JP2018508023A - 競合アッセイによる小分子のナノポア検出法 - Google Patents

Abstract

標的物と代理物との間の競合アッセイを行う段階、およびその後にナノポア装置において複合体タイプを検出する段階による、混合試料における標的小分子の検出のための方法および組成物を、本明細書に開示する。ナノポアを用いた小分子の検出のための競合アッセイを、本明細書に開示する。十分なサイズの（20 kDaより大きい）標的分子は、固体状態のナノポアを通過する時に、電流インピーダンス、移行時間、または他の測定可能なパラメータにおける変化を引き起こす。標的分子が十分に大きくはなく、したがって顕著な変化を引き起こさない場合には、追加の分子／試薬を、検出を手助けするために使用することができる。この検出試薬は、小分子または「捕捉リガンド-分子複合体」に結合することになる（例えば、ペプチド検出は、ペプチド／アプタマー複合体を認識するモノクローナル抗体（mAb）によって手助けされる）。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月11日に提出された米国特許仮出願第62/131,969号の恩典を主張し、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。

背景
小分子は、多くの生物学的機能において重要な役割を果たす。小分子は、タンパク質の機能を、例えば、それらに結合すること、およびそれらの正常な機能を阻害または活性化することによって変更できるため、その中でタンパク質が作動するシステムを混乱させる／破壊することができる。次に、そのような破壊は、疾患を誘発するか、または疾患の進行を加速することがある。他方で、小分子の投薬量を制御することによって、これらのシステム内でタンパク質が果たす役割についての詳細を明らかにすることができる（Stockwell, Brent R. "Exploring biology with small organic molecules." Nature 432. 7019 (2004): 846-854（非特許文献1））。小分子の存在および濃度の検出はまた、薬物代謝などの代謝プロセスの結果を評価するために使用することもでき、これは、臨床試験および薬物有効性研究に恩恵をもたらし、かつ加速することができよう。小分子はまた、ヒトおよび動物の診断法を超えて、農作植物のストレスおよび水質のモニタリング目的を含み、環境の状態を評価するために使用することもできる。小分子を検出し、正確に定量する能力は、したがって、生物工学の多くの領域にわたって価値がある。

小分子を測定するためには、多くの利用可能な方法がある；安価であるが、精度および感度に欠けるものもあれば、非常に感度が高いが、高価でありかつ複雑であるものもある。より安価なハイスループット法は、一般に、関心対象の標的分子に色素を結合させる段階、および、試料の総計としての蛍光または吸光度を検出する段階を含む。この技法は、高い偽陽性および／または高い偽陰性を作り出す、色素または干渉分子の非特異性によって妨害されうる。高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析を含むより複雑な分析法は、標的小分子を精密に測定することができるが、複雑かつ高価であり、専用の実験スペースおよび訓練された人員を必要とする。したがって、必要とされるのは、（色素結合アッセイと同様に）費用効率が高く、高い特異性、感度、および精度を提供し、かつ携帯型装置上で行うことができる、小分子を検出する方法である。小分子の検出および／または定量のための好ましい分析試験は、専用の実験室に拘束されることなく、かつ特化された設備または訓練された人員を必要としないであろう。さらに、好ましい分析装置は、低価格であり、かつ高い再現性のものであろう。したがって、ナノポア形状および／またはより大きいナノポアの範囲に許容性を示す低価格の装置上で、正確なかつ低価格の分析結果を提供するための方法が、必要とされる。

Stockwell, Brent R. "Exploring biology with small organic molecules." Nature 432. 7019 (2004): 846-854

概要
ナノポアを用いた小分子の検出のための競合アッセイを、本明細書に開示する。

十分なサイズの（20 kDaより大きい）標的分子は、固体状態のナノポアを通過する時に、電流インピーダンス、移行時間、または他の測定可能なパラメータにおける変化を引き起こす。標的分子が十分に大きくはなく、したがって顕著な変化を引き起こさない場合には、追加の分子／試薬を、検出を手助けするために使用することができる。この検出試薬は、小分子または「捕捉リガンド‐分子複合体」に結合することになる（例えば、ペプチド検出は、ペプチド／アプタマー複合体を認識するモノクローナル抗体（mAb）によって手助けされる）。

しかし、この戦略が理想的ではない小分子（例えば、薬物化合物）が依然として存在しうる。例えば、標的小分子がひとたび捕捉されると、追加の検出分子を結合するのに利用可能な表面積の低減のために、それに対する検出試薬を作り出すことが難しい可能性がある。したがって、本発明者らは、小分子化合物の検出、ならびに、結合親和性および速度論（K_on、K_off、K_d、K_mなど）を測定する能力の両方を可能にする、新たな戦略を考案した。方法はまた、複合集合体（例えば、HIV Envタンパク質単量体、二量体、または三量体）を調査するのにも適用可能である。

いくつかの態様において、試料中に存在する疑いのある標的分子の有無を検出するための方法を本明細書に提供し、本方法は、層を含む装置を提供する段階であって、該層が、装置の内部空間を第1の体積と第2の体積とに分け、該層が、該第1の体積と該第2の体積とを接続するナノポアを含み、かつ該装置が、ナノポアを通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む、前記段階；代理分子、融合分子、およびポリマー骨格を提供する段階であって、該融合分子が、該ポリマー骨格を結合して骨格／融合分子複合体を形成するように適合したポリマー骨格結合ドメインを含み、かつ、該代理分子または該標的分子を結合するように適合した標的分子結合ドメインを含む、前記段階；該代理分子および該融合分子を該試料と組み合わせることによって競合アッセイを行う段階であって、該標的分子が該試料中に存在する場合に、該標的分子が、該標的分子結合ドメインに対する結合について該代理分子と競合する、前記段階；該試料を該第1の体積中に負荷する段階；該ナノポアへ電圧を印加する段階であって、該第1の体積が、該ポリマー骨格、該融合分子、該代理分子、および、該標的分子を含む疑いのある該試料を含み、該ポリマー骨格が該融合分子にハイブリダイズし、かつ該融合分子が、該代理分子または該標的分子にハイブリダイズする、前記段階を含む。

いくつかの態様において、印加された電圧は、標的分子または代理分子に結合した骨格／融合分子複合体の、ナノポアを通る第1の体積からの移行を誘導して、センサーにより検出される電気信号における変化を生成する。いくつかの態様において、方法は、検出された電気信号における変化を時間の関数として記録する段階をさらに含む。さらなる態様において、方法は、検出されて記録された電気信号における変化を時間の関数として分析して、試料における標的小分子の有無を判定する段階を含む。

いくつかの態様において、競合アッセイは、試料を第1の体積中に負荷した後に行われる。いくつかの態様において、競合アッセイは、試料を第1の体積中に負荷する前に行われる。

いくつかの態様において、代理分子はマレイミドポリエチレングリコールを含む。いくつかの態様において、代理分子は、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、アミン、カルボン酸、ハロゲン化物、エステル、マレイミド、チオール、ジシクロカルビミド、ピリジル、ピリジルジスルフィド、およびアセチルからなる群より選択される化学反応基を含む。いくつかの態様において、代理分子は、強いかまたは弱い求核試薬または求電子試薬を含む。いくつかの態様において、代理分子は、ペプチド、デンドリマー、核酸、ナノもしくはミクロビーズもしくは粒子、量子ドット、タンパク質、ポリヌクレオチド、リポソーム、抗体、または抗体断片を含む。いくつかの態様において、代理分子は、ペイロード分子に結合するように適合したペイロード結合部位を含む。さらなる態様において、ペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、蛍光体、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、PEG分子、リポソーム、またはコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される。いくつかの態様において、ペイロード分子は電荷を含む。いくつかの態様において、荷電ペイロード分子は、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、またはイオンからなる群より選択される。いくつかの態様において、代理分子は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、金属結合、およびビオチン‐アビジン相互作用からなる群より選択される相互作用を介してペイロード分子に結合している。

いくつかの態様において、標的分子は、サイズが30,000 Da、20,000 Da、10,000 Da、5,000 Da、2,000 Da、1,000 Da、500 Da、200 Da、100 Da、50 Da、20 Da、または10 Da未満の小分子を含む。いくつかの態様において、標的分子は、ペプチド、インスリン、オキシトシン、アミノ酸、タンパク質もしくはタンパク質のドメイン、ヌクレオチド、オリゴマー、DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、ホルモン、脂質、コレステロール、代謝産物、糖、グリカン、ペプチドグリカン、ポリグリカン、リン脂質、ステロイド、化学合成アゴニストおよびアンタゴニスト、ポリ核酸の合成誘導体、多環式芳香族炭化水素、炭素分解副産物、ダイオキシン、シクロヘキサミド、ビタミン、アデノシン三リン酸およびATP類似体、神経伝達物質、ドーパミン、L-ドーパ、セロトニン、金属、電解質、有機金属、麻薬および麻薬誘導体、ヒアルロン酸、またはレチノールを含む。

いくつかの態様において、融合分子はペプチド核酸を含む。いくつかの態様において、融合分子は、システインタグ付加されたビスペプチド核酸を含む。いくつかの態様において、融合分子は、架橋化核酸、ロックド核酸、ビオチン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン誘導体、ジンクフィンガータンパク質、zfp結合ドメイン、CRISPRドメイン、TALEN、DNA、PNA、またはRNAオリゴマーを含む。

いくつかの態様において、ポリマー骨格は、ナノポアへの電位の印加時に、第1の体積から第2の体積へ該ナノポアを通って移行するように適合した負荷電ポリマーまたは正荷電ポリマーを含む。いくつかの態様において、ポリマー骨格は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、DNA/RNAハイブリッド、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む。

いくつかの態様において、センサーは、単一のナノポアのみを通過する物体を同定するように構成されている。いくつかの態様において、センサーは電気センサーである。いくつかの態様において、センサーは、ナノポアへの電圧の印加時に、該ナノポアを通って流れる電流を検出する。

いくつかの態様において、時間の関数としての電気信号における変化の分析は、代理分子に結合した骨格／融合物複合体のナノポアを通る移行によるイベントと、標的分子に結合した骨格／融合物複合体の該ナノポアを通る移行によるイベントとの分離を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される標的小分子検出の方法は、90％、95％、98％、または99％より大きい、標的小分子の検出の信頼度を提供する。いくつかの態様において、試料は、第1の体積中への負荷の前に精製されない。

いくつかの態様において、ナノポアは、直径が少なくとも5 nm、10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、または50 nmである。いくつかの態様において、装置は、連続した少なくとも2つのナノポアを含み、ペイロード分子に結合したアンプリコンは、移行の間に該少なくとも2つのナノポア中に同時に存在する。

また、以下を含むキットも、本明細書に提供する： ナノポアを含む装置であって、該装置が、装置の内部空間を第1の体積と第2の体積とに分ける層を含み、該層が、該第1の体積と該第2の体積とを接続する該層を通るナノポアを含み、かつ該装置が、ナノポアを通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む、前記装置；代理分子、融合分子、およびポリマー骨格であって、該融合分子が、該ポリマー骨格を結合して骨格／融合分子複合体を形成するように適合したポリマー骨格結合ドメインを含み、かつ、該代理分子または該標的分子を結合するように適合した標的分子結合ドメインを含む、前記代理分子、融合分子、およびポリマー骨格；ならびに、該装置における競合アッセイの結果を観察することにより、該標的小分子の有無を検出するための使用説明書。

いくつかの態様において、キットの代理分子はマレイミドポリエチレングリコールを含む。いくつかの態様において、キットの代理分子は、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、アミン、カルボン酸、ハロゲン化物、エステル、マレイミド、チオール、ジシクロカルビミド、ピリジル、ピリジルジスルフィド、およびアセチルからなる群より選択される化学反応基を含む。いくつかの態様において、キットの代理分子は、弱いかまたは強い求核試薬または求電子試薬を含む。いくつかの態様において、キットの代理分子は、ペプチド、デンドリマー、核酸、ナノもしくはミクロビーズもしくは粒子、量子ドット、タンパク質、ポリヌクレオチド、リポソーム、または抗体を含む。いくつかの態様において、キットの代理分子は、ペイロード分子に結合するように適合したペイロード結合部位を含む。

いくつかの態様において、キットのペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、蛍光体、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、PEG分子、リポソーム、またはコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される。いくつかの態様において、キットのペイロード分子は電荷を含む。いくつかの態様において、キットの荷電ペイロード分子は、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、またはイオンからなる群より選択される。いくつかの態様において、キットの代理分子は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、金属結合、およびビオチン‐アビジン相互作用からなる群より選択される相互作用を介してペイロード分子に結合している。

いくつかの態様において、標的分子は、サイズが30,000 Da、20,000 Da、10,000 Da、5,000 Da、2,000 Da、1,000 Da、500 Da、200 Da、100 Da、50 Da、20 Da、または10 Da未満の小分子を含む。いくつかの態様において、キットの標的分子は、N-エチルマレイミド、ペプチド、インスリン、オキシトシン、アミノ酸、タンパク質またはタンパク質のドメイン、ヌクレオチド、オリゴマー、DNA、RNA、ホルモン、脂質、コレステロール、代謝産物、糖、グリカン、ペプチドグリカン、ポリグリカン、リン脂質、ステロイド、化学合成アゴニストおよびアンタゴニスト、合成誘導体（PNA、LNA、BNA）、多環式芳香族炭化水素（PAH）、炭素分解副産物、ダイオキシン、シクロヘキサミド、ビタミン、アデノシン三リン酸およびATP類似体、神経伝達物質、ドーパミン、L-ドーパ、セロトニン、金属、電解質、有機金属、麻薬および麻薬誘導体、ヒアルロン酸、ならびにレチノールからなる群より選択される分子を含む。

いくつかの態様において、キットの融合分子はペプチド核酸を含む。いくつかの態様において、キットの融合分子は、システインタグ付加されたビスペプチド核酸を含む。いくつかの態様において、キットの融合分子は、標的小分子を結合するドメインに融合した、架橋化核酸、ロックド核酸、ビオチン、ストレプトアビジン（またはストレプトアビジン誘導体）、ジンクフィンガータンパク質またはzfp結合ドメイン、CRISPRドメイン、TALEN、DNAまたはRNAオリゴマーを含む。

いくつかの態様において、キットのポリマー骨格は、ナノポアへの電位の印加時に、第1の体積から第2の体積へ該ナノポアを通って移行するように適合した負荷電ポリマーまたは正荷電ポリマーを含む。いくつかの態様において、キットのポリマー骨格は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、DNA/RNAハイブリッド、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む。

いくつかの態様において、キットにおける装置のセンサーは、単一のナノポアのみを通過する物体を同定するように構成されている。いくつかの態様において、キットにおける装置のセンサーは電気センサーである。いくつかの態様において、キットにおける装置のセンサーは、ナノポアへの電圧の印加時に、該ナノポアを通って流れる電流を検出する。

また、試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法も、本明細書に提供し、本方法は、層を含む装置を提供する段階であって、該層が、装置の内部空間を第1の体積と第2の体積とに分け、該層が、該第1の体積と該第2の体積とを接続するナノポアを含み、かつ該装置が、ナノポアを通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む、前記段階；代理分子、融合分子、およびポリマー骨格を提供する段階であって、該融合分子が、該ポリマー骨格を結合して骨格／融合分子複合体を形成するように適合したポリマー骨格結合ドメインを含み、かつ、該代理分子または該標的分子を結合するように適合した標的分子結合ドメインを含む、前記段階；該代理分子および該融合分子を該試料と組み合わせることによって競合アッセイを行う段階であって、該標的分子が該試料中に存在する場合に、該標的分子が、該標的分子結合ドメインに対する結合について該代理分子と競合する、前記段階；該試料を該第1の体積中に負荷する段階；該ナノポアへ電圧を印加する段階であって、該第1の体積が、該ポリマー骨格、該融合分子、該代理分子、および、該標的分子を含む疑いのある該試料を含み、該ポリマー骨格が該融合分子にハイブリダイズし、かつ該融合分子が、該代理分子または該標的分子にハイブリダイズする、前記段階；ナノポアにおける該標的小分子に結合した該骨格／融合分子の捕捉速度を、ナノポアにおける該代理分子に結合した該骨格／融合分子の捕捉速度と比較して、該実験試料における標的小分子の量を定量する段階を含む。

試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法のいくつかの態様において、電圧は、標的分子または代理分子に結合した骨格／融合分子複合体の、ナノポアを通る第1の体積からの移行を誘導して、センサーにより検出される電気信号における変化を生成する。いくつかの態様において、試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法は、電気信号における変化を時間の関数として記録する段階をさらに含む。いくつかの態様において、試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法は、電気信号における変化を時間の関数として分析して、該試料における該標的小分子の有無を判定する段階をさらに含む。

試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法のいくつかの態様において、競合アッセイは、該試料を第1の体積中に負荷した後に行われる。試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法のいくつかの態様において、競合アッセイは、該試料を第1の体積中に負荷する前に行われる。

前述のおよび他の目標、特徴、および利点は、同様の参照文字が異なる図を通して同じ部分を指す添付の図面において例証されるような、本発明の特定の態様の以下の説明から明らかであろう。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに、本発明の種々の態様の原理を例証することに重きがおかれている。また本開示の態様として、特徴を例証するデータ図も、限定ではなく例示のみにより提供される。

標的小分子が、骨格／融合物複合体の小分子結合ドメインに結合するようにペイロードが付加された代理小分子と競合する、競合アッセイの概略図を図示する。 上記の、1つずつナノポア中に捕捉される、骨格／融合分子‐標的分子タイプおよび骨格／融合分子‐代理分子タイプを図示する。 骨格／融合分子‐標的分子タイプおよび骨格／融合分子‐代理分子タイプについての理想的なナノポア電流イベントシグネチャを図示する。 ナノポア装置での単一分子検知を実証する。（a）V＝100 mVの電圧で直径27 nmのナノポアを通過する3.2 kb dsDNA骨格によって引き起こされた、代表的な電流シフトイベント（1M LiCl）。イベントを、伝導度シフトの深さ（δG＝δI/V）および持続時間によって定量する。（b）10分に渡って記録した744イベントについてのδG対持続時間の散布図。 その後の競合反応に参照対照として使用するための、RP-HPLCによる個々の反応物の特徴決定を示す。 複合体形成を検証し、PNA分子に対する競合的結合の結果を評価するための、RP-HPLCによる、システイン標識されたPNA分子と変動する濃度の過剰なPEG-マレイミドおよび／またはNEMとのインキュベーションの産物の特徴決定を示す。 NEMが標的物であり、PEGが代理物であり、各々がDNA骨格に結合するPNA上の結合部位について競合する、ナノポアで試験した骨格／融合物‐標的物複合体（レーン4）および骨格／融合物‐代理物複合体（レーン9）の、電気泳動移動度を比較するゲルを示す。 NEMが標的物であり、PEGが代理物である、骨格／融合物‐標的物複合体および骨格／融合物‐代理物複合体について記録された代表的なイベントを示す。添加されたペイロードサイズの代理物は、より深くてより長く続くイベントシグネチャを作り出す。 同じ孔上で記録された、すべての骨格／融合物‐標的物イベント、次いですべての骨格／融合物‐代理物イベントについての、平均δG対持続時間の散布図を示す。 図7における集団由来の、時間と共に記録された、100μsよりも短い持続時間を有するイベントのパーセンテージの進展を示す。エラーバーは、測定されたパーセンテージにおける不確定度を示す。 両方ともナノポア上で試験した、骨格／融合物‐標的物複合体および骨格／融合物‐代理物複合体の、1：1（レーン3）および4：1（レーン9）の代理物：標的物競合比での電気泳動移動度を比較するゲルを示す。前述のように、NEMは標的物であり、PEGは代理物であり、各々はDNA骨格に結合するPNAに対して競合して結合する。 100％骨格／融合物‐標的物複合体および100％骨格／融合物‐代理物複合体、ならびにまた、4：1および1：1の代理物：標的物（PEG：NEM）競合比でのインキュベーション後の骨格／融合物についての、δG対持続時間の散布図を示す。すべての試薬タイプを、測定間に洗い流して、同じ孔上で連続的に記録した。 図10における集団由来の、時間と共に記録された、100μsよりも短い持続時間を有するイベントのパーセンテージの進展を示す。エラーバーは、測定されたパーセンテージにおける不確定度を定量する。100μsよりも速いイベントにおける増大は、代理分子と比較して増大する、骨格／融合物複合体に対する標的小分子結合の画分を示す。 複合体形成を検証し、PNA分子に対する競合的結合の結果を評価するための、RP-HPLCによる、システイン標識されたPNA分子と、固定された濃度のPEG-マレイミド、変動する濃度のNEMとのインキュベーションの産物の特徴決定を示す。 NEMが標的物であり、PEGが代理物であり、各々がDNA骨格に結合するPNA上の結合部位について競合する、ナノポアで試験した骨格／融合物‐標的物複合体（(a)、レーン4）および骨格／融合物‐代理物複合体（(b)、レーン4）の電気泳動移動度を比較するゲルを示す。 同じ孔上で記録された、すべての骨格／融合物‐標的物イベント、次いですべての骨格／融合物‐代理物イベントについての、δG対持続時間の散布図を示す。 図13における集団由来の、時間と共に記録された、70μsよりも短い持続時間を有するイベントのパーセンテージの進展を示す。エラーバーは、測定されたパーセンテージにおける不確定度を定量する。 すべての3種をナノポア上で試験した、骨格／融合物‐標的物複合体および骨格／融合物‐代理物複合体の、50：1（(a)、レーン4）および10：1（(b)、レーン4）および2：1（(b)、レーン9）の代理物：標的物競合比での、電気泳動移動度を比較するゲルを示す。前述のように、NEMは標的物であり、PEGは代理物であり、各々はDNA骨格に結合するPNA上の結合部位について競合する。 図18における集団由来の、時間と共に記録された、70μsよりも短い持続時間を有するイベントのパーセンテージの進展を示す。エラーバーは、測定されたパーセンテージにおける不確定度を定量する。70μsよりも速いイベントの画分は、標的物：代理物比が増大するにつれて増大する。

詳細な説明
本出願を通して、本文は、本発明の装置、組成物、システム、および方法の種々の態様に言及する。説明される種々の態様は、さまざまな例証となる例を提供するように意味され、代替の種の説明として解釈されるべきではない。むしろ、本明細書に提供される種々の態様の説明は、重複する範囲でありうることが注目されるべきである。本明細書において議論される態様は、単に例証となるだけであり、本発明の範囲を限定するようには意味されない。

また本開示を通して、種々の刊行物、特許、および公開特許明細書が、特定する引用によって参照される。これらの刊行物、特許、および公開特許明細書の開示は、これにより、それらの全体が参照により本開示中に組み入れられる。

本明細書において使用される際、「含む」という用語は、システム、装置、および方法が、列挙される構成要素または段階を含むが、他のものを排除しないことを意味するように意図される。システム、装置、および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」とは、組み合わせに対していずれかの本質的な意義を有する他の構成要素または段階を排除することを意味するものとする。「からなる」とは、他の構成要素または段階を排除することを意味するものとする。これらの移行句の各々によって定義される態様は、本発明の範囲内である。

範囲を含むすべての数値表示、例えば、距離、サイズ、温度、時間、電圧、および濃度は、0.1の増分によって（＋）または（−）に変動する近似値である。すべての数値表示は「約」という用語が前につくことが、いつも明記されるわけではないが、理解されるべきである。本明細書に記載する構成要素は、単に例示であること、およびそのようなものの同等物は当技術分野において公知であることもまた、いつも明記されるわけではないが、理解されるべきである。

本明細書において使用される際、「内部空間を分けるナノポアを含む装置」とは、内部空間を2つの体積またはチャンバに分ける構造内に開口部を構成する孔を有する装置を指すものとする。装置はまた、孔と孔の間ごとに1つの共通のチャンバを伴う、1つより多いナノポアを有することもできる。

本明細書において使用される際、「融合分子」という用語は、骨格に結合する1つと、小分子と結合または反応するもう1つの、少なくとも2つのドメインを含有する分子を指す。

本明細書において使用される際、「標的小分子」という用語は、試料内に存在する可能性も存在しない可能性もある関心対象の小分子を指す。分子生物学および薬理学において、小分子は、生物学的プロセスの調節を助長するか、または、人工（すなわち合成薬物）もしくは天然の産物（例えばタンパク質）のいずれかの、より大きい分子の分解産物（代謝産物）である、低分子量の（1000ダルトンより小さい）有機化合物である。本特許出願の文脈において、本発明者らは、小分子を、固体状態のナノポアを通って往復する時に識別できる電気信号を確実に作り出すにはそれ自体では小さすぎる任意の分子として定義するため、本発明者らの小分子の定義はより広い。いくつかの態様において、小分子は、サイズが10,000 Da未満の任意の標的分子であることができるが、それらに限定されない。しかし、サイズが10,000 Daより大きい小分子もまた、ナノポアにおいて検出することが難しい場合があるため、本明細書に記載される競合アッセイを使用して、これらの小分子を同様に検出することができる。

本明細書において使用される際、「代理分子」または「代理小分子」という用語は、標的小分子と同じである可能性も同じではない可能性もある、分子を指す。代理分子は、融合分子の同じ結合部位または反応部位について、標的小分子と競合する。いくつかの態様において、代理分子は、ナノポアにおいて検出されるのに十分なほど大きい。いくつかの態様において、代理分子は、ペイロード分子に結合することができるか、または結合している小分子である。この態様において、ペイロード分子は、ナノポアにおける代理小分子の検出を容易にする。いくつかの態様において、代理小分子は、ペイロード分子に結合するように適合しているか、または構成されている。本明細書が、ペイロード分子に付加された代理小分子に言及する場合、骨格／融合分子複合体に結合した時にナノポアにおいて検出されうるならば、ペイロードを伴わない小分子が代わりに使用されてもよい。

本明細書において使用される際、「ペイロード」または「ペイロード分子」という用語は、代理小分子に結合して、ナノポアにおける競合小分子の検出の選択性および／または感度を増強する、分子または化合物を指す。いくつかの態様において、ペイロード分子は、1：1の比で代理小分子に結合している。

本明細書において使用される際、「骨格」または「ポリマー骨格」という用語は、電圧の印加時にナノポアを通って移行する、負荷電ポリマーまたは正荷電ポリマーを指す。いくつかの態様において、ポリマー骨格は、融合分子に結合することができるか、または結合している。いくつかの局面において、ポリマー骨格は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、DNA/RNAハイブリッド、またはポリペプチドを含む。骨格はまた、天然に存在する分子または生体分子ではなく、化学合成ポリマーであってもよい。好ましい態様において、ポリマー骨格は、ナノポアを通る移行時により予測可能な信号を可能にし、かつssDNAまたはRNA中に存在する二次構造を低減させるdsDNAである。いくつかの態様において、ポリマー骨格は、骨格の末端上に、または骨格の両端に存しうる融合分子結合部位を含む。骨格と融合分子とは、共有結合、非共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して接続されうる。

本明細書において使用される際、「融合物」または「融合分子」という用語は、1）骨格結合ドメイン、および2）小分子結合ドメインまたは反応部位の2つのドメインを有する、巨大分子または化合物を指す。例となる融合分子は、関心対象の小分子に特異的である、アプタマーが付加されたPNA（dsDNA骨格を結合するため）である。第2の融合物の例は、関心対象の小分子中の特異的な化学基との選択的反応性のために化学基に融合したPNA結合ドメインである。小分子結合ドメインまたは反応化学基は、高い特異性、および公知のまたは測定可能な親和性で関心対象の標的小分子を結合する能力を有し、かつまた、ペイロードが付加された代理小分子を結合する能力も有する。

本明細書において使用される際、「結合する」または「結合」という用語は、化学結合、例えば、共有結合、イオン結合、または金属結合の形成を指す。結合は、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、および／または平面スタッキング相互作用を介した2つの分子間の安定な会合を含むことができる。結合は、伝統的な化学的または生化学的カップリング手法（触媒を伴うかまたは伴わない）を用いた、ケトンおよび求核試薬などの2つの（またはそれより多い）化学反応基間の結合形成を含むことができる。いくつかの態様において、2つの分子間の安定な会合は、結合部位と安定な相互作用を形成する別の分子の競合的結合によって破壊することができる。

本明細書において使用される際、「結合部位」または「結合ドメイン」という用語は、別の分子に特異的に結合する、分子または化合物上の領域を指す。いくつかの態様において、ポリマー骨格に特異的な結合ドメインを含み、標的小分子および代理分子に特異的な結合ドメインをさらに含む融合分子を、本明細書に開示する。結合ドメインでの融合分子と他の分子との間の安定な会合（例えば、ドッキング）は、イオン結合、水素結合、およびファンデルワールス力などの非共有結合性分子間結合によって、または、結合ドメインと標的分子もしくはリガンドとの間の共有結合によって（すなわち、化学的もしくは生化学的反応性を通して）形成させることができる。

本明細書において使用される際、「競合」または「競合アッセイ」という用語は、両方の分子タイプが各骨格／融合分子上の標的分子結合ドメインに結合しようとする、代理分子（例えば、ペイロードが付加された代理小分子）と標的小分子との間の競合を指す。標的分子結合ドメインに対する結合についての競合は、競合的、非競合的、または不競合的であることができる。

本明細書において使用される際、「骨格／融合物‐標的物」または「骨格／融合物‐標的物複合体」という用語は、骨格／融合分子複合体上の標的分子結合ドメインに結合した標的小分子を指す。

本明細書において使用される際、「骨格／融合物‐代理物」または「骨格／融合物‐代理物複合体」という用語は、骨格／融合分子上の標的分子結合ドメインに結合した代理分子（例えば、ペイロード結合代理小分子）を指す。

本明細書において使用される際、「ナノポア」という用語は、特定のサイズのポリマーの通過を可能にするのに十分なサイズの開口部（穴またはチャネル）を指す。ナノポアを通って荷電ポリマーを動かすために増幅器で電圧を印加し、この孔を通る電流によって、分子がそれを通過するかどうかを検出する。

本明細書において使用される際、「センサー」という用語は、ナノポア装置から信号を収集する装置を指す。多くの態様において、センサーは、分子または他の実体、特にポリマー骨格が孔を通って移動する時に孔におけるイオン電流を測定するために、孔の2つの面に置かれた電極のペアを含む。電極に加えて、追加のセンサー、例えば光センサーが、ナノポア装置において光信号を検出するためにあってもよい。他のセンサーが、電流遮断、電子トンネル電流、電荷誘導性電界効果、ナノポア通過時間、光信号、光散乱、およびプラズモン共鳴などの特性を検出するために使用されてもよい。

本明細書において使用される際、「電流測定値」という用語は、時間に伴う、ナノポアを通る印加された電圧での電流の一連の測定値を指す。電流は、イベントを定量するために測定値として表され、電圧によって正規化された電流（伝導度）もまた、イベントを定量するために使用される。

本明細書において使用される際、「開口チャネル」という用語は、電流が分析ソフトウェアによって規定される閾値から外れない、ノイズ範囲内のナノポアチャネルを通る電流のベースラインレベルを指す。

本明細書において使用される際、「イベント」という用語は、電流測定値が規定された閾値による開口チャネル値から外れる時に始まり、電流が開口チャネル値の閾値内に戻るときに終わる、電流インピーダンス測定値のセットを指す。

本明細書において使用される際、「電流インピーダンスシグネチャ」という用語は、検出されたイベント内で特定された電流測定値および／またはパターンの収集物を指す。複数のシグネチャがまた、イベント内に存在して、分子タイプ間の識別を増強する可能性もある。

本明細書において使用される際、「標的物検出イベント」という用語は、骨格／融合物‐標的物複合体がナノポアを通り抜けたという信号を送る、特徴的なイベントまたは電流インピーダンスシグネチャを指す。本明細書において使用される際、「代理物検出イベント」という用語は、骨格／融合物‐代理物複合体がナノポアを通り抜けたという信号を送る、特徴的なイベントまたは電流インピーダンスシグネチャを指す。

代理物標的物検出イベントは、嵩を追加するペイロードによることができる。代理小分子に結合したペイロード分子の追加された嵩は、骨格／融合物‐標的物複合体と骨格／融合物‐代理物複合体との間の識別を可能にするものであり、その識別は、電流インピーダンスシグネチャにおける1つまたは複数の差に基づく。

代理物標的物検出イベントは、ペイロード電荷によることができる。代理小分子に結合したペイロード分子の追加された電荷は、骨格／融合物‐標的物複合体と骨格／融合物‐代理物複合体との間の識別を可能にするものであり、その識別は、電流インピーダンスシグネチャにおける1つまたは複数の差に基づく。

代理物標的物検出イベントは、嵩および長さとは別に、骨格／融合物‐標的物複合体と骨格／融合物‐代理物複合体との間の識別を可能にする、他の特徴を有するペイロードに起因することが可能であり、その識別は、電流インピーダンスシグネチャにおける1つまたは複数の差に基づいている。例となる特徴には、ペイロードの親水性、疎水性、長さ、アミノ酸組成、塩基組成、または他の化学的特徴が含まれる。

本明細書において使用される際、「捕捉速度」という用語は、ナノポア装置において時間と共に検出されるイベントの数を指す。いくつかの態様において、捕捉速度は、具体的に、特定の複合体と関連するイベントの捕捉および／または移行の速度を指すことができる。本明細書に記載される際、捕捉速度は、類似したナノポア条件の下で類似した質量／電荷比を有する対照と比較して濃度を推測するために使用することができる。

競合アッセイ
標的物と代理物との間の競合アッセイの使用、および、ナノポアにおける検出（例えば、電流インピーダンスシグネチャによる）を可能にするように適合した、標的物結合巨大分子と代理物結合巨大分子との間の識別用のナノポア装置の使用による、標的小分子を検出するための方法および組成物を、本明細書に開示する。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法、組成物、および装置は、骨格DNA結合分子がナノポアを通過する際のそれらの純粋に電気的な計数を可能にするように適合している。「標的物結合骨格／融合物」という実証内で提供される例は、単一の骨格／融合巨大分子がナノポアを通過するたびに、「代理物結合骨格／融合物」から識別することができる決定的なかつ堅牢な信号を提供する。これにより、混合試料からの正確なかつ精密な標的分子の検出および定量の速いかつ単純な手段が可能になり、化学的検出または光学的検出を必要としない電気的検出法を用いて、数分で100s〜1000sまたはそれより多い標的分子を個々に計数し、バックグラウンドの非標的分子から区別することが可能になる。さらに、装置の安価なハードウェア、低い電力要求量、小さなサイズ、およびナノポア形状の範囲に対する許容性を考慮すると、製作費用および装置費用は極めて低い。

いくつかの態様において、ナノポア装置において分析される競合結合アッセイを行う方法を、本明細書に提供する。1つの態様において、競合結合アッセイは、飽和（平衡）分析を用いて行われ、ここでは、代理小分子が飽和曲線を生成するのに十分な濃度であり、そこからB_max値を得ることができる。いくつかの態様において、固定された量の骨格‐融合物を、増大する濃度の代理小分子とインキュベートして、平衡に達するようにさせる。次いで、骨格を孔に通過させて、小分子代理物が結合した骨格の量を記録する。代理分子結合骨格／融合物複合体の量を代理分子の濃度に対して比較することによって、対数濃度ベースの応答曲線を生成させ、そこから、代理小分子の最大複合体結合（B_max）濃度を決定することができる。このB_max濃度を、次いで、その後の競合アッセイにおいて使用することができる。代理分子と融合分子との間の結合相互作用のK_Dは、X軸上の切片がB_maxと同等であり、Y軸が、結合していない骨格で割った代理物結合骨格である、スキャッチャードプロットから算出することができる。このプロットについて、勾配は、-1／K_Dと同等である。このK_D値、すなわち50％結合骨格を結果としてもたらす代理小分子の濃度は、下記の標準曲線を生成する時に使用される。競合アッセイは、算出されたB_maxを用いて、標的小分子を含有する試験試料を複数の異なる濃度に希釈する段階、各濃度を骨格‐融合物複合体とインキュベートする段階、および混合物を平衡に達するようにさせる段階によって行うことができる。次いで、B_max濃度の代理分子を混合物に添加し、反応が再び平衡に達するのに十分長く（例えば、典型的には5〜10分）インキュベートする。反応物をナノポア装置中に置き、ナノポアへ電圧を印加して、ナノポアを通るポリマー骨格‐融合物複合体の移行を誘導し、各々の電気シグネチャを観察して、複合体が代理分子に結合しているか標的分子に結合しているかを判定する。

いくつかの態様において、代理物結合複合体の捕捉速度を記録する。この捕捉速度を、次いで、代理物結合骨格の濃度（X軸）に対する結合イベントの捕捉速度（1秒あたり）（Y軸）を測定することによって生成される標準曲線にマッピングして、試験試料における代理物結合骨格の濃度を推定することができる。インキュベーションあたりの骨格分子の数は既知であり、各骨格は1個の小分子のみに結合できるため、小分子の数を決定することができる。例えば、未知の試料における代理物結合骨格の速度が、標準曲線上の50％結合速度に合致し、かつ1mlあたり100万個の骨格を反応において使用した場合には、小分子濃度は1mlあたり50万個であると推測することになる。

検出に対する統計学的有意性の割り当て
いくつかの態様において、時間と共に記録されたセンサー測定値のセットの集計、および数学的ツールの適用を行って、前の節で詳述されたような、試料中に存在する疑いのある標的小分子の検出に対して数的信頼値を割り当てる。

ナノポアイベント集団の特徴における差に基づいてバックグラウンド（すなわち、他の分子タイプ）から分子タイプを識別する定量法が、最近開発された（Morin, T.J., et al., "Nanopore-based target sequence detection," 2015年12月31日にPLOS Oneに投稿）。この識別法は、変動するタイプの他の分子の存在の中で特定の分子タイプを検出できること、および検出の統計学的有意性を割り当てられること（例えば、99％信頼度での試薬Xの検出）を意味する。方法を下記で提供される実施例に適用するために、最初にここで方法の概要を述べる。

一般用語において、孔の上のチャンバ中には2つのカテゴリーの分子が存在する：タイプ1は骨格／融合分子‐代理分子であり、タイプ2は骨格／融合分子‐標的分子である。実験からのデータに基づいて、タイプ2イベントの有意な画分中に存在し、かつタイプ1イベントの相対的により小さい画分中に存在するイベントシグネチャ判断基準を特定する。シグネチャ判断基準は、δG、持続時間、各イベント内のレベルの数および特徴、ならびに／またはイベント信号からコンピュータ計算された他の数値もしくは値の組み合わせに依存しうることになる。

イベントシグネチャ判断基準は、手動で、または表引きにより、または自動様式において選択できることに注目されたい。例えば、事前の実験により、所定の試験中に存在することが期待される孔サイズの範囲および他の条件についての陽性対照および陰性対照の性能を確立することができ、所定の試験について（すなわち、所定の代理小分子／ペイロードタイプについて）比較可能な条件が生じた時には、そのような対照から特定された選択判断基準を（表引き様式において）使用することができる。自動判断基準は、例えば、試料の直前の対照ランに基づいて、リアルタイムでも特定することができる。本出願において開示されるような、リアルタイムでの試料からの標的小分子の検出のためには、自動判断基準選択が適しており、好ましいアプローチである。具体的には、試料を試験する前に、タイプ1イベント集団を生成する対象を使用して、「タイプ2陽性」イベント対「タイプ1陽性」イベントに目印をつけるための判断基準を確立する「タイプ2イベント境界」の算出を自動化することができる。境界は、2Dプロットにおいて点の周りに曲線を適合させる任意の方法によってコンピュータ計算されうることになる（例えば、点は、平均シフト内のイベント対持続時間のプロットである）。曲線適合法は、最小二乗法、線形計画法もしくは二次計画法、または任意の形態の数値最適化、および区分的多項式もしくはスプラインの係数を介した境界のパラメータ化を伴うことができる。凸包のコンピュータ計算が、境界を提供することができる。より高い次元の境界適合ルーチンもまた、例えば、イベントを特徴決定する3特性（3D境界）を用いて可能である。結果として生じた境界は、多角形または平滑であることができよう。特定のパーセンテージのイベントを含む境界でイベントのサブセットを囲む目的の（すなわち、自動判断基準の特定のために点を囲む時にアウトライアーを切り捨てる機構としての）、関連する技法は、全確率のz画分を含有する最小領域の境界として定義される、z分位境界をコンピュータ計算することである。例えば、95％分位境界は、全確率の95％（データの95％）を含有する最小領域の境界である。確率密度は未知であるが、データを用いて、および標準的な数値技法で推定することができる。

ひとたび判断基準が選択されると（手動で、表引きにより、または自動様式において）、イベントを、シグネチャ判断基準がそのイベントに合う場合にはタイプ2であるとして「タグ付加」する。pを、捕捉イベントがタイプ2である確率として定義する。タイプ2分子を伴わない対照実験において、p＝0を知り、タイプ2分子について試験する実験において、pが0より大きいかどうかを知りたい。偽陽性の確率をq1＝Pr（タグ付加｜タイプ1イベント）と定義する。骨格／融合分子‐代理分子のみを伴う対照実験または実験のセットにおいて、q1は、妥当な数の捕捉イベントから良好な精度で決定される。タイプ2分子がバルク溶液中に存在するかどうかを判定するための検出実験において、捕捉イベントがタグ付加される確率は、pの関数であり、以下のように概算することができる。
Q(p)＝（タグ付加イベントの数）／N

式において、Nはイベントの総数である。99％信頼区間のQ(p)±Q_sd(p)は、
Q_sd(p)＝2.57*sqrt｛Q(p)*（1−Q(p)）／N｝
（sqrt｛ ｝は平方根関数である）
でコンピュータ計算することができる。実験の経過中に、イベントの数Nが増大するにつれて、Q(p)の値は収束し、不確定性範囲は減衰する。記録時間の関数としてのQ(p)±Q_sd(p)のプロットは、それが各試薬タイプについていかに進化するかを示す（図10、図13、図17、図19）。タイプ2分子を伴わない対照実験において、Q(0)＝q1であることに注目されたい。

検出実験において、以下の判断基準が真である時、タイプ2分子は99％信頼度で存在する。
Q(p)−Qsd(p)＞q1 （1.）

上記の判断基準が真である場合に、pは0より大きいと結論づけ；真ではない場合は、pは0より大きいとは言えない。フレームワークを、下記に提供する実施例において利用する。

測定された捕捉速度からの濃度の推定
いくつかの態様において、時間と共に記録されたセンサー測定値のセットの集計、および数学的ツールの適用を行って、試料中に存在する疑いのある標的小分子の濃度を推定する。

いくつかの態様において、変動する濃度の1つまたは複数の骨格、融合物、代理小分子および／または標的小分子が試料中に存在する疑いがある間は、プロセス（試料を骨格／融合試薬とインキュベートし、ナノポア実験を行う）を繰り返すことができる。データセットを次いで組み合わせて、より多くの情報を集めることができる。1つの態様において、標的小分子の総濃度は、集計されたデータセットへの数学的ツールの適用によって推定されることになる。

文献（Wang, Hongyun, et al., "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180j；Benner, Seico, et al., "Sequence-Specific Detection of Individual DNA Polymerase Complexes in Real Time Using a Nanopore." Nature Nanotechnology 2, no. 11 (October 28, 2007): 718-24 (doi:10.1038/nnano.2007.344)）中の方法にしたがい、生物物理学的モデルをナノポアデータに適用して、標的小分子とその基質との間の、および標的小分子と代理小分子との間の競合を伴う、結合および平衡反応速度論を定量することができる。上記で引用されたWang et al.における研究は、タンパク質のそのDNA基質に対する2つの相互に排他的でありかつ競合する結合状態を検討した。同じモデリングフレームワークを適用することができるが、2つの異なる分子は、各基質分子と共に起こりうる2つの別個の結合構造を作り出す。

本発明者らのアッセイにおいて、ナノポアは、個々の分子をバルク相から試料採取して測定している。標的分子の存在下で、あらゆる骨格／融合物は、結合した標的または結合した代理物を有することになり、骨格／融合物‐標的物複合体の画分は、標的の濃度に比例することになる。代理物濃度と比べて高い標的濃度では、標的の結合が迅速に進行し、骨格／融合物複合体のすべては標的に結合することになる。代理物濃度と比べてより低い濃度では、代理物の結合が相対的に迅速に進行し、骨格／融合物複合体のすべては代理物に結合することになる。中間の濃度では、0ではないパーセンテージの骨格／融合物イベントが、標的に結合している（タイプ2）として目印をつけられ、このパーセンテージは、時間が経過しても一定のままであり、ナノポアに隣接したバルク相チャンバにおいて反応が速く平衡に達することになる。

総標的小分子濃度を推定するために、繰り返した実験を、ナノポアで、2種以上の異なる濃度の代理分子および一定の骨格／融合物濃度を用いて実施することができる。共通の試料の一部分を用いることが標的分子濃度を保存する一方で、低い濃度（1 pM）から高い濃度（100 nM）までの、様々な濃度の代理分子の量を設定することができる。目印がつけられた標的陽性イベントのパーセンテージおよび捕捉速度を測定することによって、Wang, Hongyun, et al., ACS Nano 7, no. 5（May 28, 2013）におけるモデリングフレームワークは、既知濃度の代理分子と競合する標的分子の総濃度の推定を可能にすることができる。方法は、標的物と融合分子上の標的分子結合ドメインとの間の結合親和性のあらかじめ確立されたKd値を使用するか、または、このKd値の推定を可能にするかのいずれかであることができる。総標的小分子濃度を推定するために、マルチナノポアアレイも実行することができ、各ナノポアは、推定される骨格／融合物‐標的物に対して様々な濃度の骨格／融合物‐代理物を測定することになる。

組成物
いくつかの態様において、ペイロード分子に結合した代理小分子を、本明細書に提供する。いくつかの態様において、ペイロード分子結合部位を含む代理小分子を、本明細書に提供する。

いくつかの態様において、ペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、蛍光体、タンパク質、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、フラーレン、PEG分子、リポソーム、またはコレステロール-DNAハイブリッド、または化学合成化合物であることができる。好ましい態様において、代理小分子とペイロードとは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合、ビオチン‐（ストレプト、ニュートラ、モノ）アビジン相互作用を介して直接的または間接的に接続される。ペイロードは、代理小分子に対して差別化する特徴を追加して、検出を容易にし、骨格／融合小分子に結合したペイロードは、ナノポアを通過する時に、ペイロードを有さない骨格／融合小分子よりも著しく異なる電流シグネチャを有する。いくつかの態様において、ペイロード分子は、別の分子に結合して分子の嵩高に影響を及ぼすことができ、それにより、ペイロードを有さない骨格／融合小分子とペイロードを有する骨格／融合小分子との間の識別の感度をさらに増強する。

いくつかの局面において、代理小分子は、ペイロード分子の認識および結合を引き起こすかまたは容易にする化学修飾を含む。いくつかの態様において、代理小分子は、十分な特徴、例えば、サイズ、長さ、電荷などを有し、そのため、骨格／融合巨大分子に結合した時に認識可能な電流インピーダンスシグネチャの生成を通して、ナノポアにおいて検出されるように適合している。

いくつかの態様において、標的小分子は、ペプチド、インスリン、オキシトシン、アミノ酸、タンパク質またはタンパク質のドメイン、ヌクレオチド、オリゴマー、DNA、RNA、ホルモン、脂質、コレステロール、代謝産物、糖、グリカン、ペプチドグリカン、ポリグリカン、糖類、オリゴ糖類、多糖類、リン脂質、ステロイド、化学合成アゴニストおよびアンタゴニスト、合成誘導体（PNA、LNA、BNA）、多環式芳香族炭化水素（PAH）、炭素分解副産物、ダイオキシン、シクロヘキサミド、ビタミン、アデノシン三リン酸およびATP類似体、神経伝達物質、ドーパミン、L-ドーパ、セロトニン、金属、電解質、有機金属、麻薬および麻薬誘導体、ヒアルロン酸、レチノールを含む。本発明は、いくつかの態様において、融合分子上の結合部位に対する結合について代理分子と競合することができる任意の標的小分子の検出のための新規の機構を提供するため、この一覧は排他的であるようには意味されない。

いくつかの態様において、ポリマー骨格は、電圧の印加時にナノポアを通って移行する、負荷電ポリマーまたは正荷電ポリマーを含む。いくつかの態様において、ポリマー骨格は、切断可能ドメインまたは切断可能リンカーを含む。いくつかの態様において、ポリマー骨格は、切断可能リンカーを含み、電圧の印加時に孔を通って移行する融合分子に結合することができるか、または結合している。いくつかの局面において、ポリマー骨格は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、DNA/RNAハイブリッド、またはポリペプチドを含む。骨格はまた、天然に存在する分子または生体分子ではなく、化学合成ポリマーであってもよい。好ましい態様において、ポリマー骨格は、ナノポアを通る移行時により予測可能な信号を可能にし、かつssDNAまたはRNA中に存在する二次構造を低減させるdsDNAである。いくつかの態様において、ポリマー骨格は、骨格の末端上に、または骨格の両端に存しうる融合分子結合部位を含む。骨格と融合分子とは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して接続されうる。あるいは、切断可能リンカー構成要素の骨格に対する直接共有結合性連結が、骨格と融合分子とを接続してもよい。あるいは、融合物の接続器構成要素が、直接共有結合性連結を介して骨格に接続可能リンカーをつないでもよい。好ましい態様において、骨格結合ドメインを含む融合分子は、DNA、RNA、PNA、ポリペプチド、コレステロール/DNAハイブリッド、またはDNA/RNAハイブリッドであることができる。

いくつかの態様において、本明細書に開示される分子は、修飾されるか、または、特異的結合ドメインを介して指定された実体に結合する能力を有することができる。結合モチーフを特異的に認識することができる分子、特にタンパク質が、当技術分野において公知である。例として、ヘリックス・ターン・ヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、ウィングドヘリックス・ターン・ヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、およびHMGボックスなどのタンパク質ドメインが、ヌクレオチド配列に結合できることが公知である。これらの分子のいずれかが、アンプリコンまたはプライマーに結合するペイロード分子として作用しうる。

いくつかの局面において、結合ドメインは、ロックド核酸（LNA）、架橋化核酸（BNA）、すべてのタイプのタンパク質核酸（例えば、ビスPNA、γ-PNA）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、クラスター化されて規則的に配置された短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）（CRISPR）、またはアプタマー（例えば、DNA、RNA、タンパク質、もしくはそれらの組み合わせ）であることができる。

いくつかの態様において、結合ドメインは、DNA結合タンパク質（例えば、ジンクフィンガータンパク質）、抗体断片（Fab）、化学合成結合剤（例えば、PNA、LNA、TALENS、もしくはCRISPR）、または合成ポリマー骨格（例えば、チオラート、ビオチン、アミン、カルボキシラート）中の化学修飾（すなわち、反応部分）のうちの1つまたは複数である。

ナノポア装置
提供されるようなナノポア装置は、装置の内部空間を2つの体積に分ける構造において開口部を形成する少なくとも1つの孔、および、孔を通過する物体を（例えば、物体を示すパラメータにおける変化を検出することにより）同定するように構成された少なくとも1つのセンサーを含む。本明細書に記載される方法のために使用されるナノポア装置はまた、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT公開公報第WO/2013/012881号においても開示されている。

センサー
上記のように、種々の局面において、ナノポア装置は、標的小分子の検出を実施するための1つまたは複数のセンサーをさらに含む。

装置において使用されるセンサーは、ペイロード分子に結合しているかまたは結合していない標的ポリヌクレオチドアンプリコンを同定するために適する任意のセンサーであることができる。例として、センサーは、ポリマーと関連する電流、電圧、pH値、光学的特性、または滞留時間を測定することにより、代理分子または標的小分子に結合したポリマー骨格／融合分子複合体を同定するように構成されることができる。他の局面において、センサーは、ポリマー骨格／融合物複合体の1つもしくは複数の個々の構成要素、またはポリマー骨格／融合分子複合体に結合もしくは付加した1つもしくは複数の構成要素（例えば、代理分子または標的小分子）を同定するように構成されてもよい。センサーは、測定可能なパラメータにおける変化であって、複合体に結合した実体、複合体の構成要素、または好ましくは、複合体に結合もしくは付加した構成要素を示す変化を、検出するように構成された任意の構成要素で形成されてもよい。1つの局面において、センサーは、分子または他の実体が孔を通って移動する時に孔におけるイオン電流を測定するために、孔の2つの面に置かれた電極のペアを含む。一定の局面において、孔におけるイオン電流は、孔を通過するポリマー骨格／融合分子セグメントが代理分子または標的分子に結合している時に、測定可能なように変化する。そのような電流における変化は、例えば、ポリマー骨格／融合分子複合体に結合した代理分子（および結合実体）または標的小分子の存在、不在、および／またはサイズに対応する予測可能、測定可能な方式で変動しうる。

好ましい態様において、センサーは、ナノポアへ電圧を印加しかつ電流を測定するために使用される電極を含む。ナノポアを通る分子の移行は、電気インピーダンス（Z）を提供し、これは、オームの法則であるV＝IZ（式中、Vは印加される電圧であり、Iはナノポアを通る電流であり、Zはインピーダンスである）にしたがって、ナノポアを通る電流に影響を及ぼす。逆に、信号を送り、ナノポアイベントを定量するために、伝導度G＝1／Zがモニタリングされる。分子が電界において（例えば、印加された電圧の下で）ナノポアを通って移行する時の結果が、電流シグネチャであり、これは、電流信号のさらなる分析時にナノポアを通過する分子と相関しうる。

電流シグネチャ由来の滞留時間測定値が使用される時、構成要素のサイズは、検知装置を通過するのにかかる時間の長さに基づいて、特定の構成要素と相関することができる。

1つの態様において、センサーは、ポリマー、ポリマーの構成要素（もしくは単位）、またはポリマーに結合もしくは付加した構成要素の光学的特性を測定するナノポア装置において提供される。そのような測定の1つの例は、赤外（または紫外）分光法による特定の単位に独特の、吸収バンドの特定を含む。いくつかの態様において、センサーは電気センサーである。いくつかの態様において、センサーは蛍光シグネチャを検出する。孔の出口の放射線源を使用して、そのシグネチャを検出することができる。

本技術を、以下の実施例および実験を参照することによってさらに定義する。本発明の範囲から逸脱することなく、多くの修飾が実施されうることが、当業者に明らかであろう。

実施例1：DNAのナノポア検出
固体状態のナノポアは、2つの水性体積を分ける薄い固体状態の膜において形成されたナノスケールの開口部である。電圧固定増幅器が、開いた孔を通るイオン電流を測定しながら、膜へ電圧Vを印加する。いずれの他の単一分子センサーとも異なり、ナノポア装置は、非常に低い費用で、手持ち型要素中にパッケージすることができる。二本鎖DNA（dsDNA）などの単一の荷電分子を、電気泳動により捕捉し、孔を通って動かす時、測定した電流シフト、ならびに伝導度シフトの深さ（δG＝δI／V）および持続時間を用いて、イベントを特徴決定する（図4(a)）。

δG（ΔGとも標識される）の値は、電圧で割った平均電流シフトとしてコンピュータ計算することができる。δG（ΔGとも標識される）の値はまた、電圧で割った最大電流シフトとしてもコンピュータ計算することができる。持続時間は、シフト幅としてコンピュータ計算する。

0.1 nMの3.2kb dsDNAを、直径27 nmのナノポアを有するナノポア装置中に置いた。ナノポア装置中の溶液は、1M LiClを含んだ。ナノポアへ100 mVの電圧を印加して、ナノポアへのdsDNAの移行を誘導した。イベントを、電流センサーによって検出し、下記のように分析した。

実験中の多くのイベントを記録した後、イベントの分布を分析して、対応する分子を特徴決定した。図4(b)は、10分で記録された744イベントを生じた、V＝100 mV（1M LiCl）の電圧で直径27 nmのナノポアを通過する0.1 nMの3.2 kb dsDNAについてのイベントの特徴を示す。2つの丸で囲んだ代表的なイベントは、フォールディングせずに通過するDNAに対応するより幅広くかつより浅いイベント；および、フォールディングされて通過するDNAに対応するより速いがより深いイベントを示す。約1 kbおよびより短いdsDNAについて、DNAは、フォールディングしない状態でのみ孔を通過する。

実施例2：標的分子および代理分子を変動させる競合アッセイ
本発明者らのアッセイ法を実証するために、単一のビスPNA分子（すなわち、融合分子）を伴うdsDNA骨格（すなわち、ポリマー骨格）を用いた。ビスPNAは、変動するあらかじめ選択された量の10kDa マレイミドポリエチレングリコール（PEG-mal）（すなわち、代理分子）と競合して、変動する濃度の小さなN-エチルマレイミド（NEM）（すなわち、標的小分子）と反応し、それに結合するように、システインタグ付加した。分析した標的物：代理物の相対比は、1：1および1：4であった。

試薬調製の方法は以下のようであった：25μMシステインタグ付加ビスペプチド核酸（ビスPNA）の溶液を、変動する選択された濃度の小分子N-エチルマレイミド（NEM、125 g/mol）および／または10kDa マレイミドポリエチレングリコール（PEG-mal、10,000 g/mol）と室温で20分の間、混合して反応させた。コンジュゲーションは、ビスPNA結合緩衝液（0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.4）中で実施した。

短時間のインキュベーション後に、反応産物を逆相HPLC（Agilent 1100シリーズ）により分析して、NEM-ビスPNAコンジュゲートおよび／またはPEG-ビスPNAコンジュゲートの組成を確認した。RP-HPLCにおいて、被分析物を、時間と共に有機移動相の濃度を増大させることによって非極性固定相から溶出させ、それらの特徴的な吸光度スペクトルによって同定した。それぞれの反応物のピーク吸光度は、220nm（10kDa PEG-マレイミド）、270nm（PNA）、および303nm（NEM）であった。PNAは反応物の最も強いシグナルを与えるため、それをすべての競合実験において使用して、PNA-NEMおよび／またはPNA-PEGの結果として生じる反応産物の進行をモニタリングした。

個々の反応物のみの溶出時間および吸光度スペクトルを、最初にRP-HPLCにより特徴決定して、その後の競合反応のための参照対照として使用した（図5）。PNAは、6.12分で溶出し、270nmで強い吸光度を呈した（図5(a)）。ピークはまた、9.80分でも溶出し、それは製造業者から提供されたPNAにおける不純物であると判定されて、次に続く反応のいずれにも関与しなかった。PEG-マレイミド分子自体は、18.73分で小さな広いピークを与え（図5(b)）、他方でNEMのみは、5.71分で非常に小さいピークを与えた（図5(c)）。競合する分子であるPEGおよびNEMによって放出されるシグナルが弱いために、6.12分でのPNA吸光度の消失、および強い270nm吸光度を伴う他の場所での新たなPNAピークの出現を、次いで、PNAカップリングの成功の指標として使用した。

PNAをPEG-マレイミドのみとインキュベートした時、カップリングしていないPNAを示す6.12分の溶出時間で通常検出されるPNA吸光度（図6、無地菱形）が消失し、270nmでの強い吸光度を有する新たな分子が17.86分で溶出して、PNA-PEGコンジュゲートの形成を示した（図6、無地正方形）。同様に、PNAをNEMのみとインキュベートさせた時、PNAは分子と完全に反応して、新たなピークが9.5分で出現した（図6、白丸）。PEGおよびNEMをまた、等モルおよび4：1のPEG対NEM比でPNAと反応させた（図6、無地星および無地十字）。17.86分でのピークの強度値は、NEM濃度がPEGに対して増大するにつれて試料に渡って減少し、NEMがシステインタグ付加PNA分子のチオール反応基について成功裡に競合できることを示す。

NEM-PNA複合体および／またはPEG-PNA複合体を、ポリマー骨格／融合分子複合体の形成（すなわち、ビスPNAコンジュゲートに対するdsDNAの結合）を可能にするように、ビスPNA結合緩衝液において60℃で2時間の間、1074bpの二本鎖DNA（dsDNA）断片と混合した。骨格‐融合分子結合複合体を、5％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動移動度シフトアッセイによって確認した（図7）。具体的には、5％ポリアクリルアミドゲルを泳動して、NEM（標的物）または10kDa PEG（代理物）のいずれかでタグ付加された（すなわち、結合した）PNA分子によるdsDNAの結合を評価した。裸の1074bp dsDNA（図7、レーン1）を、DNAに対して10倍〜100倍のモル過剰量のNEM結合PNAの範囲に渡る、増大する量のNEM結合PNAとインキュベートさせた（図7、レーン2から5）。50倍のモル過剰量のNEM結合PNAは、1074bp配列を完全に標識するのに十分であることが見出され（図7、レーン4）、そのため、その後のナノポア分析において使用した。PEGタグ付加PNAを、同様に、10倍〜50倍のモル過剰量の範囲に渡る濃度でdsDNAに結合させた（図7、レーン7〜9）。ナノポア分析に使用した試料は、存在するすべてのDNAがPEG標識PNAに結合している試料であった（図7、レーン9、50倍のモル過剰量）。

ひとたび検証されたら、ナノポア分析のために、泳動緩衝液（1M LiCl、10mMトリス、1mM EDTA、pH 8）において、NEMまたはPEG-malに結合したポリマー骨格／融合物複合体を示された濃度に希釈した。実施例1におけるすべての試薬を、22 nmの膜において同じ直径20〜22 nmの孔上で連続的に試験した。緩衝液のみの洗い流しを、各試薬タイプの試験の間に使用した。

最初に、DNA/PNA-NEM複合体は0.5 nMで、17分に渡って346イベントを生じた。図8および図9において見られるように、大部分のイベントは、100μsよりも速く、中央ドエル（IQR（四分位間範囲））＝44（20）μsecであった。捕捉速度は0.33 sec^-1（R²＝0.9973）であった。その後、1074 DNA＋PNA＋PEGを0.5 nMで測定して、20分に渡って651イベントを生じた。図8および図9において見られるように、多くのイベントは、100μsよりも長く、中央ドエル（IQR）＝72（275）μsecであった。捕捉速度は0.68 sec^-1（R²＝0.9985）であった。

「検出に対する統計学的有意性の割り当て」の節において確立されたフレームワークを適用することによって、タイプ2分子としてのDNA/PNA-NEM複合体、およびタイプ1分子としてのDNA/PNA-PEGの検出に対して統計学的信頼度を割り当てた。適している判断基準は、0.1 msよりも速い場合にイベントをタイプ2としてタグ付加することである。DNA/PNA-PEGを陰性対照として使用して、偽陽性q1＝0.585（58.8％）をコンピュータ計算することができる。DNA/PNA-NEM（タイプ2）対照は、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝94.7977±3.0752を生じた。数学的フレームワークの方程式（1）から、結果はQ(p)−Q_sd(p)＝0.917＞0.585であり、これは、DNA/PNA-NEM分子が99％信頼度で存在すると言えることを意味する。

記録時間の関数としてのQ(p)±Q_sd(p)のプロットを、図10において各試薬タイプ（DNA/PNA-NEMおよびDNA/PNA-PEG）について示す。DNA/PNA-NEM複合体（骨格／融合物‐標的物）が、記録の最初の1分以内に99％信頼度で検出されたことに注目されたい。

次に、PEG：NEM比を80：20および50：50で変動させて、ビスPNA結合部位についての競合が、ナノポア測定値においていかに転換されるかを評価した。

NEM（標的物）および10kDa PEG（代理物）でタグ付加されたPNA分子の溶液によるdsDNAの結合を、5％ポリアクリルアミドゲル上で検出した（図11）。PNA分子をdsDNAに結合させるために、等モル量のPEGおよびNEM（1：1）と事前に反応させたPNAの溶液を、DNAに対して10倍〜100倍のモル過剰量のPNAにおいて、1074bp dsDNA断片（すなわち、ポリマー骨格）と混合した（図9、レーン2〜5）。ナノポア分析を、各DNA分子がPNAタグ付加分子に結合している試料について実施した（図11、レーン3）。PNAをまた、4：1のモル比でPEGがNEMより多い、PEGおよびNEMの溶液と混合した。タグ付加されたPNA分子のこの溶液を、その後、同様の様式でDNAを浸潤させた（レーン7〜9、10倍〜50倍のモル過剰量）。ナノポア分析を、各DNA分子がPNAタグ付加分子に結合している試料について実施した（図11、レーン9）。

最初に、0.2 nM 1074 DNA/PNA＋PEG：NEM＝80：20は、19分に渡って952イベントを生じ、中央ドエル（IQR）＝56（44）μsecおよび1.0 sec^-1の捕捉速度（R²＝0.9984）であった。0.1 msよりも速いイベントの画分は、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝79.0966＋/−3.3946であった。その後、0.2 nM 1074 DNA/PNA＋PEG：NEM＝50：50は、15分に渡って754イベントを生じ、中央ドエル（IQR）＝48（20）μsおよび0.951 sec^-1の捕捉速度（R²＝0.9978）であった。0.1 msよりも速いイベントの画分は、PEGに対するNEMの相対量が増大するにつれて、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝91.7772＋/−2.577まで増大した。図12は、DNA/PNA-NEMおよびDNA/PNA-PEG対照、ならびにDNA/PNA＋PEG：NEM＝80：20およびDNA/PNA＋PEG：NEM＝50：50オーバーレイについてのイベントプロットを示す。DNAのみの対照も示す。図13は、図12における各試薬タイプについて、記録時間の関数としてのQ(p)±Q_sd(p)のプロットを示す。PEGに対するNEMの相対量が増大するにつれて画分が増大する傾向は、NEMとPEGとの間の競合がナノポアで検出可能であることを示す。NEMについて99％信頼度でここに示されるように、そのような測定値を使用して、標的小分子の存在を検出することができる。そのような測定値はまた、生物物理学的モデルと組み合わせて、標的小分子濃度を推定することもできる。

実施例3：固定された代理物および変動する標的分子での競合アッセイ
実施例2におけるように、単一のビスPNA分子を伴うdsDNA骨格を、変動する濃度のモデル標的小分子としての小さなN-エチルマレイミド（NEM）、および一定量のモデル代理物10kDaマレイミドポリエチレングリコール（PEG-mal）と混合したシステインタグ付加ビスPNAと共に使用した。代理物および標的小分子は、システインタグ付加ビスPNAに対する結合について競合した。代理分子の濃度は一定であり、標的物および代理物の両方を変動させた実施例2とは対照的であった。この実施例において調べた標的物：代理物の相対比は、1：2および1：10および1：50であった。各混合物から形成された複合体を、直径が20〜22 nmのナノポアを用いて22 nmの膜で分析した。

試薬調製の方法は以下のようであった：25μMシステインタグ付加ビスPNAの溶液を、250μM 10kDa PEG-malおよび変動する濃度のNEMと室温で20分の間、ビスPNA結合緩衝液において混合して、PEG-malまたはNEMを各システインタグ付加ビスPNAに結合させた。

短時間のインキュベーション後に、反応産物を逆相HPLC（Agilent 1100シリーズ）により分析して、NEM-ビスPNAコンジュゲートおよび／またはPEG-ビスPNAコンジュゲートの組成を確認した。個々の反応物のみの溶出時間および吸光度スペクトルを、最初にRP-HPLCにより特徴決定して、その後の競合反応のための参照対照として使用した（図5）。PNAは、6.12分で溶出し、270nmで強い吸光度を呈した（図5(a)）。ピークはまた、9.80分でも溶出し、それは製造業者から提供されたPNAにおける不純物であると判定されて、次に続く反応のいずれにも関与しなかった。PEG-マレイミド分子自体は、18.73分で小さな広いピークを与え（図5(b)）、他方でNEMのみは、5.71分で非常に小さいピークを与えた（図5(c)）。競合する分子であるPEGおよびNEMによって放出されるシグナルが弱いために、6.12分でのPNA吸光度の消失、および強い270nm吸光度を伴う他の場所での新たなPNAピークの出現を、次いで、PNAカップリングの成功の指標として使用した。

異なる実験設計を利用してシステインのチオール反応基についての競合を実証するために、PNAをまた、標的分子NEMを漸増させながら固定量のPEGとインキュベーションした。最初に、250μMのPEGのみを、25μM PNAとインキュベートして、明らかなピークを17.86分で検出した（図14、黒四角）。別の反応において、NEMを次いで、250μM PEGの存在下で5μM（図14、黒星）から125uM（図14、白三角）まで漸増させた。より多くのNEMが添加されるにつれて、17.86分でのPNA-PEGピークの明らかな低減が見られ、他方で、PNA-NEMコンジュゲートを示す9.5分でのピークの増大が検出された。まとめると、これらの結果は、標的分子NEMが、チオール反応基と成功裡に競合できることを示す。

NEM-PNA複合体および／またはPEG-PNA複合体を、dsDNAポリマー骨格に対するシステインタグ付加ビスPNA融合分子の結合を可能にするように、ビスPNA結合緩衝液において60℃で2時間の間、1074bp dsDNA断片と混合した。

インキュベーションの結果を、5％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動移動度シフトアッセイによって観察した（図15）。具体的には、図15(a)は、NEM（標的物）でタグ付加されたPNA分子に対するdsDNAの結合を評価するための5％ポリアクリルアミドゲルの泳動を示す。裸の1074bp dsDNA（(a)、レーン1）を、DNAに対して10倍〜100倍のモル過剰量の標識PNAの範囲に渡る、増大する量のNEM標識PNAとインキュベートさせた（(a)、レーン2〜5）。50倍のモル過剰量のNEMタグ付加PNAは、1074bp配列を完全に標識するのに十分であることが見出され、そのため、その後のナノポア分析において使用した（(a)、レーン4）。図12(b)は、10kDa PEG（代理物）とコンジュゲートされているPNA分子に対するdsDNAの結合を評価するために泳動された10％ポリアクリルアミドゲルを示す。1074bp DNAを、増大する濃度のPNA-PEGと同様にインキュベートして、各DNA分子がPNAに結合している試料を、ナノポア分析において使用した（(b)、レーン4）。

ひとたび複合体形成が検証されたら、ナノポア分析のために、泳動緩衝液（1M LiCl、10mMトリス、1mM EDTA、pH 8）において、試料を示された濃度に希釈して、ナノポア装置中に置いた（図16）。最初に、1074bp DNA-PNA-NEMは0.2 nMで、15分に渡って389イベントを生じ、（中央、IQR）ドエル＝（44, 16）μsec、0.45 sec^-1のイベント速度（R²＝0.9972）であった。その後、1074bp DNA-PNA-PEGは0.2 nMで、15分に渡って251イベントを、より長いイベントの増大を再び伴って生じ、（中央、IQR）ドエル＝（60, 252）μsec、0.2742 sec^-1の捕捉速度（R²＝0.9972）で、25％切り捨てたデータについてであった。

「検出に対する統計学的有意性の割り当て」の節において確立されたフレームワークを適用することによって、タイプ2分子としてのDNA/PNA-NEM複合体、およびタイプ1分子としてのDNA/PNA-PEGの検出に対して統計学的信頼度を割り当てた。適している判断基準は、0.07 msよりも速い場合にイベントをタイプ2としてタグ付加することである。DNA/PNA-PEGを陰性対照として使用して、偽陽性q1＝0.554（55.4％）をコンピュータ計算することができる。DNA/PNA-NEM（タイプ2）対照は、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝95.3728±2.7436を生じた。数学的フレームワークの方程式（1）から、結果はQ(p)−Q_sd(p)＝0.926＞0.554であり、これは、DNA/PNA-NEM分子が99％信頼度で存在すると言えることを意味する。

記録時間の関数としてのQ(p)±Q_sd(p)のプロットを、図17において各試薬タイプ（DNA/PNA-NEMおよびDNA/PNA-PEG）について示す。DNA/PNA-NEM複合体が、記録の最初の1分以内に99％信頼度で検出されたことに注目されたい。

次に、PEG：NEM比を50：1、10：1、および2：1で変動させて、ビスPNA結合部位についての競合が、特にPEG代理物が一定に保たれた時に、ナノポア装置においていかに観察されるかを評価した。

5％ポリアクリルアミドゲル（図18）を泳動して、NEM（標的物）および10kDa PEG（代理物）でタグ付加されたPNA分子の溶液によるdsDNAの結合を評価した。図18(a)は、10％ポリアクリルアミドゲルを泳動して、50：1のモル比でPEGおよびNEMを含有する溶液と反応したPNAのDNA結合能力を評価したことを示す。1074bp DNAを、10倍〜100倍のモル過剰量に及ぶ濃度で、増大する量の完全に反応したPNAとインキュベートした（図18(a)、レーン2〜5）。ナノポア分析を、PNA-PEG種およびPNA-NEM種による完全なDNA結合を呈する試料について実施した（図18(a)、レーン4）。図18(b)は、PEGおよび増大する量のNEM（それぞれ10：1および2：1のPEG対NEMのモル比）に結合したPNAのDNA結合能力を評価するために泳動された10％ポリアクリルアミドゲルを示す。1074bp DNAを、10倍〜100倍のモル過剰量に及ぶ濃度で、増大する量の結合したPNAとインキュベーションした（レーン2〜5＝10：1比、レーン7〜10＝2：1比）。ナノポア分析を、PNA-PEG種およびPNA-NEM種による完全なDNA結合を呈する試料について実施した（図18(b)、レーン4および9）。

まず、同じ孔上で、1074bp DNA-PNA-10×PEGおよび0.2×NEM（50：1の代理物：標的物）は、PEGのみのアッセイからは区別不能であった集団を伴い、15分に渡って337イベントを生じ、（中央、IQR）ドエル＝（68, 210）μsecであった。0.07 msよりも速いイベントの画分は、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝51.3353＋/−7.0132であり、これは、DNA/PNA-NEMの存在の検出を推測するほど十分には高くなかった。すなわち、方程式（1）を満たさないため、50：1の代理物：標的物比でのこの試験においては、DNA/PNA-NEMが存在したと言うことはできない。その後、1074bp DNA-PNA-10×PEGおよび1×NEMは、30分に渡って472イベントを生じ、（中央、IQR）ドエル＝（60, 76）μsecであった。0.07 msよりも速いイベントの画分は、PEGに対するNEMの相対量が増大するにつれて、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝62.0763＋/−5.7526まで増大した。数学的フレームワークの方程式（1）から、結果はQ(p)−Q_sd(p)＝0.563＞0.554であり、これは、DNA/PNA-NEM分子が99％信頼度で存在すると言えることを意味する。最後に、1074 bp DNA-PNA-10×PEGおよび5×NEMは、30分に渡って687イベントを生じ、（中央、IQR）ドエル＝（52, 48）μsecであった。0.07 msよりも速いイベントの画分は、PEGに対するNEMの相対量が増大するにつれて、99％信頼度でQ(p)±Q_sd(p)＝70.0146＋/−4.5029までさらに増大した。再び、数学的フレームワークの方程式（1）から、結果はQ(p)−Q_sd(p)＝0.655＞0.554であり、これは、DNA/PNA-NEM分子が99％信頼度で存在すると言えることを意味する。図19は、各試薬タイプについて、記録時間の関数としてのQ(p)±Q_sd(p)のプロットを示す。

実施例2におけるように、PEGに対するNEMの相対量が増大するにつれて画分が増大する傾向は、NEMとPEGとの間の競合がナノポアで検出可能であることを示す。NEMについて99％信頼度でここに示されるように、そのような測定値を使用して、標的小分子の存在を検出することができる。そのような測定値はまた、生物物理学的モデルと組み合わせて、標的小分子濃度を推定することもできる。99％信頼度で、Q(end)＝63.5015＋/−6.7551である。

Claims (56)

1. 試料中に存在する疑いのある標的分子の有無を検出するための方法であって、以下の段階を含む、方法：
   層を含む装置を提供する段階であって、該層が、装置の内部空間を第1の体積と第2の体積とに分け、該層が、該第1の体積と該第2の体積とを接続するナノポアを含み、かつ該装置が、ナノポアを通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む、前記段階；
   代理分子、融合分子、およびポリマー骨格を提供する段階であって、該融合分子が、該ポリマー骨格を結合して骨格／融合分子複合体を形成するように適合したポリマー骨格結合ドメインを含み、かつ、該代理分子または該標的分子を結合するように適合した標的分子結合ドメインを含む、前記段階；
   該代理分子および該融合分子を該試料と組み合わせることによって競合アッセイを行う段階であって、該標的分子が該試料中に存在する場合に、該標的分子が、該標的分子結合ドメインに対する結合について該代理分子と競合する、前記段階；
   該試料を該第1の体積中に負荷する段階；
   該ナノポアへ電圧を印加する段階であって、該第1の体積が、該ポリマー骨格、該融合分子、該代理分子、および、該標的分子を含む疑いのある該試料を含み、該ポリマー骨格が該融合分子にハイブリダイズし、かつ該融合分子が、該代理分子または該標的分子にハイブリダイズする、前記段階。
2. 電圧が、標的分子または代理分子に結合した骨格／融合分子複合体の、ナノポアを通る第1の体積からの移行を誘導して、センサーにより検出される電気信号における変化を生成する、請求項1記載の方法。
3. 電気信号における変化を時間の関数として記録する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
4. 電気信号における変化を時間の関数として分析して、試料における標的小分子の有無を判定する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
5. 競合アッセイが、試料を第1の体積中に負荷した後に行われる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
6. 競合アッセイが、試料を第1の体積中に負荷する前に行われる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
7. 代理分子がマレイミドポリエチレングリコールを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
8. 代理分子が、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、アミン、カルボン酸、ハロゲン化物、エステル、マレイミド、チオール、ジシクロカルビミド、ピリジル、ピリジルジスルフィド、およびアセチルからなる群より選択される化学反応基を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
9. 代理分子が、強いかまたは弱い求核試薬または求電子試薬を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
10. 代理分子が、ペプチド、デンドリマー、核酸、ナノもしくはミクロビーズもしくは粒子、量子ドット、タンパク質、ポリヌクレオチド、リポソーム、抗体、または抗体断片を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
11. 代理分子が、ペイロード分子に結合するように適合したペイロード結合部位を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
12. ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、蛍光体、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、PEG分子、リポソーム、またはコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
13. ペイロード分子が電荷を含む、請求項11記載の方法。
14. 荷電ペイロード分子が、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、またはイオンからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
15. 代理分子が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、金属結合、およびビオチン‐アビジン相互作用からなる群より選択される相互作用を介してペイロード分子に結合している、請求項11記載の方法。
16. 標的分子が、サイズが30,000 Da、20,000 Da、10,000 Da、5,000 Da、2,000 Da、1,000 Da、500 Da、200 Da、100 Da、50 Da、20 Da、または10 Da未満の小分子を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
17. 標的分子が、ペプチド、インスリン、オキシトシン、アミノ酸、タンパク質もしくはタンパク質のドメイン、ヌクレオチド、オリゴマー、DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、ホルモン、脂質、コレステロール、代謝産物、糖、グリカン、ペプチドグリカン、ポリグリカン、リン脂質、ステロイド、化学合成アゴニストおよびアンタゴニスト、ポリ核酸の合成誘導体、多環式芳香族炭化水素、炭素分解副産物、ダイオキシン、シクロヘキサミド、ビタミン、アデノシン三リン酸およびATP類似体、神経伝達物質、ドーパミン、L-ドーパ、セロトニン、金属、電解質、有機金属、麻薬および麻薬誘導体、ヒアルロン酸、またはレチノールを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
18. 融合分子がペプチド核酸を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
19. 融合分子が、架橋化核酸、ロックド核酸、ビオチン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン誘導体、ジンクフィンガータンパク質、zfp結合ドメイン、CRISPRドメイン、TALEN、DNA、PNA、またはRNAオリゴマーを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
20. 融合分子が、システインタグ付加されたビスペプチド核酸を含む、請求項19記載の方法。
21. ポリマー骨格が、ナノポアへの電位の印加時に、第1の体積から第2の体積へ該ナノポアを通って移行するように適合した負荷電ポリマーまたは正荷電ポリマーを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
22. ポリマー骨格が、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、DNA/RNAハイブリッド、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
23. センサーが、単一のナノポアのみを通過する物体を同定するように構成されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
24. センサーが電気センサーである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
25. センサーが、ナノポアへの電圧の印加時に、該ナノポアを通って流れる電流を検出する、請求項24記載の方法。
26. 時間の関数としての電気信号における変化の分析が、代理分子に結合した骨格／融合物複合体のナノポアを通る移行によるイベントと、標的分子に結合した骨格／融合物複合体の該ナノポアを通る移行によるイベントとの分離を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
27. 90％、95％、98％、または99％より大きい、標的小分子の検出の信頼度を提供する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
28. 試料が、第1の体積中への負荷の前に精製されない、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
29. ナノポアが、直径が少なくとも5 nm、10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、または50 nmである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
30. 装置が、連続した少なくとも2つのナノポアを含み、ペイロード分子に結合したアンプリコンが、移行の間に該少なくとも2つのナノポア中に同時に存在する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
31. 以下を含む、キット：
    ナノポアを含む装置であって、該装置が、装置の内部空間を第1の体積と第2の体積とに分ける層を含み、該層が、該第1の体積と該第2の体積とを接続する該層を通るナノポアを含み、かつ該装置が、ナノポアを通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む、前記装置；
    代理分子、融合分子、およびポリマー骨格であって、該融合分子が、該ポリマー骨格を結合して骨格／融合分子複合体を形成するように適合したポリマー骨格結合ドメインを含み、かつ、該代理分子または該標的分子を結合するように適合した標的分子結合ドメインを含む、前記代理分子、融合分子、およびポリマー骨格；ならびに
    該装置における競合アッセイの結果を観察することにより、該標的小分子の有無を検出するための使用説明書。
32. 代理分子がマレイミドポリエチレングリコールを含む、請求項31記載のキット。
33. 代理分子が、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、アミン、カルボン酸、ハロゲン化物、エステル、マレイミド、チオール、ジシクロカルビミド、ピリジル、ピリジルジスルフィド、およびアセチルからなる群より選択される化学反応基を含む、請求項31記載のキット。
34. 代理分子が、弱いかまたは強い求核試薬または求電子試薬を含む、請求項31記載のキット。
35. 代理分子が、ペプチド、デンドリマー、核酸、ナノもしくはミクロビーズもしくは粒子、量子ドット、タンパク質、ポリヌクレオチド、リポソーム、または抗体を含む、請求項31記載のキット。
36. 代理分子が、ペイロード分子に結合するように適合したペイロード結合部位を含む、請求項31記載のキット。
37. ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、蛍光体、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、PEG分子、リポソーム、またはコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される、請求項36記載のキット。
38. ペイロード分子が電荷を含む、請求項36記載のキット。
39. 荷電ペイロード分子が、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、またはイオンからなる群より選択される、請求項38記載のキット。
40. 代理分子が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオンπ相互作用、平面スタッキング相互作用、金属結合、およびビオチン‐アビジン相互作用からなる群より選択される相互作用を介してペイロード分子に結合している、請求項36記載のキット。
41. 標的分子が、サイズが30,000 Da、20,000 Da、10,000 Da、5,000 Da、2,000 Da、1,000 Da、500 Da、200 Da、100 Da、50 Da、20 Da、または10 Da未満の小分子を含む、請求項31記載のキット。
42. 標的分子が、N-エチルマレイミド、ペプチド、インスリン、オキシトシン、アミノ酸、タンパク質またはタンパク質のドメイン、ヌクレオチド、オリゴマー、DNA、RNA、ホルモン、脂質、コレステロール、代謝産物、糖、グリカン、ペプチドグリカン、ポリグリカン、リン脂質、ステロイド、化学合成アゴニストおよびアンタゴニスト、合成誘導体（PNA、LNA、BNA）、多環式芳香族炭化水素（PAH）、炭素分解副産物、ダイオキシン、シクロヘキサミド、ビタミン、アデノシン三リン酸およびATP類似体、神経伝達物質、ドーパミン、L-ドーパ、セロトニン、金属、電解質、有機金属、麻薬および麻薬誘導体、ヒアルロン酸、ならびにレチノールからなる群より選択される分子を含む、請求項31記載のキット。
43. 融合分子がペプチド核酸を含む、請求項31記載のキット。
44. 融合分子が、システインタグ付加されたビスペプチド核酸を含む、請求項43記載のキット。
45. 融合分子が、標的小分子を結合するドメインに融合した、架橋化核酸、ロックド核酸、ビオチン、ストレプトアビジン（またはストレプトアビジン誘導体）、ジンクフィンガータンパク質またはzfp結合ドメイン、CRISPRドメイン、TALEN、DNAまたはRNAオリゴマーを含む、請求項31記載のキット。
46. ポリマー骨格が、ナノポアへの電位の印加時に、第1の体積から第2の体積へ該ナノポアを通って移行するように適合した負荷電ポリマーまたは正荷電ポリマーを含む、請求項31記載のキット。
47. ポリマー骨格が、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、DNA/RNAハイブリッド、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む、請求項31記載のキット。
48. センサーが、単一のナノポアのみを通過する物体を同定するように構成されている、請求項31記載のキット。
49. センサーが電気センサーである、請求項31記載のキット。
50. センサーが、ナノポアへの電圧の印加時に、該ナノポアを通って流れる電流を検出する、請求項49記載のキット。
51. 試料中に存在する標的小分子の量を定量するための方法であって、以下の段階を含む、方法：
    層を含む装置を提供する段階であって、該層が、装置の内部空間を第1の体積と第2の体積とに分け、該層が、該第1の体積と該第2の体積とを接続するナノポアを含み、かつ該装置が、ナノポアを通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む、前記段階；
    代理分子、融合分子、およびポリマー骨格を提供する段階であって、該融合分子が、該ポリマー骨格を結合して骨格／融合分子複合体を形成するように適合したポリマー骨格結合ドメインを含み、かつ、該代理分子または該融合分子を結合するように適合した標的分子結合ドメインを含む、前記段階；
    該代理分子および該融合分子を該試料と組み合わせることによって競合アッセイを行う段階であって、該標的分子が該試料中に存在する場合に、該標的分子が、該標的分子結合ドメインに対する結合について該代理分子と競合する、前記段階；
    該試料を該第1の体積中に負荷する段階；
    該ナノポアへ電圧を印加する段階であって、該第1の体積が、該ポリマー骨格、該融合分子、該代理分子、および、該標的分子を含む疑いのある該試料を含み、該ポリマー骨格が該融合分子にハイブリダイズし、かつ該融合分子が、該代理分子または該標的分子にハイブリダイズする、前記段階；
    ナノポアにおける該標的小分子に結合した該骨格／融合分子の捕捉速度を、ナノポアにおける該代理分子に結合した該骨格／融合分子の捕捉速度と比較して、該実験試料における標的小分子の量を定量する段階。
52. 電圧が、標的分子または代理分子に結合した骨格／融合分子複合体の、ナノポアを通る第1の体積からの移行を誘導して、センサーにより検出される電気信号における変化を生成する、請求項51記載の方法。
53. 電気信号における変化を時間の関数として記録する段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
54. 電気信号における変化を時間の関数として分析して、試料における標的小分子の有無を判定する段階をさらに含む、請求項53記載の方法。
55. 競合アッセイが、試料を第1の体積中に負荷した後に行われる、請求項51記載の方法。
56. 競合アッセイが、試料を第1の体積中に負荷する前に行われる、請求項51記載の方法。

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