CN105203506A - 重金属离子上转换发光检测用纳米探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重金属离子上转换发光检测用纳米探针及其制备方法。该探针由能量给体和能量受体通过π-π键相互作用结合形成,其特征在于所述的能量给体为经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶(CS-UCNPs)与可专一性识别重金属离子的探针DNA分子进行共价键组装而形成,其中探针DNA与上转换发光纳米晶的摩尔比为1:2000~1:2500;所述的上转换发光纳米晶的表面羧基化率为:30%~60%;所述的能量受体为:单壁碳纳米角(SWCNHs)、氧化石墨烯(GO)或碳纳米管(WCNTs);所述的能量给体与能量受体的质量比为15:1~30:1。本发明方法具有工艺简单,操作方便,结构易控的优势,所制备的纳米探针不仅尺寸均一、结构稳定,而且具有毒性低、生物相容性好的特点,在细胞遗传学和分子生物学研究等领域具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种重金属离子上转换发光检测用纳米探针及其制备方法。
背景技术
重金属污染已成为最严重的环境生态污染之一,由于重金属排入环境后不易除去,而是在环境中长期累积,这将对生物的生存和人类的健康造成威胁。重金属对人体产生伤害的方式主要是通过改变酶的结构,有些重金属离子会干扰人体必需金属离子的代谢,通过替换酶中的其他必需金属离子,使酶失活。例如,Hg2+毒性高,通过食物链进入人体并逐渐累积,能够与各种蛋白质的疏基结合,破坏细胞代谢,肝脏解毒功能,并对大脑和神经造成严重损害。医学研究早已证实,一定程度的汞暴露将严重损伤人的大脑、心脏、肾、肺及免疫系统。铅的毒性与汞相似,具有持久性和高度积累性,主要的靶器官是神经系统和造血系统。当血液中的铅离子达到一定浓度时,会严重影响人的生长和智力发育,损伤认知功能、神经行为,严重者造成痴呆,对人体组织和器官造成不可修复的伤害。鉴于重金属离子在生物体内易积累、不可降解、毒性大等特点,发展重金属离子分析检测技术极为重要。
目前应用较广泛的检测重金属离子的方法有:原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光度法(AFS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等,虽然这些方法早已投入使用,并且技术也很成熟,但是每种技术都有局限性。原子吸收光谱法具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、抗干扰能力强等优点,但是,测定每种元素都需要相应的空心阴极灯,不能进行多元素同时分析。原子荧光光度法的检出限比原子吸收法要低,谱线清晰干扰少,灵敏度较高,线性范围大,但是应用元素有限。电感耦合等离子体质谱法具有比原子吸收法更低的检测限,是痕量元素分析领域中最先进的方法,但价格昂贵,易受污染。因此,开发高灵敏度、高选择性,背景发光影响小的可用于重金属离子检测的纳米探针具有重要的理论意义及现实的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有重金属离子检测技术中的不足,提供一种重金属离子上转换发光检测用纳米探针,从而实现对重金属离子的痕量检测。
本发明的目的之二在于提供该纳米探针的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用将作为能量给体的一端带有探针DNA序列的上转换发光纳米晶,和作为能量受体的单壁碳纳米角(SWCNHs)、氧化石墨烯(GO)或碳纳米管等通过π-π键相互作用结合在一起,制备基于发光共振能量转移的纳米探针体系,实现对重金属离子的上转换发光检测。
根据上述机理,本发明采用如下技术方案:
一种重金属离子上转换发光检测用纳米探针,由能量给体和能量受体通过π-π键相互作用结合形成,其特征在于所述的能量给体为经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶(CS-UCNPs)与可专一性识别重金属离子的探针DNA分子进行共价键组装而形成,其中探针DNA与上转换发光纳米晶的摩尔比为:1:2000~1:2500;所述的上转换发光纳米晶的表面羧基化率为:30%~60%;所述的能量受体为:单壁碳纳米角(SWCNHs)、氧化石墨烯(GO)或碳纳米管(WCNTs);所述的能量给体与能量受体的质量比为15:1~30:1。
上述的具有核壳结构的上转换发光纳米晶为:NaYF4:Yb,ErNaYF4、NaYF4:Yb,ErNaYF4:Yb,Er、NaYF4:Yb,ErNaGdF4或NaYF4:Yb:ErNaGdF4:Yb,Er。
一种制备上述的重金属离子上转换发光检测用纳米探针的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶Cit-UCNPs用N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化,得到活化后的Cit-UCNPs;
b.将步骤a所得活化后的Cit-UCNPs与探针DNA分子按照质量比260:1~290:1的比例溶于去离子水中,4℃搅拌10~12小时;经分离提纯得到能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA;
c.将步骤b所得能量给体与能量受体按照质量比为20:1~24:1的比例溶于去离子水中,4℃搅拌1~2小时,最终得到重金属离子上转换发光检测用纳米探针。
上述的经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶Cit-UCNPs的制备步骤为:
a-1.将具有核壳结构的上转换发光纳米晶分散在甲苯和氯仿的混合溶剂中,配制成浓度为1mg/mL~3mg/mL的分散溶液,所述的甲苯和氯仿的体积比为1:2~2:3;
a-2.在惰性气氛下,将无水柠檬酸钠溶于二乙二醇中,配制成浓度为0.1M~0.3M的溶液,在100℃~120℃下保持30~40min,冷却;
a-3.将步骤a-1所得分散液滴加到步骤a-2所得的柠檬酸溶液中,其中纳米晶与柠檬酸的摩尔比为1:80~1:150;加热至130℃,保持40~50min,蒸发除掉甲苯、氯仿,加热至180℃,氩气环境下,保持1~2小时,冷却、离心,用乙醇和水洗涤,即制得经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶。
上述的Cit-UCNPs的活化方法为:
b-1.将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺按照质量比1:1~3:1加入到去离子水中,然后加入经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶,4℃搅拌2~4小时,将所得到的混合物离心,用去离子水洗涤3次,得到活化的Cit-UCNPs纳米晶。
本发明的优点在于:以稀土上转换发光纳米晶作为能量给体构筑纳米探针,其激发光源位于近红外光区的980nm,有效避免了高能量光的光损伤及生物背景发光强的缺点。其次,所合成的纳米探针具有良好生物相容性及低的生物毒性,可实现生物体中重金属离子的检测。另外,本发明方法所制备的纳米探针粒径均一、形貌良好、结构稳定,且实验条件温和。
附图说明
图1是本发明实施例1中UCNPs(A);CS-UCNPs(B);Cit-UCNPs(C);Cit-UCNPs-ssDNA1(D)的TEM图。
图2为本发明实施例3中纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs中加入不同金属离子后在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图;
图3为本发明实施例3中纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-GO中加入不同金属离子后在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图。
图4是本发明实施例4中纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs加入不同浓度铅离子后在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图;
图5为本发明实施例4中纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-GO加入不同浓度铅离子后在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解,下面将结合附图和实施例来详细说明。这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。
具有核壳结构的上转换发光纳米晶的制备方法参见文献:
Li,Z.;Zhang,Y.,Anefficientanduser-friendlymethodforthesynthesisofhexagonal-phaseNaYF4:Yb,Er/Tmnanocrystalswithcontrollableshapeandupconversionfluorescence.Nanotechnology2008, 19(34),345606.
实施例1:
本实施例提供一例用于重金属铅离子上转换发光检测的纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs的合成方法,其包括以下步骤:
一、Cit-UCNPs纳米晶的制备:
1.将8~10mgCS-UCNPs分散在预备的5mL甲苯和氯仿的混合溶液中,其中,甲苯和氯仿的体积比为1:2~2:3;
2.在惰性气氛下,将0.4~0.6g无水柠檬酸钠溶于15mL二乙二醇中,加热至110℃,并保持30~40min,冷却;
3.将步骤1所得纳米晶慢慢滴加到步骤2所得到的溶液中,加热至130℃,保持40~50min,蒸发除掉甲苯、氯仿,加热至180℃,氩气环境下,保持1~2小时,冷却、离心,用乙醇和水洗涤,即制得Cit-UCNPs纳米晶。
二、能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA1的制备
1.预备纳米晶Cit-UCNPs3~4mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)3~4mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)2~3mg、100μM探针DNA1分子20~30μL、去离子水1~3mL;探针DNA1的序列为:5’-NH2-(CH2)6-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’,该探针DNA1为可专一性识别铅离子的DNA。
2.将预备的NHS与EDC按照质量比1:1~3:1加入到1~3mL去离子水中,然后加入预备的Cit-UCNPs纳米晶,4℃搅拌反应2~4小时,将所得到的混合物离心,用去离子水洗涤3次,得到活化的Cit-UCNPs纳米晶;
3.将该活化的Cit-UCNPs纳米晶与探针DNA1分子按照质量比260:1~290:1的比例溶于去离子水中,4℃搅拌10~12小时;将所得到的混合物离心,用去离子水洗3次后得到能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA1。
三、纳米探针的制备:
1.预备Cit-UCNPs-ssDNA1纳米晶2~5mg,0.1mg/mL的SWCNHs3~7mL,去离子水1~3mL;
2.将Cit-UCNPs-ssDNA1纳米晶与SWCNHs按照质量比20:1~24:1的比例溶于1~3mL去离子水中,4℃搅拌1~2小时,最终得到用于铅离子上转换发光检测的Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs纳米探针。
实施例2:
本实施例提供一例用于重金属汞离子上转换发光检测的纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA2-GO的合成方法,其包括以下步骤:
一、能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA2的制备
1.预备Cit-UCNPs3~4mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)3~4mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)2~3mg、100μMHg2+探针DNA2分子20~30μL、去离子水1~3mL;探针DNA2的序列为:5’-NH2-TTCTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTG-3’,该探针DNA为可专一性识别重金属汞离子的DNA。
2.将预备的NHS与EDC按照质量比1:1~3:1加入到1~3mL去离子水中,然后加入预备的Cit-UCNPs纳米晶,4℃搅拌反应2~4小时,将所得到的混合物离心,用去离子水洗涤3次,得到活化的Cit-UCNPs纳米晶;
2.将该活化的Cit-UCNPs纳米晶与探针DNA2分子按照质量比260:1~290:1的比例溶于去离子水中,4℃搅拌10~12小时;将所得到的混合物离心,用去离子水洗3次后得到能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA2。
三、纳米探针的制备:
1.预备Cit-UCNPs-ssDNA2纳米晶2~5mg,0.1mg/mL的GO3~7mL,去离子水1~3mL;
2.将Cit-UCNPs-ssDNA2纳米晶与氧化石墨烯(GO)按照质量比20:1~24:1的比例溶于1~3mL去离子水中,4℃搅拌1~2小时,最终得到用于重金属汞离子上转换发光检测的Cit-UCNPs-ssDNA2-GO纳米探针。
实施例3:
本实施例提供纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs或Cit-UCNPs-ssDNA1-GO对铅离子专一性检测实验,其包括以下步骤:
1.用去离子水配制各种金属离子的浓溶液(0.1M)。
2.预备纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs或Cit-UCNPs-ssDNA1-GO浓溶液,然后用去离子水稀释到所需浓度。
3.取一定体积的各种金属离子的浓溶液分别加入到2.0mL纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs的溶液中,室温下搅拌30~50min然后进行光谱测试,结果如图2所示;采用相同方法,向纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-GO中加入一定体积的各种金属离子的浓溶液,操作步骤不变,结果如图3所示。
实施例4:
本实施例提供纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs或Cit-UCNPs-ssDNA1-GO用于重金属铅离子上转换发光检测的滴定实验光谱图,其包括以下步骤:
1.预备纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs或者Cit-UCNPs-ssDNA1-GO,然后用去离子水稀释到所需浓度。
2.用移液管吸取2.0mL纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs置于1.0cm×1.0cm石英比色皿中,用微量进样器向此溶液中逐滴加入铅离子,室温下搅拌30~50min然后进行光谱测试,结果如图4所示;采用相同方法,向纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-GO中加入铅离子,操作步骤不变,结果如图5所示。
图1是本发明实施例1中UCNPs(A);CS-UCNPs(B);Cit-UCNPs(C);Cit-UCNPs-ssDNA1(D)的TEM图。从图中可以看出,所合成的UCNPs纳米粒子可均匀分散在环己烷溶液中,粒径大小在30nm;CS-UCNPs粒径大小在35nm;纳米粒子分散性良好且尺寸均一。改性后的Cit-UCNPs及键合探针DNA1后的Cit-UCNPs-ssDNA1纳米粒子能均匀分散在水溶液中,与CS-UCNPs相比,形貌及粒径大小未发生明显变化。
图2是本发明实施例3中纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs加入不同金属离子后在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图;图3是纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-GO加入不同金属离子后在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图。从图中可以看出,对于Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Ni2+、Co2+、Cu2+等离子,其相应的发光光谱在545及660nm附近的发射峰并没有显著增强,只有溶液中加入铅离子后,Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs及Cit-UCNPs-ssDNA1-GO的发光光谱在545nm及660nm附近处具有强的发射峰,分别对应于稀土Er3+的4S3/2→4I15/2,及4F9/2→4I15/2的跃迁,说明本发明所制备的纳米探针能够实现对铅离子的专一性识别。
图4是本发明实施例4中纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs加入不同浓度的铅离子后,在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图;图5是纳米探针Cit-UCNPs-ssDNA1-GO加入不同浓度的铅离子后,在980nm激发光照射下的上转换发光光谱图。从图中可以看出,随着铅离子浓度的增加,Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs及Cit-UCNPs-ssDNA1-GO的发光光谱在545nm及660nm附近的发光呈线性恢复,说明Cit-UCNPs-ssDNA1-SWCNHs及Cit-UCNPs-ssDNA1-GO探针的ssDNA片段在Pb2+存在下,通过鸟嘌呤之间的hoogsteen氢键形成鸟嘌呤-四聚平面,然后通过π-π堆积聚集而形成高稳定性的G-四链体,导致SWCNHs或GO剥离纳米颗粒的表面,能量传递过程被禁止,造成上转换发光纳米晶的发光恢复,从而实现对铅离子的高灵敏度检测。
以上结果表明,该发光共振能量转移体系能够用于铅离子的测定。更重要的是,这种基于发光共振能量转移的检测模型可以拓展到其他离子的检测体系中,例如将水溶性上转换纳米粒子与专一性识别重金属(Hg2+、Pb2+、Ag+、)的DNA偶联,当金属离子存在时,该DNA会与金属离子特异性结合,从而使能量受体远离上转换纳米粒子表面,造成上转换发光纳米粒子的发光恢复,从而实现重金属离子的检测。
按照本发明方法所制备的基于稀土上转换发光纳米晶的用于重金属离子上转换发光检测的纳米探针,具有水分散性好、结构稳定,上转换发光较强等优点,可应用于专一性检测重金属离子。本发明方法具有工艺简单,操作方便,结构易控的优势,在细胞遗传学和分子生物学研究等领域具有潜在应用价值。
如本发明上述实施例所述,采用与其相同或相似方法所得到的其它用于专一性检测重金属离子的纳米探针,均在本发明保护范围内。
Claims (5)
1.一种重金属离子上转换发光检测用纳米探针,由能量给体和能量受体通过π-π键相互作用结合形成,其特征在于所述的能量给体为经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶(CS-UCNPs)与可专一性识别重金属离子的探针DNA分子进行共价键组装而形成,其中探针DNA与上转换发光纳米晶的摩尔比为:1:2000~1:2500;所述的上转换发光纳米晶的表面羧基化率为:30%~60%;所述的能量受体为:单壁碳纳米角(SWCNHs)、氧化石墨烯(GO)或碳纳米管(WCNTs);所述的能量给体与能量受体的质量比为15:1~30:1。
2.根据权利要求1所述的重金属离子上转换发光检测用纳米探针,其特征在于所述的具有核壳结构的上转换发光纳米晶为:NaYF4:Yb,ErNaYF4、NaYF4:Yb,ErNaYF4:Yb,Er、NaYF4:Yb,ErNaGdF4或NaYF4:Yb:ErNaGdF4:Yb,Er。
3.一种制备根据权利要求1或2所述的重金属离子上转换发光检测用纳米探针的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶Cit-UCNPs用N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化,得到活化后的Cit-UCNPs;
b.将步骤a所得活化后的Cit-UCNPs与探针DNA分子按照质量比260:1~290:1的比例溶于去离子水中,4℃搅拌10~12小时;经分离提纯得到能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA;
c.将步骤b所得能量给体与能量受体按照质量比为20:1~24:1的比例溶于去离子水中,4℃搅拌1~2小时,最终得到重金属离子上转换发光检测用纳米探针。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于所述的经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶Cit-UCNPs的制备步骤为:
a-1.将具有核壳结构的上转换发光纳米晶分散在甲苯和氯仿的混合溶剂中,配制成浓度为1mg/mL~3mg/mL的分散溶液,所述的甲苯和氯仿的体积比为1:2~2:3;
a-2.在惰性气氛下,将无水柠檬酸钠溶于二乙二醇中,配制成浓度为0.1M~0.3M的溶液,在100℃~120℃下保持30~40min,冷却;
a-3.将步骤a-1所得分散液滴加到步骤a-2所得的柠檬酸溶液中,其中纳米晶与柠檬酸的摩尔比为1:80~1:150;加热至130℃,保持40~50min,蒸发除掉甲苯、氯仿,加热至180℃,氩气环境下,保持1~2小时,冷却、离心,用乙醇和水洗涤,即制得经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于所述的Cit-UCNPs的活化方法为:
b-1.将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺按照质量比1:1~3:1加入到去离子水中,然后加入经羧基功能化的具有核壳结构的上转换发光纳米晶,4℃搅拌2~4小时,将所得到的混合物离心,用去离子水洗涤3次,得到活化的Cit-UCNPs纳米晶。
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HONGQI CHEN等: "Aptamer-basedsensingforthrombininredregionvia fluorescence resonantenergytransferbetweenNaYF4:Yb,Er upconversion nanoparticles andgoldnanorods", 《BIOSENSORS ANDBIOELECTRONICS》 * |
LI-JIAO HUANG等: "DNA-functionalized upconversion nanoparticles as biosensors for rapid, sensitive, and selective detection of Hg2+ in complex matrices", 《ANALYST》 * |
SHIJIA WU等: "Dual fluorescence resonance energy transfer assay between tunable upconversion nanoparticles and controlled gold nanoparticles for the simultaneous detection of Pb2+and Hg2+", 《TALANTA》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2019010930A1 (zh) * | 2017-07-10 | 2019-01-17 | 深圳大学 | 基于上转换材料的光电化学dna传感器及其检测方法 |
CN108918489A (zh) * | 2018-07-10 | 2018-11-30 | 同济大学 | 一种铅离子荧光检测方法以及用于铅离子检测的纳米颗粒荧光传感器 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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