CN104634982A - Vegf-c在制备败血症及重症细菌感染诊断试剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学及疾病诊断领域，具体涉及败血症和重症细菌感染的新型诊断标志物的鉴定，和其作为诊断指标、监测疾病进展的临床应用。本发明的方案为公开了VEGF-C在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途；以及VEGF-C与VEGFR-3和/或IL-6共同在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。本发明VEGF-C蛋白作为败血症及重症细菌感染血清标志物的检测具有灵敏、高效、稳定的优点，为败血症或重症细菌感染的快速诊断和监测提供了理论基础、新的检测方法，对基础研究和临床应用均有重要的意义。

Description

VEGF-C在制备败血症及重症细菌感染诊断试剂中的用途
技术领域
本发明涉生物医学及疾病诊断领域，具体涉及血管内皮生长因子-C在制备败血症及重症细菌感染检测试剂中的应用及其相关诊断试剂。
背景技术
天然免疫（innate immunity）作为机体免疫系统的重要组成部分，在机体受到病原微生物入侵时，迅速发挥免疫应答反应，是机体清除病原微生物的关键防御系统。但过度活化或持续性炎症反应也会引起严重的机体损伤和相关炎症性疾病，如细菌等病原微生物感染引起的败血症（Sepsis）。败血症或败血症休克（septic shock）都是临床上常见的急危重症，死亡率高，至今临床上仍缺乏疗效高、副作用小的方法。细菌感染是败血症休克最常见的病因，细菌的产物包括内毒素，外毒素和细菌外壁成分LPS可直接或间接地刺激单核细胞、多形核中性粒白细胞或巨噬细胞细胞等淋巴细胞启动炎症反应，产生大量的促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)，如TNF-α,IL-6,IL-1β等。
血管内皮生长因子-C（Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）是VEGF家族成员，作为配体，特异性结合血管内皮生长因子受体家族成员VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF-C和其受体的结合能够导致受体分子之间形成同型或异型二聚体，促进受体的自磷酸化，进而招募下游信号分子和传递信号。VEGF-C与其受体通过影响血管或淋巴管内皮细胞的生长、生存和迁移等功能，在生理和病理条件下的血管和淋巴管生成过程中发挥重要作用。
VEGF-C主要由内皮细胞和基质细胞分泌。最近研究发现，肿瘤细胞和巨噬细胞等也能够产生VEGF-C。肿瘤部位高表达的VEGF-C通过促进肿瘤相关淋巴管生成而导致肿瘤的转移。通过针对VEGF/VEGFR信号转导通路的不同治疗策略，如靶向VEGF-C受体的可溶性抗体、可溶性诱饵受体或抑制剂，能够降低肿瘤的转移。外周血中有VEGF家族成员存在，并且伴随一些疾病的发生，其在外周血中含量相应变化，是这些疾病的潜在诊断标志物。如血清中VEGF-A的含量与胃癌转移的（Oh,S.Y.,H.C.Kwon,et al.(2008)."Clinicopathologic significance of HIF-1alpha,p53,and VEGF expression and preoperativeserum VEGF level in gastric cancer."BMC Cancer8:123.），血清VEGF-C含量作为中晚期宫颈癌的特异性诊断标志物（Mathur,S.P.,R.S.Mathur,et al.(2005)."Serum vascular endothelialgrowth factor C(VEGF-C)as a specific biomarker for advanced cervical cancer:Relationship toinsulin-like growth factor II(IGF-II),IGF binding protein3(IGF-BP3)and VEGF-A[corrected]."Gynecol Oncol98(3):467-483.），血清VEGF-C含量作为卵巢癌病人的诊断和预后标志物（Cheng,D.,B.Liang,et al.(2013)."Serum vascular endothelial growth factor(VEGF-C)as adiagnostic and prognostic marker in patients with ovarian cancer."PLoS One8(2):e55309.）等。
败血症是细菌等病原微生物侵入血液循环并在其中生长繁殖，产生毒素，引起严重的免疫反应，造成全身性、多器官感染的疾病。败血症或重症细菌感染促使机体发生不可控的急性炎症反应，导致人体器官功能受损或衰竭和多系统发生中毒症状，如皮肤、粘膜系统坏死、呼吸系统不规则，中枢神经系统、消化系统、血管系统和心血管系统炎症、泌尿系统感染等，进而导致死亡。在免疫力低下者如儿童，新生儿和老年人中易发。同时，败血症也是医院内，尤其在重症监护病房（ICU），死亡率较高的一种因素。据报道，美国每年有750,000人感染败血症(Angus and Wax,2001)，其中28%-50%患者死于败血症，远远高于死于前列腺癌、乳腺癌和艾滋病的总人数。败血症发生的早期及时诊断和监测性用药对于其治疗至关重要。目前败血症或重症细菌感染的检查主要靠细菌学方法，通过采血做血液细菌培养的方法或者通过病原菌抗原及DNA检测确定是否为感染。但细菌学方法存在耗时长和假阳性的弱点，对及时诊断和用药产生很大的局限。因而，发展新的灵敏、快速、高效辅助败血症或重症细菌感染的诊断或监测疾病进展的方法，对于临床及时诊断和治疗至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种快速诊断败血症或快速诊断严重细菌感染的方法，从而实现败血症及严重细菌感染患者的及时用药；并且本发明还可用于监测患者的病程进展，以便于调整药量，防止临床上抑菌药物的滥用，极具临床价值及应用前景。
本发明首先公开了VEGF-C（Vascular endothelial growth factor-C，血管内皮生长因子-C）在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。
较优的，所述VEGF-C为生物标志物。
更优的，所述VEGF-C为血清生物标志物。
本发明公开了VEGF-C作为血清生物标志物诊断及监测败血症、重症细菌感染的新用途，可将VEGF-C用于制备败血症诊断试剂，败血症病程监测试剂，重症细菌感染诊断试剂，或者重症细菌感染病程监测试剂。
本发明第二方面公开了VEGF-C，与VEGFR-3和/或IL-6，在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。
较优的，所述VEGF-C，IL-6以及VEGFR-3为生物标志物。
本发明所述VEGF-C，与VEGFR-3和/或IL-6，，包括VEGF-C与IL-6，VEGF-C与VEGFR-3，VEGF-C与IL-6和VEGFR-3共三种情况。即VEGF-C可以联合其受体VEGFR-3，以及现有的败血症检测指标IL-6，进行败血症及重症细菌感染的检测和监控，制备败血症及重症细菌感染测、病程监测试剂。
本发明所述VEGF-C、IL-6和VEGFR-3均为已知蛋白，例如VEGF-C为血管内皮生长因子‐C，人VEGF-C的蛋白序列可参考GenBank：CAA63907.1。
本发明通过研究发现，与健康人或动物相比，败血症患者或重症细菌感染患者外周血的血清中VEGF-C含量显著增高，与败血症或重症细菌感染正相关，并与病程发展相关；并且，与健康人群或动物相比，病患血清中IL-6的含量和巨噬细胞表面VEGFR-3的表达水平也显著增高。IL-6是一种已知与败血症密切相关的细胞因子，其在血清中的含量已经作为一种灵敏性与特异性较高的、诊断败血症的方法；VEGFR-3的表达水平升高是本发明新发现的。因此，IL-6与VEGFR-3可以作为一种辅助性检测指标，结合血清中VEGF-C的含量，成为临床上败血症或重症细菌感染的诊断、监测或预后的重要生物学标志物。
本发明第三方面公开了一种败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂盒，所述试剂盒包括VEGF-C蛋白ELISA检测试剂。
进一步的，所述VEGF-C蛋白ELISA检测试剂包括VEGF-C一抗，以及酶标记的VEGF-C二抗。
较优的，所述酶为辣根过氧化物酶（HRP）。
所述VEGF-C蛋白因子ELISA检测试剂还包括酶所对应的底物。
进一步的，所述败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂盒还包括VEGFR-3表达水平检测试剂和/或IL-6蛋白ELISA检测试剂。
较优的，所述IL-6蛋白ELISA检测试剂包括IL-6一抗，以及酶标记的IL-6二抗；所述VEGFR-3表达水平检测试剂为VEGFR-3荧光免疫试剂，或者所述VEGFR-3表达水平检测试剂为VEGFR-3逆转录试剂。前述二抗为与一抗具有不同抗原表位的抗体，能够形成一抗-目标蛋白-二抗的双抗体夹心结构。
更优的，所述VEGFR-3荧光免疫试剂包括VEGFR-3抗体，以及荧光基团标记的抗VEGFR-3抗体（抗VEGFR-3抗体是指抗前述VEGFR-3抗体的抗体，其能够特异性结合前述VEGFR-3抗体）；所述VEGFR-3逆转录试剂包括SEQ ID NO:1-2所示序列的引物。
本发明所采用的荧光基团可以为现有技术的任意一种荧光基团，例如可以为Alexa488。
本发明第四方公开了VEGF-C酶联免疫试剂盒在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。所述VEGF-C酶联免疫试剂盒可以为现有的VEGF-C蛋白的ELISA检测试剂盒。
本发明第五方面公开了VEGF-C作为败血症或重症细菌感染血清标志物的应用。
优选的，为VEGF-C联合VEGFR-3和/或IL-6作为败血症或重症细菌感染血清标志物的应用。
本发明第六方面公开了一种诊断或监测败血症和重症细菌感染的方法，包括检测待测病人或动物血清中VEGF-C蛋白因子的含量。
优选的，该方法还包括检测待测病人或动物血清中IL-6蛋白因子的含量，和/或淋巴细胞表面VEGFR-3的表达水平。
优选的，淋巴细胞表面VEGFR-3的表达水平可以通过免疫染色法或RT-PCR的方法检测。
本发明通过研究公开了利用VEGF-C含量诊断和监测预后败血症和重症细菌感染的临床用途。本发明第一次将检测外周血中VEGF-C含量或巨噬细胞表面受体VEGFR-3的方法应用于诊断败血症和重症细菌感染，尤其首次发现检测外周血中VEGF-C含量比与败血症和重症细菌感染相关的IL-6更灵敏，进而验证出一种检测外周血中VEGF-C含量的方法，作为制备诊断败血症和重症细菌感染的试剂盒。这为临床诊断败血症或重症细菌感染的病人或动物，以及监测疾病进展提供了更为灵敏、高效、稳定的途径。并且本发明人这些创新性的发现，为败血症或重症细菌感染的快速诊断和监测提供了理论基础、新的检测方法，对基础研究和临床应用均有重要的意义。
附图说明
图1：VEGF-C在小鼠巨噬细胞及LPS休克小鼠血清中蛋白表达水平检测
图2：VEGF-D在小鼠巨噬细胞及LPS休克小鼠血清中蛋白表达水平检测
图3：LPS腹腔注射小鼠的外周血血清中VEGF-C的含量检测
图4：LPS腹腔注射小鼠的外周血血清中VEGF-D的含量检测
图5：LPS刺激的小鼠原代巨噬细胞表面VEGFR-3在mRNA和蛋白水平的表达检测
图6：LPS刺激的小鼠巨噬细胞表面VEGFR-3蛋白的表达
图7：VEGF-C在败血症患者和正常人血清中的蛋白表达水平检测
图8：IL-6在败血症患者和正常人血清中的蛋白表达水平检测
图9：VEGF-D在败血症患者和正常人血清中的蛋白表达水平检测
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人著，分子克隆:实验室指南（New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的具体条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
1.实验方法
1.1细胞实验
从野生型小鼠腹腔中分离经3%Thioglycollate(THG，购自Sigma公司，B2551)诱导富集的原代巨噬细胞（PEM），用含10%FBS和双抗（青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，购自Invitrogen,15140）的DMEM培养液培养细胞，种植于12孔板中，每孔细胞数为0.5mln，培养液体积为1ml。用含1ug/ml LPS（购自Sigma公司）的DMEM培养液刺激各孔细胞，分别刺激不同时间后收集上清，用小鼠VEGF-C和VEGF-D检测ELISA试剂盒（购自上海西唐生物科技公司，货号分别为F11672和F11673）分别检测培养液上清中VEGF-C和VEGF-D的含量。以4000pg/ml和500pg/ml的标准VEGF-C稀释液作为对照，以未经LPS刺激的原代巨噬细胞作为空白对照（Mock），实验结果见图1-2。
1.2动物实验
成年小鼠经35mg LPS/kg体重（注射体积200μl，溶剂为PBS）腹腔注射，24h后，经眼球采血。血液室温凝固20分钟，3000rpm/min离心20分钟，收集上清血清。以腹腔注射200μl PBS的小鼠作为空白对照（Mock），获得对照血清。利用ELISA试剂盒检测血清中VEGF-C和VEGF-D的含量，实验结果见图3-4。
2.实验结果及分析
由图1-2可知，在LPS刺激的小鼠原代巨噬细胞上清中检测到大量VEGF-C；并且LPS刺激24h及以后上清中VEGF-C的含量均超过4000pg/ml；而VEGF-D在小鼠原代巨噬细胞上清中的含量接近125pg/ml，整体含量水平较低。
由图3-4可知，VEGF-C在LPS处理过的小鼠血清中含量超过2000pg/ml，远远高于对照PBS注射组，而VEGF-D在LPS刺激后血清含量略有上升，但整体含量水平较低。
实施例2
1.实验方法
1.1实时荧光定PCR(RT-PCR)方法
从野生型成年小鼠中分离得到骨髓（bone marrow）细胞，体外利用含10ng/ml M-CSF的(Peprotech,货号315-02-10)DMEM培养液诱导，使其分化为成熟的骨髓来源的巨噬细胞（BMM）。利用含1ug/ml LPS的DMEM全培养液刺激细胞，24h后用Trizol裂解细胞，抽提RNA，反转录为cDNA。通过特异性VEGFR-3引物（序列如表1中SEQ ID NO：1-2所示）和RT-PCR技术检测细胞中VEGFR-3的相对含量，内参基因选择为beta-Actin（内参引物序列如表1中SEQ ID NO：3-4所示），实验结果见图5。
表1PCR引物序列
1.2免疫荧光和流式细胞法
从成年小鼠中分离得到腹腔巨噬细胞（PEM）,体外DMEM全培养液培养，分别用含1ug/ml LPS的DMEM全培养液诱导不同时间后，用细胞刮刮下细胞，4%P多聚甲醛溶液固定细胞，进行VEGFR-3抗体(购自eBioscience,货号14-5988)染色，并通过带有荧光基团Alexa488的第二抗体（购自Molecular Probes,货号A11055）标记VEGFR-3抗体，流式细胞仪检测VEGFR-3在巨噬细胞表面的表达水平，实验结果见图6。
2.实验结果及分析
由图5可知，LPS刺激24h后，BMM中VEGFR-3mRNA含量上升3倍以上，因此通过实时荧光定PCR方法，检测到LPS刺激能够显著升高小鼠原代巨噬细胞中VEGFR-3的mRNA水平。
由图6可知，在对照和LPS刺激12、24、36小时后，VEGFR-3在PEM细胞表面的表达量分别为10%，33%，37%和64%，可见LPS刺激显著升高了小鼠原代巨噬细胞表面VEGFR-3蛋白的表达。
实施例3
1.实验方法
收集20例确诊败血症患者的外周血样品作为实验组，收集24例健康人的外周血样品作为对照组。各份血液样品收集在EDTA抗凝管中，体积为5ml左右，放于4℃冰箱冷藏。在15ml离心管中，加入等体积的密度为1.077g/ml的Ficoll聚蔗糖分离液，然后将血液样品加入到分离液的上层，水平转子800g室温离心20分钟。分层结束后，最上层浅黄色部分即为血清，通过ELISA试剂盒检测上层血清中VEGF-C、VEGF-D及IL-6的浓度（VEGF-C酶联免疫试剂盒购自上海西唐生物科技公司，货号F03080、VEGF-D酶联免疫试剂盒购自上海西唐生物科技公司,货号F03090，IL-6酶联免疫试剂盒购自eBioscience公司，货号88-7066）。利用GraphPad Prism6软件对血清中VEGF-C和IL-6的浓度进行了统计分析。组间比较用非配对t检验分析，确定p<0.05为差异有显著性（*）,p<0.01为差异有极显著性（**）。
2.实验结果及分析
20位败血症患者血清样品中VEGF-C和IL-6的含量，与24名正常健康人进行比较的结果见图7-8。
由图8可知，败血症患者血清中VEGF-C的浓度水平均极显著高于正常人组（p值均小于0.0001），提示血清中VEGF-C的水平可以作为血清学标志物，用于诊断和监测败血症或重症细菌感染的病人或动物。
由图7和图8比较可知，败血症患者血清中VEGF-C和IL-6的浓度水平均极显著高于正常人组（p值均小于0.0001），提示VEGF-C的水平可以联合血清中IL-6的水平一同检测，作为诊断和监测败血症或重症细菌感染发生发展的可靠方法。而且，VEGF-C的绝对含量较IL-6的绝对含量数值高，提示检测和监测VEGF-C数值提供一种更灵敏的指标。
图7和图9比较可知，在败血症病人外周血血清中，通过ELISA方法检测到高水平的VEGF-C，而正常人中含量很低；正常对照组和败血症患者血清中VEGF-D含量没有显著差别（p=0.279）,VEGF-D在正常对照组和败血症患者血清中含量水平均低于50pg/ml。
总之，本发明首先利用来自大肠杆菌的细胞质膜成分脂多糖（LPS）注入实验小鼠体内，诱导小鼠产生败血症症状，提取外周血和分离获得血清，通过ELISA方法检测VEGF-C和IL-6的含量。相应地，利用来自大肠杆菌的细胞质膜组成成分脂多糖（LPS）在体外刺激人或小鼠巨噬细胞，检测其表面VEGFR-3表达水平。并且，还通过从正常人和病人中提取血液样品，分离获取血清，利用酶联免疫法试剂盒（ELISA）检测血清中VEGF-C和白细胞介素-6（IL-6）的含量。结果表明，在败血症病人和败血症小鼠外周血的血清中VEGF-C和IL-6的含量显著高于正常对照。而且，先天性免疫细胞巨噬细胞在LPS，E.coli或SL1344刺激时，能够迅速分泌大量VEGF-C和IL-6,并升高表面VEGFR-3水平。这提示在急性细菌感染发生时，体内巨噬细胞作为抵御病原菌感染的第一道防线，能够迅速发生应急反应，在分泌促炎细胞因子IL-6的同时，分泌VEGF-C。
本发明对败血症发生时巨噬细胞升高VEGF-C和受体VEGFR-3的相应功能进行研究，保护范围不限于上述实施例。

Claims (10)

1.VEGF-C在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述VEGF-C为生物标志物。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述VEGF-C为血清生物标志物。
4.VEGF-C，与VEGFR-3和/或IL-6，在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。
5.一种败血症或重症细菌感染诊断以及病程监测试剂盒，所述试剂盒包括VEGF-C蛋白ELISA检测试剂；所述VEGF-C蛋白ELISA检测试剂包括VEGF-C一抗，以及酶标记的VEGF-C二抗。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括IL-6蛋白ELISA检测试剂，和/或VEGFR-3表达水平检测试剂；所述IL-6蛋白ELISA检测试剂包括IL-6一抗，以及酶标记的IL-6二抗；所述VEGFR-3表达水平检测试剂为VEGFR-3荧光免疫试剂，所述VEGFR-3荧光免疫试剂包括VEGFR-3抗体，以及荧光基团标记的抗VEGFR-3抗体；或者所述VEGFR-3表达水平检测试剂为VEGFR-3逆转录试剂；所述VEGFR-3逆转录试剂包括SEQ ID NO:1-2所示序列的引物。
7.VEGF-C酶联免疫试剂盒在制备败血症或重症细菌感染诊断及病程监测试剂中的用途。
8.VEGF-C作为败血症或重症细菌感染血清标志物的应用。
9.一种诊断或监测败血症及重症细菌感染的方法，包括检测待测病人或动物血清中VEGF-C蛋白因子的含量。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法还包括检测待测病人或动物血清中IL-6蛋白因子的含量，和/或巨噬细胞表面VEGFR-3的表达水平。
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