CN112067586A - 一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法 - Google Patents

一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，属于光谱分析技术领域。本发明包括：将长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs通过表面修饰适配体PSA‑A和金锥纳米粒子Au NBPs通过表面修饰适配体互补链PSA‑C进行自组装，由于长余辉纳米粒子的发射峰与金锥纳米粒子的紫外吸收峰重叠，存在能量共振转移，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的荧光淬灭。此外ZGGO:Cr,Er,Yb NPs与Au NBPs之间存在电荷转移，导致SERS信号增强。本发明以荧光信号和拉曼信号共同作为检测信号，提高了检测的准确性。

Description

一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱 分析方法
技术领域
本发明属于光谱分析技术领域，尤其是涉及一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法。
背景技术
前列腺特异性抗原(PSA)是诊断前列腺癌，判断治疗后癌症复发情况常用的一种肿瘤标志物。目前普遍认为前列腺疾病诊断阈值是4ng mL-1，当血清中PSA 含量高于这一浓度时即有患癌风险。因此准确检测PSA在血清中的含量水平可以有效反映前列腺疾病的发生。常见的PSA检测方法有：电化学免疫分析、化学发光免疫分析、比色免疫分析等，但是存在重现性差，实验过程复杂，不能完全消除生物样品的背景干扰等缺点。因此，迫切需要开发出能够准确、灵敏、特异性检测PSA含量的传感器。
荧光传感器由于具有多种检测能力，快速响应和出色的灵敏度而被广泛研究。此外，作为光学传感器之一，表面增强拉曼散射(SERS)传感器反映了分子振动的信息，可以产生出色的SERS增强效果并实现灵敏的单分子检测。然而，荧光技术和SERS技术均存在一些限制。例如，荧光信号容易被漂白，并且发射光谱宽。SERS信号需要更长的采集时间。相比之下，双信号检测方法结合了两种技术的特点，其结果的准确性优于单信号检测方法。因此，基于双信号的检测方法显示出巨大的应用前景。
发明内容
本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法。本发明提供的检测方法具有较强的准确性，以及较高的灵敏度和特异性。
一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，所述的分析方法具体包括以下步骤：将ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液，与Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液搅拌混均，固液分离取沉淀物，并将其重新分散在PBS 缓冲液中，加入PSA溶液并用紫外灯照射，最后分别测定溶液荧光光谱以及拉曼光谱。
所述分析方法的具体步骤如下：
(1)ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液的制备方法：
①长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的制备：
将Cr(NO3)2、Zn(NO3)2、Yb(NO3)2、Er(NO3)2、锗酸铵溶液与Ga(NO3)2溶液混合均匀得到溶液1，随后加入CTAB，并调节溶液的pH值至7-9，超声处理，搅拌混均后进行水热反应，待反应结束后固液分离取沉淀物，洗涤并干燥即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs；
②长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的氨基化：将上述所得 ZGGO:Cr,Er,YbNPs分散于NaOH溶液中，剧烈搅拌后固液分离取沉淀，并将其分散在N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷 APTES试剂，在75-85℃水浴中加热，待反应结束后固液分离取固相，并将固相分散在水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③长余辉纳米粒子表面前列腺特异性抗原适配体PSA-A修饰：向PSA-A溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液 EDC/NHS孵育30-40min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的 ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液，并在室温下振荡孵育5-6h，反应结束后固液分离取沉淀物，用水清洗最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得 ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液；
(2)Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液的制备方法：
①金锥纳米Au NBPs溶液的制备：将HAuCl4、十六烷基三甲基氯化铵CTAC、柠檬酸溶液与NaBH4溶液混合搅拌；将所得溶液在75-85℃油浴中加热85-95min 得到金种溶液，将上述金种溶液加热CTAB、HAuCl4、AgNO3、HCl与AA抗坏血酸的混合溶液中，并孵育1.8-2.2h得到金锥纳米Au NBPs溶液；
②Au NBPs@4-ATP的制备：向金锥纳米Au NBPs溶液中加入4-ATP溶液，反应结束后固液分离取固相并用水洗涤，将固相溶解在水中得到Au NBPs@4-ATP溶液；
③表面前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C修饰：向前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C溶液中加入步骤②中所得Au NBPs@4-ATP溶液，室温下搅拌8-10h；反应结束后固液分离收集沉淀物，用水清洗最后分散在Tris-HCl缓冲溶液中，即得Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液；
(3)荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液与Au NBPs/PSA-C溶液在PBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育4-6h，固液分离收集沉淀物，将其重新分散在PBS缓冲液中；将PSA标准溶液分别加入到上述溶液中，室温下振荡孵育5-6h；之后使用250-260nm紫外灯照射，测试所得溶液的荧光光谱，得到以PSA浓度对数为横坐标，以检测探针ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A的发光恢复程度F-F0为纵坐标的标准曲线；测试所得溶液的拉曼光谱，得到以PSA浓度对数为横坐标，以检测探针Au NBPs@4-ATP/PSA-C的拉曼信号变化程度I-I0为纵坐标的标准曲线，其中，所述F代表有PSA时的荧光强度；I代表有PSA时的拉曼强度；F0代表没有PSA 时的荧光强度；I0代表没有PSA时的拉曼强度。
步骤(1)①中所述Cr(NO3)2、Zn(NO3)2、Yb(NO3)2、Er(NO3)2、锗酸铵与 Ga(NO3)2的摩尔比为0.04-0.06:12-14:0.2-0.3:0.02-0.03:2-3:14-16；CTAB的使用量为15-17mg。
步骤(1)①中所述水热反应条件为在110-130℃条件下加热14-16h。
步骤(1)②所述ZGGO:Cr,Er,Yb NPs和固体NaOH的质量比为8-12:0.48-1.2， N,N-二甲基甲酰胺溶剂与APTES溶液体积比为30-50:0.2-0.8。
步骤(1)③前列腺特异性抗原适配体PSA-A稀释后的浓度为5-15μM， EDC/NHS浓度为55-65mM，所述稀释后PSA-A溶液、EDC/NHS和氨基化的 ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液体积比为22-24:5-7:4-6。
步骤(2)①所述制备金种溶液时所用的HAuCl4、CTAC、柠檬酸溶液与NaBH4的摩尔比为2.2-2.5：495-505：45-55：6.1-6.5；制备Au NBPs时CTAB、HAuCl4、 AgNO3、HCl与AA的摩尔比为8-12:0.04-0.06:0.0008-0.0012:1-3:0.07-0.09。
步骤(2)②中Au NBPs与4-ATP的摩尔比为1:50-1:60。
步骤(2)③中所述PSA-C与Au NBPs@4-ATP的摩尔比为1:90-1:110。
步骤(1)、(2)、(3)中所述PBS缓冲溶液浓度为8-12mM，pH为7.2-7.6； Tris-HCl缓冲液pH为7.0-7.4。
本发明有益的技术效果在于：
采用红色发射的长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs作为发光材料，通过羧基与氨基之间形成酰胺共价键的方式将PSA-A连接在ZGGO:Cr,Er,Yb NPs表面，制备出可特异性识别前列腺抗原的检测探针。在金锥纳米材料表面修饰拉曼信标和前列腺抗原适配体的互补链，记作Au NBPs@4-ATP/PSA-C。当无PSA 时，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs由于能量共振转移，荧光淬灭；而ZGGO:Cr,Er,Yb NPs 与Au NBPs@4-ATP/PSA-C之间存在电荷转移，导致SERS信号增强。当存在 PSA时，由于目标物与检测探针的特异性识别使组装结构解离，此时 ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的荧光恢复，Au NBPs@4-ATP的SERS信号减弱。据此开发出一种可以用于监测PSA含量的荧光拉曼双重光谱分析法。该方法能够有效消除自体荧光干扰，提高了检测的准确性，具有较高的灵敏度和特异性。
本发明提出的一种检测前列腺特异性抗原的荧光拉曼双重光谱分析方法具有很高的灵敏度和特异性，本检测方法无需原位激发，可以消除检测环境中自体荧光的背景干扰，大大提高了检测的灵敏度；长余辉材料能增强Au NBPs@4-ATP的SERS效应，且Au NBPs@4-ATP能有效淬灭长余辉的荧光，PSA 的检测结果可以同时通过荧光光谱及拉曼光谱反映，进一步提高了检测的准确度。
附图说明
图1是实施例2中检测PSA的荧光拉曼适配体传感器的原理示意图；
图2是实施例2中中存在不同浓度的PSA时，荧光拉曼传感器的荧光光谱、拉曼光谱及标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
1，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的合成及表面PSA-A的修饰：
①将0.004mmol Cr(NO3)2，1.2mmol Zn(NO3)2，0.02mmol Yb(NO3)2，0.002 mmol Er(NO3)2和0.2mmol锗酸铵溶液加入到1.4mmol Ga(NO3)2溶液中混合搅拌均匀后，得到溶液1，随后向溶液1中加入15mgCTAB，并用氨水调节溶液的pH值至7；在室温下超声20min，搅拌0.8h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在110℃下加热14h；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水至少洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,YbNPs粉末；
②将上述所得8mg ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末分散于3mL浓度为4mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌11h；离心收集下层沉淀，将其分散在3mL N,N- 二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在75℃水浴中加热搅拌22h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③使用PBS缓冲溶液将PSA-A稀释至5μM，之后加入50μL，浓度为55mM 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液 (EDC/NHS)孵育30min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的 ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液，并在室温下振荡孵育5h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水至少清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为0.6mg/mL的ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液；
2，Au NBPs的制备及表面PSA-C的修饰：
①首先向0.2mM HAuCl4，48mM CTAC，4mM柠檬酸溶液中加入新鲜制备的24mMNaBH4溶液，室温搅拌1min；将溶液在75℃油浴中加热搅拌85min 得到金种溶液。然后向8mmol CTAB，0.04mmol HAuCl4，0.0008mmol AgNO3， 1mmol HCl，0.07mmol AA的混合溶液中加入3mL上述金种溶液，并在28℃下振荡孵育1.8h得到Au NBPs溶液。
②向步骤①中所得的0.8mL，浓度为8nM的Au NBPs溶液中加入4μL，浓度为98μM的4-ATP溶液，在室温下孵育10h；反应结束后离心收集沉淀物，并用超纯水洗涤3次，最终分散于超纯水中，得到Au NBPs@4-ATP溶液。
③用Tris-HCl缓冲溶液稀释前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C至浓度为 8μM，再加入步骤②中所得0.9mL，浓度为8nM的Au NBPs@4-ATP溶液，室温下搅拌8h；反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后分散在 Tris-HCl缓冲溶液中，即得浓度为1.7nM的Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液。
3，荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将步骤(1)中所得10μL ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液与步骤(2)中所得180 μL AuNBPs@4-ATP/PSA-C溶液在100μL PBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育4h，固液分离收集沉淀物，将其重新分散在PBS缓冲液中；将配制好的一系列浓度为10fg/mL、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、 10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的PSA标准溶液分别加入到上述溶液中，室温下振荡孵育5h；之后使用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次；通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。
实施例2
1，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的合成及表面PSA-A的修饰：
①将0.005mmol Cr(NO3)2，1.3mmol Zn(NO3)2，0.025mmol Yb(NO3)2，0.0025 mmolEr(NO3)2和0.25mmol锗酸铵溶液加入到1.5mmol Ga(NO3)2溶液中混合搅拌均匀后，得到溶液1，随后向溶液1中加入16mgCTAB，并用氨水调节溶液的pH值至8；在室温下超声25min，搅拌1h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在120℃下加热15h；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水至少洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,YbNPs粉末；得到的ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的TEM如图1所示。
②将上述所得10mg ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末分散于4mL浓度为5mM的 NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌12h；离心收集下层沉淀，将其分散在4mL N,N- 二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入50μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在80℃水浴中加热搅拌24h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③使用PBS缓冲溶液将PSA-A稀释至10μM，之后加入60μL、浓度为60mM 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液 (EDC/NHS)孵育35min，孵育完成后加入氨基化的ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液，并在室温下振荡孵育5.5h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为0.8mg/mL的 ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液；
2，Au NBPs的制备及表面PSA-C的修饰：
①首先向0.25mM HAuCl4，50mM CTAC，5mM柠檬酸溶液中加入新鲜制备的25mMNaBH4溶液，室温搅拌2min；将溶液在80℃油浴中加热搅拌90min 得到金种溶液。然后向10mmol CTAB，0.05mmol HAuCl4，0.0010mmol AgNO3， 2mmol HCl，0.08mmol AA的混合溶液中加入3.5mL上述金种溶液，并在30℃下振荡孵育2h得到Au NBPs溶液。得到的Au NBPs的TEM如图2所示。
②向步骤①中所得的1.0mL，浓度为10nM的Au NBPs溶液中加入5μL，浓度为100μM的4-ATP溶液，在室温下孵育11h；反应结束后离心收集沉淀物，并用超纯水洗涤3次，最终分散于超纯水中，得到Au NBPs@4-ATP溶液。
③用Tris-HCl缓冲溶液稀释前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C至浓度为 10μM，再加入1mL浓度为10nM的Au NBPs@4-ATP溶液，室温下搅拌9h；反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后分散在Tris-HCl缓冲溶液中，即得浓度为1.8nM的Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液。
3，荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将20μL ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液与200μL Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液在150μLPBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育5h，固液分离收集沉淀物，将其重新分散在PBS缓冲液中；将配制好的一系列浓度为10fg/mL、100fg/mL、 1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的 PSA标准溶液分别加入到上述溶液中，室温下振荡孵育5.5h；之后使用254nm 紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次；通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。实验结果见图2。
实施例3
1，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的合成及表面PSA-A的修饰：
①将0.006mmol Cr(NO3)2，1.4mmol Zn(NO3)2，0.03mmol Yb(NO3)2，0.003mmol Er(NO3)2和0.3mmol锗酸铵溶液加入到1.6mmol Ga(NO3)2溶液中混合搅拌均匀后，得到溶液1，随后向溶液1中加入17mgCTAB，并用氨水调节溶液的pH值至9；在室温下超声30min，搅拌1.2h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在130℃下加热16h；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末；
②将上述所得12mg ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末分散于5mL浓度为6mM的 NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌13h；离心收集下层沉淀，将其分散在5mL N,N- 二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入80μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在85℃水浴中加热搅拌26h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③使用PBS缓冲溶液将PSA-A稀释至15μM，之后加入70μL，浓度为65mM 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液 (EDC/NHS)孵育40min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的 ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液，并在室温下振荡孵育6h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水至少清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为1.0mg/mL的ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液。
2，Au NBPs的制备及表面PSA-C的修饰：
①首先向0.3mM HAuCl4，52mM CTAC，6mM柠檬酸溶液中加入新鲜制备的26mM NaBH4溶液，室温搅拌3min；将溶液在85℃油浴中加热搅拌95min 得到金种溶液。然后向12mmolCTAB，0.06mmol HAuCl4，0.0012mmol AgNO3， 3mmol HCl，0.09mmol AA的混合溶液中加入4mL上述金种溶液，并在32℃下振荡孵育2.2h得到Au NBPs溶液。
②向1.2mL、浓度为12nM的Au NBPs溶液中加入6μL、102μM 4-ATP溶液，在室温下孵育12h；反应结束后离心收集沉淀物，并用超纯水洗涤3次，最终分散于超纯水中，得到AuNBPs@4-ATP溶液。
③用Tris-HCl缓冲溶液稀释前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C至浓度为 12μM，再加入1.1mL、浓度为12nM的Au NBPs@4-ATP溶液，室温下搅拌 10h；反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后分散在Tris-HCl 缓冲溶液中，即得浓度为1.9nM的AuNBPs@4-ATP/PSA-C溶液。
3，荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将30μL ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液与220μL Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液在200μLPBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育6h，固液分离收集沉淀物，将其重新分散在PBS缓冲液中；将配制好的一系列浓度为10fg/mL、100fg/mL、 1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的 PSA标准溶液分别加入到上述溶液中，室温下振荡孵育6h；之后使用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次；通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。
测试例
1，检测方法的特异性研究：
取20μL ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液与200μL Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液在150μLPBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育5h，固液分离收集沉淀物，将其重新分散在PBS缓冲液中；将浓度为200pg/mL的不同干扰物质包括BSA、 CEA、L-半胱氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸分别与浓度为1ng/mL的PSA混匀后加入到反应体系中，在室温下振荡5.5h；之后使用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次。仅存在1ng/mL PSA 时溶液的发光强度明显恢复，其余非特异性分子未见明显变化；由此说明，当检测环境中存在其他高浓度的干扰物时，发光强度不因其他物质存在而发生明显的增强或减弱。通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。仅存在1ng/mL PSA时溶液的拉曼信号降低，其余非特异性分子未见明显变化；这表明开发的传感器对PSA具有良好的特异性。
2，检测方法的准确性研究：
1mL正常人血液在400rpm转速下离心5min后吸取上层血清，体积为0.5 mL。用PBS溶液将血清稀释到1mL。样品1，样品2，样品3，样品4的人血清中添加的PSA标准样品的浓度分别为1pg/mL，10pg/mL，50pg/mL和1 ng/mL。将50μL制备好的加标血清试样加入到实施例2的检测体系中，室温下振荡孵育5h。经过254nm紫外灯照射10min，测试每组溶液的发光光谱及发光强度，每组溶液测三次。血清中PSA的回收率在97.7％-103％的范围内。通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。得到血清中PSA的回收率在98.0％-100.3％的范围内。这一实验结果表明了本方法具有很高的准确性，可以实现在血液样品中PSA的准确定量检测。

Claims (10)

1.一种基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，所述的分析方法具体包括以下步骤：将ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液，与Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液搅拌混匀，固液分离取沉淀物，并将其重新分散在PBS缓冲液中，加入PSA溶液并用紫外灯照射，最后分别测定溶液荧光光谱以及拉曼光谱。
2.根据权利要求1所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，所述分析方法的具体步骤如下：
(1)ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液的制备方法：
①长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的制备：
将Cr(NO3)2、Zn(NO3)2、Yb(NO3)2、Er(NO3)2、锗酸铵溶液与Ga(NO3)2溶液混合均匀得到溶液1，随后加入CTAB，并调节溶液的pH值至7-9，超声处理，搅拌混匀后进行水热反应，待反应结束后固液分离取沉淀物，洗涤并干燥即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs；
②长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的氨基化：将上述所得ZGGO:Cr,Er,Yb NPs分散于NaOH溶液中，剧烈搅拌后固液分离取沉淀，并将其分散在N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES试剂，在75-85℃水浴中加热，待反应结束后固液分离取固相，并将固相分散在水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③长余辉纳米粒子表面前列腺特异性抗原适配体PSA-A修饰：向PSA-A溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液EDC/NHS孵育30-40min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液，并在室温下振荡孵育5-6h，反应结束后固液分离取沉淀物，用水清洗最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液；
(2)Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液的制备方法：
①金锥纳米Au NBPs溶液的制备：将HAuCl4、十六烷基三甲基氯化铵CTAC、柠檬酸溶液与NaBH4溶液混合搅拌；将所得溶液在75-85℃油浴中加热85-95min得到金种溶液，将上述金种溶液加热CTAB、HAuCl4、AgNO3、HCl与AA抗坏血酸的混合溶液中，并孵育1.8-2.2h得到金锥纳米Au NBPs溶液；
②Au NBPs@4-ATP的制备：向金锥纳米Au NBPs溶液中加入4-ATP溶液，反应结束后固液分离取固相并用水洗涤，将固相溶解在水中得到Au NBPs@4-ATP溶液；
③表面前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C修饰：向前列腺特异性抗原适配体互补链PSA-C溶液中加入步骤②中所得Au NBPs@4-ATP溶液，室温下搅拌8-10h；反应结束后固液分离收集沉淀物，用水清洗最后分散在Tris-HCl缓冲溶液中，即得Au NBPs@4-ATP/PSA-C溶液；
(3)荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A溶液与Au NBPs/PSA-C溶液在PBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育4-6h，固液分离收集沉淀物，将其重新分散在PBS缓冲液中；将PSA标准溶液分别加入到上述溶液中，室温下振荡孵育5-6h；之后使用250-260nm紫外灯照射，测试所得溶液的荧光光谱，得到以PSA浓度对数为横坐标，以检测探针ZGGO:Cr,Er,Yb/PSA-A的发光恢复程度F-F0为纵坐标的标准曲线；测试所得溶液的拉曼光谱，得到以PSA浓度对数为横坐标，以检测探针Au NBPs@4-ATP/PSA-C的拉曼信号变化程度I-I0为纵坐标的标准曲线，其中，所述F代表有PSA时的荧光强度；I代表有PSA时的拉曼强度；F0代表没有PSA时的荧光强度；I0代表没有PSA时的拉曼强度。
3.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(1)①中所述Cr(NO3)2、Zn(NO3)2、Yb(NO3)2、Er(NO3)2、锗酸铵与Ga(NO3)2的摩尔比为0.04-0.06:12-14:0.2-0.3:0.02-0.03:2-3:14-16；CTAB的使用量为15-17mg。
4.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(1)①中所述水热反应条件为在110-130℃条件下加热14-16h。
5.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(1)②所述ZGGO:Cr,Er,Yb NPs和固体NaOH的质量比为8-12:0.48-1.2，N,N-二甲基甲酰胺溶剂与APTES溶液体积比为30-50:0.2-0.8。
6.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(1)③前列腺特异性抗原适配体PSA-A稀释后的浓度为5-15μM，EDC/NHS浓度为55-65mM，所述稀释后PSA-A溶液、EDC/NHS和氨基化的ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液体积比为22-24:5-7:4-6。
7.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(2)①所述制备金种溶液时所用的HAuCl4、CTAC、柠檬酸溶液与NaBH4的摩尔比为2.2-2.5：495-505：45-55：6.1-6.5；制备Au NBPs时CTAB、HAuCl4、AgNO3、HCl与AA的摩尔比为8-12:0.04-0.06:0.0008-0.0012:1-3:0.07-0.09。
8.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(2)②中Au NBPs与4-ATP的摩尔比为1:50-1:60。
9.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，步骤(2)③中所述PSA-C与Au NBPs@4-ATP的摩尔比为1:90-1:110。
10.根据权利要求2中所述的基于荧光淬灭拉曼增强的前列腺特异性抗原双信号光谱分析方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中所述PBS缓冲溶液浓度为8-12mM，pH为7.2-7.6；Tris-HCl缓冲液pH为7.0-7.4。
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