CN107266562A - 一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法 - Google Patents

一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法。其包括：胶原多肽探针的设计，设计特定氨基酸序列的胶原多肽，包括:①、中间含有较多的((Gly‑Pro‑Hyp)n或(Gly‑Pro‑Pro)n重复序列，以帮助多肽可以与胶原蛋白特异性结合；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；胶原多肽探针的制备，通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再使用发光物质修饰该胶原多肽；胶原纤维染色；体外成像。本发明设计的胶原多肽探针制备简单，检测方便，无生物毒性，能特异性的结合胶原蛋白，在肿瘤，关节炎等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评价等领域具有巨大的应用前景。

Description

一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像 方法
技术领域
本发明涉及一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
胶原蛋白作为哺乳动物体内最丰富的的蛋白，是细胞外基质的主要组成成分，在组织形成和维持体内平衡中起到关键作用。当胶原蛋白的产生和降解平衡遭到破坏时，会引起诸多疾病，其中一些疾病可能致命。在胶原重建过程中，若胶原产生过剩，过量的胶原在器官中累积，易产生组织纤维化，最终导致肿瘤等严重疾病；或者胶原不可控降解导致胶原蛋白退化性疾病，如关节炎。在诸多病理条件中，胶原蛋白分子的三重螺旋结构被蛋白酶在细胞外环境中酶解。因此，设计和制备能特异性识别胶原蛋白的探针对这些疾病的诊断和治疗具有重要意义。目前，已研发出一些短肽和抗体用于胶原蛋白的识别及成像，但是，这些检测方法存在价格昂贵，操作复杂，特异性差，结合能力弱等缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法。本方法是利用特定序列的胶原多肽可以特异性的结合部分解链的胶原蛋白，特异性好、结合能力强、制备简单，检测方便，无生物毒性。
本发明的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其包括以下步骤：
(1)胶原多肽探针的设计
设计特定氨基酸序列的胶原多肽，包括:①、中间含有较多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重复序列，以帮助多肽可以与胶原蛋白特异性结合；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；
(2)胶原多肽探针的制备
通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再使用发光物质修饰该胶原多肽；
(3)胶原纤维染色
在胶原纤维分散液中加入胶原多肽探针溶液，4℃孵育3h，离心弃上清液，用1xPBS洗掉未结合探针；
(4)体外成像
在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
(5)体内成像
将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
所述步骤(1)中胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)n(n为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)n(n为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)m(n和m为1-20之间的整数)，或(Gly-Pro-Pro)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)m(n和m为1-20之间的整数)中的一种；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸。
所述步骤(1)中的发光物质为荧光素类、香豆素类、罗丹明类、菁染料类、BODIPY类、磷光分子、半导体量子点及碳量子点、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种；所述发光物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。
所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为：
a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30％乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；
g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
h)将20-30mg纯肽由DMF溶解，称取荧光物质(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；
i)将反应液加入冰乙醚中，得到黄色沉淀，黄色沉淀由水溶解并透析除去荧光物质，然后将溶液冻干得到探针。
所述步骤(3)中胶原纤维由I型胶原醋酸溶液在NaCl溶液中透析得到，将0.5-1.5mg/mL I型胶原蛋白醋酸溶液在NaCl溶液中透析，得到胶原纤维；将0.05-0.15mg/mL探针溶液加入到胶原纤维分散液中，在4℃孵育3hrs，离心后弃上清液，然后加入1x PBS振荡，离心后弃上清液，重复三次，用以洗掉未结合探针，然后将处理后的纤维分散液滴于载玻片上，实验荧光显微镜获取图像；
所述步骤(4)中组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μLDAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
所述步骤(5)中胶原多肽探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1X PBS中，实验活体为小鼠，小鼠体重为20-30g，小鼠由含2％异氟烷氧气麻醉。
本发明的有益效果是：
1.制备简单，检测方便；
2.特异性好，结合能力强。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1为本发明的胶原纤维染色荧光显微镜图；
图2为本发明的体外成像的荧光显微镜图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明进行详细说明，如图1和2所示，本实施例的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其包括以下步骤：
(1)胶原多肽探针的设计
设计特定氨基酸序列的胶原多肽，包括:①、中间含有较多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重复序列，以帮助多肽可以与胶原蛋白特异性结合；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；
(2)胶原多肽探针的制备
通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再使用发光物质修饰该胶原多肽；
(3)胶原纤维染色
在胶原纤维分散液中加入胶原多肽探针溶液，4℃孵育3h，离心弃上清液，用1xPBS洗掉未结合探针；
(4)体外成像
在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
(5)体内成像
将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
所述步骤(1)中胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)n(n为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)n(n为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)m(n和m为1-20之间的整数)，或(Gly-Pro-Pro)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)m(n和m为1-20之间的整数)中的一种；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸。
所述步骤(1)中的发光物质为荧光素类、香豆素类、罗丹明类、菁染料类、BODIPY类、磷光分子、半导体量子点及碳量子点、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种；所述发光物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。
所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为：
a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30％乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；
g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
h)将20-30mg纯肽由DMF溶解，称取荧光物质(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；
i)将反应液加入冰乙醚中，得到黄色沉淀，黄色沉淀由水溶解并透析除去荧光物质，然后将溶液冻干得到探针。
所述步骤(3)中胶原纤维由I型胶原醋酸溶液在NaCl溶液中透析得到，将0.5-1.5mg/mL I型胶原蛋白醋酸溶液在NaCl溶液中透析，得到胶原纤维；将0.05-0.15mg/mL探针溶液加入到胶原纤维分散液中，在4℃孵育3hrs，离心后弃上清液，然后加入1x PBS振荡，离心后弃上清液，重复三次，用以洗掉未结合探针，然后将处理后的纤维分散液滴于载玻片上，实验荧光显微镜获取图像；
所述步骤(4)中组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μLDAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
所述步骤(5)中胶原多肽探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1X PBS中，实验活体为小鼠，小鼠体重为20-30g，小鼠由含2％异氟烷氧气麻醉。
实施例1
(1)胶原多肽探针的设计
设计的胶原多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Pro-Amp(-FAM)-(Gly-Pro-Hyp)3，其中FAM为羧基荧光素；
(2)胶原多肽探针的制备
1.将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
2.由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
3.将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
4.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
5.重复步骤3、4，直到合成目标序列的胶原多肽(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Pro-Amp-(Gly-Pro-Hyp)3。向反应器中加入25％乙酸酐，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次。
6.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝90:5:5)，反应3hrs。
7.反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。
8.将25mg纯肽由DMF溶解，称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应24hrs。
9.将反应液加入冰乙醚中，得到黄色沉淀，黄色沉淀由水溶解并透析除去荧光物质，然后将溶液冻干得到探针。
(3)胶原纤维染色
将1mg/mL I型胶原蛋白醋酸溶液在NaCl溶液中透析，得到胶原纤维。在80μL胶原纤维分散液中加入50μL 0.1mg/mL探针溶液，4℃孵育3hrs，离心弃上清液，加入100μL 1xPBS振荡，洗掉未结合探针，离心去上清，重复三次；纤维分散液滴于载玻片上，实验荧光显微镜获取图像，如图1所示。
(4)体外成像
鼠耳组织冰冻切片上加0.5mL封闭液，放置30min后吸走液体。使用100μL 5μM探针溶液染色，4℃孵育2hrs。吸去染色液后，使用100μL DAPI稀释液染色1min。使用1x PBS洗涤3次，洗掉未结合探针和过量的DAPI。滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照，如图2所示。
(5)体内成像
将110μL的4nM胶原多肽探针由小鼠尾部注射，将已麻醉的小鼠放入成像装置中进行成像试验。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)胶原多肽探针的设计
设计特定氨基酸序列的胶原多肽，包括:①、中间含有较多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重复序列，以帮助多肽可以与胶原蛋白特异性结合；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；
(2)胶原多肽探针的制备
通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再使用发光物质修饰该胶原多肽；
(3)胶原纤维染色
在胶原纤维分散液中加入胶原多肽探针溶液，4℃孵育3h，离心弃上清液，用1x PBS洗掉未结合探针；
(4)体外成像
在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
(5)体内成像
将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
2.根据权利要求1所述的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于：所述胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)n(n为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)n(n为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)m(n和m为1-20之间的整数)，或(Gly-Pro-Pro)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)m(n和m为1-20之间的整数)中的一种；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于：所述发光物质为荧光素类、香豆素类、罗丹明类、菁染料类、BODIPY类、磷光分子、半导体量子点及碳量子点、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种；所述发光物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。
4.根据权利要求1所述的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于，所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为：
a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30％乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；
g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
h)将20-30mg纯肽由DMF溶解，称取荧光物质(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；
i)将反应液加入冰乙醚中，得到黄色沉淀，黄色沉淀由水溶解并透析除去荧光物质，然后将溶液冻干得到探针。
5.根据权利要求1所述的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于：所述步骤(3)中胶原纤维由I型胶原醋酸溶液在NaCl溶液中透析得到，将0.5-1.5mg/mL I型胶原蛋白醋酸溶液在NaCl溶液中透析，得到胶原纤维；将0.05-0.15mg/mL探针溶液加入到胶原纤维分散液中，在4℃孵育3hrs，离心后弃上清液，然后加入1x PBS振荡，离心后弃上清液，重复三次，用以洗掉未结合探针，然后将处理后的纤维分散液滴于载玻片上，实验荧光显微镜获取图像。
6.根据权利要求1所述的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于：所述步骤(4)中组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μL DAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
7.根据权利要求1所述的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其特征在于：所述步骤(5)中胶原多肽探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1XPBS中，实验活体为小鼠，小鼠体重为20-30g，小鼠由含2％异氟烷氧气麻醉。
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