排便习惯改变为主要特征，常持续存在或反复发作，经检查可以排除引起这些症状的器质性疾病，目前认为本病是一种功能性肠道疾病。在西方国家IBS发病率为10%-15%，而在中国由于地域，人种不同，各地发病率有所不同，北京地区的发病率为0.82%，广州地区则为5.6%。根据大便的性状将IBS分为便秘型IBS(IBS-C)，腹泻型IBS(IBS-D)和混合型(IBS-M)，各型之间可以相互转换，以IBS-C和IBS-M型之间转换为多见。

IBS的发病机制至今尚不明确，情绪因素、饮食、药物或激素均可引起胃肠道张力改变，促发或加重IBS。情绪焦虑、抑郁等精神因素和心理因素常引起IBS症状的发作和反复。近年来对IBS的发病机制作了进一步地探讨，改变了多年来把IBS一直当成单纯肠动力紊乱的看法，认识到本病具有内脏感觉异常，结肠对刺激的敏感性增高，从而产生腹痛以及腹泻等排便异常的特点，而感觉异常所引起的动力紊乱是受中枢神经调控的。因此，证明中枢神经的状态也能够影响IBS病人的症状。进而有研究表明，给予小剂量选择性5-羟色胺再摄取抑制剂作用于神经中枢，可以减轻IBS病人的症状，及Ringel，Drossman等用15O作PET脑扫描，发现直肠扩张后IBS病人脑血流的图谱与健康人不同；袁耀宗等用功能性磁共振影像学检查也观察到IBS病人与健康人之间存在着脑图的差异。这些都表明神经系统对肠功能具有影响。应激和肠道感染都是重要的发病诱因。Neal等报告对544例细菌性胃肠炎患者追随半年的观察，有25%的患者发生肠功能紊乱。在北京地区对IBS的流行病学调查中发现，痢疾史阳性导致发生本病的危险性上升2倍，其调查表明到有痢疾或肠炎史的IBS患者，其末端回肠、乙状结肠与直肠交界处肠黏膜中炎性介质IL-1βmRNA的表达增高。IL-1βmRNA可抑制肠道水、钠的吸收而产生腹泻，还与迟发性疼痛和过敏有关，它在感染后IBS肠黏膜组织中含量的增高，表明炎症及其随后引起的免疫反应可能参与了IBS的发病机制。

因此可证明神经因素和免疫因素在肠道中之间存在神经免疫机制。在肠黏膜内有着多种能够释放调节介质的免疫细胞，如分泌白细胞介素的单核细胞，分泌组胺、5-HT的肥大细胞和嗜铬细胞等。其中，肥大细胞被认为很可能是在神经和免疫机制之间担当沟通作用的重要免疫细胞。因为它们在肠道的炎症反应中能够分泌多种抗炎介质，又能释放神经介质，而且许多肥大细胞是和神经纤维紧邻的，刺激神经即可使肥大细胞活化。有实验对对56例符合罗马Ⅱ标准的IBS病人的肠黏膜活检组织进行了检测，发现IBS患者末端回肠黏膜内肥大细胞的数目(均值：10.98±2.96)比非IBS对照组的病人(6.05±0.51)明显增多(P<0.01)。在症状发作期间，其直肠黏膜内肥大细胞的活化比例(85%)较非IBS对照组(15%)明显为高。

空肠弯曲杆菌C.jejuni是一种革兰氏阴性菌，与小肠结肠炎有关，局部急性炎症反应，参与肠组织的损伤和腹泻。其毒素CjCDT可以调节宿主肠道上皮细胞炎症反应，诱导肠上皮细胞释放IL-8，而CDT的抗体具有中和并刺激IL-8的释放能力。CDT感染人结肠上皮细胞致使NF-κΒ的激活和Toll样受体(TLR)信号并且转录因子NF-κΒ激活大量的促炎细胞因子的基因，包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α。其中多数炎症因子诱导急性炎症过程中会促使细胞外基质成分的过度沉积，并使vinculin蛋白质的表达和mRNA相适应，即vinculin基因的转录和翻译活性均有增强。加之CDT毒素性的作用使细胞胀破甚至凋亡，过度炎症的状况下机体易引发该蛋白的自身免疫产生vinculin抗体，因此vinculin抗体可作为肠易激综合症的一种检测指标

由于目前IBS缺乏特异性的体格检查和生化异常的标志，患者临床表现多样性（症状的部位、发作类型以及严重性），甚至同一患者不同时间也有差异。在过去30年中，为规范IBS的诊断，增强诊断的特异性，已提出几种症状学诊断标准，常用的诊断标准是Manning标准和国际功能性胃肠病工作组制订的罗马标准。但都是根据临床症状积分，并通过必要的检查排除器质性病变后诊断的。在该领域急需一种生化标志物来区分肠易激综合症与其他一些炎症性肠病等。

荧光微球纳米颗粒在标志物检测领域具有巨大潜能。它具有以下特点：1、灵敏度高：不受外界的背景干扰；2、稳定性高：避免了样本腐蚀或自身衰变引发的淬灭现象；3、灵活性高：可以组合多样化光谱；4、安全性高：对于检测者、检测样品和环境都没有危害；5、方便简易：可对样品直接进行检测，无需特殊处理；6、 以上特点决定其在生物标记物方面应用前景较广阔，尤其是在床旁检测领域。通过荧光微球纳米颗粒标记人Vinculin抗原，建立一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法在临床检测领域具有重要的应用价值。

发明内容

肠易激综合症(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的慢性胃肠道疾病，以腹痛、腹部不适和排便习惯改变为主要特征，常持续存在或反复发作，经检查可以排除引起这些症状的器质性疾病，目前认为本病是一种功能性肠道疾病。在西方国家IBS发病率为10%-15%，而在中国由于地域，人种不同，各地发病率有所不同，北京地区的发病率为0.82%，广州地区则为5.6%。根据大便的性状将IBS分为便秘型IBS(IBS-C)，腹泻型IBS(IBS-D)和混合型(IBS-M)，各型之间可以相互转换，以IBS-C和IBS-M型之间转换为多见。

IBS的发病机制至今尚不明确，情绪因素、饮食、药物或激素均可引起胃肠道张力改变，促发或加重IBS。情绪焦虑、抑郁等精神因素和心理因素常引起IBS症状的发作和反复。近年来对IBS的发病机制作了进一步地探讨，改变了多年来把IBS一直当成单纯肠动力紊乱的看法，认识到本病具有内脏感觉异常，结肠对刺激的敏感性增高，从而产生腹痛以及腹泻等排便异常的特点，而感觉异常所引起的动力紊乱是受中枢神经调控的。因此，证明中枢神经的状态也能够影响IBS病人的症状。进而有研究表明，给予小剂量选择性5-羟色胺再摄取抑制剂作用于神经中枢，可以减轻IBS病人的症状，及Ringel，Drossman等用15O作PET脑扫描，发现直肠扩张后IBS病人脑血流的图谱与健康人不同；袁耀宗等用功能性磁共振影像学检查也观察到IBS病人与健康人之间存在着脑图的差异。这些都表明神经系统对肠功能具有影响。应激和肠道感染都是重要的发病诱因。Neal等报告对544例细菌性胃肠炎患者追随半年的观察，有25%的患者发生肠功能紊乱。在北京地区对IBS的流行病学调查中发现，痢疾史阳性导致发生本病的危险性上升2倍，其调查表明到有痢疾或肠炎史的IBS患者，其末端回肠、乙状结肠与直肠交界处肠黏膜中炎性介质IL-1βmRNA的表达增高。IL-1βmRNA可抑制肠道水、钠的吸收而产生腹泻，还与迟发性疼痛和过敏有关，它在感染后IBS肠黏膜组织中含量的增高，表明炎症及其随后引起的免疫反应可能参与了IBS的发病机制。

因此可证明神经因素和免疫因素在肠道中之间存在神经免疫机制。在肠黏膜内有着多种能够释放调节介质的免疫细胞，如分泌白细胞介素的单核细胞，分泌组胺、5-HT的肥大细胞和嗜铬细胞等。其中，肥大细胞被认为很可能是在神经和免疫机制之间担当沟通作用的重要免疫细胞。因为它们在肠道的炎症反应中能够分泌多种抗炎介质，又能释放神经介质，而且许多肥大细胞是和神经纤维紧邻的，刺激神经即可使肥大细胞活化。有实验对对56例符合罗马Ⅱ标准的IBS病人的肠黏膜活检组织进行了检测，发现IBS患者末端回肠黏膜内肥大细胞的数目(均值：10.98±2.96)比非IBS对照组的病人(6.05±0.51)明显增多(P<0.01)。在症状发作期间，其直肠黏膜内肥大细胞的活化比例(85%)较非IBS对照组(15%)明显为高。

空肠弯曲杆菌C.jejuni是一种革兰氏阴性菌，与小肠结肠炎有关，局部急性炎症反应，参与肠组织的损伤和腹泻。其毒素CjCDT可以调节宿主肠道上皮细胞炎症反应，诱导肠上皮细胞释放IL-8，而CDT的抗体具有中和并刺激IL-8的释放能力。CDT感染人结肠上皮细胞致使NF-κΒ的激活和Toll样受体(TLR)信号并且转录因子NF-κΒ激活大量的促炎细胞因子的基因，包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α。其中多数炎症因子诱导急性炎症过程中会促使细胞外基质成分的过度沉积，并使vinculin蛋白质的表达和mRNA相适应，即vinculin基因的转录和翻译活性均有增强。加之CDT毒素性的作用使细胞胀破甚至凋亡，过度炎症的状况下机体易引发该蛋白的自身免疫产生vinculin抗体，因此vinculin抗体可作为肠易激综合症的一种检测指标

由于目前IBS缺乏特异性的体格检查和生化异常的标志，患者临床表现多样性（症状的部位、发作类型以及严重性），甚至同一患者不同时间也有差异。在过去30年中，为规范IBS的诊断，增强诊断的特异性，已提出几种症状学诊断标准，常用的诊断标准是Manning标准和国际功能性胃肠病工作组制订的罗马标准。但都是根据临床症状积分，并通过必要的检查排除器质性病变后诊断的。在该领域急需一种生化标志物来区分肠易激综合症与其他一些炎症性肠病等。

荧光微球纳米颗粒在标志物检测领域具有巨大潜能。它具有以下特点：1、灵敏度高：不受外界的背景干扰；2、稳定性高：避免了样本腐蚀或自身衰变引发的淬灭现象；3、灵活性高：可以组合多样化光谱；4、安全性高：对于检测者、检测样品和环境都没有危害；5、方便简易：可对样品直接进行检测，无需特殊处理；6、 以上特点决定其在生物标记物方面应用前景较广阔，尤其是在床旁检测领域。通过荧光微球纳米颗粒标记人Vinculin抗原，建立一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法在临床检测领域具有重要的应用价值。

附图说明：图1干式免疫荧光检测系统结构示意图，其中1为样品垫；2为荧光结合垫；3为硝酸纤维素膜；4为吸水垫；5为PVC底板；6为样本中目标抗原；7为荧光微球标记的Vinculin抗原；8为荧光微球标记的鸡IGY；9为检测线：Vinculin抗原；10为质控线：兔抗鸡IgY。

Claims (10)

1.一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于，本试剂盒包括PVC底板、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫。

2.所述荧光结合垫上包被有Vinculin抗原-纳米荧光微球复合物、鸡IgY-纳米荧光微球复合物；硝酸纤维素膜上有Vinculin抗原构成的检测线和兔抗鸡IgY抗体构成的质控线。

3.如权利要求1所述的一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于，所述的纳米荧光微球为醛基化红荧光微球，纳米颗粒粒径为100~200nm，激发波长为365nm，发射波长为612±5nm，表面醛基基团含量为0.1～0.5mmol/g。

4.如权利要求1所述的一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于，通过醛基荧光微球与Vinculin抗原蛋白末端的氨基残基在弱碱性环境下醛胺缩合制备得到Vinculin抗原-纳米荧光微球复合物用于特异性结合受试者血清、血浆或全血中的Vinculin抗体。

5.如权利要求1 所述的一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于荧光微球纳米颗粒与Vinculin抗原蛋白或鸡IgY按照一定比例（ul：ug）分别混合，25-37℃反应1～4小时，分别制备得到Vinculin抗原-纳米荧光微球复合物及鸡IgY-纳米荧光微球复合物。

6.如权利要求1所述的一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于荧光结合垫的制备：将荧光结合垫切成9mm×300mm细条，将Vinculin抗原-纳米荧光微球复合物及鸡IgY-纳米荧光微球复合物按照一定比例混合均匀铺在荧光结合垫上，25～37℃烤干或-20～-60℃冻干得到制备好的荧光结合垫。

7.如权利要求1所述的一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于，将硝酸纤维素膜贴于PVC底板上。

8.将兔抗鸡IgY用PBS稀释到浓度为0.1-2mg/ml，作为C线包被液；将Vinculin蛋白用PBS稀释到浓度为0.1-2mg/ml，作为T线。

9.通过喷膜仪，将T线包被液和C线包被液在硝酸纤维素膜上均匀划线得到检测线和质控线，25-37℃烤干，依次组装荧光结合垫、样品垫和吸水垫并斩切切条后即可得到检测试纸条。

10.如权利要求1所述的一种肠易激综合症标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法，其特症在于检测样品为血清、血浆或全血。