CN107764786A - 基于阳离子脂质体‑基因结合动力学的检测方法 - Google Patents

基于阳离子脂质体‑基因结合动力学的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及基于阳离子脂质体‑基因结合动力学的检测方法。本发明通过琼脂糖凝胶电泳技术定性定量的分析阳离子脂质体与基因的结合过程；通过构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱技术及停流光谱技术来检测阳离子脂质体与基因之间的结合过程，拟合其结合动力学曲线符合线性方程，实现从宏观和微观检测阳离子脂质体‑基因结合动力学的目的。本发明公开的阳离子脂质体‑基因结合动力学的检测方法，适用于研究带正电荷的阳离子脂质体与基因的体外结合动力学过程，拓宽了琼脂糖凝胶电泳技术、荧光光谱技术和停流光谱技术的应用，并为阳离子脂质体基因载体递送机制研究及进一步应用研究提供理论基础。

Description

基于阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法
技术领域
本发明涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及基于阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法。
背景技术
近几十年来，随着对基因的深入研究，科学家发现许多疾病，如遗传性疾病癌症，都与人体的基因异常有密切关系。将正常的外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常，从根本上消除产生疾病症状的内因，达到治疗或者预防疾病的目的[1]，从而产生了一种革新性的治疗方法，即基因治疗。基因治疗过程中，如何将基因安全高效地递送到病变组织或细胞，是基因治疗成功的关键。阳离子脂质体是目前研究最深入、应用最广泛的一种基因递送载体，可通过带正电的头部和基因上带负电的磷酸基团结合，有效地压缩基因形成复合物，使基因能够顺利通过各种障碍，如逃逸免疫系统、穿透细胞膜、从内涵体释放等，完成基因递送过程[2]。在阳离子脂质体递送基因的过程中，阳离子脂质体与基因的结合动力学是阳离子脂质体介导基因高效递送的关键问题，阳离子脂质体与基因结合得太疏松，基因可能会在血液中提前释放而无法到达靶部位；两者结合得过于紧密又不利于基因与阳离子脂质体发生解离，影响基因在细胞内释放，从而影响其递送效率。
对于阳离子脂质体与基因结合动力学的研究，国内外相关报道甚少。Lai等[3]跟踪了阳离子脂质体与质粒DNA在不同电荷比例下的复合过程，发现初始复合物很快形成，但随即聚集形成尺寸更大的复合物，大尺寸的复合物会影响载体的递送效率。梁德海课题组发现siRNA与聚酰胺-胺型树枝状大分子、商用试剂Lipofectamine 2000以及寡聚精氨酸形成的复合物随着时间也会发生再聚集[4]，影响载体的转染效率。这些技术只是从阳离子脂质体与基因结合过程中复合物尺寸的变化，颗粒的聚集情况考察阳离子脂质体与DNA结合过程对转染效率的影响。国内外尚缺少通过动力学技术对阳离子脂质体与基因结合过程的研究，严重制约阳离子脂质体的发展。
凝胶电泳作为一种高分辨、高灵敏、高速度、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。目前，对于凝胶电泳在动力学方面的应用还未有报道。
FRET是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于10nm)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。目前，对于荧光光谱法在阳离子脂质体与基因结合动力学方面的研究还未见报道。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种从宏观和微观检测阳离子脂质体-基因结合动力学的方法，通过琼脂糖凝胶电泳技术直观且定量的分析不同时间阳离子脂质体与基因结合情况。通过构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪和停流光谱仪检测宏观及微观时间内阳离子脂质体与基因之间的结合动力学，并拟合其结合动力学方程。
本发明采用如下技术方案：一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，具体步骤如下：
(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，阳离子脂质体与基因的质量比(N/P)8：1～1：1，随即将上述复合物在0～70min进行琼脂糖凝胶电泳实验，通过琼脂糖凝胶电泳成像系统软件定量分析阳离子脂质体结合基因的量；
(2)采用荧光染料分别标记阳离子脂质体与基因，按阳离子脂质体与基因的质量比8：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪检测阳离子脂质体与基因结合0～70min内复合物的发光强度；
(3)将核酸染料与基因结合，构建FRET体系，加入阳离子脂质体使其与核酸染料竞争结合基因，采用停流光谱仪检测阳离子脂质体与基因在0-200s内的瞬时结合动力学，得到结合动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程y＝-0.0004x+1.3657。其中，x代表结合时间，y代表结合后荧光变化，用电压表示。
优选的，所述的阳离子脂质体为氨基酸型阳离子脂质体、肽型阳离子脂质体、单价季铵盐阳离子脂质体和双子型季铵盐阳离子脂质体。
优选的，所述的基因包括质粒DNA、siRNA。
优选的，所述步骤(2)中用于标记阳离子脂质体的荧光染料为磷脂酰乙醇胺(N-(biotinoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,NBD-PE)，标记基因的荧光染料为罗丹明123。
优选的，所述的与基因结合的核酸染料为有机染料分子(Gelred)或溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)。
优选的，所述的阳离子脂质体与基因的质量比6：1。
本发明与现有技术相比，具有下列优点：
1.本发明从宏观时间及秒级时间内分析阳离子脂质体与基因的结合过程，并定量的分析阳离子脂质体结合基因的情况。现有技术仅从阳离子脂质体与基因结合过程中复合物尺寸的变化，颗粒的聚集情况考察阳离子脂质体与基因的结合过程，而阳离子脂质体与基因的结合作用比较复杂，其结合情况是阳离子脂质体介导基因高效递送的关键，阳离子脂质体与基因结合得太疏松，基因可能会在血液中提前释放而无法到达靶部位；两者结合得过于紧密又不利于基因与阳离子脂质体发生解离，影响基因在细胞内释放，从而影响其递送效率。运用本发明可以对阳离子脂质体介导基因递送的机制进行深入分析。
2.目前，凝胶电泳技术和荧光光谱技术还没有运用到结合动力学研究领域。本发明可以实现将凝胶电泳技术和荧光光谱技术应用于阳离子脂质体与基因结合动力学方面的研究。从宏观时间下测定阳离子脂质体与基因的结合过程。同时，与停流光谱技术结合使用，进一步测量脂质体与基因在秒级内的结合情况，为精准测量阳离子脂质体与基因的结合奠定了技术基础。
本发明取得的有益效果是，可以在宏观时间及微观时间下测定阳离子脂质体与基因的结合过程，并精确定量测定了阳离子脂质体结合基因的量，拟合出阳离子脂质体与基因结合动力学轨迹符合线性方程y＝-0.0004x+1.3657。拓宽了凝胶电泳及荧光光谱的应用，并为阳离子脂质体基因载体的基因递送机制研究提供了理论基础。
附图说明
图1为阳离子脂质体与质粒DNA在N/P为6:1时结合不同时间的凝胶电泳图；(泳道1为Marker，泳道2为裸DNA，泳道3-19为结合时间分别为2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,30,40,50,60,70min)
图2为0～70min内阳离子脂质体与质粒DNA在N/P为6:1时结合质粒DNA的量；
图3为荧光光谱仪检测阳离子脂质体与质粒DNA在N/P为6:1时结合不同时间的荧光强度；
图4为阳离子脂质体与质粒DNA的结合动力学曲线。
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
实施例1
将1.2μL浓度为1mg/mL的阳离子脂质体CDO14D用超纯水稀释至10μL，将0.4μL浓度为0.5μg/μL的pGL-3质粒DNA用超纯水稀释至10μL，阳离子脂质体CDO14D与pGL-3质粒DNA按照质量比6:1混合后，在2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,30,40,50,60,70min时进行凝胶电泳实验。比较各点DNA条带与裸DNA条带，在凝胶成像系统软件中算出阳离子脂质体结合质粒DNA的量。结果如图1所示，通过电泳实验得出在0-70min内，随着结合时间的延长，阳离子脂质体结合DNA的量也逐渐增多，从0逐渐增大到100％，在10、20、30、40、50、60和70min，脂质体与DNA结合量分别为28％、38.5％、79.5％、89％、95.5％、99％和100％。从50min开始趋于平衡，说明阳离子脂质体与DNA几乎完全结合。
实施例2
将1mg荧光染料NBD-PE溶于1mL无水乙醇，取50μLNBD-PE乙醇溶液加到1mL阳离子脂质体CDO14D中，制成溶液A。将1mg荧光染料罗丹明123溶于1mL二甲基亚砜，取此溶液2.5μL与5μL浓度为0.5μg/μL的pGL-3质粒DNA混合，加入10μL PBS缓冲液，再用超纯水稀释至50μL，制成溶液B。取64μL溶液A和200μL溶液B混合，用436μL超纯水稀释至700μL。用荧光光谱仪检测混合液于0～70min混合液的荧光强度。检测条件为：激发波长466nm，发射波长529nm，激发狭缝为1nm，发射狭缝为0.8nm，扫描范围为500-750nm。结果如图2-3所示，在0-70min内，随着结合时间的延长，复合物的荧光强度也逐渐增大，从0逐渐增大到7.07×103，从50min开始达到平衡，说明阳离子肽脂质体完全结合DNA。
实施例3
阳离子肽脂质体CDO14D与pGL-3质粒DNA分别配制稀释液，其中CDO14D与pGL-3质粒DNA的质量比为6:1：将3μL GelRed(10000×)加到30μL浓度为1μg/μL的pGL-3质粒DNA中(溶液A)，180μL 1mg/μL的阳离子脂质体CDO14D用820μL超纯水稀释(溶液B)。将溶液A和溶液B分别转入注射器中，注射进停流光谱仪，记录0～250s内荧光强度的变化。检测条件为：激发波长260nm，发射波长600nm，仪器恒温25℃。从0-200s，其荧光强度呈下降趋势，说明阳离子肽脂质体与DNA的结合是瞬时发生的。数据通过线性拟合得到结合动力学轨迹符合线性方程y＝-0.0004x+1.3657。
参考文献
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[2]Loh X.J.,Lee T.C.,Dou Q.Q.,et al.Utilising inorganic nanocarriersfor gene delivery.Biomaterials Science2016,4:70-86.
[3]Lai E.,van Zanten J.H.Real time monitoring of lipoplex molar mass,size and density.ControlledRelease2002,82:149-158.
[4]Zhou J.H.,Liu J.,Shi T.,et al.Phase separation ofsiRNA-polycationcomplex and its effect ontransfectionefficiency.SoftMatter2013,7:2262-2268.
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，阳离子脂质体与基因的质量比为8：1～1：1，将上述复合物在0～70min进行琼脂糖凝胶电泳实验，通过琼脂糖凝胶电泳成像系统软件定量分析阳离子脂质体结合基因的量；
(2)采用荧光染料分别标记阳离子脂质体与基因，按阳离子脂质体与基因的质量比8：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪检测阳离子脂质体与基因结合0～70min内复合物的发光强度；
(3)将核酸染料与基因结合，构建FRET体系，加入阳离子脂质体使其与核酸染料竞争结合基因，采用停流光谱仪检测阳离子脂质体与基因在0-200s内的瞬时结合动力学，得到结合动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程y＝-0.0004x+1.3657；其中，x代表结合时间，y代表结合后荧光变化，用电压表示。
2.根据权利要求1所述的一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，所述的阳离子脂质体为氨基酸型阳离子脂质体、肽型阳离子脂质体、单价季铵盐阳离子脂质体和双子型季铵盐阳离子脂质体。
3.根据权利要求1所述的一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，所述的基因包括质粒DNA、siRNA。
4.根据权利要求1所述的一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中用于标记阳离子脂质体的荧光染料为磷脂酰乙醇胺，标记基因的荧光染料为罗丹明123。
5.根据权利要求1所述的一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，所述与基因结合的核酸染料为有机染料分子或溴化乙锭。
6.根据权利要求1所述的一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中发光强度的检测条件为：激发波长466nm，发射波长529nm，激发狭缝为1nm，发射狭缝为0.8nm，扫描范围为500-750nm。
7.根据权利要求1所述的一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中停流光谱仪检测的检测条件为：激发波长260nm，发射波长600nm，仪器恒温25℃。
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