CN104540965A - 靶标检测和信号放大 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测靶标分子以及放大通过检测测定产生的可检测信号的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及利用催化核酸酶来产生和/或放大指示存在靶标分子(例如核酸和蛋白质)的信号的方法以及用于所述方法中的组合物。

Description

靶标检测和信号放大
以交叉引用的方式并入
本申请要求2012年6月18日提交的澳大利亚临时专利申请号2012902551、2012年8月10日提交的澳大利亚临时专利申请号2012903462，及2013年4月3日提交的澳大利亚完整专利申请号2013202354的优先权，各案的完整内容以交叉引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测靶标分子以及放大通过检测测定产生的可检测信号的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及利用催化核酸酶来产生和/或放大指示存在靶标分子(例如核酸和蛋白质)的信号的方法以及用于所述方法中的组合物。
背景
许多测定当前可用于检测样本中的靶标分子。一些依赖于使用酶，并且特别是催化对核酸进行修饰的酶，包括以下论述的下列酶。
核酸酶
核酸酶是裂解在核酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的酶。脱氧核糖核酸酶作用于DNA，而核糖核酸酶作用于RNA，不过，有一些核酸酶利用DNA与RNA两者作为底物。核酸酶可被进一步分类为核酸内切酶和核酸外切酶，但一些酶可具有多种功能，并且同时展现核酸内切酶活性与核酸外切酶活性。核酸内切酶裂解多核苷酸链内的磷酸二酯键。相比之下，核酸外切酶裂解在多核苷酸链末端的磷酸二酯键。核酸外切酶可自DNA或RNA链的5’端或3’端，或自两端移除核苷酸。
蛋白质核酸外切酶的非限制性实例包括核酸外切酶I(大肠杆菌(E.coli))、核酸外切酶III(大肠杆菌)、核酸外切酶VII和T7核酸外切酶。核酸外切酶III(ExoIII)是催化自3’钝端或3’凹入的双链体DNA逐步移除单核苷酸的一种核酸外切酶。所述酶还能够在双链体DNA内的切口处起作用。ExoIII对具有至少4nt的单链突出端的单链DNA或双链体DNA具有极小活性。
催化核酸酶
催化核酸酶是能够修饰特定底物的非蛋白质酶。催化核酸酶包括DNA分子(在本领域中也称为DNA酶(DNAzyme)、脱氧核糖酶或DNA酶(DNA enzyme))、RNA分子(在本领域中也称为核糖酶)以及主要由多个DNA和/或RNA分子组成的多组分核酸酶(在本领域中也称为MNA酶)。催化核酸酶可通过例如裂解或连接来修饰特定核酸底物序列。一类独特的催化核酸酶(在本领域中称为辣根过氧化物酶模拟性DNA酶)可催化将特定化学底物转化成它们的氧化产物的过氧化物酶反应，所述产物可例如产生颜色变化或发射荧光或化学发光信号。
能够裂解或连接RNA底物、DNA底物和/或嵌合DNA/RNA底物的DNA酶和核糖酶通常可仅修饰满足最小序列要求的靶标核酸底物。举例来说，底物应与酶的底物结合臂展现足够的碱基对互补性，并且还需要在催化修饰的位点处具有特定序列。此类在催化裂解位点处的序列要求的实例包括对于供DNA酶裂解的嘌呤:嘧啶序列(10-23模型)的要求以及对于供锤头状核糖酶用的序列尿苷:X的要求，其中X可等于A、C或U但非G。10-23DNA酶是能够在特定RNA磷酸二酯键处裂解核酸底物的DNA酶。这种DNA酶具有侧接两个底物识别结构域(臂)的含15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域。
MNA酶是另一种类的催化核酸酶。这些多组分核酸酶需要装配促进剂(assembly facilitator)(例如靶标核酸)来实现它们的装配和催化活性。MNA酶主要由多种部件酶(part-enzyme/partzyme)组成，这些部件酶在一种或多种装配促进剂存在下进行自装配，并且形成了能够催化修饰底物的催化活性MNA酶。部件酶具有多个结构域，包括结合装配促进剂(如靶标核酸)的感应臂(sensor arm)；结合底物的底物臂；和部分催化核心序列，这些序列在多种部件酶组分装配时组合以提供完整的催化核心。MNA酶可被设计用来识别众多的装配促进剂，包括例如不同靶标核酸序列。在装配促进剂存在下，催化活性MNA酶可由部件酶组分装配，接着结合并催化修饰底物以产生输出信号。装配促进剂可为生物或环境样本中存在的靶标核酸。在所述情况下，MNA酶催化活性指示存在靶标。已报道若干能够裂解核酸底物的MNA酶，并且其它可连接核酸底物的MNA酶在本领域中也是已知的。
适配酶(Aptazyme)是特定类型的催化核酸(DNA酶、核糖酶或MNA酶)，这些核酸已与适体结构域连接以对核酸酶进行别构调控，从而使它们的活性取决于存在能够结合所述适体结构域的靶标分析物/配体。已使用互补调控寡核苷酸，通过结合适配酶内的适体与一部分催化核酸结构域两者以在不存在靶标分析物下抑制适配酶的活性。通过靶标配体与适体部分结合，由此促进调控寡核苷酸的移除，可逆转对适配酶催化活性的抑制。本发明者没发现先前有采用以下寡核苷酸的方法的任何公开内容：所述寡核苷酸被设计用来可逆抑制未与适体偶联的催化核酸(即，不是适配酶的催化核酸)的催化活性对核酸底物的修饰，其中抑制作用是由结合催化核酸的催化核心或其一部分的寡核苷酸介导的。
链置换聚合酶(Strand displacing polymerase)
DNA聚合酶催化脱氧核糖核苷酸聚合形成DNA链。它们是负责DNA复制的天然存在的酶，其中聚合酶“阅读”作为模板的完整DNA链，并且使用它来合成新链。一些DNA聚合酶含有5’-3’校对核酸外切酶活性，借此它们将降解在合成期间遇到的任何下游链(例如TaqDNA聚合酶)。相比之下，链置换DNA聚合酶能够置换在合成期间遇到的任何下游链。这些下游链不被降解，并且保持完整。链置换DNA聚合酶的实例包括Phi29、DNA聚合酶I克林诺片段(KlenowFragment)、VentR和Bst聚合酶大片段。
激酶和磷酸酶
激酶可催化γ-磷酸自ATP转移至蛋白质中的特定氨基酸以及核酸末端。磷酸酶可催化通过水解酯化的磷酸来移除磷酸基团，从而产生磷酸根离子和具有游离羟基的分子。通过激酶进行的蛋白质磷酸化和通过磷酸酶进行的脱磷酸化对于调控细胞内的信号转导路径很重要，由此在如代谢、细胞周期进程、细胞移动和细胞凋亡等细胞过程中起关键作用。在分子生物学中，寡核苷酸3’末端的磷酸化可用作防止它们被聚合酶延伸的方法。或者，寡核苷酸3’末端的脱磷酸化可用作使它们被聚合酶延伸的方法。
靶标扩增和信号放大技术
为增加靶标检测的灵敏度，已采用使靶标扩增或信号放大的策略，其中有许多利用了DNA和/或RNA聚合酶。采用靶标扩增的现存方法的实例包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录物介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。依赖于链置换扩增的那些方法(例如SDA、RCA和LAMP)需要使用具有链置换活性的聚合酶。也已描述了利用包括切口核酸内切酶在内的核酸酶的信号放大级联(例如NESA)。
也已描述利用催化核酸的信号放大级联。一个实例涉及使用一种通过核糖核苷酸接点接合两个邻近的过氧化物酶模拟性DNA酶组成的寡核苷酸。这种寡核苷酸的末端是通过与各末端杂交的短接头DNA连接在一起，由此形成准环状结构。这一结构的形成会暂时抑制DNA酶的催化活性。在靶标装配促进分子存在下装配的MNA酶直接与DNA酶杂交，并且裂解它们之间的核糖核苷酸接点。裂解含有所述寡核苷酸的DNA酶会使两种DNA酶彼此分开，并且与短接头DNA分开，从而导致DNA酶活化。这一策略的局限是信号放大仅限于因每一MNA酶裂解事件而活化的两种DNA酶，并且因为这些过氧化物酶模拟性DNA酶不能修饰核酸底物，所以不存在使这些DNA酶活化其它DNA酶分子的机制。因此，这种策略不适合作为能够进行指数信号放大的环状反馈级联中的第一步。此外，一旦DNA酶分子自准环状结构释放，MNA酶臂与DNA酶之间的互补性(此为初始裂解事件发生所必需的)也可能导致DNA酶分子的螯合，从而潜在地限制反应的灵敏度。
在其它现存的信号放大方法中，许多局限是明显的。举例来说，在许多技术中，反应速度受限于样本中最初存在的靶标DNA分子的数目。因此，这些和其它方法常缺乏临床应用所需的速度和灵敏度。还有的方法由于对催化核酸分子的抑制作用不足，而在不存在靶标下产生假阳性信号。利用DNA链置换的许多方法比较缓慢，并且缺乏靶标扩增方法的灵敏度。主要依赖于独特识别位点的测定可妨碍通用靶标序列的检测，或可能针对每一新靶标序列需要新的探针。
因此，持续需要用于检测和定量核酸序列和其它靶标并且合并了信号放大作用的方法。
发明概述
本发明通过提供本文所述的组合物、试剂盒和方法解决了现存靶标分子检测和/或信号放大方法中的至少一个明显缺点。
本发明至少部分涉及以下实施方案1-174：
实施方案1：一种组合物，包含：(i)第一分子复合物，包含：第一催化核酸酶；或其催化部分；或与所述酶或所述其催化部分互补的核苷酸序列；通过互补碱基配对与第一阻断寡核苷酸(BL)杂交，其中至少一个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与催化核心核苷酸互补的核苷酸，与所述第一BL杂交，并且所述第一催化核酸酶不是适配酶；以及(ii)能够由所述第一催化核酸催化修饰的核酸底物。
实施方案2：根据实施方案1所述的组合物，其中至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与所述催化核心核苷酸互补的核苷酸，与所述第一阻断寡核苷酸或其部分杂交。
实施方案3：根据实施方案1或实施方案2所述的组合物，其中仅一个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与所述催化核心核苷酸互补的核苷酸；不与所述第一阻断寡核苷酸杂交。
实施方案4：根据实施方案1至3中任一项所述的组合物，其中至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与所述催化核心核苷酸互补的核苷酸；不与所述第一阻断寡核苷酸杂交。
实施方案5：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中：所述阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段，各自通过互补碱基配对与所述第一酶或所述其催化部分的不同杂交臂杂交；以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；并且所述中间区段包含第二催化核酸酶的底物，并且所述底物中至少一段不与所述第一酶或其催化部分杂交。
实施方案6：根据实施方案1至5中任一项所述的组合物，其中所述中间区段部分或完全跨越：所述第一催化核酸酶或其催化部分的所述催化核心；或所述互补核苷酸序列的与所述催化核心互补的核苷酸。
实施方案7：根据实施方案1至6中任一项所述的组合物，其中所述其催化部分是部件酶。
实施方案8：根据实施方案1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一阻断寡核苷酸的5’末端与所述第一催化核酸酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列的3’末端相对。
实施方案9：根据实施方案1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一阻断寡核苷酸的5’末端与所述第一催化核酸酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列的5’末端相对。
实施方案10：根据实施方案5至9中任一项所述的组合物，其中所述中间区段包含第一底物和任选的第二底物，并且每一所述底物中至少一段不与所述第一酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列杂交。
实施方案11：根据实施方案10所述的组合物，其中所述第一底物和所述第二底物包含不同核苷酸序列。
实施方案12：根据实施方案10或实施方案11所述的组合物，其中所述中间区段还包含第三底物，所述第三底物包含与所述第一底物和所述第二底物不同的核苷酸序列，并且所述第三底物中至少一段不与所述第一酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列杂交。
实施方案13：根据实施方案10至12中任一项所述的组合物，其中每一所述底物中至少一部分包含相同核苷酸序列。
实施方案14：根据实施方案10至13中任一项所述的组合物，其中所述中间区段的任何所述底物都包含限制酶的部分识别位点。
实施方案15：根据实施方案10至14中任一项所述的组合物，其中所述第一BL；所述第一酶或所述其催化部分；所述序列的与催化核心核苷酸互补的所述核苷酸；或所述核酸底物中的任一种被栓系于不溶性载体。
实施方案16：根据实施方案15所述的组合物，其中所述底物是借助于抗生蛋白链菌素(streptavidin)-生物素相互作用被栓系。
实施方案17：如实施方案10所述的组合物，还包含第二分子复合物，所述第二分子复合物包含通过互补碱基配对与第二BL杂交的所述第二催化核酸酶，其中：所述第二BL包含各自通过互补碱基配对与所述第二酶的不同杂交臂杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；所述中间区段任选包含所述第一底物的拷贝和第三底物，并且每一所述底物中至少一段不与所述第二酶杂交；并且所述第一酶能够杂交和裂解所述第三底物，并且所述第二酶能够杂交和裂解所述第二底物。
实施方案18：根据实施方案5至9中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶具有不同底物特异性。
实施方案19：根据实施方案5至9中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶具有相同底物特异性。
实施方案20：根据实施方案5至19中任一项所述的组合物，其中任何所述分子复合物的所述中间区段中的核苷酸数目都超过催化核心核苷酸的数目。
实施方案21：根据实施方案5至19中任一项所述的组合物，其中任何所述复合物的所述中间区段中的核苷酸数目都等于催化核心核苷酸的数目。
实施方案22：根据实施方案5至21中任一项所述的组合物，还包含将所述第一阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述第一催化核酸酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列的一个末端的发夹环。
实施方案23：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，包含第一阻断寡核苷酸和第二阻断寡核苷酸以及第一催化核酸酶和第二催化核酸酶，其中：所述第一酶和所述第二酶各自包含两个独立杂交臂；所述第一阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段，分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交；所述第二阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段，分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述第一区段和所述第二区段各自与不同杂交臂杂交；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸各自包含在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段，其中各中间区段不与所述第一酶或所述第二酶杂交；并且所述中间区段中的任一个或两个包含催化核酸酶的底物。
实施方案24：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述第一酶、所述其催化部分或所述互补核苷酸序列的每个核苷酸都与所述第一BL杂交。
实施方案25：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述杂交的阻断寡核苷酸提供自所述第一分子复合物延伸的单链3’或5’突出区段。
实施方案26：根据实施方案25所述的组合物，其中所述突出区段或其一部分与能够杂交所述突出部分并且使所述第一催化核酸酶或其催化部分自所述BL解离的释放寡核苷酸(releaseroligonucleotide，RL)互补。
实施方案27：根据实施方案26所述的组合物，其中所述释放寡核苷酸不包含与所述第一催化核酸酶或其催化部分相同的核苷酸序列。
实施方案28：根据实施方案25至27中任一项所述的组合物，其中所述第一酶提供自所述复合物延伸的单链3’突出区段。
实施方案29：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，还包含将所述阻断寡核苷酸的一端连接于所述第一酶的一端的发夹环。
实施方案30：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，还包含与第二催化核酸酶杂交形成第二分子复合物的第二BL，其中：第一发夹环将所述第一BL连接于所述第一催化核酸酶，并且第二发夹环将所述第二BL连接于所述第二催化核酸酶；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸提供分别自所述第一分子复合物和所述第二分子复合物延伸的单链突出区段；所述第一分子复合物的所述突出区段的一部分通过互补碱基配对与所述第二分子复合物的所述突出区段的一部分杂交；并且各突出区段的未杂交部分组合以形成包含与释放寡核苷酸(RL)的中间区段的碱基对互补性的区段。
实施方案31：根据实施方案25至29中任一项所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的中间区段。
实施方案32：根据实施方案31所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸中含有限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的核苷酸不与所述第一酶杂交。
实施方案33：根据实施方案31或实施方案32所述的组合物，其中所述限制性核酸内切酶识别位点是切口核酸内切酶识别位点。
实施方案34：根据实施方案29所述的组合物，其中所述发夹环包含茎，在所述茎中一条链提供可由链置换聚合酶延伸的引物的结合位点，和/或所述阻断寡核苷酸和/或所述第一酶各自被3’磷酸化。
实施方案35：根据实施方案34所述的组合物，其中所述链置换聚合酶选自由克林诺片段、Bst、Sequenase 2.0、Vent、Phi29、Pyrophage3137或其任何变体组成的组。
实施方案36：根据实施方案1至35中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶或其部分是DNA酶、核糖酶、或MNA酶的组分。
实施方案37：根据实施方案5至22中任一项所述的组合物，其中所述第二催化核酸酶是DNA酶、核糖酶或MNA酶。
实施方案38：根据实施方案36所述的组合物，其中所述DNA酶、核糖酶或MNA酶能够裂解底物。
实施方案39：根据实施方案37所述的组合物，其中所述DNA酶、核糖酶或MNA酶能够裂解底物。
实施方案40：根据实施方案36至39中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶是DNA酶。
实施方案41：一种试剂盒，包括根据实施方案1至40中任一项所述的组合物。
实施方案42：一种试剂盒，包括根据实施方案5至23中任一项所述的组合物，以及以下组分中的任一种或两种：能够在由所述第一催化核酸酶和/或所述第二催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物(reporter substrate)；对所述中间区段的所述底物具有特异性的引发催化核酸酶(initiator catalytic nucleic acid enzyme)或其催化组分。
实施方案43：根据实施方案42所述的试剂盒，其中所述引发催化酶是DNA酶、核糖酶、适配酶、适配MNA酶或MNA酶。
实施方案44：根据实施方案42或实施方案43所述的试剂盒，其中任何所述BL都包含限制酶的部分识别位点，并且所述试剂盒还包括所述限制酶。
实施方案45：一种试剂盒，包括根据实施方案25至30中任一项所述的组合物，以及以下组分中的任何一种或多种：包含与所述阻断寡核苷酸互补的序列并且对所述阻断寡核苷酸的与所述第一催化核酸酶互补的区域具有结合亲和力的释放寡核苷酸；能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；核酸外切酶；包含与所述阻断寡核苷酸的区段互补的序列并且当与所述阻断寡核苷酸杂交时能够募集核酸外切酶活性的核酸酶识别片段。
实施方案46：根据实施方案45所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶选自由核酸外切酶III和T7核酸外切酶组成的组。
实施方案47：根据实施方案45或实施方案46所述的试剂盒，其中所述第二催化核酸酶是核糖酶、DNA酶或MNA酶。
实施方案48：一种试剂盒，包括根据实施方案31至33中任一项所述的组合物，以及以下组分中的任何一种或多种：包含与所述阻断寡核苷酸互补的序列并且对所述阻断寡核苷酸的与所述第一催化核酸酶互补的区域具有结合亲和力的释放寡核苷酸；能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；对在所述释放寡核苷酸和所述阻断寡核苷酸杂交后形成的识别序列具有特异性的限制性核酸内切酶。
实施方案49：根据实施方案48所述的试剂盒，其中所述识别序列中由所述释放寡核苷酸提供的组分包含硫代磷酸酯键联，从而防止所述释放寡核苷酸被所述限制性核酸内切酶裂解。
实施方案50：根据实施方案48所述的试剂盒，其中所述识别序列是针对切口核酸内切酶，并且所述限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
实施方案51：一种试剂盒，包括根据实施方案34或实施方案35所述的组合物，以及以下组分中的任何一种或多种：对所述结合位点具有特异性的引物；链置换聚合酶或其组分；能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物。
实施方案52：一种试剂盒，包括：通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交的第一催化核酸酶，和将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述催化核酸第一酶的一个末端的发夹环；能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；对靶标分子具有特异性的引发催化核酸酶；对所述发夹环的区段具有特异性的引物寡核苷酸；链置换聚合酶或其组分；对在所述引物与所述发夹环的所述区段杂交以及任选随后使用所述阻断寡核苷酸作为模板由所述链置换聚合酶延伸所述引物后形成的识别序列具有特异性的限制性核酸内切酶。
实施方案53：根据实施方案52所述的试剂盒，其中所述识别序列中由所述发夹环的所述区段提供的组分包含硫代磷酸酯键联，从而防止所述区段被所述限制性核酸内切酶裂解。
实施方案54：根据实施方案52所述的试剂盒，其中所述识别序列是针对切口核酸内切酶，并且所述限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
实施方案55：根据实施方案52至54中任一项所述的试剂盒，其中所述第一酶的每个核苷酸都与所述BL杂交。
实施方案56：根据实施方案52至55中任一项所述的试剂盒，其中链置换聚合酶选自由克林诺片段、Bst、Sequenase 2.0、Vent、Phi29、Pyrophage 3137或其任何变体组成的组。
实施方案57：根据实施方案41至56中任一项所述的试剂盒，其中所述第一催化核酸酶是DNA酶、核糖酶或MNA酶。
实施方案58：一种用于检测样本中存在或不存在第一靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：至少一种包含BL和第一催化核酸酶的分子复合物，所述BL包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含催化核酸酶的第一底物的中间区段，其中所述第一底物中至少一段不与所述第一酶杂交；第一引发酶和报道底物；其中，所述第一引发酶对所述第一靶标以及所述中间区段的所述第一底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述第一引发酶的杂交诱导所述第一引发酶的催化活性，由此促进所述第一底物在与所述第一引发酶杂交时裂解；所述第一底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离；并且所述分子复合物的所述第一酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后能够与所述报道底物杂交并将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述第一靶标的可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述第一靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述第一靶标分子不存在。
实施方案59：根据实施方案58所述的方法，其中与所述样本接触的所述分子复合物具有的所述阻断寡核苷酸的5’末端与所述催化核酸酶的5’末端相对。
实施方案60：根据实施方案58所述的方法，其中与所述样本接触的所述分子复合物具有的所述阻断寡核苷酸的5’末端与所述催化核酸酶的3’末端相对。
实施方案61：根据实施方案58或实施方案59所述的方法，包括使所述样本与第一分子复合物和第二分子复合物接触，其中所述第一分子复合物包含所述BL和所述第一催化核酸酶，并且在所述第一区段与所述第二区段之间的所述中间区段包含所述第一底物和第二底物；所述第二分子复合物包含第二BL和第二催化核酸酶，所述第二BL包含通过互补碱基配对与所述第二酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含所述第一底物的拷贝和第三底物的中间区段；所述引发酶对所述靶标以及每一所述中间区段的所述第一底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，由此促进每一所述中间区段的所述第一底物在与所述引发酶杂交时裂解；每一所述中间区段的所述第一底物的裂解导致每一所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；所述第一酶对所述第三底物具有结合特异性，并且所述第二酶对所述第二底物具有结合特异性；并且在每一所述分子复合物解离之后，所述第一酶能够杂交和裂解另一第二分子复合物的第三底物，并且所述第二酶能够杂交和裂解另一第一分子复合物的第二底物，由此放大所述可检测信号。
实施方案62：根据实施方案61所述的方法，其中所述第一底物、所述第二底物或所述第三底物与所述报道底物相同。
实施方案63：根据实施方案61所述的方法，其中所述分子复合物的所述中间区段的所述底物与所述报道底物相同，并且在自所述阻断寡核苷酸进行所述解离后，第一所述分子复合物的所述第一催化核酸酶可杂交和裂解第二所述分子复合物的所述中间区段的所述底物，由此促进所述可检测信号的放大。
实施方案64：根据实施方案60所述的方法，其中在所述第一区段与所述第二区段之间的所述中间区段形成包含所述第一底物的所述至少一段的发夹环结构。
实施方案65：根据实施方案59所述的方法，其中所述中间区段包含第二引发催化核酸酶的第二底物，并且所述方法还包括使所述样本与所述第二引发催化核酸酶接触；其中所述第二引发酶对靶标以及所述中间区段的所述第二底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述第二引发酶的杂交诱导所述第二引发酶的催化活性，由此促进所述第二底物在与所述第二引发酶杂交时裂解；其中所述第二底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离，由此允许所述第一催化核酸酶与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供可检测信号。
实施方案66：根据实施方案65所述的方法，其中所述第二引发酶对不同于所述第一靶标的第二靶标具有结合特异性。
实施方案67：根据实施方案66所述的方法，其中所述第二引发酶对所述第一靶标具有结合特异性。
实施方案68：根据实施方案65至67中任一项所述的方法，其中所述中间区段包含第三引发催化核酸酶的第三底物，并且所述方法还包括使所述样本与所述第三引发催化核酸酶接触；其中所述第三引发酶对靶标以及所述中间区段的所述第三底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述第三引发酶的杂交诱导所述第三引发酶的催化活性，由此促进所述第三底物在与所述第三引发酶杂交时裂解；其中所述第三底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离，由此允许所述第一催化核酸酶与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供可检测信号。
实施方案69：根据实施方案68所述的方法，其中所述第三引发酶对不同于所述第一靶标和所述第二靶标的第三靶标具有结合特异性。
实施方案70：根据实施方案68所述的方法，其中所述第三引发酶对所述第一靶标具有结合特异性。
实施方案71：根据实施方案65至70中任一项所述的方法，其中所述中间区段的所述第一底物和所述第二底物共有共同的核苷酸区段，所述核苷酸区段包含所述第一底物的5’末端和所述第二底物的3’末端，或反之亦然。
实施方案72：根据实施方案71所述的方法，其中所述共同的核苷酸区段在所述第一底物的3’部分中开始，并且在所述第二底物的5’部分中终止。
实施方案73：根据实施方案59中任一项所述的方法，其中所述报道底物与所述第二底物相同，并且所述分子复合物的所述第一催化核酸酶能够杂交和裂解所述第二底物。
实施方案74：根据实施方案65至72中任一项所述的方法，其中所述报道底物不同于所述中间区段的任何所述底物，并且所述第一催化核酸酶不能杂交和裂解所述中间区段的任何所述底物。
实施方案75：根据实施方案58至74中任一项所述的方法，其中所述第一催化核酸、所述第一底物、所述第一引发酶和所述报道底物中的任何一种或多种被栓系于不溶性载体。
实施方案76：根据实施方案75所述的方法，其中所述中间区段的所述底物是借助于抗生蛋白链菌素-生物素相互作用栓系于所述载体。
实施方案77：根据实施方案59至76中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过以下方式来检测另一靶标：(a)进一步使所述样本与以下各物接触：包含另一BL和另一催化核酸酶的另一分子复合物，所述另一BL包含各自通过互补碱基配对与所述另一酶杂交的两个末端区段，以及在所述两个末端区段之间并且包含另一催化核酸酶的至少一种其它底物的中间区段，其中所述其它底物中至少一部分不与所述另一酶杂交；另一引发催化核酸酶；和另一报道底物；其中，所述另一靶标不同于所述第一靶标，所述中间区段的所述至少一种其它底物不同于所述第一底物，所述另一报道底物不同于所述第一报道底物，所述另一引发催化核酸酶不同于所述第一引发催化核酸酶，所述另一引发酶对所述另一靶标以及所述中间区段的所述其它底物具有结合特异性，并且所述另一靶标与所述另一引发酶的杂交诱导所述另一引发酶的催化活性，由此促进所述其它底物在与所述另一引发酶杂交时裂解；所述其它底物的裂解导致所述另一分子复合物中所述另一阻断寡核苷酸和所述另一催化核酸酶的杂交链解离；并且所述另一分子复合物的所述另一酶对所述另一报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述另一报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述另一靶标的另一可检测信号；以及(b)确定通过所述进一步接触是否产生另一可检测信号，其中检测到所述信号指示所述另一靶标分子存在，而未能检测到所述另一信号指示所述另一靶标分子不存在。
实施方案78：根据实施方案77所述的方法，其中所述另一报道底物与所述至少一种其它底物相同，并且所述另一分子复合物的所述另一催化核酸酶能够杂交和裂解所述至少一种其它底物。
实施方案79：根据实施方案77所述的方法，其中所述另一报道底物不同于所述至少一种其它底物，并且所述另一分子复合物的所述另一催化核酸酶不能杂交和裂解所述至少一种其它底物。
实施方案80：根据实施方案59所述的方法，其中任何所述分子复合物的任何所述底物都包含部分限制酶识别位点，并且任何所述靶标都包含所述部分限制酶识别位点的互补部分；所述方法还包括使所述样本与能够识别和裂解所述限制酶识别位点的限制酶接触；所述靶标能够通过互补碱基配对与包含所述部分识别位点的所述BL杂交，由此使所述限制酶识别位点完整，借此允许所述限制酶将包含所述部分识别位点的所述BL裂解，从而导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；并且所述分子复合物的所述催化核酸酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述靶标的可检测信号。
实施方案81：根据实施方案80所述的方法，其中所述报道底物与由所述分子复合物的所述催化核酸酶裂解的所述底物相同。
实施方案82：根据实施方案80所述的方法，其中所述报道底物不同于包含所述部分识别位点的所述底物，以及所述分子复合物的所述催化核酸酶。
实施方案83：根据实施方案58至79中任一项所述的方法，其中任何所述引发酶都包含适体；在不存在所述靶标下，所述适体采用阻止所述引发酶的催化活性的构象；并且在存在所述靶标下，所述适体结合所述靶标，并且采用允许所述引发酶具有催化活性的构象，由此裂解所述分子复合物的所述底物。
实施方案84：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：报道底物；以及至少一种包含BL和第一催化核酸酶的分子复合物，所述BL包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含适体的中间区段，其中所述适体中至少一段不与所述第一酶杂交；其中，与所述样本接触的所述分子复合物具有的所述阻断寡核苷酸的5’末端与所述催化核酸酶的5’末端相对，并且在所述第一区段与所述第二区段之间的所述中间区段包含所述适体，所述靶标对所述适体具有结合亲和力，并且所述靶标与所述适体的杂交诱导所述第一酶的催化活性，由此促进所述第一底物的裂解；所述靶标与所述BL的所述适体部分结合导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离；并且所述分子复合物的所述第一酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述第一靶标的可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述第一靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述第一靶标分子不存在。
实施方案85：根据实施方案58所述的用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：第一分子复合物和第二分子复合物，其中所述第一复合物包含第一BL和第一催化核酸酶，其中所述第二复合物包含第二BL和第二催化核酸酶，所述第一BL和所述第二BL各自包含通过互补碱基配对与所述酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含催化核酸酶的底物的中间区段，其中所述底物中至少一段不与所述第一酶或所述第二酶杂交；以及引发酶，其中所述引发酶对所述靶标以及所述第一分子复合物的所述底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，由此促进所述底物在与所述引发酶杂交时裂解；所述第一分子复合物的所述底物的裂解导致所述第一分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；所述第一分子复合物的所述催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述第二分子复合物的所述底物，从而导致所述第二分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；所述第二分子复合物的所述催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解另一所述第一分子复合物的所述底物，从而导致所述另一所述第一分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的解离；并且所述第一分子复合物和所述第二分子复合物的任一种或两种底物是当裂解时能够提供可检测信号的报道底物；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案86：根据实施方案63或实施方案85所述的方法，其中所述第一分子复合物和所述第二分子复合物中的任一种或两种包含将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述催化核酸酶的一个末端的发夹环。
实施方案87：一种用于检测样本中存在或不存在多个靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：包含第一阻断寡核苷酸和第二阻断寡核苷酸以及第一催化核酸酶和第二催化核酸酶的分子复合物，其中所述第一酶和所述第二酶各自包含两个独立杂交臂；所述第一阻断寡核苷酸包含分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交的第一区段和第二区段；所述第二阻断寡核苷酸包含分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交的第一区段和第二区段；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述第一区段和所述第二区段各自与不同杂交臂杂交；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸各自包含在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段，其中各中间区段不与所述第一酶或所述第二酶杂交；并且所述中间区段中的任一个或两个包含催化核酸酶的底物；和多种引发催化核酸酶；以及多种报道底物，其中第一引发催化核酸酶对第一靶标分子具有结合特异性，并且第二引发催化核酸酶对第二靶标分子具有结合特异性；所述第一引发酶和所述第二引发酶对所述分子复合物的所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸中的任一种或两种的所述中间区段的所述底物具有结合特异性；每一所述靶标与每一所述引发酶的杂交诱导每一所述引发酶的催化活性，由此促进每一所述阻断寡核苷酸的所述底物在与所述引发酶杂交时裂解；每一所述底物的裂解导致所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的杂交链自所述分子复合物的所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶的所述杂交臂解离；并且每一所述催化核酸酶对至少一种报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述报道底物中至少一种杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述靶标分子的可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案88：根据实施方案87所述的方法，其中所述分子复合物的所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述中间区段包含相同底物。
实施方案89：根据实施方案88所述的方法，其中所述分子复合物的所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述中间区段包含不同底物。
实施方案90：根据实施方案87至89中任一项所述的方法，其中所述多个靶标分子包含由不同引发酶杂交的不同靶标分子。
实施方案91：根据实施方案87至90中任一项所述的方法，其中所述多种报道底物包含不同报道底物。
实施方案92：根据实施方案87至91中任一项所述的方法，其中所述分子复合物的所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶具有不同底物特异性，并且每一所述酶杂交和裂解不同报道底物。
实施方案93：根据实施方案58至93中任一项所述的方法，其中任何所述分子复合物都包含通过互补碱基配对与催化核酸杂交的阻断寡核苷酸(BL)，并且所述酶的至少一个但非所有催化核心核苷酸与所述BL杂交。
实施方案94：根据实施方案58至63、85或86中任一项所述的方法，其中所述接触包括使所述样本与根据实施方案1至10或17至21中任一项所述的组合物接触。
实施方案95：根据实施方案87至92中任一项所述的方法，其中所述接触包括使所述样本与根据实施方案23所述的组合物接触。
实施方案96：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：至少一种包含阻断寡核苷酸和第一催化核酸酶的分子复合物，所述阻断寡核苷酸包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与所述第一酶杂交的中间区段，其中所述阻断寡核苷酸提供自所述分子复合物延伸的单链3’或5’突出区段；以及引发催化核酸酶、前体底物和报道底物，其中所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供释放寡核苷酸；所述释放寡核苷酸包含与以下各物具有碱基对互补性的序列：由所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸提供的所述突出区段中的至少一部分；以及通过互补碱基配对与所述分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交的所述阻断寡核苷酸的至少一部分；所述释放寡核苷酸的核苷酸序列与所述催化核酸酶的核苷酸序列不相同；当存在时，所述释放寡核苷酸可与所述阻断寡核苷酸杂交，从而形成双链体并由此导致所述分子复合物中所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交链解离；并且所述分子复合物的所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案97：根据实施方案96所述的方法，其中所述分子复合物包含将所述阻断寡核苷酸的一端连接于所述第一催化核酸酶的一端的发夹环。
实施方案98：根据实施方案97所述的方法，其中所述接触包括使多种所述分子复合物与所述样本接触，其中；第一所述分子复合物的所述突出区段的一部分通过互补碱基配对与第二所述分子复合物的所述突出区段的一部分杂交；所述释放寡核苷酸包含与所述第一分子复合物的所述突出区段的一部分以及杂交所述第一分子复合物的所述第一催化核酸酶的所述阻断寡核苷酸的一部分具有碱基对互补性的第一区段；与所述第二分子复合物的所述突出区段的一部分以及杂交所述第二分子复合物的所述第一催化核酸酶的所述阻断寡核苷酸的一部分具有碱基对互补性的第二区段；以及在所述第一区段与第三区段之间并且与每一所述阻断寡核苷酸的所述突出区段的至少一部分具有碱基对互补性的中间区段；所述释放寡核苷酸的所述第一区段对所述第一分子复合物中通过互补碱基配对与所述第一分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交的所述阻断寡核苷酸的一部分具有结合亲和力；所述释放寡核苷酸的所述第二区段对所述第二分子复合物中通过互补碱基配对与所述第二分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交的所述阻断寡核苷酸具有结合亲和力；当存在时，所述释放寡核苷酸可与每一所述阻断寡核苷酸杂交，从而导致每一所述分子复合物中所述催化核酸和所述阻断寡核苷酸的杂交链解离；并且每一所述分子复合物的所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案99：根据实施方案96至98中任一项所述的方法，其中所述前体底物是或包含所述靶标。
实施方案100：根据实施方案96所述的方法，另外包括通过使所述样本与核酸外切酶接触来放大所述可检测信号，所述核酸外切酶当与所述释放寡核苷酸杂交时能够消化所述阻断寡核苷酸，其中所述消化释放出所述释放寡核苷酸，所述释放寡核苷酸可接着结合第二所述分子复合物，并且引发另外的可检测信号的产生。
实施方案101：根据实施方案100所述的方法，其中通过所述释放寡核苷酸与所述阻断寡核苷酸杂交而形成的所述双链体包含具有至少四个核苷酸的3’突出区段和相对钝端。
实施方案102：根据实施方案100或实施方案101所述的方法，其中所述核酸外切酶选自ExoIII和T7核酸外切酶。
实施方案103：根据实施方案96所述的方法，另外包括通过使所述样本与切口核酸内切酶接触来放大所述可检测信号，所述切口核酸内切酶当与所述释放寡核苷酸杂交时，能够裂解所述阻断寡核苷酸，由此使所述释放寡核苷酸自所述双链体释放并允许其与第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，并且引发另外的可检测信号的产生。
实施方案104：根据实施方案96所述的方法，另外包括通过使所述样本与限制性核酸内切酶接触来放大所述可检测信号，所述限制性核酸内切酶当与所述释放寡核苷酸杂交时，能够裂解所述阻断寡核苷酸，由此使所述释放寡核苷酸自所述双链体释放并允许其与第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，并且引发另外的可检测信号的产生。
实施方案105：根据实施方案104所述的方法，其中所述限制性核酸内切酶在结合由所述释放寡核苷酸和所述阻断寡核苷酸的区段形成的识别位点之后将所述阻断寡核苷酸裂解，每一所述区段都包含部分识别位点；由所述释放寡核苷酸区段提供的所述部分识别序列包含硫代磷酸酯键联，从而防止所述释放寡核苷酸被所述限制性核酸内切酶裂解；并且所述阻断寡核苷酸的所述部分识别位点不与所述分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交。
实施方案106：根据实施方案104所述的方法，其中所述限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶；所述切口核酸内切酶在结合由所述释放寡核苷酸和所述阻断寡核苷酸的区段形成的识别位点之后将所述阻断寡核苷酸裂解，每一所述区段都包含部分识别位点；并且所述阻断寡核苷酸的所述部分识别位点不与所述分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交。
实施方案107：根据实施方案96所述的方法，另外包括通过使所述样本与引物寡核苷酸和链置换聚合酶或其组分接触来放大所述可检测信号，其中所述分子复合物还包含自所述阻断寡核苷酸的一个末端延伸的发夹环，其中所述第一催化核酸酶与邻近于所述发夹环末端的所述阻断寡核苷酸杂交；所述发夹环包含茎，在所述茎中一条链提供所述引物的结合位点；当存在时，所述阻断寡核苷酸、第一催化核酸酶和所述释放寡核苷酸各自被3’磷酸化；当存在时，所述释放寡核苷酸可与所述阻断寡核苷酸杂交，从而形成双链体，由此导致所述分子复合物中所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交链解离，并且形成包含所述引物结合位点的3’突出区段；所述引物能够与所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的新多核苷酸的合成；并且所述合成使所述释放寡核苷酸自所述双链体释放，从而允许其与第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，并且引发另外的可检测信号的产生。
实施方案108：根据实施方案107所述的方法，其中所述发夹环是连接于所述阻断寡核苷酸。
实施方案109：根据实施方案96至98和实施方案108中任一项所述的方法，其中，所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含与含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的释放寡核苷酸，并且发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述释放寡核苷酸的一个末端；所述释放寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物的至少一部分杂交的中间区段；并且所述引发催化核酸酶对所述前体底物的裂解导致所述阻断寡核苷酸和所述释放寡核苷酸的杂交链解离。
实施方案110.根据实施方案96所述的方法，其中所述前体底物是所述报道底物；所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含通过互补碱基配对与包含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的释放寡核苷酸；所述释放寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与所述前体底物的至少一部分杂交的中间区段；并且所述分子复合物的所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述前体底物，由此提供可检测信号。
实施方案111：根据实施方案110所述的方法，其中所述前体复合物包含将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述释放寡核苷酸的一个末端的发夹环。
实施方案112：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：至少一种包含阻断寡核苷酸和第一催化核酸酶的分子复合物，所述阻断寡核苷酸包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与所述第一酶杂交的中间区段，其中所述阻断寡核苷酸提供自所述分子复合物延伸的单链3’或5’突出区段；以及引发催化核酸酶、核酸外切酶、前体底物和报道底物，其中：所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，所述引发酶的催化活性促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供核酸酶识别片段；所述核酸酶识别片段包含与所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸的所述3’或5’突出区段中至少一部分具有碱基对互补性的第一区段，和至少四个核苷酸长度并且不与所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸共有碱基对互补性的第二区段；当存在时，所述核酸酶识别片段可与所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，从而形成能够引发所述核酸外切酶对所述阻断核苷酸的降解的双链体；所述核酸外切酶对所述双链体的降解使所述阻断核苷酸消化，从而以独立实体形式释放所述分子复合物的所述核酸酶识别片段和所述第一催化核酸；所述第一催化核酸酶在所述降解之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；并且所述核酸酶识别片段可结合第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸的所述3’或5’突出区段中的至少一部分；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案113.根据实施方案112所述的方法，其中所述前体底物是所述报道底物；所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含与含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的核酸酶识别片段，并且发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述释放寡核苷酸的一个末端；所述前体复合物的所述核酸酶识别片段包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物的至少一部分杂交的中间区段；并且在所述核酸外切酶对所述双链体的所述降解之后，所述分子复合物的所述第一催化核酸酶能够杂交和裂解所述前体底物，由此提供可检测信号。
实施方案114：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：包含通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交的第一催化核酸酶或其组分的分子复合物；引发催化核酸酶；前体底物、报道底物；第一限制性核酸内切酶；和链置换聚合酶或其组分；其中所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供引物寡核苷酸；所述阻断寡核苷酸提供自所述分子复合物延伸的单链突出区段，所述突出区段包含所述第一限制性核酸内切酶的第一部分识别位点；所述突出区段包含形成所述引物的结合位点的核苷酸；所述引物能够与所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第二催化核酸酶的合成；所述第二催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；所述引物的所述杂交和/或所述合成使所述第一部分识别位点完整，并且所述第一限制性核酸内切酶能够在所述引物与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第三催化核酸酶的合成；并且所述第三催化核酸酶的所述合成导致所述第二催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第二催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案115：根据实施方案114所述的方法，其中由所述突出区段提供的所述部分识别位点包含硫代磷酸酯键联，从而防止其被所述限制性核酸内切酶裂解。
实施方案116：根据实施方案114所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶，并且所述突出区段包含所述切口核酸内切酶的部分识别位点。
实施方案117：根据实施方案114至116中任一项所述的方法，其中所述突出区段被修饰成形成将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述酶的一个末端的发夹环，所述发夹环中至少一个区段的相对核苷酸不共有碱基对互补性，所述发夹环的所述区段包含形成所述限制性核酸内切酶的部分识别位点和所述引物的结合位点的核苷酸。
实施方案118：根据实施方案114至117中任一项所述的方法，其中所述前体底物是所述报道底物；所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含与含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的所述引物，并且发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述引物的一个末端；所述前体复合物的所述引物包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物的至少一部分杂交的中间区段；并且所述第一催化核酸酶、所述第二催化核酸酶或所述第三催化核酸酶中的任何一种或多种在所述解离之后能够杂交和裂解所述前体底物，由此提供可检测信号。
实施方案119.根据实施方案114至117中任一项所述的方法，其中所述引物寡核苷酸是前体复合物的组分，所述前体复合物包含通过互补碱基配对与包含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的所述引物寡核苷酸；所述引物寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物中的至少一部分杂交的中间区段；所述引发催化核酸酶是能够在靶标存在下与所述前体底物杂交的MNA酶；并且所述MNA酶对所述样本中所述靶标的识别促进所述MNA酶对所述前体底物的裂解，由此释放所述引物寡核苷酸。
实施方案120：根据实施方案119所述的方法，其中在所述前体复合物中，发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述引物寡核苷酸的一个末端。
实施方案121：根据实施方案114至117中任一项所述的方法，另外包括通过以下方式来放大所述可检测信号：提供模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸包含各自含有与所述引物互补的核苷酸序列的第一5’区段和第二3’区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的中间区段；以及使所述模板与所述引物寡核苷酸、另一限制酶，以及链置换聚合酶或其组分接触；其中，所述引物与所述模板的所述第一区段杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述模板互补的新链的合成；所述引物的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整，并且提供所述引物的与所述第二区段互补的第一拷贝；并且所述完整的部分识别位点位于所述引物的所述第一拷贝附近并在其5’端，从而形成接点，并且所述另一限制性核酸内切酶在所述接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发所述引物的与所述第二区段互补的第二拷贝的合成，并且置换所述引物的所述第一拷贝，由此引发另外的可检测信号的产生。
实施方案122：根据实施方案121所述的方法，其中所述模板寡核苷酸是作为发夹结构的组分提供，所述发夹结构包含通过互补碱基配对与所述模板的所述第二区段和所述中间区段中的至少一部分杂交的第二链；所述第一区段中至少一部分存在于在所述模板的一端处形成的发夹环中，所述发夹环连接所述第一链的末端和所述第二链的末端；并且所述第一区段的与所述引物互补的所述核苷酸序列不与所述模板或所述第二链杂交。
实施方案123：根据实施方案114至117中任一项所述的方法，另外包括通过以下方式来产生多种所述引物寡核苷酸：提供包含以下各物的模板寡核苷酸：包含与引发引物互补的核苷酸序列的第一5’区段；包含与所述引物互补的核苷酸序列的第二3’区段；和在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的中间区段；以及使所述模板与所述引发引物、另一限制酶和链置换聚合酶或其组分接触，其中所述引发引物与所述模板的所述第一区段杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述模板互补的新链的合成；所述引发引物的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整，并且提供所述引物寡核苷酸的与所述第二区段互补的第一拷贝；并且所述完整的部分识别位点位于所述引物寡核苷酸的所述第一拷贝附近并在其5’端，从而形成接点，并且所述另一限制性核酸内切酶在接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发所述引物寡核苷酸的与所述第二区段互补的第二拷贝的合成，并且置换所述引物寡核苷酸的所述第一拷贝。
实施方案124：根据实施方案121至123中任一项所述的方法，其中所述中间区段中的所述限制性核酸内切酶识别位点的所述组分包含硫代磷酸酯键联，从而防止其被所述另一限制性核酸内切酶裂解。
实施方案125：根据实施方案121至123中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
实施方案126：根据实施方案114至118中任一项所述的方法，其中所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸还包含第二区段，所述第二区段含有与所述引物寡核苷酸互补的核苷酸序列；并且与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的所述第二催化核酸酶的所述合成提供所述引物寡核苷酸的第一拷贝。
实施方案127：根据实施方案126所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸的包含与所述引物互补的核苷酸序列的所述第二区段位于所述阻断寡核苷酸的包含与所述第一催化核酸酶互补的核苷酸序列的第一区段的3'端。
实施方案128：根据实施方案126或实施方案127所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段，所述中间区段包含限制性核酸内切酶的第二部分识别位点；并且与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的所述第二催化核酸酶的所述合成提供所述引物寡核苷酸的第一拷贝，并且使所述第二部分识别位点完整，所述识别位点接着能够被另一限制性核酸内切酶识别和裂解。
实施方案129：根据实施方案121至125或128中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶与所述第一限制性核酸内切酶相同。
实施方案130：根据实施方案121至125或128中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶不同于所述第一限制性核酸内切酶。
实施方案131：根据实施方案130所述的方法，其中所述方法还包括使所述样本与所述另一限制性核酸内切酶接触。
实施方案132：根据实施方案126至131中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶能够在所述第二催化核酸酶与所述引物的所述第一拷贝之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发所述引物的第二拷贝的合成，并且导致所述引物的所述第一拷贝自所述BL解离。
实施方案133：根据实施方案128至132中任一项所述的方法，其中限制性核酸内切酶的所述第二部分识别位点包含硫代磷酸酯键联，从而防止其被所述限制性核酸内切酶裂解。
实施方案134：根据实施方案128至133中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
实施方案135：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：包含通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交的第一催化核酸酶或其组分的分子复合物；引发催化核酸酶；前体底物、报道底物；具有磷酸酶活性的酶；以及链置换聚合酶或其组分；其中所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供在3’端包含2’3’环磷酸基团的引物寡核苷酸的非活性形式；所述具有磷酸酶活性的酶能够自所述引物寡核苷酸的所述非活性形式移除所述2’3’环磷酸基团，由此提供所述引物寡核苷酸的活性形式；所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸中一部分是单链，并且包含形成所述引物寡核苷酸的所述活性形式的结合位点的全部或一部分的核苷酸；所述引物寡核苷酸的所述活性形式能够通过互补碱基配对与所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第二催化核酸酶的合成；所述第二催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在于所述样本中，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在于所述样本中。
实施方案136：根据实施方案135所述的方法，另外包括使所述样本与限制性核酸内切酶接触，其中所述阻断寡核苷酸的包含所述引物寡核苷酸的所述活性形式的所述结合位点的全部或一部分的所述单链区段还包含所述限制性核酸内切酶的部分识别位点；所述引物的所述活性形式的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整；并且所述限制性核酸内切酶能够在所述引物与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第三催化核酸酶的合成；并且所述第三催化核酸酶的所述合成导致所述第二催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第二催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号。
实施方案137：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：包含催化核酸酶或其组分的第一模板(ASDz)的分子复合物，所述第一模板通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交；引发催化核酸酶；前体底物、报道底物；具有磷酸酶活性的酶；限制性核酸内切酶；以及链置换聚合酶或其组分；所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供在3’端包含2’3’环磷酸基团的引物寡核苷酸的非活性形式；所述具有磷酸酶活性的酶能够自所述引物寡核苷酸的所述非活性形式移除所述2’3’环磷酸基团，由此提供所述引物寡核苷酸的活性形式；所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸中一部分是单链，并且包含形成所述引物寡核苷酸的所述活性形式的结合位点的全部或一部分的核苷酸，其中所述结合位点包含所述限制性核酸内切酶的部分识别位点；所述引物寡核苷酸的所述活性形式能够通过互补碱基配对与所述结合位点杂交，从而使所述部分识别位点完整，并且提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述ASDz模板具有碱基对互补性的催化核酸酶的合成，并且由此导致(i)所述BL；和(ii)所述ASDz模板的杂交区段解离；所述限制性核酸内切酶能够在所述引物与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述ASDz模板具有碱基对互补性的第二催化核酸酶的合成；所述第二催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述ASDz模板的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在于所述样本中，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在于所述样本中。
实施方案138：根据实施方案135至107中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸的所述单链部分是呈发夹环形式，所述发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述第一核酸酶的一个末端；所述发夹环中至少一段的相对核苷酸不共有碱基对互补性；并且所述发夹环的所述至少一段是的所述引物所述活性形式的所述结合位点。
实施方案139：根据实施方案135至138中任一项所述的方法，其中所述引发催化核酸酶对所述前体底物的所述催化修饰在所述引物寡核苷酸的所述非活性形式的3’末端形成所述2’3’环磷酸基团。
实施方案140：根据实施方案135至139中任一项所述的方法，其中所述具有磷酸酶活性的酶是具有多核苷酸磷酸酶活性的酶。
实施方案141：根据实施方案135至140中任一项所述的方法，其中所述具有磷酸酶活性的酶是T4多核苷酸激酶。
实施方案142：根据实施方案135至141中任一项所述的方法，其中所述前体底物也是所述报道底物。
实施方案143：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：使所述样本与以下各物接触：包含通过互补碱基配对与引物模板链杂交的阻断寡核苷酸(BL)链的发夹状引物模板，其中：所述引物模板链包含与第一引物寡核苷酸互补的第一核苷酸区段和与第二引物寡核苷酸互补的第二核苷酸区段，以及在所述第一区段与所述第二区段中间的部分限制酶识别位点，所述BL和所述引物模板链当通过互补碱基配对最佳地杂交在一起时包含至少一个内部错配核苷酸，并且所述BL链和所述引物模板链是由包含未杂交核苷酸的发夹部分连接在一起，所述未杂交核苷酸提供所述第二引物寡核苷酸的结合位点；链置换聚合酶或其组分；第一限制性核酸内切酶；以及对所述靶标和前体底物具有结合特异性的引发酶，其中所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此产生所述第二引物寡核苷酸；其中：由所述引发酶产生的所述第二引物寡核苷酸通过互补碱基配对与所述发夹环部分的所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述引物模板链具有碱基对互补性的第一新寡核苷酸链的合成，同时使所述BL的杂交部分自所述引物模板链解离，所述新寡核苷酸链包含初始第一引物寡核苷酸和第二引物寡核苷酸，以及位于所述第一引物寡核苷酸和所述第二引物寡核苷酸中间的部分限制酶识别位点，所述部分限制酶识别位点是所述引物模板链的所述部分限制酶识别位点的互补序列，所述新寡核苷酸链的产生使所述引物模板链的所述部分识别位点完整，从而提供所述第一限制性核酸内切酶的裂解位点，所述第一限制性核酸内切酶能够在所述新寡核苷酸链中引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述引物模板链的所述第一核苷酸区段具有碱基对互补性的另一第一引物的合成，并且所述另一第一引物寡核苷酸的所述合成导致与所述引物模板链杂交的所述初始第一引物寡核苷酸的解离；以及另外使所述样本与以下各物接触：包含通过互补碱基配对与包含阻断寡核苷酸的第二链杂交的第一链的分子复合物，所述第一链包含第一催化核酸酶或其组分的模板，其中所述BL包含所述第一催化核酸酶的具有至少一个取代的催化核心核苷酸的部分核苷酸序列，所述部分核苷酸序列不与所述第一催化核酸酶或其组分的所述模板共有碱基对互补性，并且其中所述第一催化核酸酶或其组分在所述分子复合物的一个末端提供单链突出区段；能够使用所述突出部分作为模板以使所述BL序列沿所述第一催化核酸酶或其组分的全长延伸的聚合酶、第二限制性核酸内切酶和报道底物；其中所述分子复合物的所述第一链和所述第二链是由发夹部分连接，所述发夹部分包含另一引物寡核苷酸结合位点和第二限制性核酸内切酶的另一个部分识别位点；所述另一引物寡核苷酸能够与所述另一引物寡核苷酸结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述第一链模板具有碱基对互补性的第一催化核酸酶或其组分的合成；所述另一引物寡核苷酸的所述杂交和/或所述合成使所述另一个部分识别位点完整，并且所述第二限制性核酸内切酶能够在所述另一引物寡核苷酸与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述第一链模板具有碱基对互补性的另一催化核酸酶或其组分的合成；并且所述另一催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述第一链模板的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触和所述另外接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案144：根据实施方案143所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是相同的。
实施方案145：根据实施方案144所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是不同的。
实施方案146：根据实施方案143至145中任一项所述的方法，其中所述第一引物和所述另一引物是相同的。
实施方案147：根据实施方案143至145中任一项所述的方法，其中所述第一引物和所述另一引物是不同的。
实施方案148：一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：包含引物和第一阻断寡核苷酸(BL)的部分发夹状引物复合物，所述第一BL具有通过互补碱基配对与所述引物杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含催化核酸酶的第一底物的中间区段，其中所述第一底物中至少一段不与所述引物杂交，并且所述第一BL在所述部分发夹状引物复合物的一个末端提供第一单链突出区段；包含第一催化核酸酶或其组分的模板链的部分发夹状分子复合物，所述模板链与第二BL杂交，其中所述第二BL包含所述第一催化核酸酶或其组分的具有至少一个取代的催化核心核苷酸的部分核苷酸序列，所述部分核苷酸序列不与所述模板链共有碱基对互补性，所述部分发夹状分子复合物包含含有未杂交核苷酸的发夹环部分，所述未杂交核苷酸提供所述引物复合物中所述引物的结合位点和限制性核酸内切酶的部分识别位点，并且所述模板在所述分子复合物的一个末端提供第二单链突出区段；第一聚合酶，其中所述第一聚合酶使用所述第一突出区段作为模板，促进所述引物链沿所述部分发夹状引物复合物中的所述第一BL的全长延伸，以形成完整发夹状引物复合物；第二聚合酶，其中所述第二聚合酶使用所述第二突出区段作为模板，促进所述第二BL沿所述部分发夹状分子复合物中的所述模板链的全长延伸，以形成完整发夹状分子复合物；第二催化核酸酶，能够特异性杂交和裂解所述第一BL的所述中间区段，从而导致所述第一BL和所述引物的杂交区段解离，并且所述引物在所述解离之后能够通过互补碱基配对与所述完整发夹分子复合物的发夹环部分杂交，由此提供游离的3’羟基；链置换聚合酶或其组分，能够使用所述游离的3’羟基来引发与所述分子复合物的所述模板链具有碱基对互补性的所述第一催化核酸酶或其组分的合成，其中所述引物寡核苷酸的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整；第二限制性核酸内切酶，能够在所述引物与所述第一催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述分子复合物的所述模板链具有碱基对互补性的另一第一催化核酸酶或其组分的合成，并且所述另一第一催化核酸酶的所述合成导致所述分子复合物中所述第一催化核酸酶和所述模板链的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
实施方案149：根据实施方案96至148中任一项所述的方法，其中任何所述分子复合物都包含通过互补碱基配对与催化核酸杂交的阻断寡核苷酸(BL)，并且所述酶的至少一个但非所有催化核心核苷酸与所述BL杂交。
实施方案150：根据实施方案96、97或99至111中任一项所述的方法，包括使所述样本与根据实施方案23至29中任一项所述的组合物接触。
实施方案151：根据实施方案98或99所述的方法，包括使所述样本与根据实施方案30所述的组合物接触。
实施方案152：根据实施方案103至106或109中任一项所述的方法，包括使所述样本与根据实施方案33至35中任一项所述的组合物接触。
实施方案153：根据实施方案107至109中任一项所述的方法，包括使所述样本与根据实施方案36或实施方案37所述的组合物接触。
实施方案154：根据实施方案58至153中任一项所述的方法，其中所述靶标是所述引发催化核酸酶的催化活性所需的作为辅因子的离子化合物。
实施方案155：根据实施方案154所述的方法，其中所述靶标是单价或二价金属离子。
实施方案156：根据实施方案154或实施方案155所述的方法，其中所述靶标选自Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+以及Pb2+中的任何一个或多个。
实施方案157：根据实施方案100至109、112或114至117中任一项所述的方法，其中所述前体底物是或包含所述靶标分子。
实施方案158：根据实施方案58至157中任一项所述的方法，其中所述第一催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
实施方案159：根据实施方案58至158中任一项所述的方法，其中所述引发催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
实施方案160：根据实施方案87至93、95或114至142中任一项所述的方法，其中所述第二催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
实施方案161：根据实施方案114至134、136或137中任一项所述的方法，其中所述第三催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
实施方案162：根据实施方案58至153中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是包含DNA、RNA、配体或其组合的核酸。
实施方案163：根据实施方案107至109、111或114至142中任一项所述的方法，其中所述链置换聚合酶或其组分选自由克林诺片段、Bst、Sequenase 2,0、Vent、Phi29、Pyrophage 3137链置换聚合酶或其任何变体组成的组。
实施方案164：根据实施方案103、106、116、125、136或137中任一项所述的方法，其中所述切口核酸内切酶选自由Nt.AlwI、Nb.BsmAI、Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、Nt.BhaIII、Nt.BsmAI、Nb.BsmI、Nt.CviPII、Nb.Mva1269I、Nt.BspQI、Nb.BtsI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI组成的组。
实施方案165：根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述第一酶或所述其催化部分的不同杂交臂杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；所述第一阻断寡核苷酸的5’末端与所述第一催化核酸酶或其催化部分的3’末端相对，并且所述中间区段包含适体，并且所述适体中至少一段不与所述第一酶或其催化部分杂交。
实施方案166：根据实施方案1至4所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸的一端还包含含有至少一部分自身互补性的发夹环。
实施方案167：根据实施方案5至35中任一项所述的组合物，还包含选自由DNA酶、核糖酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶组成的组的引发催化核酸酶或其催化组分；其中所述引发催化核酸酶或其催化组分能够催化修饰所述中间区段的所述底物。
实施方案168：根据实施方案10所述的组合物，其中所述第一酶能够催化修饰所述第一底物和/或所述第二底物。
实施方案169：根据实施方案5所述的组合物，其中所述BL的所述第一区段或所述第二区段是通过发夹环区段接合于所述第一酶或所述其催化部分的杂交臂。
实施方案170：在本发明的一个实施方案中，所述阻断寡核苷酸不能与所述催化核酸酶的靶标分子杂交。
实施方案171：在本发明的一个实施方案中，所述方法是在体外或离体执行。
实施方案172：在本发明的一个实施方案中，所述样本是生物样本或环境样本。
实施方案173：在本发明的一个实施方案中，所述方法是对生物样本执行以诊断动物、人、哺乳动物、非人动物或非人哺乳动物的疾病或感染。
实施方案174：在本发明的一个实施方案中，所述方法不被执行用来诊断疾病或感染。
附图简述
图1描绘通过与阻断寡核苷酸(BL)杂交来使DNA酶分子可逆失活。BL含有底物序列(底物1)，所述底物序列可由第一MNA酶(Mz1)裂解，从而导致DNA酶(Dz)与BL分离，由此活化/恢复DNA酶的催化活性。DNA酶可接着裂解荧光团(浅色圆)与淬灭剂(深色圆)之间的底物，并且这一裂解可使荧光信号增加。图示了这一策略的三个非限制性实例(图i)-iii))。在所有对示例性策略的说明中，引发事件是由Mz1进行的裂解，然而，在所有情况下，引发事件可由能够裂解相同底物(底物1)的另一不同催化核酸(例如DNA酶或适配酶)促进。当使用MNA酶时，举例来说，可使引发取决于可充当能够裂解底物1的任何MNA酶的装配促进剂(AF1)的任何特定靶标的存在。
图2提供了描绘由DNA酶准环策略达成的来自具有1种和2种失活DNA酶(分别图解描绘于图1图ii)和iii)中)的环的荧光信号的时程图。在这些情况下，反应由DNA酶引发。
图3图i)描绘了使用如图1图i)中概述的阻断的DNA酶策略来说明MNA酶(Mz1)能够裂解BL内存在的底物(底物1)，由此活化/恢复DNA酶(Dz2)的催化活性。Dz2可接着裂解荧光团与淬灭剂之间的底物2，并且这一裂解可使荧光信号增加。图ii)提供了描绘由图i)中图解描绘的策略达成的荧光信号的时程图。还说明了涉及连续释放和活化DNA酶分子并且可用于放大信号的级联。说明所述策略的两个非限制性实例(图iii)和iv))。第一(图iii)概述‘自催化’级联，其中BL分子内存在的底物序列可由被设计用来与裂解与DNA酶相同的底物的MNA酶裂解，所述DNA酶已通过BL暂时失活。第二(图iv)概述‘交叉催化’级联，其中存在两种分子开关复合物，各自含有DNA酶，所述DNA酶可潜在裂解相对分子开关的底物序列，并且反之亦然。在两个实例中，分子开关可由于受BL分子(BLA和BLB)抑制而以非活性状态存在，直至活性MNA酶(Mz1)在可充当装配促进剂(AF1)的靶标分子存在下裂解BLA而引发级联。在本图中所有对示例性策略的说明中，DNA酶与BL之间的杂交都以DNA酶与BL之间的5’端与3’端配对形式存在(如图1图i)中所概述)，然而除此之外，双链体的一端由非互补序列连接，形成发夹状结构。所述配对可实际上在无连接性发夹环下存在，或代之以涉及DNA酶与BL之间的5’端与5’端配对(包括在一个结构内由一种以上DNA酶和BL组成的此类配对)，或杂交方法的组合，其非限制性实例呈现于图1中。在本图中所有对示例性策略的说明中，引发事件是由Mz1进行的裂解，然而，在所有情况下，引发事件可由能够裂解相同底物(底物1)的另一不同催化核酸(例如DNA酶或适配酶)促进。当使用MNA酶时，可使引发取决于可充当能够裂解底物1的任何MNA酶的装配促进剂(AF)的任何特定靶标的存在。
图4说明产生释放寡核苷酸(RL)分子(图(i))以及使用RL活化最初通过与BL分子杂交而无活性的DNA酶分子(ii、iii和iv)的方法。在所说明的非限制性实例中，BL分子不含由单独DNA酶或MNA酶裂解的底物序列。作为替代，由RL使DNA酶与BL分离，所述RL在称为‘支点(toehold)’的单链突出部分处结合BL，并且继续与BL的其余部分杂交，由此置换预先结合DNA酶。这产生游离DNA酶，所述DNA酶现与BL分离，并且具有恢复的催化活性。图i)中描绘了RL活化的方法，这些方法包括了最初在发夹状复合物中不具活性或与单独BL杂交的RL。MNA酶在它的靶标存在下裂解BL内存在的底物导致产生活性RL分子。RL活化DNA酶的能力在三个非限制性实例中说明(图ii)-iv))。在第一种策略中，DNA酶和BL是两种独立的寡核苷酸，并且RL的作用导致两种寡核苷酸完全分离(图ii))。在第二种策略中，连接DNA酶和BL分子以使它们以呈发夹状DNA结构的单一寡核苷酸形式存在，并且RL的作用可导致发夹的打开(图iii))。在第三种策略中，将两种发夹状DNA结构连接在一起的复合物可通过单一RL分子的作用来打开(图iv))。
图5提供了描绘由RL介导的DNA酶活化策略达成的来自单一发夹状DNA酶与两种连接的发夹状DNA酶两者的荧光信号(分别图解描绘于图4图iii)和图iv)中)的时程图。
图6图i)说明RL介导的自BL分子置换DNA酶(如图4中所述)，其中进一步涉及使用称为核酸外切酶III(ExoIII)的蛋白质酶。ExoIII催化自3’钝端或凹入的双链体DNA的3’端逐步移除单核苷酸，并且当BL与RL杂交时，在此处用于降解BL。这促进RL分子的‘再循环’，以使它能起作用以连续置换和活化若干DNA酶。图ii)说明由图i)中描绘的ExoIII策略达成的荧光信号。
图7图i)说明RL介导的自BL分子置换出DNA酶(如图4中所述)，但涉及使用选择性裂解DNA双链体仅一条链的称为‘切口酶’的限制酶。当BL链与RL的含有双链识别序列的一条链的区域形成双链体时，切口酶在此处用于选择性裂解BL链。这促进RL分子的‘再循环’，因为在热力学上不再有利于它与BL再杂交。RL可接着起作用以连续置换和活化其它DNA酶。图ii)说明由图i)中描绘的切口酶策略达成的荧光信号。
图8图i)说明RL介导的自BL分子置换出DNA酶(如图4中所述)，但进一步涉及使用DNA聚合酶，所述酶能够置换在聚合物合成期间预先结合于模板链的DNA链。因此，链置换聚合酶用于自RL/BL双链体置换RL，并且合成与BL互补的链，由此防止DNA酶或RL与BL再杂交。这促进RL分子的‘再循环’，以使它们能起作用以连续置换和活化其它DNA酶。图ii)说明由图i)中描绘的链置换聚合酶策略达成的荧光信号。
图9图i)说明RL与BL分子(BLA)预先杂交以最初使RL失活。这一BL可含有催化核酸(例如，如所说明的DNA酶(Dz1)，或MNA酶，以使反应是靶标依赖性的)的底物，以使这一底物的裂解导致RL分子的活化，由此它可接着通过使第二DNA酶与它自身的BL(BLB)分离来起到活化另一功能性分子，如第二DNA酶(Dz2)的作用(如最初于图4中所述)。图ii)说明由图i)中概述的策略达成的荧光信号。这种策略也可用于产生环状级联(图iii))，其中由RL活化的催化核酸可接着起作用以自RL/BL分子开关裂解BLA分子内存在的底物，此可导致RL分子与催化核酸两者的连续活化，并且由此可用于放大信号。
图10说明通过使用如核酸外切酶III(ExoIII)等核酸酶来直接活化如DNA酶等催化核酸。ExoIII催化自3’钝端或凹入的双链体DNA的3’端逐步移除单核苷酸，并且在此处用于降解BL/DNA酶分子开关中的BL部分。通过存在活性核酸酶识别片段(NRF)来触发ExoIII活性，所述NRF可与一部分BL部分杂交，并且促进ExoIII对它的降解。这可导致DNA酶的活化和NRF的再循环，以使它能起作用以通过相同方法连续活化其它DNA酶(图i))。这种策略也可用于产生环状级联，借此通过NRF促进的ExoIII降解事件活化的DNA酶可接着起作用以自NRF/BL分子开关裂解BLA分子内存在的底物。这可导致NRF分子(也被再循环)的连续活化与DNA酶的活化，并且可用于放大信号(图ii))。
图11说明通过使用如克林诺片段(3’-5’外切)等链置换聚合酶来直接活化如DNA酶等催化核酸。如图i)中所示，所述酶在此处通过延伸引物而自Dz/BL分子开关置换DNA酶部分，所述引物可与一部分BL杂交，或在Dz/BL以发夹状结构连接在一起的实施方案中与环序列杂交。链置换引物延伸使用BL部分作为模板，并且在延伸的引物与BL之间产生非活性双链体，而Dz现在是单链并具有活性的。此外，还描绘了使用限制酶(RE)，并且其活性导致产生可由聚合酶延伸以合成和置换活性DNA酶的其它拷贝的新引物。图ii)说明由图i)中描绘的策略达成的荧光信号。这种策略也可用于产生环状级联，借此DNA酶被活化和合成(通过单独聚合酶活性或聚合酶与RE组合的活性)，并且可接着起作用以自引物/BL分子开关裂解BL分子内存在的底物(图iii))。这可导致连续活化引物与DNA酶两者(如果同时使用RE，那么还合成了新活性DNA酶)，并且可用于放大信号。
图12概述用于产生活性引物分子的示例性方法。在每一情况(图i)、图ii)和图iii))下，活性引物可通过由催化核酸(例如活性DNA酶、活性适配酶，或在靶标存在下装配的活性MNA酶(如所说明))裂解底物来产生。
图13概述用于扩增引物的示例性方法，所述引物可接着如图11中所概述，用于活化和/或合成新DNA酶。图i)-iii)中所示的示例性方法涉及使初始引物(活性引物)与模板杂交，所述引物由链置换聚合酶延伸以产生之前是RE识别位点的引物的新拷贝(新引物)。可接着发生RE切口和聚合的连续循环以连续合成新引物。
图14概述用于同时扩增DNA酶与引物的示例性方法，这两者均可接着如最初图11中所概述，用于活化和/或合成新DNA酶。图i)和ii)中所示的示例性方法涉及使初始引物(活性引物)与发夹状DNA酶/BL杂交，所述引物可由链置换聚合酶延伸以活化先前已由于BL而不具活性的DNA酶，并且产生DNA酶的新合成的拷贝，随后可进一步产生引物的新拷贝(新引物)。新引物之前也可为切口RE识别位点，以使切口和聚合的连续循环可用于不仅连续合成新DNA酶，而且也连续合成新引物。
图15显示由DNA酶准环策略达成的来自具有1种失活的DNA酶与2种失活的DNA酶的环的荧光信号，所述DNA酶已通过用MNA酶在它的靶标装配促进剂存在下裂解环中的BL部分来活化(分别图解描绘于图1图ii)和iii)中)。
图16图i)描绘两种DNA酶准环，即环A与环B之间的交叉催化级联。环A含有Dz3；一种能够裂解环B的BLB内存在的底物3a的DNA酶。环B含有Dz2；一种能够裂解环A的BLA内存在的底物2a的DNA酶。BLA和BLB还各自含有可由Mz1裂解的底物1；所述Mz1是一种在靶标装配促进剂(AF1)存在下形成的MNA酶。图ii)提供了描绘由图i)中概述的交叉催化DNA酶准环策略达成的荧光信号的时程图，比较了在使用单一浓度的MNA酶装配促进剂情况下由仅环A进行活化与环A和环B一起进行活化产生的荧光信号。图iii)提供了描绘由图i)中概述的交叉催化DNA酶准环策略，在环A与环B一起存在下以及在滴定MNA酶装配促进剂浓度下达成的荧光信号的时程图。
图17说明通过使用链置换聚合酶以及具有磷酸酶活性的酶(例如T4PNK)和任选的RE(如图ii)中所示)来活化(图i))或合成(图ii)如DNA酶等催化核酸。当MNA酶裂解底物时，释放一种潜在引物，所述引物由于在它的3’端存在2’3’环磷酸基团而不具活性。T4PNK则可用于移除2’3’环磷酸基团，由此使引物具有活性。活性引物可接着与一部分BL杂交，或在BL于发夹状结构内形成双链体的实施方案中与环序列杂交(图i)和ii))。在图i)中，通过链置换聚合酶进行的引物延伸使用了BL部分作为模板，并且在延伸的引物与BL之间产生非活性双链体，而Dz现在是单链并具有活性的，并且因此能够裂解底物以提供信号。图ii)显示了示例性实施方案，其中由链置换聚合酶延伸活化的引物产生切口核酸内切酶识别位点。BL与含有DNA酶的非活性反义序列(ASDz)以及具有切口RE的双链体识别位点的一条链的寡核苷酸形成双链体。BL含有非活性部分和/或突变DNA酶，但不含形成具有切口RE的双链体识别位点的第二链所需的互补序列。适当RE可用于在通过延伸引物形成的新双链体的完整识别位点处将一条链切口，由此产生新引物，链置换聚合酶可使用ASDz作为模板自所述引物合成新Dz分子。所述系统连续合成新Dz分子，并且图ii)显示了示例性线性级联，借此合成的DNA酶可裂解与MNA酶所裂解的底物不同的底物。图iii)显示由图ii)中概述的线性级联策略达成的荧光信号。
图18图i)和ii)分别说明由图17图i)和ii)中概述的策略达成的环状反馈级联，借此新活化或新合成的催化核酸酶(在这种情况下描绘为DNA酶)被设计用来与引发级联反应的MNA酶裂解相同底物。
图19图i)描绘可如图11中所概述，用于以连续方式合成催化核酸序列(例如DNA酶)的四种不同结构。结构A由‘完整’发夹状DNA酶/BL组成，借此所述发夹的Dz区域包含催化活性所需的完整序列，并且一旦通过引物和链置换聚合酶的置换作用打开了发夹，所述Dz区域就会变得具有活性。结构B由包含含非活性部分DNA酶序列(其中催化核心中缺乏必需碱基)的非活性寡核苷酸的BL组成，所述BL阻断能够充当DNA酶合成的模板的反义DNA酶(ASDz)序列。结构C由包含含非活性部分DNA酶序列(其中催化核心内的必需碱基突变)的非活性寡核苷酸的BL组成，所述BL阻断能够充当DNA酶合成的模板的ASDz序列。在聚合酶存在下，BL链可被延伸，但Dz核心区域内的突变碱基对仍然会使这一寡核苷酸无活性。因此，结构B与结构C在被引物打开时均不会暴露出功能性DNA酶。结构D包含未阻断的Dz模板(ASDz)和邻近的引物结合位点。结构B、结构C和结构D各自能够提供DNA酶合成的模板，但所产生的活性DNA酶达成明显的信号变化。图ii)说明由自图i)中描绘的结构A-D各自产生的活性DNA酶达成的荧光信号。
图20例示两种策略，其中可使用多种引发催化酶(例如MNA酶Mz1、Mz2、Mz3))分别检测靶标分子，并且有助于通过催化修饰并入准环状DNA酶的BL中的多种底物或底物组分之一来产生可检测信号(最初概述于图1图ii)中)。第一种策略(图i))涉及在BL的中间区域内包括多种独立的邻近底物序列，借此每一底物序列可由独立的引发催化酶(例如MNA酶)进行催化修饰。第二种策略(图iii))涉及包括独立的底物序列与其组分两者，借此每一底物或底物组分可由独立的引发催化酶(例如MNA酶)进行催化修饰。图ii)和iv)分别说明由图i)和iii)中描绘的策略达成的荧光信号。
图21，图i)说明涉及最初概述于图1图ii)中的准环策略的自催化级联反应。准环的BLA包含两种邻近底物序列；即，底物1和底物2a。底物1可由MNA酶(Mz1)在它的靶标装配促进剂(AF1)存在下裂解，从而导致DNA酶(Dz2)的释放和活化。Dz2可接着裂解底物2。如果底物2也存在于准环中(图i)中的底物2a)，那么这可导致其它Dz2分子的释放，由此触发BLA裂解事件的指数级联。Dz2也可裂解独立的荧光标记的底物2，从而导致信号的产生和放大。在图ii)和iii)中，描绘了不可能以自催化方式进行反馈的准环，因为BLB和BLC分子不含有底物2。图iv)说明由图i)-iii)中描绘的策略达成的荧光信号。
图22图i)描绘裂解底物(底物1)的MNA酶(Mz1)，所述底物是以用荧光团和淬灭剂染料对标记的独立实体形式提供。作为替代，图ii)描绘了裂解自催化准环的BL内存在的底物1的相同Mz1(最初概述于图21图i中)，借此裂解底物1导致DNA酶(Dz2)的释放和活化，以及自催化级联的后续引发(通过由Dz2裂解BL内的底物2(图ii)中的底物2a))。活性Dz2也可裂解以用荧光团和淬灭剂染料对标记的独立实体形式提供的底物2。图iii)说明并比较了由图i)和ii)中描绘的两种策略达成的荧光信号。
图23图i)描绘使用部分发夹状引物与部分阻断的发夹状Dz-模板(反义DNA酶；ASDz)分子两者来引发以靶标依赖性方式合成新DNA酶分子。BLB是不完整Dz序列，所述序列在核心区域内具有至少一个失活性突变，使得聚合酶对其进行的延伸不能产生活性DNA酶。最初，两种部分发夹状分子均可由聚合酶自3’端延伸以产生完全发夹状的结构。MNA酶(Mz1)可在它的靶标装配促进剂(AF1)存在下形成以裂解发夹状引物的BLA内存在的底物1。这一裂解可导致功能性引物的释放，所述引物又结合发夹状Dz-模板，其中所述引物可延伸和合成活性DNA酶分子，这些DNA酶分子可裂解荧光标记的底物，从而产生可检测荧光信号。图ii)说明由图i)中描绘的策略达成的荧光信号。
图24图i)描绘自催化DNA酶准环(图21图i))连接于固体载体。在所概述的示例性策略中，准环的BL通过连接策略(例如通过使用生物素来使BL连接于涂布抗生蛋白链菌素的二氧化硅微球体)来栓系于固体载体。所述环的BL包含另一间隔子区域，所述间隔子区域的3’末端用生物素部分修饰，以使BL可通过生物素-抗生蛋白链菌素键连接于微球体。DNA酶接着通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与BL杂交。在靶标装配促进剂(AF1)存在下装配的MNA酶(Mz1)可用于引发自催化级联反应，所述反应可在准环保持连接于固体表面时发生。图ii)提供了说明由图i)中描绘的策略达成的荧光信号的时程图。
图25图i)扩展了图13图iii)中描绘的策略，借此引物(引物2)可与发夹状引物模板分子杂交以引发不同引物(引物1)的合成。每一引物1可接着通过与部分阻断的发夹状Dz-模板杂交来引发活性DNA酶(Dz1)分子的合成(先前概述于图17图ii)和图23图i中)。每一Dz1可接着裂解底物1，所述底物可用荧光团和淬灭剂染料对标记，由此裂解导致荧光信号的可检测增加。图ii)提供了说明由图i)中描绘的策略达成的荧光信号的时程图。
图26图i)例示涉及两种独立的自催化准环(环A和环B)的多路检测反应。尽管所有组分都一起在同一反应室中，但显示每一级联反应是独立地起作用。通过由不同MNA酶裂解各BL内存在的不同底物来引发级联，所述MNA酶各自可在用它们的独特靶标序列装配之后起作用。每一级联导致对不同荧光报道底物的修饰，其中每个探针还使用了不同荧光染料以区分两种反应以及指示每个靶标的存在。图ii)提供了说明图i)中描绘的多路反应策略中的来自两种荧光报道探针的荧光信号的两个时程图。
图27图i)描绘了自催化准环状结构(图21图i))，借此通过靶标序列(靶标1)与BL内的RE底物(底物1)杂交，从而募集RE的活性对BL进行选择性切口来引发级联。底物1和靶标1各自包含RE识别序列的一条链，由此两者结合在一起导致形成完整识别位点，并且触发RE对BL进行的切口。BL内的底物2(底物2a)和游离底物2(用荧光团/淬灭剂染料对标记)均可在由RE介导的Dz2自环释放之后被Dz2裂解。图ii)提供了说明由图i)中描绘的策略达成的荧光信号的时程图。
图28描绘使用适体来识别靶标分析物/配体以及促进BL自另一功能性分子(在这种情况下是DNA酶)解离的策略，所述解离可导致恢复DNA酶催化活性。这种策略的两个非限制性实例描绘于图i-ii)中。图i)概述了使用适配酶来裂解分子开关复合物的BL内存在的底物(底物1)，所述适配酶仅在它的靶标分析物/配体存在下起作用。适配酶包含DNA酶结构域(Dz1结构域)和适体结构域。适体结构域的存在导致适配酶的DNA酶结构域的暂时失活。在靶标分析物/配体存在下，适体区域结合分析物，从而导致适配酶结构的构象变化，此又允许DNA酶结构域采用活性构象，由此恢复它的催化活性。活性适配酶裂解底物1(底物1)导致最初与BL杂交的第二DNA酶(Dz2)的释放。活性Dz2可接着裂解它的底物(底物2)，如果所述底物用荧光团和淬灭剂部分标记，那么导致荧光信号增加。
图ii)描绘了涉及直接在分子开关的BL内包括适体的示例性策略。在图ii)中，DNA酶(Dz)与BL杂交，从而导致它的暂时失活。BL由与Dz杂交的5’端和3’端组成，所述各端由不与Dz互补但包含适体序列的中心部分连接。在靶标分析物(配体)存在下，适体可结合分析物，此可导致BL的构象变化，从而使BL与Dz分离，恢复Dz的催化活性。活性Dz可接着起作用以裂解它的底物(底物(Substrate)；可用荧光团和淬灭剂部分标记)，并且裂解可导致荧光信号增加。
图iii)说明由图i)中描绘的策略达成的荧光信号。
定义
本文使用的某些术语和短语应具有如下阐述的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本申请中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数形式的提及物。举例来说，术语“一种MNA酶”也包括多种MNA酶。除非上下文另外需要或明确作相反陈述，否则本文以单个整数、步骤或要素叙述的本发明的整数、步骤或要素明确涵盖单数形式和复数形式的所述整数、步骤或要素。
除非作不同指示，否则术语“包含”和“具有”是指“主要包括但未必仅包括”。此外，用词“包含(comprising)”的变化形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相应变化的含义。因此，举例来说，“包含”靶标分子A的样本可仅由靶标分子A组成，或可包括一种或多种不同类型的靶标分子(例如靶标分子B和/或靶标分子C)。类似地，“具有”磷酸酶活性的酶可仅具有磷酸酶活性，或还可具有其它额外活性(例如激酶活性)。
术语“阻断寡核苷酸”、“阻断剂”、“阻断分子”和“BL”在本文中可互换使用，并且具有相同含义。BL是能够通过互补碱基配对与第二寡核苷酸杂交，由此防止所述第二寡核苷酸执行它能够在不存在所述BL下执行的功能的一种寡核苷酸。举例来说，BL当与第二寡核苷酸杂交时，可通过抑制它与其它寡核苷酸杂交的能力，和/或通过抑制它形成活性构象的能力来防止所述第二寡核苷酸起作用。第二寡核苷酸的通过与BL杂交进行抑制的特定功能可包括例如以下能力：催化修饰底物；提供活性MNA酶的组分部件酶；用作能够替代核酸双链体的一条链的“释放寡核苷酸”；充当能够进行聚合酶介导的伸长的引物；充当聚合酶介导的互补链合成的模板；和/或形成能够由核酸内切酶或核酸外切酶识别和消化的双链体。第二寡核苷酸的在BL存在下被抑制的特定功能可不包括能够阻断配体结合适配酶。BL可包含一个或多个不通过互补碱基配对与第二寡核苷酸杂交的区段。或者，BL的所有核苷酸都能够与第二寡核苷酸杂交。通过添加对BL中与第二寡核苷酸互补的区域具有结合亲和力的另一实体(例如，如以下定义的“释放寡核苷酸”(RL))，BL可自与其杂交的第二寡核苷酸解离。举例来说，RL可通过互补碱基配对与突出区段(“支点”)杂交，所述突出区段是由在BL与功能性失活的第二寡核苷酸的杂交链之间形成的双链体中的BL提供。相较于第二寡核苷酸对相同BL或其区段的结合亲和力，RL对BL或其区段的结合亲和力可更强、相等或降低。BL可为不连续实体、较大寡核苷酸的区段，或例如通过连接核酸序列(例如发夹环接头序列)或通过任何其它手段(例如非核酸化学，包括间隔子修饰，如C3磷酰胺间隔子和乙二醇间隔子，如间隔子9和间隔子18，这些间隔子各自可用于形成发夹结构的环)连接于另一寡核苷酸(例如第二寡核苷酸)。BL可包含催化核酸酶的一种或多种底物。BL还可包含供一种或多种靶标分析物识别的一种或多种适体序列，但在所述情况下，BL可能不能够或是不能够通过互补结合来抑制适配酶的功能。通过适体序列与靶标分析物之间的相互作用，BL可自与其杂交的第二寡核苷酸解离。
术语“释放寡核苷酸”、“释放剂(releaser)”、“释放分子”和“RL”在本文中可互换使用，并且具有相同含义。RL是能够通过互补碱基配对与给定核酸双链体的第一链杂交，由此替代所述双链体的第二链并且大致上或完全阻止所述第二链与所述第一链再杂交的一种寡核苷酸。RL借助于对双链体第一链中的与第二链互补的区域具有结合亲和力来影响双链体的杂交链的解离，并且在结合之后，RL替代第二寡核苷酸。RL可包含一个或多个不通过互补碱基配对与第一链杂交的区段。RL最初可通过互补碱基配对与给定核酸双链体的第一链所提供的突出区段(“支点”)杂交。相较于第二链对相同第一链或其区段具有的结合亲和力，RL对所述第一链或其区段的结合亲和力可更强、相等或降低。借助于非限制性实例来说，RL可通过互补碱基配对与作为“分子开关”(如下定义)的组分的BL杂交。RL和BL的杂交可将BL与分子开关中先前与BL杂交的另一组分(例如催化核酸酶)分离，由此释放呈催化活性状态的酶。在这一情形中，BL可作为独立寡核苷酸(包含RL的寡核苷酸的组分)形式提供，或可连接于RL(例如通过连接核酸或非核酸间隔子序列)。
如本文所用的术语“分子开关”是指含有RL、NRF、引物、催化核酸酶和/或催化核酸酶组分中任何一种或多种的复合物，可通过各种方法使其成为功能性失活的或具有活性的，包括但不限于，通过与BL杂交实现失活，或通过移除经互补碱基配对与开关杂交的BL(例如通过裂解BL或由RL替代)实现活化。
术语“模板”、“聚合酶模板”、“聚合酶的模板”、“聚合酶的核酸模板”和“核酸聚合酶模板”在本文中可互换使用，并且具有相同含义，是指充当聚合酶的模板以产生与模板序列具有碱基对互补性的新核酸序列(即，所述新核酸序列是所述模板的反义序列)的单链核酸序列(例如DNA和/或RNA)。各种类型的模板都可用于本发明中。模板的非限制性实例包括“DNA酶模板”、“Dz模板”或“Dz-模板”，此类模板包含DNA酶的反义核酸序列，并且可由聚合酶用于合成活性DNA酶。模板的其它实例包括“引物模板”或“引物合成模板”，此类模板包含引物的反义核酸序列，并且可由聚合酶用于合成活性引物以引发另一分子的合成。模板的另一实例包括“RE模板”，此类模板包含双链体RE识别位点的一条链，并且可由聚合酶复制用来合成双链体RE识别位点的第二链，由此产生可由RE裂解的功能性序列。
如本文所用的术语“靶标”和“靶标分子”是指能够由本文所述的分子复合物检测的任何分子，包括但不限于，核酸、蛋白质、朊病毒、小有机化合物、催化核酸酶辅因子(例如二价或单价离子)以及整个生物体。举例来说，靶标可为充当装配促进剂以引导MNA酶的装配的核酸；能够结合适体，借此与适体结合导致适配MNA酶或其它适配酶活化的任何分子；或能够促进催化核酸、RL、引物或NRF自BL分子释放的任何分子。
如本文所用的术语“核酸酶识别片段”和“NRF”是指可通过互补碱基配对与第二寡核苷酸杂交，并且由此产生核酸酶的识别位点的寡核苷酸。识别位点的产生引发了酶对通过NRF和第二寡核苷酸杂交形成的双链体的组分的活性(例如由核酸外切酶消化第二寡核苷酸)。NRF可沿它的整个长度与第二寡核苷酸互补。或者，NRF的一个或多个区段可与第二寡核苷酸互补，而一个或多个其它区段则不能。
术语“引物”、“引物序列”和“引物寡核苷酸”在本文中可互换使用，并且具有相同含义。引物是指可通过互补碱基配对与另一核酸的单链区段杂交，并且由此促进由聚合酶合成与所述单链区段具有碱基对互补性的新核酸链的短寡核苷酸(例如长度小于：50、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸)。
术语“催化核酸分子”、“催化核酸”、“催化核酸酶”、“核酸酶”和“催化核酸序列”在本文中可互换使用，并且具有相同含义。这些术语涵盖能够特异性识别和催化修饰一种或多种底物的任何核酸。举例来说，这一种或多种底物可为核酸，并且催化修饰可为连接或裂解。如本文所用的催化核酸酶包括DNA分子或含有DNA的分子、RNA或含有RNA的分子，以及DNA-RNA或含有DNA-RNA的分子。催化核酸酶的非限制性实例包括DNA酶(DNAzyme)(也称为DNA酶(DNAenzyme)和脱氧核糖酶)、核糖酶(也称为RNA酶(RNA enzyme)和RNA酶(RNAzyme))和多组分核酸酶(MNA酶)。催化核酸酶在本文中可称为“引发催化核酸酶”或“引发酶”，是指负责引发根据本发明的级联的第一步的催化核酸酶。“引发催化核酸酶”或“引发酶”也可包括适配酶，其中DNA酶或核糖酶连接于适体；或适配MNA酶，其中MNA酶组分连接于适体。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且具有相同含义，是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，或其类似物、衍生物、变体、片段或组合，包括但不限于，DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、微小RNA前体和初级微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合。借助于非限制性实例来说，核酸的来源可选自包含合成、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或其任何组合的组。
如本文所用，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”和“寡核苷酸(oligo)”可互换使用，并且具有相同含义，是指DNA或含有DNA的核酸分子、RNA或含有RNA的分子，或DNA-RNA或含有DNA-RNA的分子。寡核苷酸的非限制性实例包括核酸靶标；BL；RL；NRF；催化核酸酶(例如DNA酶、核糖酶、MNA酶)；底物，例如可由MNA酶、DNA酶和/或核糖酶修饰的底物；引物，如本文所述的级联中使用的引物；以及MNA酶的组分。寡核苷酸可包含至少一个添加或取代，包括但不限于下表1中阐述的添加或取代中的任何一个或多个。寡核苷酸可例如用作PCR引物、DNA酶、部件酶或适体。如本文提及的寡核苷酸可通过任何方法来合成，包括例如通过化学合成(例如自组分核苷酸合成，或向所述寡核苷酸的预先存在片段中添加核苷酸)。寡核苷酸也可通过连接或以其它方式接合所述寡核苷酸的多个片段来构建。如本文提及的“连接产物”是包含主要由已通过连接酶接合(连接)在一起的两个或更多个寡核苷酸组成的寡核苷酸的核酸。
如本文所用的术语“核苷酸”与“核苷酸残基”和“碱基”具有相同含义，并且涵盖了包含碱基A、C、G、T或U的核苷酸以及其衍生物或类似物(其非限制性实例列于表1中)。
如本文关于核酸或核苷酸所用的术语“衍生物”包括任何功能相当的核酸或核苷酸，包括整体地产生(例如通过重组手段)或合成后添加(例如通过化学手段)的任何融合分子。所述融合物可包含添加有RNA或DNA，或缀合至多肽(例如嘌呤霉素(puromycin)或其它多肽)、小分子(例如补骨脂素(psoralen))或抗体的本发明的寡核苷酸。
如本文关于核酸或核苷酸所用的术语“类似物”包括物理结构与DNA或RNA分子或残基相关，并且能够与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键的化合物(即，它能够与DNA或RNA残基或其类似物退火以形成碱基对)，但所述键结并非所述化合物涵盖在术语“类似物”内必需的。所述类似物可具有与其结构相关的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基不同的化学和生物性质。甲基化、碘化、溴化或生物素化残基是类似物的实例。已描述了含有核苷酸类似物的活性DNA酶，包括脱氧肌苷、C-5-咪唑脱氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-脱氮-dATP、2’-O-甲基RNA、2’O-甲基帽。其它类似物也可与如DNA酶、核糖酶和MNA酶等催化核酸酶的催化活性相容。改变具有催化活性的核酸(例如通过用一个碱基取代另一碱基，通过用类似物取代碱基)或改变糖组分或磷酸二酯骨架对于熟练技术人员来说可为简单的。举例来说，改变可在合成期间或通过在合成之后修饰特定碱基来进行。凭经验测试并入了改变(如碱基变化或碱基类似物)的催化核酸允许评估改变的序列或特定类似物对催化活性的影响。碱基A、C、G、T和U的类似物在本领域中是已知的，并且一个子组列于表1中。可抑制核酸酶消化的类似物的非限制性实例在本领域中也是熟知的。所述类似物可策略性地放置在寡核苷酸内以防止被核酸外切酶和/或核酸内切酶裂解。举例来说，已知硫代磷酸酯键联的Sp立体异构体会极大地抑制许多核酸酶的裂解，包括但不限于，限制性核酸内切酶、λ核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶III(大肠杆菌)、核酸外切酶I(大肠杆菌)、核酸外切酶T和RecJ。纳入多个硫代磷酸酯键联可特别有效阻断核酸酶活性。
表1：核苷酸类似物的实例
如本文所用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”是指仅在MNA酶装配促进分子(例如靶标分析物)存在下装配以形成能够催化修饰一种或多种底物的催化活性核酸酶的两个或更多个寡核苷酸序列(例如部件酶)。举例来说，部件酶A和部件酶B可各自结合靶标分析物(例如通过与核酸靶标进行互补碱基配对)。MNA酶仅在部件酶A和部件酶B的感应臂在靶标上邻近于彼此杂交时形成。MNA酶的底物臂接合底物，对所述底物的修饰(例如裂解或连接)是由MNA酶的通过部件酶A和B上的部分催化结构域相互作用形成的催化核心来催化。应了解，如本文所用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”涵盖所有已知的MNA酶和修饰的MNA酶，包括以下任何一项或多项中公开的那些：PCT专利公布号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084，以及相关美国专利公布号2007-0231810、2010-0136536和2011-0143338(这些文件各自的内容以引用的方式整体并入本文)。术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”所涵盖的MNA酶和修饰的MNA酶的非限制性实例包括具有裂解催化活性的MNA酶(如本文所例示)、包含一种或多种装配抑制剂的拆散的或部分装配的MNA酶、包含一种或多种适体的MNA酶(“适配MNA酶”)、包含一个或多个截短的感应臂和任选的一种或多种稳定化寡核苷酸的MNA酶、包含一种或多种活性抑制剂的MNA酶、多组分核酸非活性酶原(MNAi)以及具有连接酶催化活性的MNA酶(“MNA酶连接酶”)，各自详述于以下一项或多项中：WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US 2007-0231810、US 2010-0136536和/或US2011-0143338。
如本文所用的术语“适配酶”是指一种催化核酸(DNA酶或核糖酶或MNA酶)，所述核酸已与适体结构域连接以对其活性进行别构调控，以使它依赖于靶标分析物的存在。用于将适体并入催化核酸或催化核酸组分中的方法包括但不限于，使适体直接缀合于催化核酸或催化核酸组分的一个或多个结构域；将适体并入催化核酸的非功能性区域中；或邻近于催化核酸的功能性区域缀合适体，其中适体与催化核酸两者均与调控寡核苷酸部分杂交以在不存在分析物下抑制适配酶的催化活性。
术语“装配促进分子”、“装配促进剂”、“MNA酶装配促进分子”和“MNA酶装配促进剂”在本文中可互换使用，并且是指可与一种或多种部件酶组分的感应臂杂交，并且由此促进催化活性MNA酶的装配的实体(例如核酸)。装配促进剂可促进具有裂解、连接酶或其它酶活性的MNA酶的装配。装配促进剂可为单一分子或包含与一种或多种寡核苷酸“部件酶”的感应臂杂交的多个独立分子。装配促进剂可为待检测或定量的靶标(例如选自由以下组成的组的核酸：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、微小RNA前体和初级微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、扩增子或其任何组合)。
如本文所用，术语“部件酶”、“部件酶组分”和“部件酶寡核苷酸”可互换使用，并且具有相同含义，各自是指含有DNA和/或含有RNA的寡核苷酸，其中两种或更多种仅在MNA酶装配促进分子存在下可一起形成“MNA酶”。部件酶包含三个结构域：“催化”结构域，所述结构域形成催化化学修饰的MNA酶的催化核心的一部分；“感应臂”结构域，所述结构域与装配促进剂(例如靶标分析物)缔合和/或结合；和“底物臂”结构域，所述结构域与底物缔合和/或结合。
术语“底物”和“底物分子”在本文中可互换使用，并且是指能够被催化分子(例如催化核酸酶或蛋白质酶)识别和催化修饰的任何分子。底物可包含例如能够被催化核酸酶特异性识别和催化修饰的单链或双链核酸。被催化修饰的底物可通过间接和/或直接手段来检测。举例来说，对底物的催化修饰可借助于一个级联中的一个或多个依赖于底物被催化修饰的后续步骤来间接检测。或者或另外，对底物的催化修饰可例如通过直接检测一种或多种修饰的底物产物和/或由修饰底物直接产生的任何其它信号(例如通过裂解底物并且由此在空间上分开存在于未修饰底物上的先前配对的荧光团和淬灭分子而产生的荧光信号)来检测。可在催化分子催化修饰后直接检测的底物在本文中也称为“报道底物”或“报道探针底物”。
如本文所用，术语“适体”涵盖由于具有较高等级结构(例如3D结合结构域或口袋)而能够以高亲和力和特异性识别一种或多种配体的核酸或肽序列。适体可结合核酸、蛋白质、朊病毒、小有机化合物或整个生物体。本文的优选适体是可通过吸附、回收和再扩增的迭代过程自复杂的合成核酸文库分离的短单链DNA或RNA寡聚物。产生的适体可针对从小分子(如氨基酸或抗生素)至蛋白质、核酸结构或完整细胞的范围内的几乎任何靶标。
如本文所用的术语“配体”是指能够以高亲和力和特异性结合适体的任何分子，包括但不限于，蛋白质、朊病毒、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、小有机化合物、完整细胞以及整个生物体。配体也可称为“靶标分析物”或“分析物”。
在本文中提及两个或更多个核酸之间的“杂交”，或提及“杂交”的两个或更多个核酸应理解为需要核酸的全部或一部分之间的互补碱基配对。
缩写
在本文中以及在整篇说明书中使用以下缩写：
AS：反义
ATP：三磷酸腺苷
BL：阻断寡核苷酸
RL：释放寡核苷酸
NRF：核酸酶识别片段
ExoIII：核酸外切酶III
NESA：切口核酸内切酶信号放大
SDA：链置换扩增
LAMP：环介导的等温扩增
RCA：滚环扩增
TMA：转录物介导的扩增
3SR：自主序列复制
NASBA：基于核酸序列的扩增
MNA酶或Mz：多组分核酸酶
DNA酶或Dz：脱氧核糖核酸酶；
PCR：聚合酶链反应；
F：荧光团染料分子；
Q：淬灭分子；
dNTPα：α-硫代-脱氧核苷酸
JOE或6-JOE：6-羧基-4',5’-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素。
TxR：得克萨斯红(texas red)
Oligo：寡核苷酸
IB：爱荷华黑(Iowa Black)
IDT：整合DNA技术
Pol：聚合酶
RE：限制性核酸内切酶
T4PNK：T4多核苷酸激酶
发明详述
以下详述足够详细地传达了本发明的示例性实施方案以使得本领域普通技术人员能够实施本发明。所述各种实施方案的特征或限定未必限制本发明的其它实施方案或本发明整体。因此，以下详述不限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
如上所论述，当前可用于靶标分子检测的测定和被设计用来放大由所述测定产生的信号的方法明显存在众多局限。本发明的组合物、试剂盒和方法解决了这些局限中的一种或多种。
提供了用于检测、鉴定和/或定量靶标的组合物、方法和试剂盒。
本发明的一些方面涉及能够用作分子开关的分子复合物。这些复合物可包含例如可通过与BL杂交而功能性失活的以下任何一种或多种：RL、NRF、引物、催化核酸酶、催化核酸酶组分或聚合酶模板。自复合物移除BL可致使剩余组分具有功能活性。或者，这些组合物可包含例如不与BL杂交并且可通过与BL杂交而功能性失活的以下任何一种或多种：功能活性RL、NRF、引物、催化核酸酶、催化核酸酶组分或聚合酶模板。
本发明的其它方面涉及利用本发明的分子复合物检测靶标分子和/或信号放大的方法。所述方法大体上包括使用包含分子开关的组分的组合物，所述分子开关可通过催化核酸、聚合酶模板、引物、NRF或RL分子与BL分子之间的杂交形成。这种杂交可导致催化核酸、引物、NRF、RL或聚合酶模板的功能性失活直至BL自它解离时。提供这些分子开关有助于开发检测和信号放大级联。
举例来说，BL可含有针对一种或多种不同催化核酸分子的一种或多种底物序列，由此裂解一种或多种底物可使BL与一个或多个先前通过互补碱基配对与BL杂交的其它分子(例如不同催化核酸、引物、NRF、RL和/或聚合酶模板)分离。BL可包含能够被一种或多种靶标分析物结合的一种或多种适体。靶标分析物与适体的结合可导致BL与一种或多种先前通过互补碱基配对与BL杂交的其它分子(例如不同催化核酸、引物、NRF、RL和/或聚合酶模板)分离。与BL分离可恢复这些分子执行它们的相应功能的能力，即，催化底物修饰、引发新核酸的合成、引发核酸酶活性、释放双链体中的寡核苷酸，或充当模板供聚合酶合成作为模板的互补序列的核苷酸序列。
在另一实例中，通过与BL杂交而功能性失活的催化核酸分子可通过RL分子与BL分离，由此恢复它的催化活性。尽管RL是在酶释放之后与BL杂交，但所述过程可通过单独或组合起作用以使RL自所形成的RL/BL复合物释放的酶的活性而自主地重复，所述酶如DNA酶、MNA酶或其它催化核酸酶、限制酶，包括但不限于切口酶、其它核酸内切酶、核酸外切酶和/或链置换聚合酶。这又允许RL参与其它轮BL分离，由此自BL/酶复合物释放其它催化酶。
在另一实例中，通过与BL杂交而功能性失活的催化核酸可由核酸酶(例如RE或核酸外切酶)或链置换聚合酶的活性直接活化，这些酶活性可通过提供NRF或引物来引发。RE可与链置换聚合酶一起使用，通过RE裂解(包括单链切口)、引物延伸和链置换活动的循环来连续合成新催化核酸。
本文所述的分子开关可用于构建环状级联，借此初始活性催化核酸(如MNA酶在它的靶标装配促进剂存在下)对BL的裂解，和/或通过靶标分析物结合BL内的适体来移除BL，可触发功能性分子(例如另一催化核酸、引物、NRF、RL或聚合酶模板)的活化。功能性分子可直接或间接(通过募集如核酸酶或聚合酶等蛋白质酶)活化另一催化核酸，所述催化核酸可接着起作用以裂解BL，从而导致其它功能性分子的活化。环状反馈级联可用于在检测到靶标之后放大信号。
本发明的其它方面涉及包括本文所述的分子复合物和执行本发明的方法所必需的任选的其它组分(例如，如MNA酶及其组分、DNA酶和/或核糖酶、核酸外切酶、核酸内切酶、RL、BL、NRF、引物、聚合酶模板、底物等催化核酸中的任何一种或多种)的试剂盒。
组合物和试剂盒
本文提供用于执行本发明的方法的组合物和试剂盒。仅借助于非限制性实例来说，所述组合物和试剂盒可包含以下任何一种或多种：催化核酸酶(例如MNA酶和/或其部件酶组分、DNA酶和/或核糖酶)、核酸外切酶、核酸内切酶、RL、BL、NRF、引物、聚合酶模板以及底物(例如催化核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶的底物)。
提供的组合物和试剂盒的各种组分可以呈功能性失活的形式。举例来说，提供的组分可以呈包含BL的分子复合物形式，其中所述BL与所述组分杂交，由此防止它在不存在所述BL下起作用。在所述组合物和试剂盒中包括其它组分(例如RL、核酸外切酶、核酸内切酶、聚合酶、NRF、引物和/或其它催化核酸酶)可提供一种使组分自BL解离，由此恢复所述组分的功能性能力的手段。
或者或另外，提供的组合物和试剂盒的各种组分可以呈功能活性形式。包括能够与组分杂交的BL可提供一种使组分失活的手段。
因此，提供的组合物和试剂盒的各种组分可以呈分子开关形式，其中所述组分可随后通过各种方法而功能性失活或具有功能活性，包括但不限于，通过与BL杂交实现失活，或通过移除与组分杂交的BL(例如通过裂解BL、通过RL或靶标分析物结合BL内的适体来进行置换)实现活化。
以下提供适于包括在所述组合物和试剂盒中的组分的非限制性实例。
催化核酸酶
本发明的组合物和试剂盒可包含一种或多种不同类型的催化核酸酶和/或其一种或多种组分(例如一种或多种部件酶和/或装配促进剂)和/或催化核酸酶或其组分的互补序列。
提供的催化核酸酶和/或其组分可以呈分子复合物形式，其中酶或其组分由于与另一成分(例如BL)杂交而催化失活。在所述情况下，催化核酸酶或其组分自复合物中其它成分解离可使所述酶能够具有催化活性，由此提供分子开关。
或者或另外，提供的催化核酸酶和/或其组分可以呈不连续实体形式，这些实体不是分子复合物的组分，并且能够在底物和/或靶标存在下具有催化活性。在所述情况下，酶或其组分能够修饰底物。在不施加任何特定限制情况下，底物可为BL的组分、引物寡核苷酸或报道底物。当以这种形式提供时，催化核酸酶或其组分可对作为组合物或试剂盒的另一成分和/或报道底物成分的组分的底物具有特异性。所述底物能够在催化修饰后提供可检测信号。举例来说，所述底物可包含一种或多种可检测标记(例如荧光团和淬灭剂)。
所述组合物和试剂盒可包含任何适合的催化核酸酶(其非限制性实例包括DNA酶、MNA酶、核糖酶和/或适配酶)和/或其组分(例如部件酶和/或装配促进剂)。
举例来说，本发明的组合物和试剂盒可包含DNA酶。可利用任何适合的DNA酶。DNA酶可为已知/现存的DNA酶，或通过体外选择新近产生。DNA酶能够裂解或连接RNA或DNA分子。可提供像例如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和/或Pb2+等二价金属离子作为DNA酶的辅因子。DNA酶可包含由两个非保守底物结合结构域(“杂交臂”)侧接的催化结构域(催化核心)，所述底物结合结构域是特异性结合靶标底物的序列区域。适合DNA酶的非限制性实例包括10:23DNA酶，所述酶包含由两个底物识别臂侧接的具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域；和8:17DNA酶。
或者或另外，所述组合物和试剂盒可包含核糖酶。可利用任何适合的核糖酶。核糖酶可为天然核糖酶或人工产生的核糖酶。核糖酶能够裂解或连接RNA或DNA分子。可提供像例如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和/或Pb2+等二价金属离子和/或单价阳离子作为核糖酶的辅因子。核糖酶可包含由两个非保守底物结合结构域(“杂交臂”)侧接的催化结构域(催化核心)，所述底物结合结构域是特异性结合靶标底物的序列区域。或者，涵盖其它核糖酶结构，其中所述结构可包含独立的靶标和底物结合臂以及催化核心。适合核糖酶的非限制性实例包括锤头状核糖酶、发夹核糖酶、分支核糖酶、大核酶(maxizyme)、I组核糖酶、II组内含子核糖酶、HDV核糖酶、RNA酶P、CPEB3核糖酶、glmS核糖酶、肽基转移酶23S rRNA、VS核糖酶、CoTC核糖酶以及GIR1铅酶(leadzyme)。
或者或另外，本发明的组合物和试剂盒可包含以下任何一种或多种：MNA酶、能够形成催化活性MNA酶的部件酶组分、MNA酶装配促进剂和/或MNA酶底物。如本领域人员所熟知，MNA酶是由两种或更多种部件酶在与适当装配促进剂(例如靶标)杂交后自装配的催化活性核酸酶。每一部件酶组分都包含部分催化核心，所述部分催化核心在MNA酶装配后组合形成能够修饰底物的单一催化核心。
适合MNA酶和它们的产生方法的非限制性实例公开于例如以下任何一项或多项中：PCT专利公布号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084，以及相关美国专利公布号2007-0231810、2010-0136536和2011-0143338(这些文件各自的内容以引用的方式整体并入本文)。适合MNA酶包括具有裂解催化活性的MNA酶、具有连接活性的MNA酶、包含一种或多种装配抑制剂的拆散的或部分装配的MNA酶、包含一种或多种适体的MNA酶(“适配MNA酶”)、包含一个或多个截短的感应臂和任选的一种或多种稳定化寡核苷酸的MNA酶、包含一种或多种活性抑制剂的MNA酶、多组分核酸非活性酶原(MNAi)以及具有连接酶催化活性的MNA酶(“MNA酶连接酶”)，各自详细描述于以下一项或多项中：WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US 2007-0231810、US 2010-0136536和/或US 2011-0143338。部件酶寡核苷酸在MNA酶装配促进剂存在下自装配以形成MNA酶。在一些实施方案中，可检测MNA酶的存在，并且这指示靶标的存在，因为MNA酶仅在所述靶标存在下形成，其中所述靶标包含装配促进剂。MNA酶更详细描述于以引用的方式整体并入本文的PCT/AU2006/001473(公布为WO 2007/041774)和PCT/AU2007/001517(公布为WO 2008/040095)中。
如本领域技术人员所知，MNA酶结构是基于一种或多种DNA酶(例如10:23和8:17DNA酶)和/或核糖酶。MNA酶可包含核糖核苷酸碱基和/或脱氧核糖核苷酸碱基和/或其类似物。举例来说，MNA酶的感应臂、底物臂或催化核心中的一个或多个可包含一个或多个核糖核苷酸碱基和/或一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基和/或一个或多个其类似物。在一些实施方案中，MNA酶在MNA酶的催化核心内包含至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或它的类似物。脱氧核糖核苷酸碱基或它的类似物可为催化活性所需的。
所述组合物和试剂盒的MNA酶可含有本领域技术人员所熟知的一种或多种取代，如类似物、衍生物、修饰或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸骨架的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其它修饰，或这些的任何组合。所述修饰、取代、缺失、插入等可在感应臂和/或底物臂中和/或在催化核心部分中进行以使分子保留催化活性。对结合底物或装配促进剂的各臂的取代和修饰可被良好耐受，并且允许定制针对不同底物/装配促进剂的分子。举例来说，对感应臂的修饰允许针对不同装配促进剂进行定制，而对底物臂的修饰允许针对不同底物进行定制。
或者或另外，本发明的组合物和试剂盒可包含催化核酸酶的一种或多种组分。举例来说，所述组合物和试剂盒可包含MNA酶的个别组分(例如一种或多种部件酶和/或一种或多种装配促进剂)。
借助于非限制性实例来说，所述组合物和试剂盒可包含在识别靶标分子后能够自装配以形成能够修饰一种或多种底物的催化活性MNA酶的个别部件酶。由此形成的MNA酶可被设计成仅在部件酶感应臂与某些装配促进剂(可为特定靶标分子)杂交后装配和/或仅催化修饰能够与MNA酶的底物臂杂交的某些特定底物。因此，所述组合物和试剂盒中包括的MNA酶可被设计用作能够引发根据本发明的检测和/或信号放大级联的“引发酶”。
举例来说，通过仅改变部件酶的感应臂，而使底物臂不变，可设计出对各种靶标具有特异性的多种MNA酶，这些MNA酶全部可利用通用MNA酶底物进行检测。熟练技术人员将了解这在消除对每一靶标的定制或独特底物的需求方面提供的益处。每一新靶标仅需要在一个或多个感应臂部分中进行一种或多种变化；底物臂部分和催化核心部分可保持恒定。因此，在使用MNA酶情况下，单一MNA酶底物可用于单一靶标，而在使用改变的MNA酶情况下，单一MNA酶底物可在一系列测定中用于多种靶标。多种MNA酶底物允许在单一测定中使用多种MNA酶(每一靶标对应一种MNA酶)多路检测多种靶标。所述使用MNA酶的多路方法易于在溶液中或在与载体系统连接下实现。因此，本文预期多路测定可在涉及使底物、或MNA酶部件酶或装配促进剂、或其它酶活性中的一种或多种连接于如本文所述的载体的系统中实现。
类似地，MNA酶可被工程改造成特异性杂交和催化修饰某些靶标底物。举例来说，通过仅改变部件酶的底物臂，而使感应臂不变，可设计出对给定靶标具有特异性的多种MNA酶，这些MNA酶识别并催化修饰一系列不同的MNA酶底物。在不施加任何特定限制情况下，底物可为包含或作为以下各物的组分的寡核苷酸：RL、NRF、引物寡核苷酸、BL、催化核酸酶或其组分(例如DNA酶、核糖酶、部件酶、装配促进剂)。所述底物可为能够在由MNA酶催化修饰后提供可检测信号的报道底物。
在某些实施方案中，所述组合物和试剂盒的MNA酶可被工程改造成特异性杂交和催化修饰通用或一般底物。可使用通用MNA酶底物，通过允许进行轻易设计变化以产生识别不同靶标的新MNA酶，来允许开发快速测定。部件酶的底物臂部分和催化核心部分可保持不变，其中仅改变一种或多种部件酶中新靶标所需的感应臂部分。提供通用底物序列，并且因此相同底物可并入针对许多不同靶标的测定中。此外，相同底物可并入本文各种实施方案中的方法中，包括底物游离于溶液中或被栓系或连接于载体的测定中。一系列通用底物可用于多路反应中，从而允许同时检测多种靶标。使用通用底物的MNA酶策略提供了优于如或信标或杂交探针等检测技术的主要优势，所述技术需要设计和使用对每一新靶标具有特异性的探针。因为MNA酶底物是通用的，并且适用于任何靶标，所以裂解这一通用MNA酶底物允许在任何靶标存在下产生和放大信号。
本发明的组合物和试剂盒中包括的DNA酶、核糖酶、部件酶、装配促进剂和/或MNA酶底物可包含能够结合靶标的适体。优选的适体可包含可通过吸附、回收和再扩增的迭代过程自复杂的合成核酸或肽文库分离的短单链DNA或RNA寡聚物或肽。因此，可产生针对从小分子(如氨基酸或抗生素)至蛋白质和核酸结构的范围内的几乎任何靶标的适体。在优选实施方案中，适体包括例如优选通过进化和选择技术产生的核酸结合分子。适体可包含DNA分子、RNA分子或两者的组合，包括但不限于，根据例如上表1的核苷酸类似物。
组合使用适体与核糖酶或DNA酶的策略在本领域中是已知的。所述分子通常是嵌合的，并且含有适体结构域与DNA酶或核糖酶结构域两者，并且因存在靶标配体而活化。适配酶的功能性活性可响应于适体结构域结合它的分析物而开启。用于产生适配酶的策略包括但不限于，通过连通结构域使核糖酶或DNA酶与适体结构域融合在一起。连通结构域可通过体外选择方法加以进化以改进它仅在靶标分析物存在下允许核糖酶或DNA酶具有活性的能力。另一示例性策略涉及将适体并入仅在核糖酶或DNA酶中起结构作用的非功能性茎环或发夹中。适体也可被连接于DNA酶或核糖酶，并且适体结构域与酶结构域两者均可与用于在不存在分析物下抑制酶结构域的催化活性的调控寡核苷酸部分杂交。在分析物存在下，适体可结合分析物，从而自酶结构域释放调控寡核苷酸，并且恢复它的催化活性。在这种情况下，分析物的存在可自DNA酶或核糖酶移除适体，并且恢复它的催化活性。适体也可用于将DNA酶或核糖酶的两种或更多种组分桥接在一起以使酶接着能够修饰它的底物。还存在一类独特DNA酶，此类酶含有氯高铁血红素(hemin)的适体，并且在氯高铁血红素存在下，可模拟过氧化物酶的活性，从而催化各种化学底物产生荧光、化学发光和比色信号。在优选实施方案中，适配酶可用于检测核酸分析物和/或非核酸分析物，并且可通过充当催化核酸而用于引发本文所述的级联反应，所述催化核酸可修饰BL分子内存在的一种或多种与不包含适配酶或连接产物的核酸互补的底物。
组合使用适体与MNA酶的策略在本领域中也是已知的。含有连接于适体的MNA酶组分的适配酶也可称为适配MNA酶。举例来说，MNA酶的至少一种部件酶可并有适体(适配部件酶)以及能够形成发夹并且因此抑制MNA酶装配的互补序列。待检测的分析物或靶标可结合适配部件酶，由此使得能够装配活性MNA酶。在不存在靶标分析物下，适配部件酶采用抑制活性MNA酶装配的发夹结构。在靶标分析物存在下，靶标分析物结合适配部件酶的适体结构域，由此破坏发夹结构，并且允许适配部件酶参与活性MNA酶的装配。活性MNA酶接着能够修饰可作为BL分子的一部分存在的MNA酶底物，此可接着恢复先前在分子开关复合物内呈非活性的DNA酶或其它催化核酸、聚合酶模板或引物、NRF或RL分子的功能。
在其它实施方案中，适体可作为并有适体以及能够形成发夹结构的互补抑制剂序列的装配促进剂的一部分存在。在不存在靶标分析物下，装配促进剂采用发夹结构，所述结构抑制这一组分引导活性MNA酶装配的能力。在靶标分析物存在下，靶标分析物结合装配促进剂的适体结构域，由此破坏发夹结构，并且允许所述组分引导活性MNA酶的装配。活性MNA酶可接着修饰可作为BL分子的一部分存在的MNA酶底物，此可接着恢复先前在分子开关复合物内呈非活性的催化核酸、聚合酶模板、引物、NRF或RL分子的功能。
本领域技术人员将了解，适体可并入一种或多种装配促进分子的任一端中。此外，应了解多种适体可并入一种或多种部件酶寡核苷酸组分中。
在优选实施方案中，本发明的组合物和试剂盒中包括的催化核酸酶(包括DNA酶、核糖酶、MNA酶或其组分)和/或它们的核酸底物可与包含能够结合靶标分子的适体的第一BL完全或部分互补。在如靶标分析物等靶标分子存在下，靶标分析物可结合适体，此可使第一BL与催化核酸、催化核酸组分和/或它们的核酸底物分离，并且恢复催化核酸或组分与它们的底物和/或其它催化核酸组分杂交以形成功能性催化核酸酶/底物复合物的能力。这可接着通过充当可修饰第二BL分子内存在的底物的催化核酸而用来引发本文所述的级联反应，所述第二BL分子抑制与其杂交的互补寡核苷酸的功能性；其中所述互补寡核苷酸不是适配酶。
在其它优选实施方案中，一种或多种适体序列或其部分可存在于BL分子内。在靶标分析物存在下，靶标分析物可结合适体，此可改变适体的构象，并且可导致催化核酸、RL、引物或NRF与BL分离，以及随后分别恢复它们的催化、释放、引发和核酸酶引发活性，其中所述催化核酸不是适配酶。
在其它实施方案中，适体序列可以呈活性引发适配MNA酶仅在靶标分析物存在下形成的构型并入部件酶(适配部件酶)的末端。在这种情况下，检测策略所需的部件酶包括标准部件酶；作为在一端中并入适体的部件酶的适配部件酶；结合适配部件酶与部件酶两者，从而能够装配活性引发适配MNA酶(在靶标存在下)的装配促进剂；底物；以及与适配部件酶中至少跨越一部分适体序列和部件酶序列的一部分底物结合臂的区域杂交的装配抑制剂。在不存在靶标下，装配抑制剂结合适配部件酶，从而防止报道探针底物的裂解。在存在靶标下，靶标结合适配部件酶的适体序列，从而防止装配抑制剂的结合，并且允许引发适配MNA酶结合和裂解MNA酶底物。因此，活性引发适配MNA酶只可在靶标存在下形成和修饰MNA酶底物。
此外，本领域技术人员应了解，装配抑制剂可为独立分子，或可并入参与MNA酶复合物的一种组分中。
本领域技术人员还应了解，一种或多种适体可并入任何寡核苷酸组分，包括部件酶、装配促进剂或MNA酶底物中。此外，适体可并入这些寡核苷酸中的任一种的任一端中。一种或多种适体可并入BL中。适体可例如并入在任一端或并入内部。
本发明的组合物和试剂盒中的催化核酸酶(例如DNA酶、核糖酶、MNA酶、部件酶、装配促进剂、底物和/或适配酶)可以作为分子复合物的通过互补碱基配对与其它分子杂交的组分提供。
在一些实施方案中，所述组合物和试剂盒可包含分子复合物，所述分子复合物包含通过互补碱基配对与一种或多种阻断寡核苷酸杂交的催化核酸酶(例如DNA酶、核糖酶或MNA酶)。BL自催化核酸酶解离可允许所述酶杂交并催化修饰底物(例如报道底物，或第二分子复合物中存在的底物)。以这种方式，移除BL可起到活化分子开关的作用。
在一些实施方案中，所述组合物和试剂盒可包含分子复合物，所述分子复合物包含通过互补碱基配对与至少一种其它BL杂交的DNA酶和/或核糖酶。BL可与DNA酶或核糖酶完全或部分杂交。由于与BL杂交，使得DNA酶或核糖酶可以是功能性失活的。DNA酶或核糖酶自BL解离可恢复DNA酶或核糖酶的催化活性。因此，包含与一种或多种BL杂交的DNA酶或核糖酶的分子复合物可提供分子开关。
在一些实施方案中，分子复合物中与催化核酸杂交的BL可包含：两个或更多个通过互补碱基配对与DNA酶或核糖酶杂交的区段，以及至少一个位于两个杂交区段之间的中间区段，其中所述中间区段不通过互补碱基配对与DNA酶或核糖酶杂交。BL可包含或可不包含催化核酸酶的底物。
举例来说，BL可包含BL所杂交的DNA酶或核糖酶的一种或多种底物，和/或不同催化核酸酶的一种或多种底物。在无任何特定限制下，BL的一个或多个中间区段可包含BL所杂交的DNA酶或核糖酶的底物，或不同催化核酸酶的底物。底物的核苷酸序列可与DNA酶或核糖酶的催化核心的核苷酸序列部分互补、完全互补或完全不互补。因此，复合物的BL中的底物可与DNA酶或核糖酶的催化核心部分但不完全杂交、完全杂交或完全不杂交。
借助于非限制性实例来说，BL可包含各自通过互补碱基配对与DNA酶或核糖酶的不同杂交臂和催化核心的某一区域杂交的第一区段和第二区段，以及位于所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段。中间区段可包含催化核酸酶的底物。中间区段可跨越DNA酶或核糖酶的一些或全部催化核心核苷酸，但不与其杂交。或者，BL的中间区段可不跨越DNA酶或核糖酶的任何催化核心核苷酸。因此，中间区段可与DNA酶或核糖酶的催化核心部分但不完全杂交或完全不杂交。在一些实施方案中，中间区段的底物可与DNA酶或核糖酶的催化核心部分但不完全杂交或完全不杂交。因此，在一些实施方案中，BL的中间区段(包括但不限于，中间区段内的底物)可与DNA酶或核糖酶的一个或多个催化核心核苷酸杂交，但不与全部催化核心核苷酸杂交。BL的中间区段(包括但不限于，中间区段内的底物)可与DNA酶或核糖酶催化核心的除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸之外的全部核苷酸杂交。
在一些实施方案中，BL的中间区段内的一种或多种底物可为分子复合物中未与BL杂交的DNA酶或核糖酶的底物(即，它是不同催化核酸的底物)。在所述情况下，与BL杂交的DNA酶或核糖酶不能裂解底物。
在其它实施方案中，BL的中间区段内的一种或多种底物可为分子复合物中BL所杂交的相同DNA酶或核糖酶的底物。在所述情况下，由于与BL的第一区段和第二区段杂交的量大于与BL的中间区域杂交的量，故可防止DNA酶或核糖酶裂解底物。
在一些实施方案中，BL的中间区段中的核苷酸数目(包括但不限于，中间区段的底物内的核苷酸数目)可超过分子复合物中BL所杂交的DNA酶或核糖酶的催化核心核苷酸的数目(例如超过至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外核苷酸)。在无特定限制下，底物可被提供于保持未与DNA酶或核糖酶杂交的环结构内。
在其它实施方案中，BL的中间区段中的核苷酸数目(包括但不限于，中间区段的底物内的核苷酸数目)可不超过分子复合物中BL所杂交的DNA酶或核糖酶的催化核心核苷酸的数目。
在一些实施方案中，在DNA酶或核糖酶的催化核心与BL的中间区段之间可存在至少一个碱基对错配(例如至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配)。
在一些实施方案中，在DNA酶或核糖酶的催化核心与BL的中间区段内的底物序列之间可存在至少一个碱基对错配(例如至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个错配)。
在一些实施方案中，在DNA酶或核糖酶的反义催化核心与BL的中间区段之间可存在至少一个碱基对错配(例如至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配)。
在一些实施方案中，在DNA酶或核糖酶的反义催化核心与BL的中间区段内的底物序列之间可存在至少一个碱基对错配(例如至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个错配)。
所述组合物和试剂盒可包含分子复合物，所述分子复合物包含BL和催化核酸(例如DNA酶、MNA酶或核糖酶)，其中整个BL可与催化核酸杂交，和/或与催化核酸的包含催化核心残基的区段杂交。举例来说，DNA酶或核糖酶的催化核心的序列与BL的序列可完全互补，并且因此BL和酶可通过互补碱基配对完全杂交。在所述情况下，所述酶将不会催化修饰杂交的BL，因为BL将不包含促进所述酶进行的催化修饰的特定残基(例如特定核糖核苷酸)。
本发明的组合物和试剂盒可包含分子复合物，其中接头将阻断寡核苷酸的一个末端接合于催化核酸的一个末端。举例来说，DNA酶或核糖酶的5’末端可连接于BL的3’末端，或DNA酶或核糖酶的3’末端可连接于BL的5’末端。可使用任何适合手段将BL连接于DNA酶或核糖酶(例如通过使用连接核酸序列或非核酸化学)。
举例来说，分子复合物可包含将阻断寡核苷酸的一个末端连接于DNA酶或核糖酶的一个末端的发夹环。发夹环可包含相对的核苷酸共有碱基对互补性的茎部分。或者，发夹环可包含一个或多个相对的核苷酸不共有碱基对互补性的茎部分。发夹环或其区段(例如茎部分或环部分的一条链)可包含引物寡核苷酸的结合位点。
或者或另外，分子复合物可包含至少一个自复合物延伸的单链突出区段(例如3’突出部分和/或5’突出部分)。单链突出区段可由BL的未杂交区段或者DNA酶或核糖酶的未杂交单链区段形成。单链突出区段可包含另一寡核苷酸或其区段(例如引物、NRF、RL；或其区段)的结合位点。
在一些实施方案中，除如本文所述的分子开关的引发催化核酸酶和/或催化核酸酶的催化功能所必需的辅因子(例如二价金属离子，像例如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和/或Pb2+；和/或单价阳离子)之外，所述组合物和试剂盒可包含活化所述开关所必需的全部组分。仅借助于非限制性实例来说，所述组合物和试剂盒可包含引发催化核酸酶和包含与BL杂交的第一催化核酸酶的分子开关。在特定辅因子存在下，引发催化核酸酶能够直接催化修饰BL以导致BL和第一催化核酸酶的解离，由此促进(直接或间接)可检测信号的产生。或者，在特定辅因子存在下，引发催化核酸酶能够催化修饰组合物或试剂盒中提供的另一组分。这一催化修饰又可提供能够与分子开关相互作用并且(直接或间接)使酶和BL解离，由此促进可检测信号的产生的组分(例如RL、NRF、引物)。
BL分子
本发明的组合物和试剂盒可包含阻断寡核苷酸(BL)分子。
BL是能够通过互补碱基配对与第二寡核苷酸杂交，由此通过抑制它的杂交能力，抑制所述第二寡核苷酸与其它分子相互作用，和/或通过抑制它形成活性构象的能力来防止所述第二寡核苷酸起作用的寡核苷酸。以这种方式，BL的存在会防止第二寡核苷酸在不存在BL下起作用。第二寡核苷酸的在BL存在下被抑制的特定功能可包括催化修饰底物的能力；提供活性MNA酶的组分部件酶的能力；用作能够替代核酸双链体的一条链的“释放寡核苷酸”的能力；充当能够进行聚合酶介导的伸长的引物的能力；充当聚合酶介导的互补链合成的模板的能力；和/或形成能够由核酸内切酶或核酸外切酶识别和消化的双链体的能力。第二寡核苷酸的在BL存在下被抑制的特定功能可不包括能够阻断配体结合适配酶。举例来说，BL当与第二寡核苷酸杂交时，可防止第二寡核苷酸与其它寡核苷酸杂交。通过添加对与第二寡核苷酸互补的至少一段BL具有结合亲和力的另一实体(例如释放寡核苷酸(RL))，可使BL自与之杂交的第二寡核苷酸解离。在一些情况下，RL可促进链置换。在这种情况下，相较于第二寡核苷酸对相同BL或其区段的结合亲和力，RL对所述BL或其区段的结合亲和力可更强、相等或降低。因此，将BL并入本发明的组合物和试剂盒中有助于提供分子开关，其中BL的杂交可用于使给定组分功能性失活，而移除BL可用于使给定组分功能性活化。
BL或BL的区段可与整个靶标寡核苷酸或寡核苷酸的区段共有碱基对互补性。与BL互补的寡核苷酸可为例如引物、NRF、RL、寡核苷酸底物、催化核酸分子或其组分(例如DNA酶、核糖酶或MNA酶、适配MNA酶或装配促进剂)。在一些实施方案中，BL或BL的区段可不与适配酶或装配促进剂具有碱基对互补性或不能够与适配酶或装配促进剂杂交。
BL可被设计成沿BL的全长与第二寡核苷酸互补。或者，BL可包含一个或多个不通过互补碱基配对与第二寡核苷酸杂交的区段。
BL可以呈离散寡核苷酸形式提供于组合物和试剂盒中，在所述情况下，BL有可能与另一寡核苷酸或其区段杂交。在所述情况下，一个分子的3’端可与另一分子的5’端杂交，并且反之亦然(参见图1，图i))。或者，相同末端(即5’与5’，及3’与3’)可杂交以在两个组分之间产生准环状结构(参见图1，图ii))。
BL可以作为另一寡核苷酸的组分提供，所述寡核苷酸如BL被设计用来与之杂交的寡核苷酸，例如引物、NRF、RL、寡核苷酸底物、催化核酸分子或其组分。在一些实施方案中，BL可通过连接核酸或非核酸间隔子序列接合于另一寡核苷酸。举例来说，BL的5’末端可连接于另一寡核苷酸的3’末端，或BL的3’末端可连接于另一寡核苷酸的5’末端。可使用任何适合手段将BL连接于另一寡核苷酸(例如通过使用连接核酸序列或非核酸化学)。BL可通过将阻断寡核苷酸的一个末端连接于另一寡核苷酸的一个末端的发夹环连接于另一寡核苷酸。发夹环可包含相对的核苷酸共有碱基对互补性的茎部分。发夹环或其区段(例如茎部分或环部分的一条链)可包含引物寡核苷酸的结合位点。
BL与引物、NRF、RL或催化核酸分子或其组分之间的杂交可导致引物、NRF、RL或催化核酸的可逆功能性失活，由此提供分子开关。
当BL是以与第二寡核苷酸杂交的形式提供于复合物中时，所述复合物可包含至少一个单链突出区段(例如3’突出部分和/或5’突出部分)。单链突出区段可由BL的未杂交区段或BL所杂交的第二寡核苷酸(例如DNA酶或核糖酶)的未杂交单链区段形成。单链突出区段可包含另一寡核苷酸或另一寡核苷酸的区段(例如引物和NRF或RL)的结合位点。
BL可包含催化核酸酶(例如DNA酶、核糖酶和/或MNA酶)的一种底物或多种底物(例如一种、两种、三种或更多种底物)。在BL包含多种底物的实施方案中，一种或多种底物可为第一催化核酸酶的底物，并且一种或多种底物可为与所述第一催化核酸酶具有不同底物特异性的第二不同催化核酸酶的底物。或者，多种底物可各自由具有相同底物特异性的催化核酸酶识别。
BL可包含一种或多种适体序列。在靶标分析物存在下，靶标分析物可结合适体，此可改变适体的构象，并且可导致催化核酸、部件酶、RL、引物或NRF与BL分离，以及随后分别恢复它们的催化、释放、引发和核酸酶引发活性。
RL分子
本发明的组合物和试剂盒可包含释放寡核苷酸分子(RL)。
RL是能够与给定核酸双链体的第一链杂交，由此替代给定核酸双链体的第二链并且大致上或完全阻止所述第二链与所述第一链重退火的寡核苷酸。相较于第二寡核苷酸对相同第一链或其区段的结合亲和力，RL对所述第一链或其区段的结合亲和力可更强、相等或在一些情况下降低。尽管对第一链具有这种结合亲和力，但RL可包含一个或多个不通过互补碱基配对与第一链杂交的区段。
RL分子可与第二分子完全或部分互补，包括但不限于BL寡核苷酸。
RL可以作为能够替代(例如置换)或移除先前与其它寡核苷酸杂交的BL，由此恢复那些其它寡核苷酸起作用的能力的组分提供于本发明的组合物和试剂盒中。因此，提供RL可以呈被设计用来螯合包含杂交的BL的复合物中的BL，并且由此使分子开关具有功能性活性的离散实体形式。
举例来说，当以离散实体形式提供时，RL可被设计用来结合由BL与任何催化核酸或其组分(例如DNA酶、核糖酶、MNA酶部件酶、装配促进剂)、NRF、引物、寡核苷酸底物或第二RL形成双链体所形成的3’或5’突出区段。在这些实施方案中，RL被设计成对BL中与意图释放的寡核苷酸互补的区域具有结合亲和力，由此促进先前与BL杂交的寡核苷酸的替代(即，RL代替最初在双链体中的寡核苷酸与BL杂交)。可使用本领域普通技术人员所知的标准技术来优化和测量RL对BL的结合亲和力。在一些实施方案中，RL的长度可超过BL所结合的寡核苷酸的长度(例如超过至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)。
或者或另外，RL可以作为分子复合物的组分提供，并且因此可以呈功能性失活的形式提供(图4图i))。在不施加任何特定限制下，RL可为连接于另一寡核苷酸或作为另一寡核苷酸的组分的寡核苷酸，所述另一寡核苷酸如BL、催化核酸酶或其组分(例如DNA酶、核糖酶、部件酶、装配促进剂)。RL可通过连接核酸或非核酸间隔子序列接合于另一寡核苷酸。举例来说，RL的5’末端可连接于另一寡核苷酸的3’末端，或RL的3’末端可连接于另一寡核苷酸的5’末端。可使用任何适合手段将RL连接于另一核苷酸(例如通过使用连接核酸序列或非核酸化学)。RL可通过将RL的一个末端连接于另一寡核苷酸的一个末端的发夹环核酸序列连接于另一寡核苷酸。发夹环可包含相对的核苷酸共有碱基对互补性的茎部分。或者，发夹环可包含一个或多个相对的核苷酸不共有碱基对互补性的茎部分。发夹环或其区段(例如茎部分或环部分的一条链)可包含引物寡核苷酸的结合位点。
NRF分子
本发明的组合物和试剂盒可包含核酸酶识别片段(NRF)分子。
NRF是可通过互补碱基配对与第二寡核苷酸杂交，并且由此产生核酸酶的识别位点的寡核苷酸。识别位点的产生引发核酸酶对通过NRF和第二寡核苷酸杂交形成的双链体的组分的活性(例如核酸外切酶消化第二寡核苷酸，或核酸内切酶将第二寡核苷酸切口)。NRF可沿它的整个长度与第二寡核苷酸互补。或者，NRF的一个或多个区段可与第二寡核苷酸互补，而一个或多个其它区段可不这样。用于包括在本发明的组合物和试剂盒中的NRF可部分或完全包含与靶标核酸的核苷酸序列相同或与靶标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
用于包括在本发明的组合物和试剂盒中的NRF可被设计成通过互补碱基配对与由两个寡核苷酸形成的双链体(例如在BL与另一寡核苷酸之间形成的双链体)中存在的突出区段杂交。NRF与突出区段的杂交可提供能够由核酸酶识别，由此促进核酸酶消化如此形成的双链体的至少一条链的序列或使所述序列完整。另外，NRF可被设计成包括不与双链体的任一寡核苷酸互补的区段(例如长度至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)。当其余部分与突出区段杂交时，这可用于提供NRF的未杂交单链部分，由此用于使NRF对核酸酶消化具有抗性。NRF的杂交区段和未杂交区段可位于NRF的相对末端。
本发明的组合物和试剂盒中的NRF可以作为能够杂交并活化如本文所述的分子开关的离散组分提供。举例来说，NRF可被设计成与由如本文所述的分子开关中的BL形成的3’突出区段杂交。NRF的第一5’区段可被设计成通过互补碱基配对与BL的3’突出部分杂交以由此形成核酸酶识别模板，而NRF的第二3’区段(例如长度至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)可被设计成不与BL(或开关中BL所杂交的寡核苷酸)共有序列互补性。
或者或另外，NRF可以作为分子复合物的组分提供，并且因此可以呈功能性失活形式提供。在不施加任何特定限制下，NRF可连接于另一寡核苷酸，或作为另一寡核苷酸的组分提供，所述寡核苷酸如BL、RL、催化核酸酶或其组分(例如DNA酶、核糖酶、部件酶、装配促进剂)。举例来说，提供的NRF可以呈与BL杂交的发夹状结构。NRF可包含通过互补碱基配对与BL杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与BL杂交的中间区段。BL的与NRF未杂交的部分可包含催化核酸酶(例如引发催化核酸酶)的底物。NRF可通过连接核酸或非核酸间隔子序列接合于另一寡核苷酸。举例来说，NRF的5’末端可连接于另一寡核苷酸的3’末端，或NRF的3’末端可连接于另一寡核苷酸的5’末端。可使用任何适合手段将NRF连接于另一核苷酸(例如通过使用连接核酸序列或非核酸化学)。NRF可通过将NRF的一个末端连接于另一寡核苷酸的一个末端的发夹环连接于另一寡核苷酸。发夹环可包含相对的核苷酸共有碱基对互补性的茎部分。或者，发夹环可包含一个或多个相对的核苷酸不共有碱基对互补性的茎部分。发夹环或其区段(例如茎部分或环部分的一条链)可包含引物寡核苷酸的结合位点。
引物
本发明的组合物和试剂盒可包含引物寡核苷酸。
引物是可通过互补碱基配对与另一核酸的单链区段杂交，并且由此促进由聚合酶合成与所述单链区段具有碱基对互补性的新核酸链的短寡核苷酸(例如长度小于：50、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸)。另一核酸的与引物杂交的单一区段可提供聚合酶的模板；在本文中也称为聚合酶模板。由聚合酶通过延伸引物合成的新核酸链包含作为模板的互补序列的核苷酸序列。因此，模板的功能在于提供由聚合酶阅读，由此指导互补核苷酸以正确顺序插入的序列。
本发明的组合物和试剂盒中包括的引物可被设计成与离散寡核苷酸(例如单链寡核苷酸、包含非互补核苷酸的突出区段或环的双链寡核苷酸)杂交。非限制性实例包括RL、BL、NRF、底物寡核苷酸、催化核酸或其组分(例如DNA酶、核糖酶、MNA酶、部件酶、装配促进剂)。
或者或另外，本发明的组合物和试剂盒中包括的引物可被设计成与存在于复合物(例如分子开关)中的寡核苷酸杂交。举例来说，引物可被设计成与复合物中的双链寡核苷酸的突出区段杂交，或与复合物中的包含非互补核苷酸的发夹环区段杂交。
在一些实施方案中，提供的引物可以呈与BL杂交的发夹结构。BL可包含通过互补碱基配对与引物杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与引物杂交的中间区段。BL的未与引物杂交的部分可包含催化核酸酶(例如引发催化核酸酶)的底物。
在其它实施方案中，引物可以作为催化核酸酶(例如DNA酶、核糖酶、MNA酶、适配酶)的底物的组分提供。引物可以呈功能性失活形式(例如借助于在分子复合物中被螯合和/或借助于作为较长底物序列的组分)存在于底物内。由催化核酸裂解底物可导致引物释放(即活化)。在一些实施方案中，仅仅由催化核酸酶裂解底物就足以释放活化的引物。在其它实施方案中，在裂解底物之后，修饰引物可为必需的(例如在3’端或邻近处修饰引物)。仅借助于非限制性实例来说，引物可需要修饰以由适当酶(例如T4PNK)移除在它的3’端的2’3’环磷酸。
引物可适于由聚合酶或其组分延伸，和/或包含核酸酶的完整或部分识别位点。
本发明的组合物和试剂盒中包括的引物可以作为离散组分提供。或者或另外，引物可以作为分子复合物的组分提供，并且因此可以呈功能性失活形式提供。在不施加任何特定限制下，引物可连接于另一寡核苷酸，或作为另一寡核苷酸的组分提供，所述寡核苷酸如BL、RL、催化核酸酶或其组分(例如DNA酶、核糖酶、部件酶、装配促进剂)、或催化核酸酶的底物(例如MNA酶底物)。引物可通过连接核酸或非核酸间隔子序列接合于另一寡核苷酸。举例来说，引物的5’末端可连接于另一寡核苷酸的3’末端，或引物的3’末端可连接于另一寡核苷酸的5’末端。可使用任何适合手段将引物连接于另一核苷酸(例如通过使用连接核酸序列或非核酸化学)。引物可通过将引物的一个末端连接于另一寡核苷酸的一个末端的发夹环连接于另一寡核苷酸。发夹环可包含相对的核苷酸共有碱基对互补性的茎部分。
寡核苷酸
本发明的组合物和试剂盒中包括的寡核苷酸(如DNA酶、核糖酶、适配酶、MNA酶和它们的相应底物、MNA酶组分(例如部件酶、装配促进剂)、引物、聚合酶模板、NRF、BL以及RL分子)可含有一个或多个本领域技术人员所熟知的取代(如类似物，例如表1中所列的类似物))、衍生物、修饰或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸骨架的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其它修饰，或这些的任何组合。所述修饰、取代、缺失、插入等可在任何位置处进行，前提是寡核苷酸保留它的功能。对寡核苷酸的取代和修饰可被良好耐受，并且允许定制在某些条件下起作用或用于改进反应效率的分子。举例来说，通过包括一种或多种核苷酸类似物来修饰BL分子可有助于在第二DNA酶或MNA酶在它的靶标存在下裂解底物区域之后DNA酶或其它催化核酸分子的释放的改进。
熟练收件人将了解DNA酶、核糖酶、MNA酶和它们的相应底物、MNA酶组分(例如部件酶、装配促进剂)、引物、底物、聚合酶模板、NRF、BL或RL分子可包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或两者。寡核苷酸可包含至少一个脱氧核糖核苷酸，并且在一些情况下可由脱氧核糖核苷酸和/或其类似物组成。
限制酶
所述组合物和试剂盒可包括一种或多种限制酶。限制酶可为I型、II型、III型或IV型限制酶。限制酶通常基于亚单位组成、裂解位置、序列特异性和辅因子要求被分类成这些类型(参见表2)。
表2：限制酶的适合类型
适于包括在本发明的组合物和试剂盒中的限制酶的非限制性实例列于表2中。本领域技术人员将了解，广泛范围的限制酶将可与涉及以下的反应相容：与链置换聚合酶的活性协力合成催化核酸；一旦由NRF触发，即直接活化催化核酸；或通过RL分子的再循环，间接活化催化核酸。举例来说，限制酶数据库REBASE(http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)中所列的许多限制酶将可与所述反应的发生相容。下表3提供本发明中的具有不同特异性和特征的限制酶的实例。
表3：限制酶的实例(各组不是互相排斥的)
*N＝任何核苷酸；R＝A或G；M＝A或C；Y＝C或T；5mC＝5甲基胞嘧啶；6mA＝6甲基腺苷
本领域技术人员将了解通过并入核苷酸类似物(包括但不限于α-硫代-脱氧核苷酸(dNTPα))来保护DNA双链体的一条链，标准RE也可被操作用来充当切口酶。
在一些实施方案中，切口酶类别的RE被提供在所述组合物和试剂盒中。包括切口酶在内的限制酶可连同链置换聚合酶一起被包括。
具有核酸外切酶活性的酶
除RE和催化核酸酶之外，能够裂解核酸序列的其它蛋白质酶也可包括在本文所述的组合物和试剂盒中。这些酶中有一些具有导致自核酸的末端移除核苷酸的核酸外切酶活性。核酸外切酶的适合以及非限制性实例包括核酸酶BAL-31、核酸外切酶I(大肠杆菌)、核酸外切酶III(大肠杆菌)、T7核酸外切酶和核酸外切酶T。核酸内切酶的实例包括T7核酸内切酶I和绿豆(Mung Bean)核酸酶。一小组适用核酸酶的性质列于表4A中。
具有磷酸酶活性的酶
所述组合物和试剂盒可包括一种或多种包含磷酸酶活性的酶。包含磷酸酶活性的酶可催化自核酸移除磷酸基团。对核酸显示磷酸酶活性的酶的非限制性实例包括T4多核苷酸激酶(T4PNK)和小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)。所述酶(例如T4PNK)可催化自多核苷酸的3’末端移除磷酸基团。
表4A：核酸酶性质
链置换聚合酶
本发明的组合物和试剂盒可包含聚合酶(例如具有链置换活性的聚合酶)。
如本领域技术人员所知，链置换描述了聚合酶置换在合成期间遇到的杂交寡核苷酸(例如DNA)的能力。这些置换的下游寡核苷酸链不被降解，并且保持完整。适合链置换聚合酶的非限制性实例包括DNA聚合酶I的克林诺片段、Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段、Pyrophage 3173和Sequenase 2.0聚合酶或其变体。
底物
本发明的组合物和试剂盒可包含能够由酶(例如DNA酶、核糖酶、适配酶和/或MNA酶或适配MNA酶)修饰的底物。
底物可为能够由包括催化核酸酶在内的酶识别、所作用或修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的任何单链或双链聚合物，或其类似物、衍生物、变体、片段或组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、微小RNA前体和初级微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合(包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基的混合聚合物)。
底物可通过各种酶活性(包括但不限于裂解或连接)来修饰，其中由酶修饰底物可提供指示酶的催化活性的可检测效应。
核酸酶的底物也可包含非核酸成分，如氨基酸、肽或蛋白质，或(“New strategies in Chemical synthesis and Catalysis”,B.Pignataro,Wiley-VCH,2012)的表6.1中概述的任何化学成分。
底物可为报道底物，所述报道底物包含有助于定量和/或检测由于酶的催化活性而产生的底物的修饰形式的一种或多种特征。报道底物可游离于溶液中，或例如结合(或“栓系”)于表面或另一分子。报道底物可通过多种手段中的任一种来标记，包括例如荧光团(利用或不利用一种或多种其它组分，如淬灭剂)、放射性标记、生物素(例如生物素化)或化学发光标记。这些各种标记可提供一种在由催化核酸酶修饰(例如裂解)后产生可检测信号的手段。
底物可为由多种催化核酸酶识别并且以催化方式所作用的通用底物。通用底物可被栓系于固体载体。本发明的组合物和试剂盒中包括的底物可作为能够由催化核酸识别和修饰的离散组分提供。本发明的其它方面涉及可由一种以上催化核酸识别和裂解的底物。举例来说，单一核酸底物可由DNA酶与MNA酶两者裂解，前提是DNA酶的底物结合臂与MNA酶的部件酶组分的底物结合臂两者均与相同所述单一核酸底物互补。在所述情况下，DNA酶的特定催化核心序列和MNA酶的部件酶对的催化核心部分可与在底物内的“裂解”位点处的裂解相容。
或者或另外，底物可以作为分子复合物的组分提供，并且因此可以作为功能性失活形式提供。在不施加任何特定限制下，一种或多种底物可连接于另一寡核苷酸，或作为另一寡核苷酸的组分提供，所述寡核苷酸如BL、RL、NRF、催化核酸酶或其组分(例如DNA酶、核糖酶、部件酶、装配促进剂)。底物可通过连接核酸或非核酸间隔子序列接合于另一寡核苷酸。举例来说，底物的5’末端可连接于另一寡核苷酸的3’末端，或底物的3’末端可连接于另一寡核苷酸的5’末端。可使用任何适合手段将底物连接于另一核苷酸(例如通过使用连接核酸序列或非核酸化学)。底物可通过将底物的一个末端连接于另一寡核苷酸的一个末端的发夹环连接于另一寡核苷酸。发夹环可包含相对的核苷酸共有碱基对互补性的茎部分。或者，发夹环可包含一个或多个相对的核苷酸不共有碱基对互补性的茎部分。发夹环或其区段(例如茎部分或环部分的一条链)可包含引物寡核苷酸的结合位点。
或者或另外，底物可包含一种或多种能够充当引物的组分。通常，当引物作为底物的组分存在时(例如借助于在分子复合物中被螯合和/或借助于作为较长底物序列的组分)，它可呈非活性形式。由催化核酸裂解底物可导致引物释放(即，活化)。在一些实施方案中，仅由催化核酸酶裂解底物就足以释放活化的引物。在其它实施方案中，在裂解底物之后，修饰引物可为必需的(例如在3’端或附近修饰引物)。仅借助于非限制性实例来说，引物可需要修饰以由适当酶(例如T4PNK)移除在它的3’端的2’3’环磷酸。
用于检测、定量和信号放大的方法
本发明提供用于检测、鉴定和/或定量至少一种靶标的各种方法。
此外，本发明提供用于放大通过这些方法产生的信号的各种级联。
所述方法利用本发明的组合物及其组分。具体来说，所述方法使用本文所述的分子开关来产生检测和信号放大级联。
靶标检测：具有内部酶底物的BL
根据本发明，用于检测靶标以及放大由靶标检测产生的信号的各种方法利用了包含催化核酸酶底物的BL。
因此，所述方法中使用的BL可含有充当一种或多种催化核酸分子的一种或多种底物的序列。这可作为将BL连接于另一寡核苷酸(例如引物、NRF、RL、聚合酶模板或催化核酸)的发夹环序列的一部分存在，或与所述发夹环序列同时存在。在所述实施方案中，裂解一种或多种底物序列可自BL释放聚合酶模板、引物、NRF、RL或催化核酸，此可导致另一寡核苷酸的功能性能力的恢复，所述功能性能力分别如引发、核酸酶引发、释放、自模板寡核苷酸合成或催化活性。
在某些实施方案中，可使用一种以上BL使一种以上催化核酸分子失活。在这种情况下，各自的底物序列可相同，并且可由第二催化核酸分子裂解，从而导致所有先前非活性催化核酸分子的恢复(图1，图iii))。或者，底物序列可不同，并且由第二催化核酸分子和第三催化核酸分子裂解。
在某些实施方案中，一种或多种MNA酶或适配酶底物可并入BL分子内。这可有助于使用一种或多种MNA酶和/或一种或多种适配酶作为引发酶来特异性检测靶标分子，并且在检测后修饰BL的底物。在一个实施方案中，BL含有MNA酶或适配酶的底物的序列，以使所述MNA酶或适配酶裂解这种底物可将BL与第二完全或部分互补的寡核苷酸分离。裂解底物可导致将BL裂解成两个或更多个较短寡核苷酸片段，这些片段各自具有低于未裂解BL的解链温度。在反应温度下，这些短裂解片段不再大致上与第二互补寡核苷酸杂交。第二互补寡核苷酸可为例如另一催化核酸或其部件酶组分、引物、聚合酶模板、NRF或RL分子，并且这些寡核苷酸自BL释放可因此恢复这些分子执行它们的相应功能的能力，即催化底物修饰，引发合成，提供合成核酸链的模板，或提供用于引发核酸酶活性的序列或释放寡核苷酸(例如通过链置换)。在一些实施方案中，第二互补寡核苷酸不是MNA酶的装配促进剂。
参照图1，例示了各种检测策略，其中可使用引发催化酶(例如MNA酶)检测靶标分子，并且促进通过催化修饰并入BL中的底物来产生可检测信号。所述策略描绘了包含与BL分子杂交的DNA酶的各种分子复合物。本领域技术人员将了解一种或多种部件酶也可以按类似方式与BL分子杂交。策略(i)涉及DNA酶(Dz2)和BL分子的末端至末端杂交，借此各自的5’端和3’端被配对，如典型DNA双链体中存在的那样。策略(ii)涉及DNA酶(Dz2)和BL各自的相同末端的杂交，也就是说，每个分子的5’端配对，以及每个分子的3’端配对。然而，为维持以恰当极性杂交，每个分子必须在相反方向上缠绕，并且因此，接着在Dz2与BL之间形成‘准环’或环状结构。策略(iii)说明准环设计所特有的特征，所述特征在于较大环可用存在的一种以上DNA酶(例如DzA和DzB)构建，其中每一DNA酶可通过一种或多种BL(例如BLA和BLB)的单一MNA酶(Mz1)的裂解活性来释放。
在图1图i)中，DNA酶(Dz2；粗黑线)是与以底物序列(底物1；粗黑虚线)连接的BL分子(BL；以两条细黑线绘制)杂交。BL的3’端与Dz2的5’端杂交，并且反之亦然。第二底物(底物2；细黑虚线)可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz2裂解。最初，Dz2不能裂解这一底物，因为它与BL杂交。当MNA酶(Mz1；粗灰线)在靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配时，这导致底物1裂解以及随后Dz2自裂解的BL分子释放。Dz2接着能够结合和裂解底物2，此可导致荧光团和淬灭剂分离，从而产生可检测的荧光信号。
图1图ii)说明准环策略，其中在DNA酶(Dz2；粗黑线)与由底物序列(底物1a；粗黑虚线)连接的BL分子(BL；以两条细黑线绘制)之间，5’端和3’端杂交。当杂交在一起时，这些分子接着形成准环，从而防止Dz2结合和裂解它的底物(底物2；细黑虚线)。底物2可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记。当MNA酶(Mz1；粗灰线)在它的靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配时，这可导致底物1a裂解以及随后Dz2自裂解的BL释放，从而破坏准环状结构。Dz2接着能够结合和裂解底物2，此可导致荧光团和淬灭剂分离，并且产生可检测的荧光信号。
图1图iii)说明含有两种独立DNA酶的准环，这两种DNA酶受到两个BL分子的暂时抑制。两种DNA酶DzA(粗黑线)和DzB(粗黑虚线)与用底物1序列(底物1a和底物1b；以粗黑虚线绘制)连接的两个BL分子BLA和BLB(均以细黑线绘制)各自杂交。最初，DzA与DzB不能对应地裂解它们的底物，即底物A和底物B，均以细黑虚线绘制。底物A和底物B可用不同荧光团(白色空心圆圈表示底物A，而灰色实心圆圈表示底物B)以及用淬灭剂(以黑色实心圆圈绘制)标记。在MNA酶(Mz1；粗灰线)于它的靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配时，其中所述Mz1可裂解BLA和BLB分子内存在的底物1，BLA和/或BLB的裂解可分别导致它们与DzA和DzB分离，由此破坏准环状结构。因此，DzA与DzB都可对应地结合和裂解底物A和底物B，从而导致荧光团和淬灭剂分离，并且产生所得可检测的荧光信号。通过裂解底物A和底物B产生的荧光信号可相同或不同。
熟练人员将认识到可使用另一不同催化核酸酶(例如适配酶)替代图1(图(i)、(ii)和(iii))中描绘的MNA酶。
现参照图3图i)，如图1图i)中概述的示例性阻断的DNA酶策略被扩展成包括将Dz和BL连接在一起作为单一分子的发夹环序列。本领域技术人员将了解，部件酶也可以按相同方式与BL杂交。发夹状DNA酶(发夹状Dz2)包含DNA酶部分(以粗黑线显示)，它与由底物序列(底物1；以粗黑虚线绘制)连接的BL部分(以两条细黑线绘制)杂交。DNA酶序列和BL序列通过非互补环序列(也呈粗黑线)连接在一起以形成发夹结构，从而使Dz2不具活性。第二底物(底物2；以细黑虚线绘制)可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心黑圆圈)标记，并且被设计成一旦Dz2具有活性，即由Dz2裂解。最初，Dz2不能裂解这一底物，因为它与BL杂交。当MNA酶(Mz1；粗灰线)在它的靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配时，它可裂解底物1，从而导致随后Dz2自发夹分子释放。活性Dz2分子可接着结合和裂解底物2，此可导致荧光团和淬灭剂分离，从而产生可检测的荧光信号。熟练人员将认识到可使用另一不同催化核酸酶(例如适配酶)替代图3图(i)中描绘的MNA酶。
现参照图20，例示了各种检测策略，其中可使用多种引发催化酶(例如，如所说明的MNA酶或者适配酶)分别检测单一靶标分子或多个靶标分子，并且促进通过对并入BL中的多种底物中的一种进行催化修饰来产生可检测信号。图(i)描绘的策略涉及在BL的中间区域内包括多种独立的邻近底物序列，其中每个底物序列可由独立引发催化酶(例如MNA酶或适配酶)催化修饰。图(iii)描绘的策略涉及包括独立底物序列或其组分，其中每一底物可由独立引发催化酶(例如MNA酶或适配酶)催化修饰。
在图20图i)中，说明了含有三种独立且邻近的底物序列的准环。在DNA酶(Dz4；粗黑线)与由三种底物序列(底物1(细灰线)、底物2(细黑线)和底物3(细黑虚线))连接的BL分子(以两条细黑线绘制)之间，各自5’端和3’端杂交。两个分子接着均形成准环，从而防止Dz4结合和裂解它的底物(底物4；以粗黑线绘制)。底物4可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记。可存在MNA酶的部件酶组分，这些组分被设计用来裂解底物1(Mz1，粗灰线)、底物2(Mz2，细黑线)或底物3(Mz3，细黑虚线)。MNA酶在分别针对Mz1、Mz2和Mz3的靶标装配促进剂AF1(粗灰虚线)、AF2(细黑虚线)和AF3(细黑线)存在下装配。这可导致底物1由Mz1裂解，底物2由Mz2裂解和/或底物3由Mz3裂解，从而导致随后Dz4自裂解的BL释放，由此破坏准环状结构。Dz4接着能够结合和裂解底物4，此可导致荧光团和淬灭剂分离，并且产生可检测的荧光信号。
在图20图iii)中，DNA酶(Dz3；粗黑线)与由底物1和2的邻近序列连接的BL分子(以两条细黑线绘制)杂交，所述底物1和2共有共同序列，其中底物1(底物1；5’一半以细灰线绘制，3’一半以细灰虚线绘制并且还充当底物2的5’一半)和底物2的3’一半(以细黑线绘制)。核糖核苷酸接点(以细黑X绘制)在催化引发酶(例如MNA酶Mz1和Mz2)的底物(分别为底物1和底物2)内充当裂解位点，其中底物1的裂解位点位于底物2在BL内的裂解位点的5’端。BL与Dz3杂交，从而形成准环，由此防止Dz3裂解它的底物(底物3；粗黑线)。底物3可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记。可存在MNA酶的部件酶组分，这些组分被设计用来结合和裂解在底物1的5’一半与所述共有的共同序列(底物1的3’一半和底物2的5’一半)之间的核糖核苷酸接点(Mz1以粗灰线绘制，但结合共有的共同序列的部分除外，它以细灰虚线绘制)，或结合和裂解在所述共有的共同序列与底物2的3’一半之间的核糖核苷酸接点(Mz2，细黑线，但结合共有的共同序列的部分除外，它以细灰虚线绘制)。Mz1和Mz2分别在它们的靶标装配促进剂AF1(粗灰虚线)和AF2(细黑虚线)存在下装配。在任一核糖核苷酸接点处裂解都可导致Dz3自裂解的BL释放，从而破坏准环状结构。Dz3接着能够结合和裂解底物，此可导致荧光团和淬灭剂分离，并且产生可检测的荧光信号。
熟练人员将认识到可使用不同催化核酸酶(例如适配酶)替代图20图(i)或图(iii)中描绘的一种或多种MNA酶。
信号检测和放大：具有内部酶底物的BL
在一些实施方案中，可产生自催化级联，借此存在于BL分子内的底物序列可由被设计用来裂解与已由BL暂时失活的催化核酸相同的底物的催化核酸裂解。在其它实施方案中，可产生交叉催化级联，借此存在两种或更多种分子开关复合物，各自含有可潜在裂解相对分子开关的底物序列，并且反之亦然的催化核酸分子。在两个实施方案中，分子开关可由于受BL分子抑制而以非活性状态存在，直至由活性催化核酸进行裂解而引发级联。举例来说，添加装配促进剂(例如靶标核酸)可导致能够裂解一个或多个BL分子以引发级联反应的活性MNA酶的装配，其中BL含有用于引发MNA酶的底物序列。或者，配体(例如能够结合适配酶的适体部分的靶标配体)的存在可活化能够裂解一个或多个BL分子以引发级联反应的适配酶，其中BL可含有用于引发适配酶的底物序列。引发BL裂解事件可导致催化核酸分子的连续活化以及随后信号的放大。或者，配体(例如能够结合BL内存在的适体的靶标配体)的存在可结合适体，并且自催化核酸分子释放BL。这一分离可用作一种替代性方法引发级联反应，借此释放的催化核酸分子可接着裂解与第二催化核酸杂交的第二BL分子。
现参照图3图iii)和iv)，使用了如图3图i)中概述的示例性阻断的DNA酶策略来产生涉及DNA酶分子的连续释放和活化的级联，所述级联可用于放大信号。
在图3图iii)中，说明了示例性自催化级联策略，其中第一DNA酶(显示为粗黑线)与由底物序列(底物1；以粗黑虚线绘制)连接的BL分子(BL；以两条细黑线绘制)杂交。Dz1和BL是通过非互补环序列(也是粗黑线)连接在一起以形成发夹结构，从而致使Dz1不具活性(非活性Dz1)。在检测靶标分子时，引发MNA酶(Mz1；粗灰线)可在它的靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下形成，并且裂解底物1，从而导致随后Dz1自发夹分子释放。活性Dz1分子可接着结合和裂解另一非活性Dz1/BL发夹状分子上的底物1，此可产生BL裂解和Dz1活化事件的级联，所述级联可用于放大信号。或者，配体(例如能够结合适配酶的适体部分的靶标配体)的存在可活化能够裂解一个或多个BL分子以引发级联反应的适配酶，其中BL可含有可由引发适配酶与活性Dz1两者裂解的底物序列。或者，配体(例如能够结合BL内存在的适体的靶标配体)的存在可结合适体，并且自Dz1释放BL。这一分离可用作一种替代性方法引发级联反应，借此释放的Dz1可接着裂解另一复合物的BL内存在的底物1。
在图3图iv)中，说明了交叉催化级联策略，其中两种DNA酶，即非活性Dz1和非活性Dz2(分别是粗黑线和细灰线)均与各自由不同底物序列连接的不同BL分子(分别是BLB和BLA；各自以两条细黑线绘制)杂交。非活性Dz1是与BLB和底物2(细黑虚线)连接，并且非活性Dz2是与BLA和底物1(粗黑虚线)连接。两种DNA酶是通过非互补环序列(也是粗黑线)连接于它们的相应BL以形成发夹结构，从而致使DNA酶不具活性。如果活性MNA酶(Mz1；粗灰线)在它的靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下形成，那么MNA酶可裂解底物1，并且导致随后Dz2自发夹分子释放。现在，活性Dz2分子可接着结合和裂解底物2，从而导致释放和活化Dz1，此又可裂解BLA中的底物1，由此触发BL裂解以及Dz1和Dz2活化事件的级联，所述级联可用于放大信号。或者，配体(例如能够结合适配酶的适体部分的靶标配体)的存在可活化能够裂解BLA分子以引发级联反应的适配酶，其中BLA可含有可由引发适配酶与活性Dz1两者裂解的底物1序列。或者，配体(例如能够结合BL内存在的适体的靶标配体)的存在可结合适体，并且例如自Dz2释放BLA。这一分离可用作一种替代性方法引发级联反应，借此释放的Dz2可接着裂解BLB内存在的底物2，由此释放Dz1。
现参照图16，使用了如图1图ii)中概述的示例性DNA酶准环策略产生一种涉及连续释放和活化DNA酶分子的级联，所述级联可用于放大信号。显示两种交叉催化环，并且每个环的BL含有两种底物。第一底物可由MNA酶在靶标装配促进剂存在下裂解，并且另一底物可由相对环的DNA酶裂解。
在图16图i)中，说明了环A与环B之间的示例性交叉催化策略。存在于准环A和B中的第一底物序列(底物1；细灰线)是由MNA酶(Mz1；粗灰线)仅在靶标装配促进剂(AF1；粗虚灰线)存在下裂解。两种准环各自含有第二底物序列，即，能够分别由来自环B的Dz2(细黑虚线)和来自环A的Dz3(粗黑线)裂解的底物2(环A内的底物2a；细黑虚线)和底物3(环B内的底物3a；粗黑线)。两种DNA酶Dz3和Dz2在分别结合于BLA和BLB时是非活性的。由Mz1裂解环A或B上的底物1导致Dz2或Dz3的释放和随后再活化，并且触发两种环之间的BL裂解事件的指数级联，借此Dz2裂解环A中的底物2，而Dz3裂解环B中的底物3。也可包括其它底物序列作为报道底物，在这一说明中是底物3，所述底物用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记。或者或另外，可添加标记的底物2。裂解其它报道底物导致荧光团和淬灭剂的分离，随后产生可检测的荧光信号。或者，交叉催化级联可通过存在可活化能够裂解BLA和BLB内的底物1以引发级联反应的适配酶的配体(例如能够结合适配酶的适体部分的靶标配体)来引发。或者，配体(例如能够结合BL内存在的适体的靶标配体)的存在可结合适体，并且例如自Dz3释放BLA。这一分离可用作一种替代性方法引发级联反应，借此释放的Dz3可接着裂解BLB内存在的底物3，由此释放Dz2。
现参照图21，使用了如图1图ii)中概述的示例性DNA酶准环策略产生一种涉及连续释放和活化DNA酶分子的级联，所述级联可用于放大信号。
在图21图i)中，描绘了自催化级联，其中准环(环A)由DNA酶(Dz2；粗黑线)和由两种底物序列(底物1(细灰线)和底物2(底物2a；粗黑线))连接的BL(BLA；以两条细黑线绘制)组成。此外，底物2可以作为单独的独立分子(也以粗黑线绘制)提供，所述分子可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记。由于Dz2与BLA之间的杂交而发生的准环形成防止Dz2结合和裂解存在于BLA内或呈单独实体形式的底物2。当被设计用来裂解底物1的MNA酶(Mz1；粗灰线)在它的靶标装配促进剂AF1(粗灰虚线)存在下装配时，这可引起Mz1裂解底物1以及随后Dz2自裂解的BLA释放，从而破坏准环状结构。Dz2接着能够结合和裂解独立的底物2分子，此可导致荧光团和淬灭剂分离，并且产生可检测的荧光信号。Dz2也可结合和裂解BLA内存在的底物2，从而引起其它Dz2分子的释放，并且由此触发BL裂解事件的指数级联，导致信号放大。或者，配体(例如能够结合适配酶的适体部分的靶标配体)的存在可活化能够裂解BLA内的底物1以引发级联反应的适配酶，其中BLA可含有可由引发适配酶与活性Dz2两者裂解的底物序列。或者，配体(例如能够结合BL内存在的适体的靶标配体)的存在可结合适体，并且例如自Dz2释放BLA。这一分离可用作一种替代性方法引发级联反应，借此释放的Dz2可接着裂解其它BLA分子内存在的底物2，由此连续释放Dz2。
在图21图ii)和iii)中，描绘的准环(分别是环B和环C)不具有以自催化方式进行反馈的潜力。对于这两种准环，底物2不再存在于BL内。对于环B，BL(BLB)由底物1和底物3(粗黑虚线)组成。对于环C，BL(BLC)仅由底物1组成。
熟练人员将认识到，上述级联仅出于例示目的而利用DNA酶，并且其它催化核酸酶(例如核糖酶)或催化核酸酶组分(例如部件酶)也可并入BL的杂交可抑制催化活性的分子开关结构中/替代所述分子开关结构中的DNA酶。
靶标检测：释放寡核苷酸
BL寡核苷酸可以作为可与分子开关复合物中的互补第三寡核苷酸杂交的单独分子存在，或者可以作为分子开关的BL部分存在，其中所述BL部分可通过接头序列连接于第三互补寡核苷酸以形成发夹结构。
以这种方式，第一RL寡核苷酸可与分子开关的BL寡核苷酸杂交，并且引起第三互补寡核苷酸的置换。当与BL杂交时，第三互补寡核苷酸可为非活性的，但一旦自BL置换，这一第三寡核苷酸即能够用作催化核酸酶、引物、聚合酶模板、NRF或另一RL。在第三寡核苷酸包含催化核酸的实施方案中，BL不被设计用来与分子开关中的整个催化核酸序列杂交，以使RL将不含催化活性所需的整个序列，并且因此RL分子不能起到核酸酶自身的作用。在其它实施方案中，单一RL分子可起作用以自一种以上BL置换一种以上催化核酸，从而导致先前以非活性状态存在的多个催化核酸分子同时恢复催化活性。
RL可通过引发酶(例如MNA酶、DNA酶、核糖酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式来提供，借此引发酶的底物被修饰成仅当存在诱导引发酶的催化活性的靶标分子时产生RL。借助于非限制性实例来说，以靶标依赖性方式产生RL可如图4图i)中所说明来达成。这一机制可用于引发图4图ii)、iii)和iv)中，图6图i)、图7图i)和图8图i)中说明的下游反应。
特定地参照图4图i)中所述的实施方案，RL(粗黑虚线)可最初与BL(实黑线)杂交，从而使RL不具活性。RL可通过非互补发夹环(以实黑线绘制)连接于BL(‘发夹状RL’)，或保持单独实体形式(‘阻断的RL’)，分别显示在图的顶部左侧和底部左侧部分。BL部分可含有可由催化核酸酶裂解的底物序列底物1(细黑虚线)，所述催化核酸酶在此处显示为MNA酶(Mz1)，所述酶可在靶标装配促进剂(AF1)存在下装配，分别以实灰线和粗灰虚线绘制。由MNA酶裂解BL可导致产生活性RL(活性RL)。或者，配体(例如能够结合适配酶的适体部分的靶标配体)的存在可活化能够裂解BL内的底物1的适配酶，由此可活化RL。由于MNA酶或适配酶裂解底物1而不再与BL杂交的活性RL分子可提供一种引发图4图i)、ii)和iii)中说明的下游反应的机制。
图4图ii)至iv)中所述的实施方案描绘了与BL分子杂交的DNA酶，所述DNA酶接着通过RL与BL杂交而与BL分子分离。本领域技术人员将了解，部件酶也可以按相同方式与BL分子杂交并释放。
在图4图ii)中所述的实施方案中，DNA酶(Dz；粗黑线)是与BL分子(BL；细灰线)杂交以形成双链体。一小部分Dz序列不与BL杂交，并且在双链体的中心以环结构显示。底物序列(底物；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz裂解，然而，由于BL的初始结合，Dz不能裂解它的底物。当活性RL(粗黑虚线)存在时，它可结合BL，并且自BL分子置换Dz。RL不能用作催化分子，因为它在Dz与BL之间的不完全杂交区域中缺乏某一必需序列。RL和BL可接着形成惰性双链体，而Dz则能够结合和裂解底物，此导致荧光团和淬灭剂的分离以及可检测荧光信号的产生。
在图4图iii)中所示的实施方案中，存在发夹状DNA酶(发夹状Dz)，所述DNA酶在单一寡核苷酸中含有已由充当发夹环(粗黑线)的短非互补序列连接的DNA酶部分(粗黑线)和BL部分(粗灰线)。此外，一小部分Dz序列不与发夹的其余部分(BL序列)杂交，并且在双链体的中心以环结构显示。底物序列(底物；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz裂解，然而，因为Dz序列被约束在发夹结构内，所以最初，Dz不能裂解它的底物。当活性RL分子(RL；粗黑虚线)存在时，它可结合发夹Dz支点(含有BL序列的链)，并且可与发夹Dz分子的BL部分杂交。RL不能用作催化分子，因为它缺乏催化活性所必需的某一序列(它缺乏在Dz中存在，但由于发夹的Dz与BL区域之间的不完全杂交而在外部成环的那些碱基)。发夹的BL部分和RL可接着形成惰性双链体，此释放Dz部分。Dz部分接着能够结合和裂解底物，此导致荧光团和淬灭剂的分离以及可检测荧光信号的产生。
图4图iv)概述一种涉及连接两种发夹状DNA酶(如图4图iii)中所述)的示例性策略，这两种发夹状DNA酶称为发夹状Dz1，它由DNA酶部分和BLA部分(两者均以实灰线绘制)组成；和发夹状Dz2，它由DNA酶部分和BLB部分(两种均以实黑线绘制)组成，其中两个发夹分子各自被延伸成含有另外的茎序列，所述茎序列彼此互补，并且由此将它们连接在一起。最初，发夹状Dz1和发夹状Dz2不能裂解它们的相应底物，即底物1和底物2，均以细黑虚线绘制。底物1与底物2两者用不同荧光团(灰色实心圆圈表示底物1，而白色空心圆圈表示底物2)标记，并且两者也用淬灭剂(以黑色实心圆圈绘制)标记。当活性RL存在时，它可结合每一发夹状Dz(已由于互补茎区域而靠近在一起)的支点序列，并且同时打开两种发夹状Dz。因此，发夹状Dz分子的两种Dz部分均能够结合和裂解它们的相应底物，从而导致荧光团和淬灭剂的分离，由此产生两种不同荧光团各自的可检测荧光信号。
信号检测和放大：释放寡核苷酸
在检测靶标时由引发酶产生的RL可使BL自杂交的催化核酸酶解离(即，活化分子开关)，由此允许所述酶催化修饰报道底物，并且产生可检测信号。这样做时，RL与BL杂交，并且由此使其成为非活性的。
本文提供了利用RL的信号放大级联。一般来说，这些级联涉及使用能够使BL自RL解离，由此允许RL使与催化核酸酶杂交的更多BL解离的组分。以这种方式，由单一靶标检测事件产生的信号可通过连续多轮RL介导的BL/核酸酶复合物解离而放大许多倍。
在一些实施方案中，核酸外切酶(例如ExoIII)可用于信号放大，借此RL分子通过ExoIII的活性得以再循环，从而导致多个催化核酸分子的连续释放和随后活化。在这一情况下，RL介导的催化核酸分子活化之后是由ExoIII选择性降解分子开关中的BL。因此，RL分子保持完整，并且接着能够与另一BL杂交。接着重复活化循环，其中每次在所述过程期间释放新的催化核酸分子，从而导致信号放大。
图6提供了激发RL分子的再循环的信号检测和放大级联的一种示例性策略。图6图i)描绘了DNA酶(Dz；粗黑线)与BL分子(BL；细灰线)杂交的策略。每个分子的3’端自双链体突出至少4个核苷酸，致使Dz/BL双链体对ExoIII介导的降解具有抗性。底物序列(底物；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz裂解，然而，当与BL杂交时，Dz是非活性的，并且不能裂解它的底物。RL可通过引发酶(例如MNA酶、DNA酶、核糖酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式提供，借此引发酶的底物被修饰成仅当存在诱导引发酶的催化活性的靶标分子时产生RL。借助于非限制性实例来说，以靶标特异性方式产生RL可如图4图i)中所说明来达成。
当活性RL存在(RL；粗黑虚线)时，它可结合BL，并且自BL分子置换Dz(图6图i)。RL和BL可接着形成双链体，借此RL的3’端自双链体突出，但如所描绘的，BL的3’端现在是钝端(或者相对于RL的5’端是凹入的)。ExoIII(以灰色分段圆圈绘制)接着能够自BL分子的3’末端消化BL分子，而使RL分子完整。RL接着被再循环，并且能够重复所述过程。每个Dz一旦被置换，即接着能够结合它的底物(其中各自的3’端突出，从而使它们对ExoIII具有抗性)，并且可裂解底物，此导致荧光团和淬灭剂的分离以及可检测荧光信号的产生。因为这可发生多次，所以就存在通过环状级联反应产生的信号的放大。
在其它实施方案中，限制酶(例如切口酶)可用于信号放大，借此RL分子通过限制酶的活性得以再循环，从而导致DNA酶的连续释放和随后活化。在RL介导的自BL分子置换催化核酸分子期间，接着在RL与BL分子之间的双链体内产生新识别位点。限制酶接着能够识别这个位点，并且选择性裂解BL，而RL分子保持完整。对RL的裂解可通过产生切口限制酶的识别位点并且使用所述切口限制酶来避免，所述切口限制酶将仅裂解具有所述识别位点的BL链而不裂解RL链。或者，可使用能够裂解两条链的限制酶，在所述情况下，具有所述识别位点的RL链可包含硫代磷酸酯键联，从而防止RL链被限制酶裂解。BL的每个较短的‘切口’片段现在对RL不再具有与完整BL相同的亲和力，并且因此将不再与RL形成稳定双链体DNA结构。RL接着能够结合另一BL，并且重复所述循环，其中催化核酸每次在所述过程期间都被活化。
转向图7，图i)，描绘了DNA酶(Dz；粗黑线)与BL(BL；细灰线)杂交的示例性策略。BL含有某一其它序列，所述序列与DNA酶不互补，并且形成切口酶的双链识别序列的一条链(以细灰虚线绘制)，它在Dz/BL双链体外部成环。切口酶，例如Nt.BspQI(以黑色实心三角绘制)也是存在的，但不能裂解BL，因为它的完整双链识别序列不存在于Dz和BL双链体内。底物序列(底物；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz裂解，然而，由于与BL杂交，Dz不能裂解它的底物。RL可通过引发酶(例如MNA酶、DNA酶、核糖酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式提供，借此引发酶的底物被修饰成仅当存在诱导引发酶的催化活性的靶标分子时产生RL。借助于非限制性实例来说，以靶标特异性方式产生RL可如图4图i)中所说明来达成。当含有双链切口酶识别序列的另一条链(自身以灰虚线绘制在RL分子中间)的活性RL分子(RL；粗黑虚线)存在时，它结合BL，并且自BL分子置换Dz，如图7图i)中所描绘。RL和BL接着形成双链体，所述双链体现在含有完整切口酶识别序列。因此，切口酶现在可裂解BL，而使RL分子完整。RL接着被再循环，并且能够重复所述过程。每种Dz一旦被置换，即接着能够结合和裂解底物，此导致荧光团和淬灭剂的分离，并且产生可检测的荧光信号。因为这可发生多次，因此存在信号放大。熟练人员将认识到，尽管以上示例性策略使用了切口酶，但所述方法可被修改以适应使用能够裂解具有通过RL和BL杂交形成的识别位点的两条链的限制酶。在所述情况下，可通过修饰具有所述识别位点的RL链以并入硫代磷酸酯键联，由此防止RL链被限制酶裂解来避免对RL的裂解。
在其它实施方案中，链置换聚合酶可用于信号放大。当与适合引物寡核苷酸组合提供时，可使用能够通过延伸引物序列来合成新核酸链的链置换聚合酶达到置换核酸的下游链，由此使置换的链成为单链的目的。这可用作活化在双链时不具功能性，但在单链时重新获得功能性的分子的功能的一种机制。引物/聚合酶介导的链置换方法可用于促进先前在结合于BL分子时呈现非活性的催化核酸分子的活化。在一个实施方案中，在RL分子置换催化核酸之后，引物可与BL分子杂交，并且可在它的3’端由链置换聚合酶延伸。这导致自BL置换RL，并且接着在BL与延伸的引物之间形成无用复合物。RL接着被再循环，并且可起作用以自BL分子置换其它催化核酸，从而导致信号放大。
参照图8，图i)，描绘了DNA酶(Dz；粗黑线)与BL分子(BL；细灰线)杂交的示例性策略。BL在它的一个末端含有形成小发夹的某一其它序列，但DNA酶和BL是单独寡核苷酸。这个小发夹的茎含有引物结合区域，然而，引物(以具有尖端的短黑线绘制)不能结合这个区域，因为所述区域在发夹茎内被阻断。当使用如克林诺片段(3’-5’外切)等链置换聚合酶(以实心黑圆圈绘制)时，它最初也不能延伸引物，因为引物不能结合它的结合位点。在区域混合物中的所有寡核苷酸中，仅引物有可能由聚合酶延伸，因为其余寡核苷酸已被3’磷酸化来阻断它们由聚合酶延伸。底物序列(底物；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz裂解，然而，由于与BL杂交，Dz不能裂解它的底物。RL可通过引发酶(例如MNA酶、DNA酶、核糖酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式提供，借此引发酶的底物被修饰成仅当存在诱导引发酶的催化活性的靶标分子时产生RL。借助于非限制性实例来说，以靶标特异性方式产生RL可如图4图i)中所说明来达成。参照图8图i)，当活性单链RL分子(RL；粗黑虚线)存在时，它结合BL，并且自BL分子置换Dz，并且也有助于打开在BL末端的发夹，由此暴露引物结合位点。因此，引物在BL的末端结合，并且由链置换聚合酶延伸，从而在所述过程中置换RL。延伸的引物和BL接着形成惰性双链体，而RL接着被再循环，并且能够重复所述过程。每种Dz一旦被置换，即接着能够结合和裂解底物，此导致荧光团和淬灭剂的分离，并且可检测荧光信号将随之产生。因为这可发生多次，所以就存在信号放大。
信号检测和放大：阻断的RL
在一些实施方案中，RL分子自身可最初通过与另一BL分子杂交来失活。BL可以作为单独寡核苷酸存在，或可与RL存在于同一寡核苷酸内，其中它们可由能形成发夹结构的环的连接核酸或非核酸间隔子序列接合。BL与RL之间的杂交可导致RL的可逆失活，并且在这一状态下，在本文中称为“分子开关”。BL分子可含有催化核酸的底物序列。当RL与BL两者被连接在一起时，这可作为发夹环序列的一部分存在，或与发夹环序列同时存在。在所述实施方案中，裂解底物序列可自BL释放RL，此可导致RL“释放”其它寡核苷酸(例如通过链置换活性)的能力的恢复。在所述实施方案中，可产生反馈级联，借此一个或多个非活性RL分子与一个或多个非活性催化核酸分子共存，其中RL与催化核酸两者均已通过与它们的相应BL分子杂交来失活(图9，图iii)。添加活性催化核酸分子或用以使活性催化核酸分子完整的最终组分(如MNA酶的装配促进剂)可导致一个或多个BL分子的裂解，此导致RL功能性和/或催化核酸催化作用的活化。这可引发两种不同分子开关之间的BL裂解和RL介导的置换事件的级联，从而导致RL和催化核酸分子的连续活化以及随后的信号放大。
举例来说，图9图i)描绘的策略中释放剂(RL；粗黑虚线)与BL分子(BLA，以粗黑线绘制)预先杂交，并且两者是由形成发夹状结构的环的非互补序列连接在一起(完整复合物被称为发夹状RL)。BLA含有可由引发催化核酸酶以靶标依赖性方式裂解的底物序列，即底物1，以细黑虚线绘制。此外，发夹状DNA酶(发夹状Dz2，粗实黑线)存在，并且在单一寡核苷酸中含有已由充当发夹环的短非互补序列连接的DNA酶与相应BL序列(BLB)。如最初在图4图iii)中所述，一小部分Dz序列不与发夹的其余部分(BLB序列)杂交，并且在双链体的中心以环结构显示。参照图9图i)，底物序列(底物2；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由Dz2裂解，然而，当Dz2序列被约束在发夹结构内时，它最初不能裂解它的底物。当发夹状RL复合物的BLA部分由催化核酸(以Dz1(粗实灰线)说明，但也可使用不同催化核酸酶，如MNA酶或适配酶)裂解时，BLA自RL解离。RL接着具有活性，并且与发夹状Dz2的BLB部分自由杂交，其中它起作用以打开发夹Dz2分子。RL不能用作催化分子自身，因为它缺乏催化活性所必需的某一序列(它缺乏在Dz2中存在，但由于发夹的Dz2与BLB区域之间的不完全杂交而在外部成环的那些碱基)。发夹状Dz2复合物的BLB部分和RL接着形成惰性双链体，此释放Dz2部分。Dz2部分接着能够结合和裂解底物2，此导致荧光团和淬灭剂的分离以及可检测荧光信号的产生。
图9图iii)概述了示例性环状级联反应，所述反应可在发夹状RL的BLA区域内存在的底物序列被设计成由催化核酸裂解随后由RL活化时发生。发夹状RL包括RL部分(粗黑虚线)和BL部分(BLA，粗黑线)，并且这些部分可由形成发夹状结构的环的非互补序列(粗黑线)连接在一起。BLA部分含有底物序列(底物1；细黑虚线)，所述底物序列可由在靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配的MNA酶(以Mz1(粗实灰线)说明，但也可使用不同催化核酸酶，如适配酶或DNA酶)裂解。此外，由于在发夹结构(完整复合物被称为发夹状Dz1，以细灰线绘制)内与BL序列(BLB)杂交，DNA酶1(Dz1)也可以呈非活性状态存在。在不存在任何活性Mz1下，两种发夹状分子一起以非活性状态存在，并且不与彼此相互作用。然而，当活性Mz1存在时，这可导致发夹状RL的BLA部分的裂解以及随后分子的RL部分的活化。RL可接着起作用以与发夹状Dz1的BLB部分杂交，并且打开发夹结构以活化所述分子的Dz1部分。活性Dz1可接着起作用以裂解另一发夹状RL分子内的底物1，由此导致其它RL分子的活化。可接着产生环状级联，借此RL分子连续活化DNA酶，并且反之亦然，并且这一级联可用于放大信号。
靶标检测和信号放大：NRF
如上所指示，NRF是可提供由核酸酶识别的序列，由此允许引发核酸酶的活性的寡核苷酸。在一些实施方案中，NRF可与BL完全或部分杂交，由此产生例如核酸外切酶(如ExoIII)等核酸酶的底物，从而导致BL的选择性裂解或降解。当BL与如催化核酸等第三功能性分子杂交时，核酸酶裂解或消化BL可接着导致催化核酸的活化以及它的功能的恢复。NRF可接着再循环以与另一BL分子杂交，并且使所述过程得以重复。在其它优选实施方案中，NRF可与另一BL分子杂交，从而导致它的暂时失活，即丧失起作用以提供引发核酸酶活性所必需的序列模板的能力。BL可以作为单独寡核苷酸存在，或可与NRF存在于同一寡核苷酸内，其中它们可由形成发夹结构的环的连接核酸或非核酸间隔子序列接合。在一个实施方案中，BL也可含有充当催化核酸分子的底物的序列。当NRF与BL被连接在一起时，这可作为发夹环序列的一部分存在，或与发夹环序列同时存在。在所述实施方案中，裂解底物序列可自BL释放NRF，此可导致它用作NRF的能力的恢复。
在其它实施方案中，可产生级联，借此NRF与催化核酸两者均由于与它们的相应BL分子杂交而以非活性状态存在。NRF有可能与BL/催化核酸分子开关的相对BL杂交，并且引发核酸外切酶对它的消化。催化核酸也有可能裂解BL/NRF分子开关的相对BL内存在的底物，并且导致NRF的活化。添加活性催化核酸分子或用以使活性催化核酸分子完整的最终组分(如MNA酶的装配促进剂)可导致一个或多个BL分子的裂解，此导致NRF功能性和/或催化核酸催化作用的活化。这可引发两种不同分子开关之间的BL裂解和NRF介导的BL核酸酶消化事件的级联，从而导致NRF和催化核酸分子的连续活化。
转向图10，图i)图解描绘了发夹状DNA酶分子(发夹状Dz1)存在的策略，并且以绘制的细灰线指示DNA酶部分并以粗黑线指示其余BL、支点和发夹环部分。底物序列(底物1；以细黑虚线绘制)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由发夹状Dz1分子的Dz1部分裂解，然而，当与BL部分杂交时，Dz1将为非活性的，并且不能裂解它的底物。NRF可通过引发酶(例如MNA酶、DNA酶、核糖酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式提供，借此引发酶的底物可被修饰成仅当存在诱导引发酶的催化活性的靶标分子时产生NRF。借助于非限制性实例来说，以靶标特异性方式产生NRF可如图10图ii)中所说明来达成。参照图10图i)，活性NRF是以粗虚黑线绘制，与发夹状Dz1的BL部分的3’端杂交，所述BL部分最初具有的3’端自双链体突出至少4个核苷酸以致它对ExoIII降解具有抗性。然而，NRF与BL杂交将提供具有适于ExoIII(灰色分段圆圈)的钝端或3’凹入末端的双链底物。ExoIII可自BL分子的3’末端选择性消化BL分子，而使NRF分子完整，从而使发夹状Dz分子成为单链，由此降解BL部分而留下Dz1部分，所述Dz1部分现在将具有活性。NRF可接着再循环，并且能够重复所述过程。一旦具有活性，每种Dz1即可结合它的底物(其中各自的3’端突出，从而使它们对ExoIII具有抗性)，并且裂解底物，从而导致荧光团和淬灭剂的分离以及可检测荧光信号的产生。
图10图ii)中所示的实施方案描绘环状级联反应，所述反应可在发夹状NRF的BL区域内存在的底物序列被设计成由催化核酸裂解随后通过NRF引发的核酸酶活性活化时发生。发夹状NRF由NRF部分(以粗黑虚线绘制)和BL部分BLA(以粗黑线绘制)组成，并且所述部分可由形成发夹状结构的环的非互补序列(也是粗黑线)连接在一起。BLA部分可含有底物序列(底物1；细黑虚线)，所述底物序列可由在靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配的活性MNA酶(Mz1；粗灰线)裂解。此外，DNA酶可以呈非活性状态存在于发夹结构内(发夹状Dz1；细灰线指示DNA酶部分，而粗黑线指示发夹环和BLB部分)。在不存在任何活性MNA酶下，两种发夹分子可以一起呈非活性状态存在，并且不与彼此相互作用。然而，当活性MNA酶存在时，这可导致发夹状NRF的BLA部分内的底物1的裂解以及随后分子的NRF部分的活化。这个步骤提供了如图10图i)中所论述的通过引发酶(例如MNA酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式来提供NRF的方法的非限制性实例。参照图10图ii)，NRF可接着起作用以与发夹状Dz1的BLB部分杂交，并且打开发夹结构以活化分子的Dz1部分(如图i)中所概述)。除NRF的再循环之外，活性Dz1接着也可起作用以裂解另一发夹状NRF分子的底物，由此导致其它NRF分子的活化。可接着产生环状级联，借此NRF分子(所述分子被再循环)连续活化DNA酶，并且反之亦然，并且可用于放大信号。
在其它实施方案中，NRF可完全或部分包含靶标。特定地参照图27图i)，自催化准环级联(如图21图i)中的级联)是通过靶标序列(靶标1；粗灰虚线)与准环的BL内的底物(底物1；细灰线)杂交来引发。底物1和靶标1各自包含RE识别序列(粗黑虚线)的一条链，以使两者结合在一起形成完整识别位点。因此，靶标1充当NRF，因为它募集RE(实心黑三角)的活性以将BL选择性切口。BL分子在它的5’端和3’端由与DNA酶(Dz2；粗黑线)杂交，从而导致Dz2暂时失活的序列(细黑线)组成。BL还含有邻近于底物1的第二底物序列底物2(底物2a，粗黑线)，一旦Dz2已通过底物1切口而自BL释放，底物2即能够由Dz2裂解。此外，底物2也是以独立实体形式提供，它已用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心黑圆圈)修饰以监测DNA酶裂解反应。仅当靶标1与RE两者均存在时，底物1将被切口，从而导致引发自催化级联以及产生荧光信号。
靶标检测和信号放大：发夹状DNA酶
在另一策略中，限制酶(例如切口酶)可与链置换聚合酶一起包括在内，并且协力用于自互补BL模板连续合成和置换催化核酸分子。在所述实施方案中，由链置换聚合酶延伸引物导致形成RE的上游识别位点。RE的核酸内切酶活性可导致在催化核酸分子的上游产生切口(例如通过使用切口酶或在具有识别位点的一条链中并入硫代磷酸酯键联)，由此形成新引物，所述引物可由链置换聚合酶延伸以合成催化核酸分子的新拷贝，并且同时置换现存的催化核酸分子。两种蛋白质酶可接着继续协力起作用以连续合成和置换新的催化核酸分子，此可用于放大信号。
举例来说，图11，图i)描绘了具有这一性质的策略，借此存在发夹状DNA酶分子(发夹状Dz)，其中Dz部分以粗黑虚线绘制，并且BL部分和发夹环以粗黑线绘制。发夹环含有具有例如切口酶Nt.AlwI(实心黑三角)等RE的RE识别位点的一条链所需的一些而非全部碱基，并且因此，发夹状Dz中的RE识别位点是不完整的。底物序列(底物；细黑虚线)用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心圆圈)标记，并且被设计成由发夹状Dz分子的Dz部分裂解，然而，由于Dz与BL部分杂交，Dz是非活性的，并且不能裂解它的底物。引物可通过引发酶(例如MNA酶、DNA酶、核糖酶或适配酶)的催化活性以靶标依赖性方式提供，借此引发酶的底物被修饰成仅当存在诱导引发酶的催化活性的靶标分子时产生引物。借助于非限制性实例来说，可使用图12i)和ii)中说明的策略来提供引物。参照图11图i)，当引物(以粗灰线绘制)存在时，它可与发夹状Dz的单链环杂交，并且可由如克林诺片段(3’-5’外切)等链置换聚合酶(以实心黑圆圈绘制)延伸。聚合酶可使用发夹状Dz的BL部分作为模板，并且合成Dz的新拷贝，由此打开发夹，并且使现存Dz成为单链并具有活性。此外，引物延伸使Nt.AlwI识别位点完整，从而促进Nt.AlwI将在上游引物与下游Dz序列之间的新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物，所述引物可由克林诺酶延伸以合成新Dz拷贝，并且置换现存的Dz。两种酶可接着一起起作用以连续合成和置换Dz分子。每种Dz一旦被置换并具有活性，即接着能够结合底物，并且可裂解底物，此导致荧光团和淬灭剂的分离以及可检测荧光信号的产生。熟练人员将认识到，尽管以上示例性策略使用了切口酶，但所述方法可被修改以适应使用能够裂解具有识别位点的两条链的限制酶，所述识别位点是通过引物与将酶连接于BL的发夹环区段的杂交和/或延伸形成。在所述情况下，可通过修饰发夹环链以并入硫代磷酸酯键联，由此防止发夹环链被限制酶裂解来避免对具有识别位点的发夹环链的裂解。
在其它实施方案中，可产生级联，借此引物与催化核酸两者最初都由于与它们的相应BL分子杂交而以非活性状态存在。举例来说，引物可最初与BL分子杂交，从而导致它的暂时失活。BL可以作为与引物分开的寡核苷酸形式存在，或可与引物存在于同一寡核苷酸内，其中它们是由形成发夹结构的环的连接核酸或非核酸间隔子序列接合。结合于引物的BL也可含有充当催化核酸分子的底物的序列。当引物与BL被连接在一起时，这可作为发夹环序列的一部分存在，或与发夹环序列同时存在。裂解底物序列可自BL释放引物，此可导致它的引发活性的恢复。引物有可能与BL/催化核酸分子开关的相对BL的一部分(如发夹环序列)杂交，并且引发聚合酶对引物的延伸，此可导致催化核酸与BL分离，并且恢复它的催化活性。催化核酸也有可能裂解BL/引物分子开关的相对BL内存在的底物，并且导致引物的活化。然而，两种分子开关均是非活性的，直至添加活性催化核酸分子，或用以使活性催化核酸分子完整的最终组分(如MNA酶的装配促进剂)，此可导致一个或多个BL分子的裂解，由此导致引物功能性或催化核酸催化作用的活化。这可引发两种不同分子开关之间的BL裂解和引物延伸事件的级联，从而导致引物和催化核酸分子的连续活化以及随后的信号放大。
借助于非限制性实例来说，图11图iii)概述环状级联反应，所述反应可在发夹状引物的BL区域内存在的底物序列(底物1)被设计成由DNA酶裂解随后通过引物-聚合酶活性活化时发生。发夹状引物包括由形成发夹结构的环的非互补序列(粗黑线)连接在一起的引物部分(粗灰线)和BL部分(BLA，粗黑线)。BLA部分含有底物1序列(细黑虚线)，所述底物序列可由在靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配的活性MNA酶(Mz1；粗黑虚线)裂解。此外，Dz1可以呈非活性状态存在于发夹结构(发夹状Dz1)内，所述发夹结构的Dz1部分是以粗黑虚线绘制，并且BL部分(BLB)和发夹环是以粗黑线绘制。克林诺聚合酶(克林诺酶；实心黑圆圈)和例如Nt.AlwI切口酶(实心黑三角)等RE也可存在于反应中。在不存在任何活性Mz1下，两种发夹分子可以一起呈非活性状态存在，并且不与彼此相互作用。然而，当活性Mz1存在时，这可导致发夹状引物的BLA部分的底物1的裂解以及随后分子的引物部分的活化。活性引物可接着起作用以与发夹状Dz1的环杂交，并且打开发夹结构以活化分子的Dz1部分。此外，引物结合和/或延伸可使RE(例如Nt.AlwI)识别位点完整，从而促进RE对在上游引物与下游Dz序列之间的新合成的链选择性切口。因此，切口将产生新引物，所述引物可由克林诺酶延伸以合成新Dz拷贝，并且置换现存的Dz。两种酶可接着一起起作用以合成和置换Dz1分子(如图i)中所概述)，所述Dz1分子各自可起作用以裂解发夹状引物的BLA部分中存在的底物1，由此产生新活性引物。可接着产生环状级联，借此活性引物分子负责连续活化和合成活性Dz1分子，并且反之亦然，并且可用于放大信号。熟练人员将认识到，尽管以上示例性策略使用了切口酶，但所述方法可被修改以适应使用能够裂解具有识别位点的两条链的限制酶，所述识别位点是通过引物与发夹状Dz1的环的杂交和/或延伸形成的。在所述情况下，可通过修饰环链以并入硫代磷酸酯键联，由此防止环链被限制酶裂解来避免对具有识别位点的环链的裂解。
在其它实施方案中，形成用于连续合成催化核酸分子(例如DNA酶)的模板的发夹状结构可代之以包含仅由部分催化核酸序列组成的Dz区域。当发生此情形时，聚合酶与RE两者的活性是所述反应中存在任何活性催化核酸所必需的。使用所述模板可用于消除背景‘非引物依赖性’信号，由此产生更强特异性。
举例来说，图19图i)描绘了可形成用于连续合成DNA酶的模板的四种独特结构(结构A、B、C和D)。用于Dz合成的模板部分也是结构A的BL(以粗黑线描绘)，并且这与最初由于BL的杂交而呈非活性的DNA酶(Dz；粗虚线)杂交。结构B-D中用于合成新DNA酶的模板(Dz模板(ASDz)；反义DNA酶序列；粗黑线)包含功能性DNA酶的反义序列。结构B和C的BL部分是以粗黑虚线绘制。显示的活性引物(短粗灰线)结合结构A-C的引物结合区域(发夹环部分)和结构D的引物结合区域。结构A称为‘完整’发夹状Dz，其中分子的Dz部分包含完整催化Dz序列(最初描绘于图11图i)中)。参照图19图i)，结构B称为‘完全阻断的’发夹状Dz模板，并且包含含Dz部分的BL，所述Dz部分由完整Dz序列的除4个核苷酸之外的全部核苷酸组成，其中这些碱基是自催化核心区域移除。结构B的Dz模板(ASDz)含有DNA酶的完整互补序列(反义序列)，包括自BL的Dz部分移除的那些核苷酸在内。因此，这导致在Dz模板内形成有4个未配对核苷酸的突起。结构C称为‘部分’阻断的发夹状Dz模板’，并且可含有与BL的Dz核心部分的突变错配的碱基配对，以BL内的小突起显示。在聚合酶(实心黑圆圈)存在下，部分阻断的发夹状Dz模板的3’端可使用ASDz模板作为复制模板进行延伸，但由于BL的核心区域内的突变碱基对，使得当Dz模板通过稍后的引物延伸而打开时，不暴露功能性Dz。结构D称为‘Dz-模板’(ASDz)，并且仅包含与Dz互补的具有邻近引物结合位点的序列。Dz-模板分子不结合于BL。
在其它实施方案中，发夹状引物(图12图i)中概述)与发夹状DNA酶分子(图11图iii)中概述)两者可分别代之以部分发夹状引物和部分发夹状DNA酶分子。部分发夹状引物最初可仅包含一部分引物区域，并且因此，可与部分发夹状Dz模板(最初描述于图19图i)中)具有降低的互补性，从而在以靶标依赖性方式引发反应之前，使两种分子之间的任何非所要的结合最少。在聚合酶存在下，部分引物区域是使用BL区域作为模板来延伸，由此使发夹状引物的序列完整。使用如图23中所说明的两种部分分子(部分发夹状引物和部分阻断的发夹Dz模板)可用于消除背景‘非靶标依赖性’信号，由此产生更强特异性。
在图23图i)中，存在部分发夹状引物，其中部分引物区域以细灰线显示，由底物1(以细黑虚线绘制)连接的BL区域(BLA)以两条细黑线显示。在聚合酶(实心大黑圆圈)存在下，部分发夹状引物的3’端可使用BLA区域作为模板进行延伸，由此使引物区域完整，并且导致形成完整发夹状引物。此外，部分阻断的发夹状Dz2模板也存在，其中BL区域(BLB)以粗黑虚线绘制，并且Dz2模板(ASDz)区域以粗黑虚线绘制。BLB包含DNA酶的在BLB的Dz核心内含有突变碱基的部分序列，所述突变碱基构成关于完整DNA酶的催化失活性突变。BLB中的突变核心碱基以小突起显示。在聚合酶存在下，部分发夹状Dz模板链的3’端可使用Dz2模板部分作为复制模板进行延伸，但由于BLB内的错误突变的碱基，当部分发夹状Dz模板结构通过由引物延伸而打开时，不暴露功能性Dz。可存在被设计用来裂解底物1的MNA酶(Mz1；粗黑虚线)，所述酶在它的靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配。这可导致底物1被Mz1裂解以及随后引物区域自部分发夹状引物释放，从而导致它的引发能力的恢复。活性引物可接着与部分阻断的发夹状Dz2模板结构的环杂交，并且引发图11中概述的通过聚合酶延伸和RE切口活性(RE以实心黑三角绘制)合成活性Dz2分子(粗黑虚线)。参照图23图i)，活性Dz2分子可接着裂解用荧光团(灰色星形)和淬灭剂(实心小黑圆圈)标记的底物2(细灰虚线)，从而产生可检测的荧光信号。
图12提供依赖于催化核酸酶的靶标依赖性活性来产生引物寡核苷酸的示例性策略。在图i)中，引物(粗灰线)最初可与BL分子(BLA，粗黑线)杂交，并且两者可由形成发夹状分子的环的非互补序列(也是粗黑线)连接。BLA可含有底物序列(细黑虚线)，所述底物序列可由MNA酶(Mz1)(粗黑虚线)在它的靶标(AF1：粗灰虚线)存在下裂解。裂解底物可自BLA释放引物，并且使引物具有活性。活性引物可接着与完整发夹状DNA酶结构(发夹状Dz2；Dz2以粗黑虚线绘制，BLB以粗黑实线绘制)的环杂交，并且继续活化和/或合成新DNA酶(例如，如图11中所概述)。在图ii)中，引物(粗灰线)最初可与单独BL分子(BLA，粗黑线)杂交，然而，两者不能如图i)中那样连接在一起，而是以两种独立寡核苷酸存在。引物可接着以与图i)中概述的方式相同的方式进行活化。在图iii)中，引物可以作为MNA酶的底物的组分存在(引物以粗灰线描绘在底物分子的左侧部分，其中其余底物在右侧以细黑虚线显示)。MNA酶(Mz1；粗黑虚线)在它的靶标(AF1；粗灰虚线)存在下可裂解底物，从而导致引物与另一裂解的片段分离。在裂解之后，由于在3’末端存在作为MNA酶裂解反应的产物的2’3’环磷酸(实心黑五边形)，引物仍然是呈非活性的。可使用T4多核苷酸激酶(T4PNK，以实心灰星形显示)或另一适当酶催化移除2’3’环磷酸，从而导致引物的活化。活性引物可接着与完整发夹状DNA酶(发夹状Dz2；Dz2以粗黑虚线绘制，BL以粗黑实线绘制)的环杂交，并且继续活化和/或合成新DNA酶，如例如图11中所概述。
在其它实施方案中，可通过MNA酶裂解底物以及随后使裂解的底物片段脱磷酸化以活化引物来触发线性级联(例如，如图12图iii)以及图17图i)和ii)中所概述)。在这些线性级联中，由初始MNA酶裂解的包含引物的底物不同于最终由发夹Dz/BL复合物所释放或通过复制部分发夹状Dz模板/BL复合物中的Dz模板所合成的Dz裂解的底物。
图17描绘两种利用引物活化策略达成引发的示例性线性级联。所述级联是基于使用活性引物来与完整发夹状(图i))或部分发夹状Dz模板结构的环杂交以活化和/或合成新DNA酶，如图11中所概述。在图17图i)中，MNA酶(Mz1；粗黑虚线)可在它的靶标(AF1；粗灰虚线)存在下装配，并且可裂解它的底物(底物1，以含有左侧部分和右侧部分的线绘制；左侧含有表示非活性引物的粗灰线，而右侧显示为细黑虚线)。底物1可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心小黑圆圈)标记。由MNA酶裂解底物1可导致引物与另一裂解的片段分离，并且如此可产生可检测信号。在裂解之后，由于在3’末端存在可作为MNA酶裂解反应的产物的2’3’环磷酸(实心黑五边形)，引物可仍然是呈非活性的。可使用T4多核苷酸激酶(T4PNK；实心灰星形)或类似的适当酶催化移除2’3’环磷酸，从而导致引物的活化(即，在它能够与互补核酸杂交，并且用于引发由适合聚合酶合成新核酸链的意义上看)。因此，活性引物可与完整发夹状DNA酶(发夹状Dz2；Dz2部分以粗黑虚线绘制，BL部分和发夹环以粗黑线绘制)的环杂交，并且可由链置换聚合酶(Pol；大实心黑圆圈)延伸。聚合酶可使用BL部分作为模板，并且合成Dz2的新拷贝，由此打开发夹，并且使现存的Dz2变为单链并具有活性。每种Dz2一旦被置换并具有活性，即可接着结合和裂解它的底物(底物2；细灰虚线)。底物2可用与底物1相同或不同的荧光团(以实心灰星形显示)和淬灭剂(实心黑圆圈)标记。由Mz1裂解底物1以及由活性Dz2裂解底物2可导致荧光团和淬灭剂的分离以及取决于使用一种还是两种荧光团标记底物1和2而产生一种或两种可检测的荧光信号。
另一线性级联可被扩展以并入RE，从而导致连续合成新DNA酶分子(如图11中所概述)。在图17图ii)中，可使用‘部分阻断的’发夹状Dz模板(最初概述于图19图i)C中)(部分阻断的发夹状Dz2模板(ASDz)；粗黑线)。部分Dz部分(以粗黑虚线绘制)存在于BL部分中，并且发夹环是以粗黑线绘制。Dz2模板(ASDz)部分是功能性DNA酶Dz2的反义序列。BLB包含DNA酶的含有在BL的Dz核心内的突变碱基(以小突起显示)的部分序列，所述突变碱基构成关于完整DNA酶的催化失活性突变。在聚合酶存在下，BL链可被延伸，但由于突变，当它被引物打开时，不能合成功能性Dz。在图ii)中所示的实施方案中，Dz模板链也含有具有RE的识别位点的一条链，以使引物沿环和Dz模板部分的延伸可导致形成完整RE识别位点。因此，RE(以实心黑三角形显示)可对在上游引物与下游Dz2序列之间的新合成的链选择性切口。切口可产生新引物，所述引物可由链置换聚合酶延伸以合成新Dz2拷贝，并且置换现存的Dz2。两种酶可接着一起起作用以合成和置换Dz2分子，所述Dz2分子各自可起作用以裂解底物2，从而使荧光团与淬灭剂分离，提供可检测的荧光信号。
在又其它实施方案中，图17图i)和ii)中概述的线性级联可被修改以产生环状反馈级联，并且由此导致在MNA酶靶标识别事件之后放大信号。图18图i)和ii)分别描绘了图17图i)和iii)中概述的线性级联的闭合反馈环路。在每一情况下，产生的活性Dz可被设计成与MNA酶识别和裂解相同底物(底物1)，由此导致产生新活性引物分子。
在其它示例性实施方案中，其它分子可存在于反应内，这些分子可充当用于合成和扩增引物的模板。参照图13中所示的示例性策略，模板含有与引物互补并且由具有RE的识别位点的一条链分隔的两个区域。参照图13图i)，引物(称为‘引物1’)与引物模板的第一互补区域杂交最初是有利的，因为它被设计成使得存在较大数目的可被杂交的核苷酸。所述引物可接着由聚合酶延伸，并且这可导致合成完整双链RE识别位点，随后是另一引物1序列。RE活性可接着允许通过RE裂解以及接着由链置换聚合酶延伸的循环来连续合成引物1。另一产生引物的模板分子可以呈如图13图i)中描绘的线性单链模板形式，或呈如图13图ii)中描绘的发夹状DNA分子形式存在，借此一条链含有用于引物合成的模板，而另一链与引物模板部分互补，并且有助于防止初始引物与第二互补区域杂交，因为这一事件不会导致另一引物1合成。所述另一产生引物的模板分子也可通过不同引物的延伸来引发，例如其中引物2产生引物1，如图13图iii)中所描绘。
参照图13中更详细显示的示例性实施方案，图i)显示初始引物(引物1；实灰线)可如何与引物模板(引物模板；实黑线)杂交，其中引物1可接着由链置换聚合酶(例如克林诺酶；实心黑圆圈)延伸以合成完整RE识别位点(实黑线)，随后合成新引物1(实灰线)。RE(实心黑三角)可接着裂解RE位点与新引物1之间的新合成的链以产生切口，由此可接着由聚合酶延伸以合成另一新引物1，同时置换先前结合的引物1。这可产生RE裂解和聚合以及链置换的连续循环以连续合成新引物。
在图13的图ii)中，类似于图i)中概述的流程，可使用初始引物1引发连续合成更多新引物1，然而，图ii)说明了可使用发夹状引物模板(实黑线)的策略。发夹分子的底部链可含有引物模板，而顶部链可含有与引物模板部分互补的序列，其中两者是由形成发夹的环的非互补序列连接。初始引物1可与环杂交，并且接着可由聚合酶使用引物模板(发夹的底部链)作为复制模板加以延伸。
在图13图iii)中，可使用不同引物(引物2；黑虚线)引发通过与图i)中概述相同的过程进行的新引物1的连续合成。
在图25图i)中，图13图iii)中描绘的策略被扩展以说明使用引物模板分子促进利用最初在图11图i)中概述的方法引发DNA酶合成。此处，引物模板(发夹状引物模板)主要由发夹状结构组成，借此一条链含有邻近于具有RE识别位点的一条链的用于合成引物1的模板(都由细黑线表示)，而引物发夹的另一链(细黑虚线)与模板部分互补。部分互补链含有在它与模板链之间的错配碱基配对(以小突起绘制)以及在3’末端的另一碱基(小黑圆圈)，其中后者不是引物序列的一部分。内部的错配碱基对使发夹状引物模板的部分互补链与部分发夹状Dz1模板分子的引物1结合位点之间的亲和力降低。在3’末端的另一碱基防止部分互补链充当引物，因为这个碱基不与引物1结合位点共有互补性。因此，部分互补链的目的在于使引物模板链在不存在引物2的延伸下呈双链构造，以防止它螯合新合成的引物1分子。
发夹状引物模板结构的环链(粗黑线)与引物2(粗灰虚线)互补，以使当引物2结合这个环时，引物2可由链置换聚合酶延伸，从而导致打开发夹状引物模板以及合成完整RE识别位点与邻近引物1(粗灰线)的同时进行。当切口限制酶(实心黑三角)存在时，它可识别完整RE识别位点，并且在上游引物2与下游引物1序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物，所述引物由链置换聚合酶(实心黑圆圈)延伸以合成另一引物1拷贝，并且自模板链置换预先存在的拷贝。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生多个活性引物1分子。每一引物1可接着引发使用部分阻断的发夹状Dz模板方法合成活性DNA酶分子，所述方法先前已概述于图17图ii)和图23图i)中。在其它示例性实施方案中，BL分子还可含有另一引物的互补序列，以使延伸BL模板上的原始引物可合成连接于另一引物的完整DNA酶的新拷贝(图14图i))。如图14图i)中所说明，初始活性引物(粗灰线)与发夹状DNA酶(发夹状Dz)/BL复合物的环杂交。发夹状Dz/BL复合物的顶部链是DNA酶(粗黑虚线)，并且显示为与含有BL(粗黑线)的底部链杂交，其中两者是通过非互补环(也是粗黑线)连接在一起。由链置换聚合酶(克林诺酶；实心黑圆圈)延伸活性引物将打开发夹状DNA酶/BL复合物，并且使用BL作为模板合成新链。新合成的链含有DNA酶的另一拷贝和新引物。在新DNA酶拷贝之前是限制酶的完整识别位点，以使由RE(实心黑三角)裂解会产生切口寡核苷酸，它可由克林诺酶延伸以产生DNA酶的新拷贝和新引物，同时置换现存拷贝。切口可通过产生切口酶的识别位点并且使用所述切口酶来产生，所述切口酶仅能够在通过引物杂交和/或延伸形成的识别位点中裂解链。或者，可通过产生能够裂解两条链的限制酶的识别位点，并且修饰环链以并入硫代磷酸酯键联，由此防止环链被限制酶裂解来产生切口。切口和延伸的这一循环起作用以连续合成在一端含有引物的新DNA酶。每条DNA酶/引物链的新引物部分可接着与新发夹状DNA酶环杂交以再引发循环。
在新合成的引物之前也可以是另一RE识别位点，以使RE活性允许连续合成其它引物(图14ii))。如图14图ii)中所说明，概述了与图i)相同的其它DNA酶和引物合成的过程，然而，在所述其它引物自身之前是RE的完整识别序列。因此，除切口和延伸以产生新DNA酶拷贝的循环之外，这也可发生以产生新引物，所述新引物是与新DNA酶分离的寡核苷酸，其中两个循环同时发生。通过使用切口酶或并入硫代磷酸酯键联来防止环链被非切口限制酶裂解，可促进切口。
检测离子化合物
在另一策略中，提供了用于确定样本(例如环境样本或生物样本)中离子化合物的不存在性，检测样本中离子化合物的存在性，和/或定量样本中的离子化合物的方法。离子化合物可为单价或二价离子。离子化合物可为催化核酸酶的活性所需的金属离子辅因子。
所述方法包括提供如本文所述的分子复合物(分子开关)和至少一种能够活化所述开关以由此提供可检测信号的其它组分。所述其它组分的功能活性可依赖于待测试的样本中离子化合物的存在。举例来说，所述方法可包括使怀疑含有离子化合物的样本与分子开关和引发催化核酸酶(例如DNA酶、核糖酶、装配的MNA酶或能够装配成MNA酶的组分)接触，所述分子开关包含与阻断寡核苷酸杂交并且由阻断寡核苷酸功能性失活的第一催化核酸酶。
在离子化合物存在下，引发催化核酸酶能够直接使复合物中的BL和第一催化核酸酶解离，由此使第一催化核酸酶具有功能活性，并且能够(直接或间接)提供可检测信号(例如，如图1、3、4、6、7、8、9、10、11、13、14、16、17或18中的任一个中所说明)。
或者，在离子化合物存在下，引发催化核酸酶能够催化修饰与样本接触的另一其它组分，由此提供能够与分子复合物相互作用，并且(直接或间接)使第一催化核酸酶和BL解离的组分(例如RL、NRF、引物、聚合酶模板)。解离可使第一催化核酸酶具有功能活性，并且能够(直接或间接)提供可检测信号(例如，如图1、3、4、6、7、8、9、10、11、13、14、16、17或18中的任一个中所说明)。
在任一情况下，引发催化核酸的催化功能取决于引发酶的催化功能所需的作为辅因子的离子化合物的存在。在不存在离子化合物下，引发催化核酸酶不能起作用，并且因此不能影响第一催化核酸酶或RL或NRF自BL的解离。
离子化合物可另外作为复合物的第一催化核酸酶的催化活性所需的辅因子。
因此，所述方法可利用需要特定金属离子辅因子来达成催化活性的催化核酸(例如DNA酶、核糖酶、适配酶和/或MNA酶)以检测样本(例如环境样本或生物样本)中金属离子的存在性或确定所述金属离子的不存在。举例来说，所述方法可有助于DNA酶介导的对环境样本(如水)中Pb2+的检测。
使用多种酶来分析多种靶标的方法
熟练人员将认识到，本文提供的方法可用于检测每一反应的单一靶标，或检测单一反应中的多种靶标。当检测多种靶标时，取决于测定和待检测物，可使用一种或多种MNA酶。举例来说，当检测多种相关结构，像例如一组共有关键序列(由MNA酶所识别)并且仅例如在长度方面或在所述关键序列外部的序列方面不同的序列时，单一MNA酶就足够。可检测具有关键序列的任何序列。当检测相差少至单一核苷酸的相关序列时，或甚至当打算检测差别极大的靶标并且需要了解各自的存在或不存在时，预期多种MNA酶是有用的。类似地，在一些实施方案中，单一MNA酶底物将足够，而在其它实施方案中，独特BL需要独特MNA酶底物来允许检测若干靶标中的每一个。在一些实施方案中，所述方法可允许检测一个反应中的多种不同类型的靶标(例如核酸靶标和蛋白质)。
特定地参照图26，说明了多种靶标的检测流程，其中两种独立的自催化准环(图21图i))被一起放置在同一反应室中。两种准环(环A和环B)可独立地起作用，并且用于在检测两种独立靶标序列之后放大信号。环A包含DNA酶(Dz2，粗黑线)和BLA，所述BLA在它的5’端和3’端由与Dz2杂交，从而导致Dz2暂时失活的序列(细黑线)组成。BLA还含有由底物1(粗灰线)和底物2(底物2a；粗黑线)的邻近序列组成的中间区域。底物1可由Mz1(粗灰线)在它的靶标装配促进剂(AF1，粗灰虚线)存在下裂解。一旦Dz2已通过Mz1裂解底物1而自BLA释放，底物2即能够由Dz2裂解。
环B包含DNA酶(Dz4，粗黑虚线)和BLB，所述BLB在它的5’端和3’端由与Dz4杂交，从而导致Dz4暂时失活的序列(细黑线)组成。BLB还含有由底物3(细灰线)和底物4(底物4a；粗黑虚线)的邻近序列组成的中间区域。底物3可由Mz3(细灰线)在它的靶标装配促进剂(AF3，细灰虚线)存在下裂解。一旦Dz4已通过Mz3裂解底物3而自BLB释放，底物4即能够由Dz4裂解。为独立监测每一级联反应，底物2和底物4也是以用不同荧光团(空心圆圈表示底物2，而实心灰圆圈表示底物4)和淬灭剂(实心黑圆圈)修饰的线性序列形式提供以独立地监测分别由Dz2和Dz4达成的裂解。
使用不溶性载体以及固体载体的方法
也应了解，通常，无论是否为多路的，所述方法都适用于溶液中，或在与上面可结合、连接或栓系下组中的一种或多种的不溶性载体或固体载体组合时适用，所述组包括BL分子、RL分子、引物、NRF、DNA酶、MNA酶组分(底物、部件酶或装配促进剂/靶标)、RE、聚合酶模板、核酸外切酶和/或链置换聚合酶。熟练人员在知晓本文论述的方法和变化形式的情况下通常将了解所述系统的特征。因此，本发明不应被视为限于本文的文字教义，而是能够按照本文提供的教义的原则和范围以及本领域中的知识加以修改和变化。
举例来说，本文涵盖使用MNA酶检测靶标的方法，其中含有MNA酶底物的BL、DNA酶或BL被设计用来与之杂交的任何其它催化核酸可被锚定于载体。在一些实施方案中，BL被连接于载体。载体可为保留底物并且不允许它在反应混合物的主体中自由移动的不溶性物质或基质。所述载体在本领域中已知用于固定或定位底物，包括核酸靶标。熟练人员将了解载体可选自呈多种形式(包括便于在微阵列中使用的珠粒)的广泛多种基质、聚合物等，以及可与反应条件相容的其它材料。在某些实施方案中，载体可为塑料材料，如塑料珠粒或晶片，或具有在其中进行特定测定的孔或管的材料。在某些实施方案中，载体可为微米载体或纳米载体。在某些实施方案中，载体可被编码。
可设计BL连接于载体，以使BL与DNA酶或其它催化核酸杂交以形成分子开关复合物后，过量的DNA酶或其它催化核酸可自固体载体洗除，从而留下例如1:1比率的构成分子开关的两种分子。由第二DNA酶或MNA酶裂解用荧光团(F)和淬灭剂(Q)标记的BL可导致荧光团释放至反应混合物的主体中，从而留下淬灭剂连接于载体。因此，当淬灭剂部分和可检测部分在裂解后分离时，可检测信号可极大增加。在一个替代性实施方案中，在裂解之后，含有荧光团的可检测部分可保持连接。这可允许定位载体上的信号。在某些情况下，设想荧光团可游离于溶液中。此外，DNA酶或其它催化核酸也可释放至溶液中，远离保持连接于固体载体的BL，从而防止在BL裂解之后的任何非所要的再杂交。
图24图i)概述了固体载体策略的一个实例，其中自催化DNA酶准环(概述于图21中)的BL被栓系于二氧化硅微球体。此处，准环的BL包含由底物1(细灰线)和底物2(底物2a；粗黑线)的邻近序列连接的两个DNA酶结合区域(细黑线)。另一间隔子区域存在于DNA酶结合区域的3’端，并且在它的极靠近3’末端处被生物素部分(实心黑六角形)修饰。BL可与DNA酶(Dz2；粗黑线)杂交，并且两者均与已涂布抗生蛋白链菌素(streptavidin)的二氧化硅微球体(珠粒)(以大灰圆圈绘制)一起孵育。因此，BL和微球体通过生物素-抗生蛋白链菌素键彼此连接，并且Dz2与BL通过沃森-克里克碱基配对杂交。当使含有栓系的准环的微球体与在靶标装配促进剂(AF1；粗灰虚线)存在下装配的MNA酶(Mz1；粗灰实线)接触时，Mz1可裂解BL中的底物1，由此引发自催化级联，借此Dz2自BL释放，并且可裂解其它连接的BL分子内的底物2。Dz2也可裂解单独的独立底物2(粗黑线)，所述底物在这一实例中未连接于微球体，但可用荧光团(空心圆圈)和淬灭剂(实心黑圆圈)标记，以使裂解底物2产生可检测的荧光信号。
或者，可对连接于珠粒的BL直接标记，以使由MNA酶裂解底物1和/或由Dz2裂解底物2可产生游离于溶液中的信号(如果淬灭剂比荧光团更靠近连接位点)；或这可产生与珠粒相伴的信号(如果荧光团比淬灭剂更靠近连接位点)。
方法的优化
熟练人员将易于了解，本文所述的方法可使用多种实验参数来优化以增进对靶标的检测、鉴定和/或定量。优化的特定实验参数和所述优化的程度将取决于所采用的特定方法以及设法检测、鉴定和/或定量的特定靶标。所述参数包括但不限于时间、温度、pH、盐和缓冲剂的浓度和身份、寡核苷酸的浓度、蛋白质酶(RE、核酸外切酶、链置换聚合酶)的浓度、辅因子、清洁剂、阳离子和其它试剂(包括但不限于，二甲亚砜(DMSO)、EDTA、ATP、甘油)、互补序列的长度、MNA酶的核酸组分的GC含量和熔点(Tm)、分子开关复合物、BL/RL复合物、BL/NRF复合物、Dz模板/BL复合物以及BL/引物复合物。
在一些实施方案中，例如对于涉及检测特定核酸序列的那些方法，可对包括执行方法的温度在内的实验参数进行优化以区分MNA酶组分与包含或不包含序列变化的靶标核酸的结合。可执行所述方法的温度可在约20℃至约96℃、约20℃至约75℃、20℃至约60℃、或约20至约55℃的范围内。
在某些实施方案中，提供了用于实施本文所述的方法的优化反应。在所述优化反应中，检测的信号增加超过未优化反应多达10％、20％或30％。更优选反应条件可使检测的信号改进至少35％或40％，并且优选多达50％或50％以上。在其它实施方案中，优化反应可使催化活性增加超过50％，并且多达66％、75％或甚至100％。在又其它实施方案中，完全优化的反应方法可使信号检测增加100％、200％或甚至300％或300％以上。其它优选的反应条件可使催化活性相较于用未优化的反应条件实施的方法改进多达1000％或1000％以上。用于优化本文提供的方法的高度优选的反应条件是包括某些二价阳离子。大多数核酸酶和蛋白质核酸修饰酶的催化活性可以按浓度依赖性方式受二价阳离子的浓度影响。优选的优化反应是针对Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+以及Pb2+中的一种或多种加以优化。
适体
本领域技术人员将易于了解本文所述的方法可用适体来执行，其中所述适体可有助于检测、鉴定和/或定量靶标，包括除核酸以外的靶标。
涵盖使用MNA酶检测靶标，包括非核酸实体的方法。所述方法可使用能够识别一种或多种配体的适体，所述适体可包括核酸或蛋白质、多肽或肽，或其组合。适体可结合靶标配体，例如蛋白质、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、整个生物体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合，或任何其它实体。
本文的优选适体可包括可通过吸附、回收和再扩增的迭代过程自合成核酸或肽的复杂文库分离的短单链DNA或RNA寡聚物或肽。因此，可产生针对范围从小分子(如氨基酸或抗生素)至蛋白质和核酸结构内的几乎任何靶标/配体的适体。在一些实施方案中，适体包括例如优选通过进化和选择技术产生的核酸结合分子。适体可包含DNA或RNA分子，或两者的组合，包括但不限于根据例如上表1的核苷酸类似物。
本领域技术人员将了解，适体可并入DNA酶、核糖酶或任何MNA酶组分中。偶联于适体的DNA酶和核糖酶在本领域中称为适配酶。所述适配酶可因存在与它们的适体组分具有亲和力的配体而使它们的催化活性开启或关闭。此外，应了解多种适体可并入一种或多种部件酶寡核苷酸组分中。特定地参照图28图i)，描绘了一种包含DNA酶结构域(Dz1结构域，粗灰虚线)和适体结构域(粗黑虚线)的适配酶。在这一实例中，适体结构域的存在导致适配酶的DNA酶结构域的暂时失活。在分析物(配体，大灰圆圈)存在下，适体结构域结合配体，从而导致适配酶结构的构象变化，此又允许DNA酶结构域采用活性构象，由此活化DNA酶结构域的催化活性。活性适配酶可接着起作用以裂解第二分子开关的BL(细黑线)内存在的底物(底物1，细灰虚线)，所述分子开关例如由准环状结构组成，其中BL与第二DNA酶(Dz2，粗黑线)杂交。由适配酶裂解底物1导致Dz2与BL分离，从而恢复Dz2的催化活性。活性Dz2可接着裂解它的底物(底物2，也是粗黑线)，如果所述底物用荧光团(小空心圆圈)和淬灭剂(小实心黑圆圈)标记，那么此导致以荧光团形式描绘的荧光信号增加，所述荧光团现在以星形绘制。
在其它示例性实施方案中，适体序列可以呈使活性MNA酶仅在靶标分析物存在下形成的构型并入部件酶(适配部件酶)的末端。在这种情况下，用于MNA酶检测策略的部件酶包括标准部件酶；作为在一端中并入适体的部件酶的适配部件酶；结合适配部件酶与部件酶两者，从而使得能够装配活性MNA酶(在靶标存在下)的装配促进剂；底物；以及与适配部件酶中至少跨越一部分适体序列和一部分部件酶序列的区域杂交的装配抑制剂。在不存在靶标下，装配抑制剂结合适配部件酶，由此阻断报道探针底物的结合(和裂解)。在靶标存在下，靶标结合适配部件酶的适体序列，从而防止装配抑制剂的结合，并且允许MNA酶底物的结合和裂解。因此，活性MNA酶仅可在靶标存在下形成并修饰MNA酶底物。
在装配MNA酶不需靶标的其它示例性实施方案中，适体可并入装配促进剂中。也设想一种相关策略，其中适体序列是以使活性MNA酶仅在靶标存在下形成的构型并入部件酶(适配部件酶)的末端。用于所述检测策略的寡核苷酸组分包括标准部件酶；作为在一端中并入适体的部件酶的适配部件酶；结合适配部件酶与部件酶两者，从而使得能够装配活性MNA酶(在靶标存在下)的装配促进剂；MNA酶底物；以及与适配部件酶中至少跨越一部分适体序列和一部分部件酶序列的区域杂交的装配抑制剂。在不存在靶标配体下，装配抑制剂结合适配部件酶，由此阻断MNA酶底物的结合(和裂解)。在配体存在下，配体结合适配部件酶的适体序列，从而防止装配抑制剂的结合，并且允许MNA酶底物的结合和裂解。因此，活性MNA酶仅可在靶标配体存在下形成并导致荧光信号产生。
此外，本领域技术人员应了解，装配抑制剂可为独立分子，或可并入参与MNA酶复合物的一种组分中。
本领域技术人员也应了解，在以上策略中，抑制剂序列可为独立分子，或可并入参与MNA酶复合物的一种组分中。此外，一种或多种适体可并入任何寡核苷酸组分(包括部件酶、装配促进剂或底物)中。此外，适体可并入这些寡核苷酸中任一种的任一末端中。
本领域技术人员应了解，适体可与DNA酶、核糖酶或任何MNA酶组分共有碱基对互补性，此可导致它们的催化活性的暂时失活。当靶标分析物存在时，它可结合适体，从而使所述适体与DNA酶、核糖酶或MNA酶组分分离，此可导致DNA酶、核糖酶或MNA酶组分的催化活性的恢复，它们可接着通过充当可修饰BL分子内存在的底物的催化核酸而用于引发本文所述的级联反应。
在其它示例性实施方案中，一个或多个适体序列或其部分可存在于BL分子内。在靶标配体存在下，靶标配体可结合适体，此可改变适体的构象，并且可导致催化核酸、RL、引物、聚合酶模板或NRF与BL分离，以及随后分别恢复它们的催化、释放、引发、模板和核酸酶引发活性。特定地参照图28，图ii)描绘了在分子开关的BL内包括适体。在图ii)中，DNA酶(Dz，粗黑线)与BL杂交，从而导致它的暂时失活。BL由与Dz(细黑线)杂交的5’端和3’端组成，所述末端由不与Dz互补，但包含适体序列(粗黑虚线)的中心部分连接。在靶标分析物(或配体，大实心灰圆圈)存在下，适体可结合配体，此可导致BL的构象变化，从而导致BL与Dz分离，恢复Dz的催化活性。活性Dz可接着起作用以裂解它的可用荧光团(小空心圆圈)和淬灭剂(小实心黑圆圈)标记的底物(底物，粗黑线)，并且可导致以荧光团形式描绘的荧光信号增加，所述荧光团现在以星形绘制。
试剂盒
本发明也提供用于实施本文公开的方法的试剂盒。典型地，用于执行本发明的方法的试剂盒含有用以执行所述方法的所有必需试剂。
试剂盒可包括根据本发明的任何组合物或其组分。仅借助于非限制性实例来说，试剂盒可包括催化核酸酶(例如MNA酶和/或其部件酶组分、DNA酶、适配酶和/或核糖酶)、核酸外切酶、核酸内切酶、RL、BL、NRF、引物、聚合酶模板以及底物(例如催化核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶的底物)。底物可包含一种或多种引物。
试剂盒可为如本文定义的分段试剂盒或组合试剂盒。分段试剂盒包括安放在单独容器中的试剂，并且可包括小玻璃容器、塑料容器或塑料带或纸带。所述容器可允许将试剂自一个区室高效转移至另一区室，同时避免样本和试剂的交叉污染，以及以定量方式将每个容器的试剂或溶液自一个区室添加至另一区室。所述试剂盒还可包括将接纳测试样本的容器、含有用于测定中的试剂的容器、含有洗涤试剂的容器以及含有检测试剂的容器。典型地，本发明的试剂盒也将包括有关使用试剂盒组分来执行适当方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可结合自动分析设备和系统(例如包括但不限于，实时PCR机器)一起使用。
举例来说，试剂盒可包括第一容器和第二容器。第一容器可包括分子开关，所述分子开关包含由于与BL杂交而以功能性失活形式存在的催化核酸(例如DNA酶)。第二容器可包括一种或多种能够以靶标依赖性或非靶标依赖性方式使BL自酶解离的寡核苷酸或蛋白质组分。试剂盒可为如本文定义的分段试剂盒或组合试剂盒。
试剂盒也可包括一个或多个其它容器，所述容器含有例如洗涤试剂和/或如在执行本发明的方法时需要的其它试剂。
对于检测、鉴定或定量不同靶标的应用而言，本发明的单一试剂盒可为适用的，或者，可能需要例如含有对每一靶标具有特异性的试剂的不同试剂盒。本发明的方法和试剂盒适用于需要检测、鉴定或定量任何实体的任何情况。
本发明现将通过参照以下具体实施例来进一步更详细描述，所述实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1
以下实施例说明通过与互补阻断寡核苷酸(BL)杂交来使DNA酶失活。BL含有两个与DNA酶具有序列互补性的区域，这些区域由充当第二独立催化核酸(在这一情况下是另一DNA酶)的底物的非互补区域连接。BL的5’端和3’端被设计成(i)分别与DNA酶(Dz2)的3’端和5’端杂交以形成具有外部成环的可裂解底物序列的线性双链体结构(示意性描绘于图1图i中))，或(ii)它们被设计成分别与5’端和3’端杂交，从而形成准环状结构(示意性描绘于图1图ii)和iii中))。在这一实施例中，说明一种准环状结构，并且由DNA酶(Dz1)而非图1图ii)中描绘的MNA酶对底物区域(底物1a)进行裂解。裂解底物区域应使得先前非活性DNA酶(Dz2)的释放和随后再活化。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:1；C(4)Sub45(24:24)(2)-FB)主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:2；DzK(10:9))的一部分互补的5’端和3’端，和(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1a组成的中心部分，所述底物1a与底物1的序列(SEQ ID NO:3；Sub45)相同，但缺乏5’末端的‘A’核苷酸和3’末端的‘GAA’核苷酸。BL在内部在自5’端起第15个核苷酸(‘T’)处用6-荧光素(“6-FAM”)部分标记，并且在自5’端起第34个核苷酸(‘T’)处用黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1；“BHQ1”)部分标记。因此，荧光团和淬灭剂部分位于底物1a区域和DNA酶互补区域的接点处。利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
用DNA酶(Dz1-SEQ ID NO:4；Dz45(9:10))裂解BL的底物1a部分。这一裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于底物2(SEQID NO:5；Sub2)。在这一实施例中，底物2在5’端用得克萨斯红部分进行末端标记，而在3’端用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分进行末端标记。
为测量Dz1裂解BL的有效性，将裂解BL产生的信号与由Dz1裂解独立底物(底物1)的阳性对照1信号相比较。底物1不含有与Dz1互补的任何其它5’和3’序列，并且在5’端上用6-FAM部分进行末端标记，而在3’端用爱荷华黑(Iowa Block；IB)淬灭剂部分进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz2互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz2中与BL分子中加下划线的碱基互补，并且被所述加下划线的碱基阻断的碱基。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表4B中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图1图ii)中说明的结构。对于反应E和F，最初使BL和Dz2一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表4B
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在45℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)与通道3(TxR)中同时测量荧光信号以分别监测FAM和得克萨斯红，并且被编程以每5秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计40分钟。
-结果
图2图i)显示从含有一个DNA酶分子的准环得到的结果。此处，作为BL分子的一部分存在的底物1a自身用FAM荧光团和淬灭剂标记。可由Dz2裂解的底物2用TxR荧光团和淬灭剂标记，并且因此，可通过TxR的荧光变化来监测Dz2的释放和活化。因此，两个裂解事件可通过测量来自两个荧光团发射波长的荧光信号分开监测。图i)中的顶部图概述来自FAM荧光团的荧光信号，而底部图概述来自TxR荧光团的荧光信号。对于准环独立存在的反应E(‘仅阻断剂’，以具有三角形符号的线显示)，不存在对底物1a的裂解，并且因此，FAM信号不增加，此外，在反应期间，TxR信号不存在显著增加，从而指示Dz2在与BL复合时是非活性的。这是相较于分别对应于仅含有底物1和底物2的反应A和C的FAM和TxR的阴性对照(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示。然而，对于Dz1存在并且可裂解底物1a的反应F(‘DNA酶1存在’；含有圆圈符号的线)，FAM信号存在即刻增加，从而指示底物1a已被裂解。这也导致TxR信号逐渐增加，从而指示Dz2现已自BL释放，并且裂解底物2。这是相较于分别对应于反应B和D的FAM和TxR的阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应各自含有分别与反应F中所存在相同的浓度的底物1和Dz1(对于FAM)以及底物2和Dz2(对于TxR)。
实施例2
以下实施例说明：
(i)通过与两种互补阻断寡核苷酸(BL)BL(A)和BL(B)杂交使两种独立DNA酶Dz(A)和Dz(B)失活。
(ii)在能够裂解BL(A)和BL(B)的底物部分，从而导致Dz(A)和Dz(B)的释放的第三DNA酶Dz(C)存在下，Dz(A)和Dz(B)随后活化。所述实施例说明一种如图1图iii)中说明的系统，其中本实施例的Dz(C)相当于第一催化核酸(根据所述图的Mz1)。
-寡核苷酸
BL(A)(SEQ ID NO:6；C4Sub45(22:23))主要由以下各物组成：(i)与Dz(A)(SEQ ID NO:7；DzK(8:7))的5’端互补的5’端；(ii)由底物1a组成的中心部分，所述底物1a与底物1的序列(SEQ ID NO:3，Sub45)相同，但缺乏5’末端的‘A’核苷酸和3’末端的‘GAA’核苷酸；和(iii)与Dz(B)(SEQ ID NO:8；Dz6(8:7))的3’端互补的3’端。
BL(B)(SEQ ID NO:9；C4Sub45T(21:24))主要由以下各物组成：(i)与Dz(B)的5’端互补的5’端；(ii)由底物1b组成的中心部分，所述底物1b与底物1的序列相同，但缺乏5’末端的‘AC’核苷酸和3’末端的‘GAA’核苷酸；和(iii)与Dz(A)的3’端互补的3’端。
在这一实施例中，BL(A)和BL(B)的5’端和3’端被设计成与Dz(A)和Dz(B)的5’端和3’端杂交，以使得形成含有由两个BL分子保持在一起的两种非活性DNA酶的准环状结构(如图1图iii)中所概述)。
第三DNA酶Dz(C)(SEQ ID NO:10；Dz45(8:9))能够裂解BL(A)的底物1a部分以及BL(B)的底物1b部分，从而导致Dz(A)和Dz(B)自准环状结构释放。
Dz(A)裂解底物A(SEQ ID NO:5，Sub 2)，所述底物在本实施例中用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)在3’端标记。
Dz(B)裂解底物B(SEQ ID NO:11，Sub 6)，所述底物在本实施例中用TxR部分在它的5’端标记以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分在它的3’端标记。
以下自5’至3’列出以上寡核苷酸的序列。
大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分DNA酶互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示DNA酶中与BL分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表5中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图1图iii)中说明的结构。对于反应E和F，最初使BL分子BL(A)、BL(B)与DNA酶Dz(A)和Dz(B)一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表5
寡核苷酸是自IDT或Biosearch Technologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在45℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)和通道3(TxR)中同时测量荧光信号以分别监测FAM和得克萨斯红，并且被编程以每5秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计40分钟。
-结果
图2图ii)显示从含有存在的两种DNA酶的准环得到的结果。在这一情况下，作为两个BL分子的一部分存在的底物序列(对于BLA为底物1a并且对于BLB为底物1b)是未标记的。可由Dz(A)在它被释放和活化之后裂解的底物序列(底物A)用FAM荧光团和淬灭剂染料标记，而可由Dz(B)在它被释放和活化之后裂解的底物(底物B)用TxR荧光团和淬灭剂标记。因此，两个裂解事件可通过观察来自两个荧光团发射波长的荧光信号来分开监测。顶部图概述来自FAM荧光团的荧光信号，而底部图概述来自TxR荧光团的荧光信号。对于当准环独立存在时的反应E(‘仅阻断剂’，以具有三角形符号的线显示)，不存在对底物1a或底物1b的裂解，并且因此，FAM或TxR信号极少增加甚至不增加，从而指示Dz(A)与Dz(B)两者在与完整BL分子复合时均是非活性的。这是相较于分别对应于反应A和C的FAM与TxR两者的阴性对照(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示，所述反应仅含有相同荧光标记的底物A和底物B序列。对于DNA酶C存在的反应F(含有圆圈符号的线)，来自FAM荧光团与TxR荧光团的信号均存在逐渐增加，从而指示Dz(A)与Dz(B)两者均自准环释放，并且现在正裂解它们的相应底物。这是相较于分别对应于反应B和D的FAM和TxR的阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应各自含有分别与反应F中相同的浓度的底物A和Dz(A)(对于FAM)以及底物B和Dz(B)(对于TxR)。
实施例3
以下实施例说明通过将DNA酶并入如(图4图iii)中概述的发夹结构(发夹状Dz)中来使DNA酶失活。在与发夹的BL部分完全互补(其中BL仅与完整DNA酶序列部分互补)的释放寡核苷酸(RL)存在下，可使DNA酶具有活性。RL缺乏完整DNA酶序列，并且因此不能作为催化DNA酶自身起作用。
-寡核苷酸
在本实施例中，利用了能够裂解底物(SEQ ID NO:3；Sub45)的发夹状DNA酶(SEQ ID NO:12；hp(R6)Dz45BUB0(4))。在这一实施例中，Sub45用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端标记。RL(SEQ ID NO:13；RL-Dz45BUB0(4))被用于活化发夹状DNA酶。将发夹状DNA酶的催化活性与相应非发夹状DNA酶(SEQ ID NO:4；Dz45(9:10))的催化活性相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示发夹中与RL互补的BL区域。斜体的碱基是指发夹结构内的DNA酶序列。加框的碱基表示DNA酶的催化核心中与发夹的BL部分不互补并且因此在发夹的茎的外部成环的部分。
-反应组分
反应A、B、C和D被设置成含有如表6中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图4图iii)中说明的结构。
表6
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在45℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计40分钟。
-结果
图5，图i)显示从含有单一DNA酶分子的发夹状DNA酶得到的结果。可由DNA酶在它由RL活化之后裂解的底物序列用FAM荧光团和淬灭剂标记。所述图(FAM)概述了来自这一FAM荧光团的荧光信号。对于当发夹Dz状独立存在时的反应C(‘仅发夹’，为以具有三角形符号的线显示)，不存在对底物的裂解，并且因此，FAM信号不增加，从而指示DNA酶部分在发夹状结构内保持非活性的。这是相较于对应于反应A的阴性对照(‘阴性对照’，含有方块符号的线)来显示，所述反应仅含有相同荧光标记的底物序列。对于当RL存在以打开发夹时的反应D(‘存在释放剂’；含有圆圈符号的线)，FAM信号存在即刻增加，从而指示DNA酶部分是游离的，并且底物已被裂解。这是相较于对应于反应B的阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应B含有与反应D中所存在相同的浓度的底物和非发夹状对照DNA酶。
实施例4
以下实施例说明通过将两种独立DNA酶放置在两种发夹DNA结构：发夹状Dz1和发夹状Dz2内来使所述DNA酶失活(如图4图iv中所概述)。每个发夹含有其它序列，对于发夹状Dz1，所述其它序列在它的BLA茎的5’端，而对于发夹状Dz2，所述其它序列在它的BLB茎的3’端。这些其它序列彼此互补，以使两种发夹DNA酶被连接在一起。这使得DNA酶紧密邻近，由此单一RL分子可结合存在于BLA与BLB两者上的它的互补序列，并且同时打开两种发夹，从而释放每一DNA酶，因此这些DNA酶接着能够裂解它们的底物。RL不能充当DNA酶自身，因为它不含足以具有催化活性的DNA酶序列。
-寡核苷酸
在本实施例中，发夹状Dz1(SEQ ID NO:14；dhp6Dz2(5)M4)含有能够裂解底物1(Sub2，SEQ ID NO:5)的DNA酶序列，而发夹状Dz2(SEQ ID NO:15；dhp5Dz6(3))含有能够裂解底物2(Sub6，SEQ IDNO:11)的DNA酶序列。底物1用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)在3’端标记(Sub2-FB)，而底物2用得克萨斯红部分在它的5’端标记以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分在它的3’端标记(Sub6-TRB2)。RL(SEQ ID NO:16；RL-dhp6)被用于自发夹结构释放DNA酶。将每一发夹状DNA酶的活性与相应非发夹状对照DNA酶，即对照DNA酶1(Dz2，SEQ ID NO:17)和对照DNA酶2(Dz6，SEQ ID NO:18)相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示发夹中与RL互补的区域。斜体的碱基是指发夹结构内的完整DNA酶序列，而加框的碱基表示DNA酶被锁定于发夹茎中的部分(与BL部分互补)。发夹状Dz1和发夹状Dz2中以灰色突出的序列是互补的。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表7中所列的以下寡核苷酸片段，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图4图iv)中说明的结构。
表7
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在40℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)和通道3(TxR)上测量荧光信号，并且被编程成每5秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计40分钟。
-结果
在图5图ii)中，显示了双重发夹状DNA酶分子的结果。可由发夹状Dz1在它被打开和活化之后裂解的底物序列(底物1)用FAM荧光团和淬灭剂标记，而可由发夹状Dz2在它被打开和活化之后裂解的底物(底物2)用TxR荧光团和淬灭剂标记。因此，两个裂解事件可通过观察来自两个荧光团发射波长的荧光信号来分开监测。顶部图概述了来自FAM荧光团的荧光信号，而底部图概述了来自TxR荧光团的荧光信号。对于当两种发夹状Dz结构均独立存在时的反应E(‘仅发夹’，以具有三角形符号的线显示)，存在对每种底物的极少裂解或不存在裂解，并且因此，FAM和TxR信号极少增加或不增加，从而指示两种DNA酶部分在它们的相应发夹状结构内保持非活性的。这是相较于分别对应于仅含有相同荧光标记的底物序列的反应A和C的FAM和TxR的阴性对照(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示。然而，对于当单一RL存在时的反应F，它同时打开两种发夹(‘存在释放剂’；含有圆圈符号的线)，并且因此FAM信号与TxR信号两者均存在增加，从而指示两种DNA酶部分现在均是游离的以裂解它们的相应底物。这是相较于分别对应于反应B和D的FAM和TxR的阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应各自含有与反应F中所存在相同的浓度的每一底物和非发夹状对照DNA酶。
实施例5
本实施例说明一种信号放大的方法，其中RL通过ExoIII的活性而再循环，导致DNA酶的连续释放以及随后活化(概述于图6图i中))。类似于实施例3，通过与BL杂交来使DNA酶失活，然而，相较于实施例3中DNA酶的一个以上核苷酸在BL中不具有互补序列并且因此在DNA酶序列结合BL时在外部成环的情形，在本实施例5中，在DNA酶与BL序列之间存在单一错配。在本实施例5中，DNA酶与BL之间的单一错配意味着，RL不含有DNA酶的催化活性所需的整个序列。在实施例5中，DNA酶可由RL活化，并且一旦BL结合于RL，BL即可由ExoIII降解，而RL分子保持完整。RL接着能够结合另一BL，并且重复所述循环，其中DNA酶每次在所述过程期间被释放。
-寡核苷酸
在本实施例中，杂交的BL(SEQ ID NO:19；BL(MM1)-Dz2)被用于阻断Dz(SEQ ID NO:20；Dz2(21:10))对它的底物(SEQ ID NO:22；Sub2h-FB)的催化活性。Sub2h-FB用-6FAM部分在它的5’端标记以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分在内部在自它的3’端起第6位处的A碱基上标记。在Dz和BL杂交之后，DNA酶与BL两者的3’端均突出至少五个核苷酸，从而允许各自对ExoIII活性具有抗性。RL(SEQID NO:22；RL(MM1)(-(+5)-Dz2)被用于自BL释放DNA酶。当与BL杂交时，RL的5’端被设计成与BL的3’端杂交以形成钝端，由此使得BL易被ExoIII降解。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示在DNA酶与BL之间具有互补性的区域。加框的碱基表示RL中与BL互补的区域。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表8中所列的以下寡核苷酸和ExoIII酶，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图6图i)中说明的结构。对于反应C-F，使DNA酶和BL一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加其它寡核苷酸组分。
表8
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。核酸外切酶III(ExoIII)是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)和无核酸酶的水(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在45℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计40分钟。
-结果
图6图ii)说明了由图6图i)中描绘的ExoIII策略达成的荧光信号。可由DNA酶在它被活化之后裂解的底物序列用FAM荧光团和淬灭剂染料标记。所述图(FAM)概述了来自这一FAM荧光团的荧光信号。对于当Dz和BL双链体独立存在时的反应C和D(‘仅BL-ExoIII’，以具有三角形符号的线显示；以及‘仅BL+ExoIII’，以具有圆圈符号的线显示)，不存在Dz的置换，并且因此无底物裂解，而且无相应FAM信号增加。这是相较于仅含有相同荧光标记的底物序列的阴性对照反应A(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示。对于关于BL的浓度(200nM)和Dz的浓度(100nM)，存在低RL浓度(50nM)的反应E和F(‘存在RL-ExoIII’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线，以及‘存在RL+ExoIII’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)，含有RL而无ExoIII的反应E的信号存在较少增加，但含有RL与ExoIII两者的反应F的信号存在大得多并且即刻增加。在两种情况下，RL起作用以置换DNA酶，然而，当ExoIII不存在时，有极少置换发生，因为少数RL分子各自将仅具有极低解离速率，并且因此将主要产生与BL的惰性双链体。当ExoIII存在时，它起作用以自BL/RL双链体降解BL，并且因此，每一RL被再循环，并且可连续置换更多Dz分子。这是相较于含有阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)的反应B来显示，所述反应B仅含有与反应F中相同的浓度的底物和游离对照DNA酶。
实施例6
以下实施例说明一种信号放大的方法，其中RL通过切口酶的活性而再循环，导致DNA酶的连续释放以及随后活化(如图7图i中所概述))。类似于实施例3，DNA酶由BL失活，并且可由RL再活化，然而，在本实施例5中，一旦BL结合于RL，即在RL/BL双链体内产生切口酶的完整双链识别位点。切口酶识别这个位点，并且对BL选择性切口，而RL分子保持完整。BL的每个‘切口’片段现在不再对RL具有与完整BL相同的亲和力，并且因此复合物解离。这使RL结合另一BL，并且重复所述循环，其中DNA酶每次在所述过程期间被释放。
-寡核苷酸
在本实施例中，杂交的BL(SEQ ID NO:23；BL-Dz2Nic7-FB)被用于阻断Dz(SEQ ID NO:17；Dz2)对它的底物(SEQ ID NO:5；Sub2-TRB2)的催化活性。Sub2-TRB2用得克萨斯红部分在它的5’端末端标记以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分在它的3’端进行末端标记。BL含有不与DNA酶互补并且形成双链切口酶识别序列的一条链的序列。当BL与DNA酶杂交时，这一其它BL序列以自双链体突出的单链环形式存在。此外，BL在内部在自5’端起第7个核苷酸(‘T’核苷酸)处用6-荧光素(“6-FAM”)部分标记，并且在自5’端起第30个核苷酸(‘T’核苷酸)处用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分标记。RL(SEQID NO:24；RL-Dz2Nic7a)被用于自BL释放DNA酶，并且同时自RL/BL复合物产生限制酶Nt.BspQI的完整双链识别位点。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示在DNA酶与BL之间具有互补性的区域。加框的碱基表示BL中与RL互补的区域。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表9中所列的以下寡核苷酸和切口酶(Nt.BspQI)，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图7图i)中说明的结构。对于反应C-F，使DNA酶和BL一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加其它寡核苷酸组分。
表9
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。切口酶Nt.BspQI是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液3(New England Biolabs)和无核酸酶的水(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在52℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道3(TxR)上测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计40分钟。
-结果
图7图ii)说明由图7图i)中描绘并且如上所述的切口酶策略达成的荧光信号。一旦DNA酶已自BL释放并且因此活化，即可由所述DNA酶裂解的底物序列用TxR荧光团和淬灭剂标记。所述图(TxR)概述了来自这个TxR荧光团的荧光信号。对于Dz和BL双链体独立存在的反应C和D(‘仅BL-Nt.BspQI’，以具有三角形符号的线显示；以及‘仅BL+BspQI’，以具有圆圈符号的线显示)，不存在Dz的置换，并且因此无底物裂解，而且无相应TxR信号增加。这是相较于含有阴性对照的反应A(‘阴性对照’，含有方块符号的线)来显示，所述反应A仅含有相同荧光标记的底物序列。对于关于BL的浓度(200nM)和Dz的浓度(100nM)存在低RL浓度(10nM)的反应E和F(‘存在RL-Nt.BspQI’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线；以及‘存在RL+Nt.BspQI’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)，含有RL而无切口酶的反应E的信号存在极少增加甚至不存在增加，但含有RL与Nt.BspQI两者的反应F的信号随时间逐渐增加。在两种情况下，RL起作用以置换DNA酶，然而，当切口酶不存在时，有极少置换发生，因为少数RL分子各自将仅具有自BL的极低解离速率，并且因此将主要产生与BL的惰性双链体。当切口酶存在时，它起作用以自BL/RL双链体选择性裂解BL，并且因此，每种RL被再循环，并且可连续置换Dz分子。这是相较于阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述阳性对照含有与反应F中所存在相同的浓度的底物和游离对照DNA酶。
实施例7
以下实施例说明一种信号放大的方法，其中RL通过链置换聚合酶的活性而再循环，导致DNA酶的连续释放以及随后活化(如图8图i中所概述))。如实施例3中一样，DNA酶最初通过与BL杂交来失活，并且可由RL再活化。在本实施例7中，BL含有在BL的末端形成可由RL打开的发夹的序列。发夹茎含有仅在RL存在下暴露的引物结合位点。一旦引物可结合这个位点，它接着由能够自BL模板置换任何上游预先杂交的链的聚合酶延伸。因此，由链置换聚合酶达成的引物延伸将导致自BL置换RL，并且将在BL模板与新合成的链之间产生无用双链体。RL接着能够结合另一BL，并且重复所述循环，其中DNA酶每次在所述过程期间被释放。
-寡核苷酸
BL(SEQ ID NO:25；hpBLr-Dz2BUB0(4)-P)被设计用来阻断能够裂解它的底物(Sub2，SEQ ID NO:5)的Dz(SEQ ID NO:26；Dz2(9:8))的活性。在这一实施例中，Sub2-FB在内部用6-FAM部分在第6位中的T核苷酸上标记以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分在3’端标记。RL(SEQ ID NO:27；RLr-Dz2BUB0(4)(-2)-P)被用于释放DNA酶，并且暴露引物(SEQ ID NO:28；PR(3)-BLDz2(10))的结合位点。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示在DNA酶与BL之间具有互补性的区域。加框的碱基表示BL中与RL互补的区域。用灰色突出的区域表示BL中充当引物结合位点的序列。/3Phos/指示3’端磷酸化，即一种防止寡核苷酸由聚合酶延伸的修饰。
反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表10中所列的以下寡核苷酸和聚合酶，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图8图i)中说明的结构。对于反应C-F，使DNA酶、BL和引物在室温下预先孵育30分钟，随后添加聚合酶至反应D和F中，并且添加RL至反应E和F中。
表10
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。链置换聚合酶克林诺片段(3’→5’外切)是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)、200μM dNTP(Bioline)和无核酸酶的水(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在40℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计40分钟。
-结果
图8图ii)说明由图8图i)中描绘的链置换聚合酶策略达成的荧光信号。可由DNA酶在它被活化之后裂解的底物序列用FAM荧光团和淬灭剂标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。对于Dz和BL双链体独立存在的反应C和D(‘仅BL-克林诺酶’，以具有三角形符号的线显示，以及‘仅BL+克林诺酶’，以具有圆圈符号的线显示)，不存在Dz的置换，并且因此无底物裂解，而且无相应FAM信号增加。这是相较于含有阴性对照的反应A(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示，所述反应A仅含有相同荧光标记的底物序列。对于关于BL的浓度(200nM)和Dz的浓度(150nM)，存在低RL浓度(10nM)的反应E和F(‘存在RL-克林诺酶’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线，以及‘存在RL+克林诺酶’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)，含有RL而无克林诺酶的反应E的信号不存在增加，但含有RL与克林诺酶两者的反应F的信号即刻增加。当聚合酶不存在时(反应E)，有极少置换发生，因为少数RL分子各自将仅具有自BL的极低解离速率，并且因此将主要产生与BL的惰性双链体。引物将能够结合它的结合位点，但将不能够被延伸。然而，当聚合酶存在时(反应F)，它可延伸引物，并且置换RL。因此，每种RL被再循环，并且可连续置换Dz分子。引物的延伸也产生BL模板与新合成的链之间的无用发夹双链体。这是相较于含有阳性对照的反应B(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应B由与反应F中所存在相同的浓度的底物和游离对照DNA酶组成。
实施例8
以下实施例说明通过将RL并入发夹RL/BL结构中来使RL初始失活，如图9图i)中所描绘。发夹状RL的BL部分(BLA)含有可由DNA酶1(Dz1)裂解并且导致RL的活化的底物序列(底物1)。活性RL可接着通过与BL部分(BLB)杂交来起作用以打开含有DNA酶2的另一发夹(发夹状Dz2)。发夹状Dz2/BLB结构的Dz2部分接着是具有活性的，并且可接着起作用以裂解荧光标记的底物2，从而导致产生荧光信号。
-寡核苷酸
在本实施例中，利用了能够裂解底物2(SEQ ID NO:3；Sub45)的发夹状Dz2(SEQ ID NO:29；hp(R3a)Dz45BUB0(4))。在这一实施例中，底物2(Sub45-FIB)用6-荧光素(‘6-FAM”)部分在5’端标记以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端标记。一旦发夹状RL的BLA组分内的底物1由Dz1(DzK(8:7)SEQ ID NO:7)裂解，发夹状RL(SEQID NO:30；hpRLb(R4)-Sub2)即被用于活化发夹状Dz2。将发夹状DNA酶的催化活性与相应非发夹状Dz2(阳性对照Dz2：SEQ ID NO:4；Dz45(9:10))的催化活性相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示在发夹状RL与发夹状Dz2之间互补的区域。斜体的碱基是指发夹状DNA酶内的DNA酶序列。加框的碱基表示DNA酶的催化核心的与发夹状Dz2的BL部分不互补并且因此在发夹的茎的外部成环的部分。
-反应组分
反应A、B、C、D以及E被设置成含有如表11中所列的以下寡核苷酸片段，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图9图i)中说明的结构。
表11
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在45℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计40分钟。
-结果
图9图ii)说明由图9图i)中概述的策略达成的荧光信号。可由发夹状Dz2在自它的发夹结构释放后而活化之后裂解的底物2用FAM荧光团和淬灭剂标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。对于发夹状Dz2独立存在的反应C(‘仅hpDz’，以具有三角形符号的线显示)，不存在对底物2的裂解，并且因此，FAM信号不增加，从而指示DNA酶部分在发夹状结构内保持呈非活性。类似地，对于发夹状RL与发夹状Dz均存在的反应D(‘仅hpDz+hpRL’，以含有圆圈符号的线显示)，FAM信号存在极少增加，从而指示相应发夹的RL部分与Dz2部分两者均在它们的发夹结构内保持呈非活性。这是相较于含有阴性对照的反应A(‘阴性对照’，含有方块符号的线)来显示，所述反应A仅含有底物2。对于Dz1存在以裂解底物1的反应E(‘hpDz+hpRL+DNA酶1’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)，FAM信号存在逐渐增加，从而指示裂解底物1使发夹状RL的RL部分活化，并且RL可接着起作用以活化发夹状Dz2，所述发夹状Dz2可接着裂解底物2。这是相较于含有阳性对照的反应B(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应B由与反应E中所存在相同的浓度的底物2和非发夹状阳性对照DNA酶2组成。
实施例9
实施例9说明如图11图i)中所描绘，使用引物直接活化DNA酶分子，而不使用RL分子。如实施例3中所概述，存在含有非活性DNA酶的发夹状分子。然而，在本实施例9中，发夹状Dz/BL复合物的BL部分与整个DNA酶序列完全杂交，其中两者是由非互补环连接。这一结构中的发夹环由形成切口酶的部分识别序列的核苷酸组成。当引物存在时，它与环序列杂交，并且在它的3’端由链置换聚合酶延伸。引物延伸导致自发夹结构置换DNA酶以及通过使用BL序列作为模板来合成DNA酶的新拷贝的同时进行。置换的DNA酶现在是具有活性的，并且可裂解它的底物。引物的延伸还使双链切口酶识别位点完整。切口酶可识别这个位点，并且在上游引物与下游新合成的DNA酶序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物，所述引物由聚合酶延伸以合成另一DNA酶拷贝，并且自BL模板置换预先存在的拷贝。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生多个DNA酶分子。
-寡核苷酸
发夹状Dz/BL复合物(SEQ ID NO:31；hp(R6b)Dz45)含有Dz，所述Dz在自BL释放并且因此具有活性时能够裂解底物(Sub45，SEQID NO:3)。在这一实施例中，Sub45用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端标记。引物(SEQ IDNO:32；PR(R6)Dz45(10))被用于活化和合成DNA酶的其它拷贝。将发夹状DNA酶的催化活性与相应非发夹状阳性对照DNA酶(SEQ IDNO:4；Dz45(9:10))的催化活性相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。斜体的碱基是指发夹状Dz/BL结构内的DNA酶序列。加下划线的碱基表示在引物与发夹状DNA酶之间具有互补性的区域。加框的碱基表示发夹状Dz/BL和引物内存在的部分切口酶识别位点。
-反应组分
反应A、B、C、D、E、F、G以及H被设置成含有如表12中所列的以下寡核苷酸、聚合酶和切口酶，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图11图i)中说明的结构。
表12
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。链置换聚合酶克林诺片段(3’→5’外切)和切口酶Nt.AlwI是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)、100μM dNTP(Bioline)和无核酸酶的水(Ambion)。所有反应的总体积都是50μL。所有反应都一式两份在37℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计100分钟。
-结果
图11图ii)说明由图11图i)中描绘的策略达成的荧光信号。可由DNA酶在它活化之后裂解的底物序列用FAM荧光团和淬灭剂标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。对于不存在蛋白质酶但发夹状Dz独立存在(‘仅hpDz’，以具有三角形符号的线显示)以及具有引物的发夹状Dz存在(‘hpDz+引物’，以具有圆圈符号的线显示)的反应C和D，信号存在极少增加，从而指示无引物延伸，无Dz的随后活化，并因此无底物裂解以及相应FAM信号增加。这是相较于含有阴性对照的反应A(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示，所述反应A仅含有相同荧光标记的底物序列。对于克林诺酶存在并且发夹状Dz在无引物(‘仅hpDz+仅克林诺酶’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)和有引物(‘hpDz+引物+仅克林诺酶’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)下存在的反应E和F，含有引物的反应F的信号存在逐渐增加，从而指示引物由克林诺酶延伸并且导致发夹状Dz的Dz部分的活化。然而，当克林诺酶与Nt.AlwI两者均存在并且发夹状Dz在无引物(反应G—‘仅hpDz+克林诺酶+Nt.AlwI’，含有具有一个垂直相交线的符号的线)以及有引物(反应H—‘hpDz+引物+克林诺酶+Nt.AlwI’，含有由实心黑方形组成的符号的线)的溶液中时，含有引物的反应H的信号存在增加，反应H比仅具有克林诺酶的反应F进行更快，从而指示除活化发夹内现存的拷贝之外，Nt.AlwI酶的存在还促进其它Dz拷贝的合成。这是相较于含有阳性对照的反应B(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应B由与反应H中所存在相同的浓度的底物和游离阳性对照DNA酶组成。还进行了在存在或不存在引物下含有发夹状Dz而且仅含有Nt.AlwI的每一反应以确认单独这种酶不导致额外信号产生。这些反应不导致FAM荧光的增加(数据未显示)。
实施例10
以下实施例说明通过与互补阻断寡核苷酸(BL)杂交来使DNA酶失活。BL含有两个与DNA酶互补的序列区域，这些区域由充当第二独立催化核酸(在这一情况下是MNA酶)的底物的非互补区域连接。BL的5’端和3’端可被设计成(i)分别与DNA酶的3’端和5’端杂交以形成具有外部成环的可裂解底物序列的线性双链体结构，或(ii)它们可被设计成分别与5’端和3’端杂交，从而形成准环状结构(如这一实施例中所述并且分别图解概述于图1图ii)和iii)中)。由MNA酶(Mz1)在它的靶标(AF1)存在下裂解底物(底物1a)区域导致先前非活性的DNA酶的释放以及随后再活化。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:1；C(4)Sub45(24:24)(2)-FB)主要由以下组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:2；DzK(10:9))的一部分互补的5’端和3’端，和(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1a组成的中心部分，所述底物1a与底物1的序列(SEQ ID NO:3；Sub45)相同，但缺乏5’末端的‘A’核苷酸和3’末端的‘GAA’核苷酸。BL在内部在自5’端起第15个核苷酸(‘T’核苷酸)处用6-荧光素(“6-FAM”)部分标记，并且在自5’端起第34个核苷酸(‘T’核苷酸)处用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分标记。因此，荧光团和淬灭剂位于底物区域和DNA酶互补区域的接点处。利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:33；TFRCA4/45-P；和部件酶B，SEQ ID NO:34TFRCB5/45-P)和装配促进剂靶标(AF1，SEQ ID NO:35AF-TFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BL的底物1a部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于底物2(SEQ ID NO:5；Sub2)。在这一实施例中，Sub2用得克萨斯红部分在5’端以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分DNA酶互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基分别表示DNA酶或部件酶的催化核心或部分催化核心。用灰色突出的核苷酸表示DNA酶中与BL分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E、F以及G被设置成含有如表13中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图1图ii)中说明的结构。对于反应E、F和G，最初使BL和DNA酶一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表13
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在45℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)与通道3(TR)两者中同时测量荧光信号以分别监测FAM和得克萨斯红，并且被编程成每5秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计40分钟。
-结果
图15图i)显示由DNA酶准环策略自含有单一失活DNA酶的环达成的荧光信号，所述DNA酶已通过MNA酶在它的靶标装配促进剂存在下裂解环的BL部分来活化。
此处，作为BL分子的一部分存在的底物序列(底物1a)自身用FAM荧光团和淬灭剂标记。可由Dz2在它释放和活化之后裂解的底物序列(底物2)用TxR荧光团和淬灭剂标记。因此，两个裂解事件可通过观察来自两个荧光团发射波长的荧光信号来分开监测。顶部图概述了来自FAM荧光团的荧光信号，而底部图概述了来自TxR荧光团的荧光信号。对于准环独立存在的反应E(‘仅阻断剂’，以具有三角形符号的线显示)和在缺乏装配促进剂的部件酶存在下的反应F(‘存在部件酶(无AF1)’，以具有圆圈符号的线显示)，不存在对底物1a的裂解，并且因此，FAM信号不增加。此外，在这些反应期间，TxR信号不存在显著增加，从而指示Dz2在与BL复合时是非活性的。这是相较于分别对应于仅含有两种荧光标记的底物序列的反应A和C的FAM和TxR的阴性对照(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示。然而，对于MNA酶的装配促进剂存在的反应G(‘部件酶+存在AF1’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)，FAM信号存在即刻增加，从而指示BL中的底物1a已被裂解。这也导致TxR信号逐渐增加，从而指示Dz2现已自BL释放，并且裂解底物2。这是相较于分别对应于反应B和D的FAM和TxR的阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应分别含有与反应G中所存在相同的浓度的底物1a和裂解底物1a的MNA酶(对于FAM)以及底物2和裂解底物2的MNA酶(对于TxR)。
实施例11
以下实施例说明：
(i)通过与两种互补阻断寡核苷酸(BL)BL(A)和BL(B)杂交使两种独立DNA酶Dz(A)和Dz(B)失活
(ii)在能够裂解BL(A)和BL(B)的底物部分，从而导致Dz(A)和Dz(B)的释放的活性MNA酶存在下，两种独立DNA酶Dz(A)和Dz(B)随后活化。
-寡核苷酸
BL(A)(SEQ ID NO:6；C4Sub45(22:23))主要由以下组成：(i)与Dz(A)(SEQ ID NO:7；DzK(8:7))的5’区域互补的5’端；(ii)由底物1a组成的中心部分，所述底物1a与底物1的序列(SEQ ID NO:3，Sub45)相同，但缺乏5’末端的‘A’核苷酸和3’末端的‘GAA’核苷酸；和(iii)与Dz(B)(SEQ ID NO:8；Dz6(8:7))的3’区域互补的3’端。BL(B)(SEQ IDNO:9；C4Sub45T(21:24))主要由以下组成：(i)与Dz(B)的5’区域互补的5’端；(ii)由底物1b组成的中心部分，所述底物1b与底物1的序列相同，但缺乏5’末端的‘AC’核苷酸和3’末端的‘GAA’核苷酸；和(iii)与Dz(A)的3’区域互补的3’端。
在这一实施例中，BL(A)和BL(B)的5’端和3’端被设计成与Dz(A)和Dz(B)的5’端和3’端杂交，由此形成含有由两个BL分子保持在一起的两种非活性DNA酶的准环状结构(如图1图iii)中所概述)。由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:33，TFRCA4/45-P；和部件酶B，SEQ IDNO:34TFRCB5/45-P)和装配促进剂(AF1，SEQ ID NO:35AF-TFRC)组成的MNA酶(Mz1)能够裂解BL(A)的底物1a部分和BL(B)的底物1b部分，从而导致自准环结构释放Dz(A)和Dz(B)。Dz(A)裂解底物A(SEQ ID NO:5，Sub 2)，所述底物A在这一实施例中用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)在3’端标记。Dz(B)裂解底物B(SEQ ID NO:11，Sub 6)，所述底物B在这一实施例中用得克萨斯红部分在它的5’端标记以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分在它的3’端标记。
以下自5’至3’列出以上寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分DNA酶互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶或部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示DNA酶中与BL分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E、F以及G被设置成含有如表14中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图1图iii)中说明的结构。对于反应E、F和G，最初使BL分子(BL(A)、BL(B))与DNA酶(Dz(A)和Dz(B))一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表14
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在48℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)和通道3(TxR)中同时测量荧光信号以分别监测FAM和得克萨斯红，并且被编程成每5秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计40分钟。
-结果
图15图ii)显示由存在两种DNA酶的准环得到的结果。在这一情况下，底物序列(对于BLA为底物1a并且对于BLB为底物1b)保持未标记。可由Dz(A)在它释放和活化之后裂解的底物序列(底物A)用FAM荧光团和淬灭剂染料标记，而可由Dz(B)在它释放和活化之后裂解的底物(底物B)用TxR荧光团和淬灭剂标记。因此，两个裂解事件可通过观察来自两个荧光团发射波长的荧光信号来分开监测。顶部图概述了来自FAM荧光团的荧光信号，而底部图概述了来自TxR荧光团的荧光信号。对于当准环独立存在时的反应E(‘仅阻断剂’，以具有三角形符号的线显示)以及准环和部件酶存在但无AF1的反应F(‘存在部件酶(无AF1)’，以具有圆圈符号的线显示)，不存在对底物1a或底物1b的裂解，并且因此，FAM或TxR信号极少增加甚至不增加，从而指示Dz(A)与Dz(B)两者在与完整BL分子复合时均是非活性的。这是相较于分别对应于仅含有相同荧光标记的底物A和底物B序列的反应A和C的FAM与TxR两者的阴性对照(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示。对于含有准环、部件酶和AF1的反应G(‘部件酶+存在AF1’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)，来自FAM荧光团与TxR荧光团两者的信号均存在逐渐增加，从而指示Dz(A)与Dz(B)两者均自准环释放，并且现在正裂解它们的相应底物。这是相较于分别对应于反应B和D的FAM和TxR的阳性对照(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应分别含有与反应G中所存在相同的浓度的底物A和Dz(A)(对于FAM)以及底物B和Dz(B)(对于TxR)。
实施例12
以下实施例说明通过与准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例1中所说明。然而，在这一实施例中，存在两种环，各自含有i)能够裂解相对环的BL内存在的底物的DNA酶和ii)含有两种邻近的独立底物的BL。存在于两种准环中的第一底物(底物1)序列由MNA酶(Mz1)在靶标装配促进剂(AF1)存在下裂解。两种准环各自含有能够由并入相对环中的DNA酶(分别是Dz2或Dz3)裂解的第二底物序列(底物2a或底物3a)。通过存在两个BL分子来使两种DNA酶保持呈非活性。由活性Mz1裂解任一环上的底物1都导致先前非活性DNA酶的释放以及随后再活化。因为每一DNA酶能够裂解相对环BL，所以这一初始活化也触发两种环之间的BL裂解事件的指数级联(示意性描绘于图16图i)中)，并且相较于单一准环的裂解，增加了DNA酶活化的速度。这将导致信号放大。
-寡核苷酸
在本实施例中，环A由BLA(SEQ ID NO:36；C(R15a)Sub45_2)组成，所述BLA主要由以下各物组成：(i)与Dz3(SEQ ID NO:37；Dz6(9:9))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1与底物2a两者的邻近序列组成的中心部分，利用BLA，通过使BLA与Dz3预先杂交，来阻断Dz3的活性。环B由BLB(SEQID NO:38；C(R16d)Sub45_6)组成，所述BLB主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:26；Dz2(9:8))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1与底物3a两者的邻近序列组成的中心部分，所述底物3a与底物3的序列(SEQ ID No:11；Sub6)相同，但缺乏5’末端的‘A’核苷酸和3’末端的‘G’核苷酸。利用BLB，通过使BLB与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:33，TFRCA4/45-P；和部件酶B，SEQ ID NO:34TFRCB5/45-P)和装配促进剂靶标(AF1，SEQ ID NO:35AF-TFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BLA或BLB的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz3或Dz2中任一种或两种的释放，从而允许它们分别作用于BLB或BLA。Dz3也可作用于不作为准环的组分的底物3。在这一实施例中，这一独立底物3用FAM部分在5’端以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BLA中与一部分Dz3互补的区域和BLB中与一部分Dz2互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz3和Dz2中分别与BLA和BLB分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C和D被设置成含有如表15中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图16图i)中说明的结构。对于所有反应，最初使BL和DNA酶一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表15
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在50℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计100分钟。
-结果
图16图ii)显示了比较当存在一种DNA酶准环与存在两种DNA酶准环时的荧光信号的结果。在这些反应中，用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物3可由Dz3裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz3的释放和活化。对于底物3和部件酶存在并且对于反应A仅有准环A(‘仅环A，无AF1’，以具有方形符号的线显示)，或对于反应C有准环A与B两者(‘环A和B，无AF1’，以含有三角符号的线显示)的反应A和C，存在对底物3的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间增加极少。这指示在不存在MNA酶装配促进剂(AF1)来触发MNA酶对底物1的裂解的情况下，DNA酶在与BL复合时是非活性的。反应B与反应A含有相同组分，但添加MNA酶装配促进剂(‘仅环A，存在AF1’，具有菱形符号的线)，并且产生初始迟滞期，随后FAM信号随时间逐渐增加，最终在约90分钟接近反应时间结束时到达平台期。反应D与反应C含有相同组分，但添加MNA酶装配促进剂(‘环A和B，存在AF1’，含有圆圈符号的线)，并且产生初始迟滞期，随后FAM信号快速增加，在约40分钟时到达平台期，从而指示交叉催化反馈级联在两种环存在时发生，此增加了Dz3活化的速度并因此增加了底物3的裂解速度。
实施例13
以下实施例说明如最初于实施例12中概述的交叉催化DNA酶准环级联。然而，在这一实施例中，以剂量下降滴定MNA酶装配促进剂的浓度以确定级联的高于背景的检测限，并且说明在所有装配促进剂浓度下，信号呈现指数放大。然而，环A和环B均存在(示意性描绘于图16图i中))，荧光标记的底物3则被荧光标记的底物2替换，所述底物2由Dz2在它自环B释放和活化之后裂解。
-寡核苷酸
在本实施例中，环A由BLA(SEQ ID NO:36；C(R15a)Sub45_2)组成，所述BLA主要由以下各物组成：(i)与Dz3(SEQ ID NO:40；Dz6(9:8))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1(SEQ ID NO:3；Sub45)与底物2a两者的邻近序列组成的中心部分，所述底物2a与底物2(SEQ ID No:5；Sub2)相同，但缺乏5’末端的‘AGG’核苷酸。利用BLA，通过使BLA与Dz3预先杂交，来阻断Dz3的活性。环B由BLB(SEQ ID NO:38；C(R16d)Sub45_6)组成，所述BLB主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:26；Dz2(9:8))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1与底物3a两者的邻近序列组成的中心部分。利用BLB，通过使BLB与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:33，TFRCA4/45-P；和部件酶B，SEQ ID NO:34TFRCB5/45-P)和装配促进剂靶标(AF1，SEQ ID NO:35AF-TFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BLA或BLB的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz3或Dz2中任一种或两种的释放，从而允许它们分别作用于BLB或BLA，或对于Dz2而言，作用于独立底物2，所述底物在这一实施例中用FAM部分在5’端以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分在3’端进行末端标记的。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BLA中与一部分Dz3互补的区域和BLB中与一部分Dz2互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz3和Dz2中分别与BLA和BLB分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表16中所列的以下寡核苷酸片段，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图16图i)中说明的结构。对于所有反应，最初使BL和DNA酶一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表16
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在48.5℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计140分钟。
-结果
图16图iii)显示了在MNA酶装配促进剂滴定下获得的来自两种DNA酶准环的荧光信号。此处，可由Dz2裂解的底物2用FAM荧光团和淬灭剂标记，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz2的释放和活化。对于每一反应：反应A(‘环A和B，1nM AF1’，以具有菱形符号的线显示)、反应B(‘环A和B，500pM AF1’，以含有三角形符号的线显示)、反应C(‘环A和B，250pM AF1’，含有圆圈符号的线)、反应D(‘环A和B，100pM AF1’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)、反应E(‘环A和B，25pM AF1’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)以及反应F(‘环A和B，无AF1’，含有方形符号的线)，存在由荧光的小幅线性增加组成的初始迟滞期，随后FAM信号急剧增加(指示信号放大的指数期)，此后，它到达平台期。每一反应经历的指数期的时间与MNA酶装配促进剂的浓度相关，其中反应A最早经历指数期，随后依序是反应B、C、D和E。缺乏靶标装配促进剂的对照反应F不产生信号，直至在所有含有装配促进剂的反应已产生信号之后，由此允许区别具有最低靶标AF1浓度的反应与缺乏靶标AF1的反应。
实施例14
实施例14说明了如早先于实施例9中所概述，使用引物来合成DNA酶分子。然而，在这一实施例中，引物最初是作为MNA酶底物的组分以非活性形式存在(如图12图iii中所描绘)。当靶标装配促进剂(AF1)存在时，MNA酶(Mz1)是具有活性的，并且可裂解它的底物，从而产生对应于底物的5’端和3’端的两个裂解片段(裂解的底物)。5’端现含有新的3’末端，由于存在2’3’环磷酸基团，所述新的3’末端仍然无法由聚合酶延伸。T4多核苷酸激酶(T4PNK)是可催化自核酸的3’末端移除磷酸基团的酶。在T4PNK存在下，2’3’环磷酸自裂解的MNA酶底物移除，并且因此，引物现在是活性引物。在图17图ii)中概述的这一反应中，存在由包含部分DNA酶的BL部分组成的发夹状分子，所述部分DNA酶含有一个底物结合臂和约一半的催化核心序列。这一部分催化核心也含有失活的突变碱基。在聚合酶存在下，它能够使用Dz模板作为复制模板来延伸这一序列，由此使在发夹分子的3’端的非活性DNA酶的序列完整。然而，由于核心区域中的突变，即使在发夹打开时，DNA酶也仍然是非活性的。在这一实施例中，发夹环由形成切口酶的部分识别序列的核苷酸组成。
当通过MNA酶底物裂解与T4PNK活性两者来活化引物时，所述引物与发夹的环序列杂交，并且在它的3’端由链置换聚合酶使用Dz模板链作为复制模板进行延伸。引物延伸导致合成DNA酶的一个新的并且完整的拷贝。引物的延伸还使双链切口酶识别位点完整。切口酶可识别这个位点，并且在上游引物与下游DNA酶序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物，所述引物由聚合酶延伸以合成另一DNA酶拷贝，并且自Dz模板置换预先存在的拷贝。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生若干能够裂解自身的底物的活性DNA酶分子。
-寡核苷酸
由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:41，TFRCA4/2-P；和部件酶B，SEQ ID NO:42TFRCB5/2-P)和装配促进剂(AF1)靶标(SEQ IDNO:35AF-TFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解底物1(SubK1(14:12)，SEQ ID NO:43)。在这一实施例中，SubK1(14:12)用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)在3’端标记。利用‘部分阻断的’发夹状Dz模板(SEQ ID NO:44；hp(R22a)ADz45)，提供了待合成的能够裂解底物2(Sub45，SEQ ID NO:3)的DNA酶的模板。在这一实施例中，Sub45用Quasar 670(“Q670”)部分在5’端标记以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)在3’端标记。将自‘部分阻断的’发夹状Dz模板合成的DNA酶的催化活性与相应阳性对照Dz(SEQ ID NO:45；Dz45(9:9))的催化活性相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。斜体的碱基是指发夹状DNA酶结构内的DNA酶序列。加下划线的碱基表示在引物与发夹状DNA酶之间具有互补性的区域。突出显示的碱基表示部分切口酶识别位点。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表17中所列的以下寡核苷酸、聚合酶、T4PNK和切口酶，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图17图ii)中说明的结构。
表17
寡核苷酸是自IDT或Biosearch Technologies购买。聚合酶Bst 2.0warm start、切口酶Nt.AlwI以及T4PNK都是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)、200μM dNTP(Bioline)和无核酸酶的水(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在51℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)和通道4(Q670)上测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计154分钟。
-结果
图17图iii)说明由图17图ii)中描绘的策略达成的荧光信号。可由活性MNA酶裂解的底物1用FAM荧光团和淬灭剂部分标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。可由合成的DNA酶裂解的底物2用Q670荧光团和淬灭剂部分标记。所述图(Q670)概述了来自这个Q670荧光团的荧光信号。对于反应A(‘无PNK，无AF1’，以具有方形符号的线显示)和反应C(‘存在PNK，无AF1’，以具有三角形符号的线显示)，不存在AF1来装配活性MNA酶。因此，不存在FAM信号增加，从而指示无底物1裂解，以及不存在Q670信号增加，从而指示不存在活性DNA酶被合成用来裂解底物2。这一Q670信号是相较于含有阴性对照的反应E(‘阴性对照’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)来显示，所述反应E仅含有底物2。
对于反应B(‘无PNK，10nM AF1’，以具有菱形符号的线显示)和反应D(‘存在PNK，10nM AF1’，以具有圆圈符号的线显示)，存在AF1，从而导致形成活性MNA酶。因此，FAM信号存在逐渐增加，从而指示底物1正由MNA酶裂解。在短暂延迟之后，反应D的Q670信号接着逐渐增加，从而指示T4PNK正自裂解的底物1移除磷酸基团，从而允许它充当引物，并且导致随后裂解底物2的DNA酶的合成。这一Q670信号是相较于含有阳性对照的反应F(‘阳性对照’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)来显示，所述反应F由底物2和与MNA酶AF1的浓度相同浓度的游离阳性对照DNA酶组成。反应D的信号平台期快于阳性对照的平台期，从而指示在反应时间期间合成了比阳性对照中提供的DNA酶多的DNA酶。反应B的Q670信号不存在增加，因为它不含有T4PNK酶，从而指示裂解的底物1不能接着充当引物，除非它的3’末端被修饰。
实施例15
实施例15说明如最初于实施例9中所述，使用引物来直接活化DNA酶分子。然而，本实施例具体地说明在改为含有不完整并且非活性的DNA酶序列的发夹状分子下发生的特异性改进。所述实施例还说明相较于使用反义Dz模板，在使用发夹状分子下发生的速度改进。比较图19图i)中描绘的四种不同分子复合物。第一种(A部分)是‘完整’发夹状Dz，如最初于实施例9中所述。第二种(B部分)称为‘完全阻断的’发夹状Dz模板，因为BL部分含有缺乏催化核心序列的四个核苷酸的DNA酶序列，并且这一BL阻断可由聚合酶复制以产生活性DNA酶的反义DNA酶模板。在第三种中，‘部分阻断的’发夹状Dz模板(C部分)中，BL部分含有部分DNA酶，所述DNA酶含有一个底物结合臂和约一半的催化核心序列。催化核心在一个区域中还含有致使通过BL的延伸形成的DNA酶催化失活的失活性突变碱基。C部分的BL阻断可由聚合酶复制以产生活性DNA酶的反义DNA酶模板。在聚合酶存在下，使用Dz模板作为复制模板，BL能够延伸这个序列，然而，由于核心区域中的突变，当发夹打开时，无活性DNA酶暴露出来。
对于‘完全阻断的’发夹状Dz模板分子与‘部分阻断的’发夹状Dz模板分子两者，Dz模板(ASDz)序列含有活性DNA酶序列的完整互补序列，包括核心区域中的分别在‘完全’和‘部分’阻断的发夹Dz模板中的BL中缺乏或突变的核苷酸的互补序列。对于所有三种发夹状分子，连接BL和DNA酶序列或其互补序列的发夹环由形成切口酶的部分识别序列的核苷酸组成。最终复合物(D部分)是邻近于引物结合位点和切口酶的部分识别序列的未阻断的反义DNA酶序列。在这一复合物中，不存在最初存在并且不形成发夹的BL序列。
当引物存在时，它与引物结合区域(所述区域是三种发夹状结构的环序列)杂交，并且在它的3’端由链置换聚合酶延伸。引物延伸导致通过使用BL(A部分)或反义Dz模板序列作为模板(B、C和D部分)合成含有催化活性所需的完整序列的新DNA酶。引物的延伸还使双链切口酶识别位点完整。切口酶可识别这个位点，并且在上游引物与下游DNA酶序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物，所述引物由聚合酶延伸以合成另一完整的DNA酶序列，并且自BL(A部分)或反义Dz模板(B、C和D部分)置换预先存在的DNA酶。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生若干活性DNA酶分子。‘完全阻断的发夹状Dz’和‘部分阻断的发夹状Dz’分子以及‘未阻断的Dz模板’的特异性改进主要是由于在活性DNA酶存在于反应中之前，对引物延伸与切口酶活性两者的绝对需求。假定主要发生‘完全阻断的发夹状Dz’和‘部分阻断的发夹状Dz’的速度改进超过‘未阻断的Dz模板’的速度，因为当发夹呈它们的初始闭合构象时，完全和部分阻断的Dz模板与相对BL链杂交，而当发夹呈打开构象时，与相对的新合成的Dz链(引物的延伸)杂交。这使Dz模板链螯合新合成的单链Dz分子的能力最小，因为Dz模板始终呈双链构造。
-寡核苷酸
利用了能够直接裂解底物(Sub45，SEQ ID NO:3)或合成裂解所述底物的DNA酶的‘完整’发夹状Dz(SEQ ID NO:31；hp(R6b)Dz45)、‘完全阻断的’发夹状Dz模板(SEQ ID NO:46；hp(R8b)ADz45)、‘部分阻断的’发夹状Dz模板(SEQ ID NO:47；hp(R11b)ADz45)以及未阻断的Dz模板(SEQ ID NO:48；(R15a)-Dz45)。在本实施例中，Sub45用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“BHQ1”)在3’端标记。引物1(SEQ ID NO:32；PR(R6)Dz45(10))被用于活化‘完整’发夹状Dz和合成DNA酶的其它拷贝。引物2(SEQ IDNO:49；PR(R8b)Dz45(14))被用于自‘完全阻断的发夹状Dz模板’和‘部分阻断的发夹状Dz模板’以及自‘未阻断的Dz模板’合成DNA酶的拷贝。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。斜体的碱基是指发夹状DNA酶结构内的DNA酶序列。加下划线的碱基表示在引物与发夹状DNA酶或反义DNA酶模板之间具有互补性的区域。加阴影的碱基表示部分切口酶识别位点。加框的碱基表示对应于DNA酶的催化核心的碱基。
-反应组分
反应A、B、C、D、E、F、G以及H被设置成含有如表18中所列的以下寡核苷酸片段、聚合酶和切口酶，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图19图i)中说明的结构。
表18
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。聚合酶Bst 2.0warm start和切口酶Nt.AlwI是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)、200μM dNTP(Bioline)和无核酸酶的水(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在54℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计148分钟。
-结果
图19图ii)说明由图19图i)中描绘的策略达成的荧光信号。可由DNA酶在它活化和/或合成之后裂解的底物序列用FAM荧光团和淬灭剂染料标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。对于分别含有‘完整’发夹状Dz分子(‘结构A-无PR’，以具有方形符号的线显示)和(‘结构A-存在PR’，以具有菱形符号的线显示)的反应A和B，FAM信号存在即刻增加，此对于两种反应而言几乎是相同的。这指示这一结构在这些条件下缺乏特异性，因为信号是在不存在引物下产生的。对于分别含有‘完全阻断的’发夹状Dz模板分子(‘结构B-无PR’，以具有三角形符号的线显示)和(‘结构B-存在PR’，以具有圆圈符号的线显示)的反应C和D，含有引物的反应D的信号存在即刻并且快速的增加，而缺乏引物的反应C的信号存在慢得多的逐渐增加。这指示已对‘完整’发夹状Dz结构的特异性加以改进，因为引物是显著增加所产生的信号所需的，然而，仍然存在一定非引物依赖性活性。
对于分别含有‘部分阻断的’发夹状Dz模板分子(‘结构C-无PR’，含有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)和(‘结构C-存在PR’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)的反应E和F，不存在引物的反应E的信号不存在增加，但含有引物的反应F的信号存在即刻并且快速的增加。因此，‘部分阻断的’发夹状Dz模板对‘完整’和‘完全阻断的’发夹状Dz模板分子的特异性进行改进，因为不存在非引物依赖性信号。最后，对于分别含有‘未阻断的’Dz模板(‘结构D-无PR’，含有具有一个垂直相交线的符号的线)和(‘结构D-存在PR’，含有由实心黑方形组成的符号的线)的反应G和H，不存在引物的反应G的信号不存在增加，但含有引物的反应H的信号存在逐渐增加。‘未阻断的’Dz模板与‘部分阻断的’发夹状Dz模板结构含有相同特异性，但在引物存在下不像‘部分阻断的’发夹状Dz模板结构那样快速地产生信号。这是因为新合成的DNA酶可与空反义Dz模板再杂交，从而不可避免地减缓反应。这似乎不在‘部分阻断的’发夹状Dz模板下发生，因为Dz模板自身在发夹结构内被阻断，并且始终保持双链。
实施例16
实施例16说明通过引物与BL分子杂交来使引物失活，所述引物与所述BL分子两者是通过非互补环连接以形成发夹结构，如图23图i)中所描绘。所述分子最初是以‘部分’发夹状引物形式提供，其中仅存在一部分引物序列。在聚合酶存在下，可使用BLA作为模板来延伸分子的3’末端以完成引物序列的合成。发夹状引物的BLA含有MNA酶的底物，以使MNA酶在它的靶标装配促进剂存在下，可裂解BL内存在的底物，从而导致引物自BL释放，使引物具有活性。如最初于实施例15中所述，也存在由BLB部分组成的‘部分阻断的’发夹状Dz模板，所述BLB部分由含有一个底物结合臂和约一半的催化核心序列的部分DNA酶组成。这一部分催化核心也含有失活性突变碱基。在聚合酶存在下，能够使用Dz模板(ASDz)作为复制模板来延伸BLB，由此使在发夹分子的3’端的非活性DNA酶的序列完整。然而，由于核心区域中存在突变，即使当发夹打开时，DNA酶也是非活性的。
一旦具有活性，引物即可起作用以与‘部分阻断的’发夹状Dz模板的环杂交，并且在它的3’端由链置换聚合酶延伸，如最初于实施例中9所述。引物延伸导致通过使用‘部分阻断的’发夹状Dz模板序列作为复制模板来合成DNA酶的一个新的并且完整的拷贝。引物的延伸还使双链切口酶识别位点完整。切口酶可识别这个位点，并且在上游引物与下游DNA酶序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物，所述引物由聚合酶延伸以合成另一DNA酶拷贝，并且自Dz模板置换预先存在的拷贝。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生若干能够裂解它们自身的底物的活性DNA酶分子。
-寡核苷酸
利用了‘部分阻断的’发夹状Dz模板(SEQ ID NO:47；hp(R11b)ADz45)，所述模板提供了待合成的能够裂解底物2(Sub45，SEQ ID NO:3)的Dz2的模板。在本实施例中，Sub45用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端标记。一旦由聚合酶延伸，并且随后由MNA酶(Mz1)裂解，部分发夹引物(SEQ ID NO:50；hpPR(R15h)Sub2)即用于活化和合成Dz2的其它拷贝。Mz1由部件酶A(KrasA4/2-P，SEQ ID:51)、部件酶B(KrasB5/2-P，SEQ ID:52)和装配促进剂1(‘AF1’，AF-Kras，SEQ ID:53)组成。对裂解的发夹引物引发新Dz2分子的合成的能力与非发夹状线性引物(PR(R8b)Dz45(14)，SEQ ID:49)的能力进行比较。还对自发夹状模板合成的Dz2的催化活性与相应非发夹状阳性对照Dz2(SEQ ID NO:4；Dz45(9:10))的催化活性进行比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。斜体的碱基是指‘部分阻断的’发夹状DNA酶模板结构内的部分DNA酶序列和发夹状引物结构内的引物序列。加下划线的碱基表示在引物与‘部分阻断的’发夹状Dz模板之间具有互补性的区域。突出显示的碱基表示部分切口酶识别位点。加框的碱基表示对应于部件酶和DNA酶的催化核心的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表19中所列的以下寡核苷酸片段、聚合酶和切口酶，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图23图i)中说明的结构。
表19
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。聚合酶Bst 2.0warm start(3’→5’外切)和切口酶Nt.AlwI是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)和无核酸酶的水(Ambion)。反应C-F还含有200μM dNTP(Bioline)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在54℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计105分钟。
-结果
图23图ii)说明由图23图i)中描绘的策略达成的荧光信号。可由Dz2在它自‘部分阻断的’发夹状Dz模板合成之后裂解的底物2用FAM荧光团和淬灭剂染料标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。对于‘部分阻断的’发夹状Dz模板独立存在(反应C，‘’仅‘部分阻断的’发夹模板’，以具有三角形符号的线显示)或‘部分阻断的’发夹状Dz模板与发夹状引物一起存在但无AF1(反应E，‘’部分阻断的发夹状模板+发夹引物，无AF1’，以具有由一个垂直相交线和两个斜相交线组成的符号的线显示)的反应C和E，信号存在极少增加，从而指示引物极少延伸甚至不延伸，Dz2随后极少合成甚至至不合成，并且因此底物2极少裂解甚至不裂解，以及相应的FAM信号极少增加甚至不增加。这是相较于含有阴性对照的反应A(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示，所述反应A仅含有相同荧光标记的底物2。
对于活性线性引物存在的反应D(‘’部分阻断的’发夹状Dz模板+线性引物’，含有圆圈符号的线)，信号存在快速增加，在约10分钟内快速到达平台期。对于含有发夹状引物和AF1的反应F(‘’部分阻断的’发夹状Dz模板+发夹状引物，存在AF1’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)，信号存在逐渐增加，在约60分钟时到达平台期。对于反应D与F两者，信号增加指示引物正在使用‘部分阻断的’发夹状Dz模板作为复制模板下进行延伸，并且导致通过聚合酶和切口酶的协同作用合成活性DNA酶。由于在BL已由MNA酶裂解之后，引物与它的BL分离需要时间，故由发夹状引物活化产生的信号较慢。来自反应D和F的信号是相较于含有阳性对照的反应B(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，反应B由相同浓度的底物2和游离阳性对照Dz2组成。来自反应D的信号比反应B的信号略快地完成，从而说明自20nM线性引物合成Dz2是在比阳性对照中相同浓度的Dz2的催化活性快的速率下进行。
实施例17
以下实施例说明通过与准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例1中所说明。然而，在本实施例17中，三种不同底物序列存在于BL内。由活性MNA酶裂解底物1、底物2或底物3导致先前非活性DNA酶的释放以及随后再活化(示意性描绘于图20图i中))。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:54；C(R19b))主要由以下各物组成：(i)与Dz4(Dz45(9:10)，SEQ ID NO:4)的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且相当于底物1、底物2和底物3的邻近序列的中心部分。利用BL，通过使BL与Dz4预先杂交，来阻断Dz4的活性。由部件酶(部件酶1A，SEQ ID NO:56，TFRCA4/77-P；和部件酶1B，SEQ ID NO:57；TFRCB5/55-P)和装配促进剂靶标AF1(SEQ ID NO:35AF-TFRC)组成的Mz1被用于裂解BL的底物1部分。由部件酶(部件酶2A，SEQ ID NO:58，KrasA4/6-P；和部件酶2B，SEQ ID NO:59；KrasB5/6-P)和装配促进剂靶标AF2(SEQ ID NO:53AF-Kras)组成的Mz2被用于裂解BL的底物2部分。由部件酶(部件酶3A，SEQ ID NO:60，RO5A4/2-P；和部件酶3B，SEQ ID NO:61；RO5B5/2-P)和装配促进剂靶标AF3(SEQ ID NO:62；AF-RO5)组成的Mz3被用于裂解BL的底物3部分。对于Mz 1、2或3，靶标依赖性裂解事件促进Dz4的释放。Dz4可接着作用于底物4(SEQ ID NO:3；Sub45)，所述底物4在这一实施例中用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑(“IB”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz4互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心或部分催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz4中与BL分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表20中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图20图i)中说明的结构。对于所有反应，最初使BL和Dz4一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表20
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在48℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计105分钟。
-结果
图20图ii)显示了比较在BL内含有三种不同底物的DNA酶准环的荧光信号的结果。在这些反应中，一旦Dz4已自BL释放，用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物4即可由Dz4裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz4的释放和活化。对于分别存在准环(Dz4与BL杂交)、底物4、以及仅Mz1、Mz2或Mz3的部件酶的反应A(‘Mz1，无AF’，以具有方形符号的线显示)、反应C(‘Mz2，无AF2’，以具有三角形符号的线显示)和反应E(‘Mz3，无AF3’，以具有由一个垂直相交线和两个斜相交线组成的符号的线显示)，存在对底物4的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间存在最小限度增加。这指示Dz4在与含有三种单独邻近底物序列的BL复合时是非活性的。反应B与反应A含有相同组分，但添加MNA酶装配促进剂(‘Mz1，存在AF1’，具有菱形符号的线)。反应D与反应C含有相同组分，但添加MNA酶装配促进剂(‘Mz2，存在AF2’，含有圆圈符号的线)。反应F与反应E含有相同组分，但添加MNA酶装配促进剂(‘Mz3，存在AF3’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)。在反应B、D和F中的每一个中，FAM信号存在即刻增加，从而指示BL已被裂解，并且Dz4被释放并且可裂解底物4。反应B、D和F各自信号的增加是在约相同速率下发生，从而指示尽管BL的长度增加，但Dz4自BL释放只需要在BL的中间区域中的任何点处进行的单一裂解事件。
实施例18
以下实施例说明通过与准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例1中所说明。然而，在这一实施例中，BL内存在一种可由8:17MNA酶(Mz1)裂解的底物序列(底物1)，并且BL内存在另一可由10:23MNA酶(Mz2)裂解的底物(底物2)。底物1由两个部分组成，第一5’部分是底物1所特有的序列，而底物的另一3’部分是另外用作底物2的5’部分的序列。8:17MNA酶(Mz1)可识别和裂解底物1。因此，这一Mz1可被设计用来识别和裂解主要由一半8:17MNA酶底物和一半10:23MNA酶底物组成的序列。由Mz1裂解底物1或由Mz2裂解底物2分别导致先前非活性Dz3的释放以及随后再活化(示意性描绘于图20图iii中))。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:63；C(R14b)Sub1_2)主要由以下各物组成：(i)与Dz3(Dz6(8:7)，SEQ ID NO:8)的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且相当于底物1和底物2的邻近序列的中心部分。利用BL，通过使BL与Dz3预先杂交，来阻断Dz3的活性。由部件酶(部件酶1A，SEQ ID NO:65，PPIAA2/1-P；和部件酶1B，SEQ ID NO:66；PPIAB3/2(9))和装配促进剂靶标AF1(SEQ ID NO:67；AF-PPIA)组成的Mz1被用于裂解BL的底物1部分。由部件酶(部件酶2A，SEQ ID NO:51，KrasA4/2-P；和部件酶2B，SEQ ID NO:52；KrasB5/2-P)和装配促进剂靶标AF2(SEQ ID NO:53；AF-Kras)组成的Mz2被用于裂解BL的底物2部分。对于Mz1或Mz2，靶标依赖性裂解事件促进Dz3的释放。Dz3可接着作用于底物3(SEQID NO:11；Sub6)，底物3在这一实施例中用FAM部分在5’端以及用黑洞淬灭剂(“BHQ1”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz中与BL分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B和C被设置成含有如表21中所列的以下寡核苷酸，参照先前章节中所列的寡核苷酸和图20图iii)中说明的结构。对于所有反应，最初使BL和Dz3一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表21
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有50mM Tris(pH 9.0)缓冲液(自制)、无核酸酶的水(Ambion)和50mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在44℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每10秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计48分钟。
-结果
图20图iv)显示了比较含有底物1和底物2的DNA酶准环的荧光信号的结果，所述底物1和所述底物2含有共有序列以使它们可由8:17MNA酶(Mz1)或10:23MNA酶(Mz2)裂解。在这些反应中，用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物3可由Dz3裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz3的释放和活化。对于反应A(‘无AF’，以具有方形符号的线显示)，存在对底物3的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间最小限度增加。这指示Dz3在与BL复合时是非活性的。反应B与反应A含有相同组分，但添加8:17MNA酶装配促进剂AF1(‘存在AF1’，具有菱形符号的线)。反应C与反应A也含有相同组分，但添加10:23MNA酶装配促进剂AF2(‘存在AF2’，含有三角形符号的线)。对于反应B与反应C两者，FAM信号均存在即刻增加，从而指示BL已被裂解，并且Dz3被释放并可裂解底物3。反应B和C各自信号的增加是在约相同速率下发生，从而指示尽管BL的长度增加，但Dz自BL释放只需要在BL的中间区域中的任何点处进行的单一裂解事件。
实施例19
以下实施例说明通过与准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例1中所说明。然而，在本实施例19中，通过比较三种不同环(分别示意性描绘于图21图i)、ii)和iii)中的环A、B和C)来说明自催化信号放大。三种环各自包含能够裂解单独底物2的DNA酶(Dz2)和含有底物1的BL，所述底物1能够由MNA酶(Mz1)在它的靶标装配促进剂(AF1)存在下裂解。此外，环A的BL还含有邻近于底物1并且一旦Dz2已通过由Mz1裂解底物1来释放，即能够由Dz2裂解的另一底物2a。因此，来自环A的Dz2有可能以自催化方式进行反馈(即，裂解它先前所结合的相同BL)。环B的BL含有邻近于底物1，但不能够由Mz1或Dz2裂解的另一底物3。来自环C的BL仅含有单一底物，即底物1。因此，来自环B和C的DNA酶不可能以自催化方式进行反馈。当AF1存在时，含有环A的反应比含有环B和C的反应更快产生荧光信号，从而指示来自环A的Dz2正以自催化方式进行反馈以裂解BL中的底物2，并且由此活化更多Dz2。
-寡核苷酸
在本实施例中，来自环A的BL分子(BLA；SEQ ID NO:68；C(R22h))、来自环B的BL分子(BLB；SEQ ID NO:69；C(R31c))和来自环C的BL分子(BLC；SEQ ID NO:70；C(R31d))主要由与Dz2(SEQ ID NO:71；Dz77_55(8:9))的一部分互补的5’端和3’端组成。BLA也由连接所述5’端和3’端并且作为底物1与底物2a两者的邻近序列的中心部分组成，所述底物2a与底物2(Sub77_55，SEQ ID No:55)的序列相同，但缺乏3’末端的‘C’核苷酸。BLB也由连接所述5’端和3’端并且相当于底物1与底物3两者的邻近序列的中心部分组成。BLC也由连接所述5’端和3’端并且相当于底物1的序列的中心部分组成。对于每一环，利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:74，LTFRCA4/72；和部件酶B，SEQ ID NO:75；LTFRCB5/72)和装配促进剂(AF1，SEQ ID NO:76；AF-LTFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BLA、BLB或BLC的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于以单独的独立分子形式提供的底物2。在这一实施例中，独立底物2用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz中与BL中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表22中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图21图i)、ii)和iii)中说明的结构。对于所有反应，最初使BL和Dz2一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表22
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在54℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计154分钟。
-结果
图21图iv)显示了比较来自环A、B和C各自的荧光信号的结果。用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物2可由Dz2裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz2的释放和活化。对于反应A(‘环A，无AF1’，以具有方形符号的线显示)、反应C(‘环B，无AF1’，以具有三角形符号的线显示)和反应E(‘环C，无AF1’，具有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)，存在对底物2的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间极少增加。这指示对于反应A、C和E，Dz2通过分别与BLA、BLB和BLC杂交而完全保持呈非活性的。
对于反应B(‘环A，存在AF1’，以含有菱形符号的线显示)，存在初始迟滞期，随后FAM信号即刻增加，快速到达平台期。这个s形曲线指示FAM信号以指数方式累积，从而指示在来自环A的Dz2已最初通过Mz1裂解底物1而自它自身的BLA释放之后，它正进行反馈并裂解其它BLA分子中存在的底物2a。相比之下，反应D(‘环B，存在AF1’，含有圆圈符号的线)和反应F(‘环C，存在AF1’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)产生的FAM信号增加相当慢，从而指示无反馈发生，因为底物2a不存在于BLB和BLC(分别对于反应D和F)内。
实施例20
以下实施例说明通过与自催化准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶初始失活，如先前在实施例19中所说明。在本实施例20中，通过比较两个MNA酶靶标检测反应来说明信号放大；第一反应存在自催化环(图22图ii))，而第二反应不存在所述环(即仅MNA酶，图22图i))。在两个反应中，相同MNA酶(Mz1)被设计用来识别和结合相同靶标装配促进剂(AF1)，并且裂解以线性序列形式提供的已用荧光团和淬灭剂修饰的底物1，或在环的BL分子的中间区域内存在的底物1a。BL分子在它的5’端和3’端由与DNA酶(Dz2)杂交，从而导致Dz2的暂时失活的序列组成。BL还含有邻近于底物1a的第二底物序列(底物2a)，一旦Dz2已通过MNA酶裂解底物1而自BL释放，所述第二底物序列即能够由Dz2裂解。此外，底物2是以线性序列形式提供，所述底物已用荧光团和淬灭剂修饰以监测DNA酶裂解反应。当AF1存在时，含有自催化环的反应比含有单独MNA酶的反应更快产生荧光信号，并且除此之外，还可导致检测不能通过由单独MNA酶获得的信号观察的靶标浓度。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:68；C(R22h))主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:71；Dz77_55(8:9))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端的中心部分，所述中心部分是相当于底物1(Sub72，SEQ ID NO:72)的底物1a和与底物2的序列(Sub77_55，SEQ ID No:55)相同但缺乏3’末端的‘C’核苷酸的底物2a的邻近序列。利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
由部件酶(部件酶A，SEQ ID NO:74，LTFRCA4/72；和部件酶B，SEQ ID NO:75；LTFRCB5/72)和装配促进剂靶标(AF1，SEQ ID NO:76；AF-LTFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BL的底物1a部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于BL内存在的底物2a。MNA酶也可作用于不作为准环的组分的单独的独立底物1。在这一实施例中，这种独立底物1用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端进行末端标记。Dz2也可作用于不作为准环的组分的单独的独立底物2。在这一实施例中，这种独立底物2用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑淬灭剂部分(“IB”)在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz中与BL中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表23中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图22图i)和ii)中说明的结构。对于所有含有BL和Dz2的反应，最初使这两种寡核苷酸一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表23
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在52℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计154分钟。
-结果
图22图iii)显示了比较仅存在MNA酶相对于存在MNA酶和自催化环的荧光信号的结果。在仅有MNA酶的反应中，用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物1可由Mz1裂解，此可通过FAM的荧光变化来监测。对于含有Mz1以及自催化环的反应，用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物2可由Dz2裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz的释放和活化。
在反应A(‘仅Mz1，无AF1’，以具有方形符号的线显示)中，不存在对底物1的裂解，并且因此，FAM信号不随时间增加。这是因为在不存在靶标装配促进剂下，MNA酶不具有活性。反应B与反应A含有相同组分，但添加100pM MNA酶装配促进剂(‘仅Mz1，存在100pM AF1’，具有菱形符号的线)，并且导致FAM信号随时间缓慢线性增加，所述信号在反应时间期间未到达平台期。反应C与反应A含有相同组分，但添加10pM MNA酶装配促进剂(‘仅Mz1，存在10pM AF1’，含有三角形符号的线)，即便FAM信号在反应时间的过程里增加，也只是存在极少增加，从而指示极少底物1正被裂解。
在反应D(‘Mz1和环，无AF1’，以具有圆圈符号的线显示)中，FAM信号随时间存在逐渐但仅微小的增加，所述信号在反应的最后30分钟内开始增加。背景荧光水平高于仅有MNA酶的反应的荧光水平，从而指示底物2与环组分可能存在一定杂交，和/或底物2的淬灭效率小于底物1。信号在接近反应结束时增加可指示级联正开始在不存在MNA酶触发剂下起作用。反应E与反应D含有相同组分，但添加100pM MNA酶装配促进剂(‘Mz1和环，存在100pM AF1’，具有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线)，并且导致FAM信号快速并且呈指数增加，在约30分钟之后到达平台期。相较于含有相同MNA酶促进剂浓度但无环的反应B，FAM信号的这一增加明显更快，从而指示环的存在会导致信号放大并因此较快检测100pM靶标装配促进剂。反应F与反应D含有相同组分，但添加10pMMNA酶装配促进剂(‘MNA酶和环，存在10pM AF1’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)，并且存在初始迟滞期，随后FAM信号快速并且呈指数增加，在约120分钟之后到达平台期。相较于含有相同MNA酶促进剂浓度但无环的反应C，FAM信号的这一增加不仅明显更快，而且可领先于无靶标反应(反应D)检测。在这种情况下，环的存在导致信号放大，以使有可能领先于背景信号检测10pM靶标装配促进剂，从而指示环使MNA酶靶标检测的速度与灵敏度两者都增加。
实施例21
以下实施例说明通过与互补BL分子杂交来使DNA酶失活，其中DNA酶和BL是通过非互补发夹环(发夹状Dz2)来连接。在这一实施例中，BL还含有另一底物序列(底物1)，所述底物序列可由MNA酶(Mz1)在它的靶标装配促进分子(AF1)存在下识别和裂解。由Mz1裂解底物1导致先前非活性发夹状Dz2的释放以及随后再活化(示意性描绘于图3图i中))。
-寡核苷酸
在本实施例中，利用了能够裂解底物2(SEQ ID NO:5；Sub2)的发夹状Dz2(SEQ ID NO:77；hpBL(R3a)-Dz2_Sub6)。在这一实施例中，底物2用FAM部分在5’端以及用黑洞淬灭剂1(“BHQ1”)部分在3’端进行末端标记。由部件酶A(SEQ ID NO:58；KrasA4/6-P)、部件酶B(SEQ ID NO:59；KrasB5/6-P)和AF1(SEQ ID NO:53；AF-Kras)组成的Mz1被用于裂解发夹状Dz2分子内的底物1，并且由此产生活性Dz2。将活性Dz2的催化活性与相应非发夹状对照Dz2(SEQ IDNO:26；Dz2(9:8))的催化活性相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz2互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz2中与BL分子中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’端磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D和E被设置成含有如表24中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图3图i)中说明的结构。
表24
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在52℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计126分钟。
-结果
图3图ii)显示由Mz1活化发夹状Dz2的荧光信号的结果。在这些反应中，底物2用FAM荧光团和淬灭剂染料标记，并且可由活性Dz2裂解。可通过FAM的荧光变化来监测发夹状Dz2的释放和活化。对于反应C(‘仅发夹状Dz2’，以具有三角形符号的线显示)和反应D(‘发夹状Dz2+Mz1，无AF1’，以具有圆圈符号的线显示)，FAM信号存在极少增加甚至不存在增加，从而指示发夹状Dz2不能裂解底物2。这一信号是相较于仅含有相同荧光标记的底物序列的反应A(‘阴性对照’，以含有方形符号的线显示)来显示。
对于反应E(‘发夹状Dz2+Mz1，存在AF1’，以具有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线显示)，FAM信号随时间存在逐渐增加，在接近反应时间结束时到达平台期。这指示添加AF1产生活性Mz1，它能够接着裂解作为发夹状Dz2的一部分存在的底物1。Dz2组分接着变得具有活性，并且可裂解底物2，从而导致荧光信号增加。反应E的信号是相较于由与反应E相同的浓度的相应非发夹状Dz2组成的反应B(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)的信号来显示，并且所述反应B导致信号快速增加，在反应30分钟内到达平台期。由于Mz1裂解底物1，随后活化Dz2以及Dz2裂解底物2需要时间，故反应E的信号慢于反应B。
实施例22
以下实施例说明了将自催化DNA酶准环(先前在实施例19中说明)连接于固体表面。此处，准环的BL在它的3’末端用生物素部分修饰，并且连同DNA酶(Dz2)一起与已涂布抗生蛋白链菌素的二氧化硅微球体一起孵育。因此，BL和微球体通过生物素-抗生蛋白链菌素键彼此连接，并且Dz2与BL通过沃森-克里克碱基配对杂交(图24图i))。在孵育过程之后，微球体用缓冲液洗涤数次以移除任何未结合的寡核苷酸。剩余微球体群体含有栓系的自催化准环，并且当将微球体放置在具有MNA酶(Mz1)的溶液中时，可引发级联，所述MNA酶可在由它的靶标分子(AF1)装配之后裂解BL中存在的底物1。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL分子(SEQ ID NO:78；C(R22h)-Bio)主要由与Dz2(SEQ ID NO:71；Dz77_55(8:9))的一部分互补的5’区域和3’区域组成。邻近于在3’最末端处的Dz2结合区域，BL含有5个核苷酸的多聚腺苷酸尾，所述多聚腺苷酸尾不与Dz2互补，并且含有连接于3’末端的生物素部分。BL的连接5’端和3’端的中心部分包含底物1与底物2a两者的邻近序列，所述底物2a与底物2的序列(Sub77_55，SEQ ID No:55)相同，但缺乏3’末端的‘C’核苷酸。利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。由部件酶(部件酶A，SEQID NO:74，LTFRCA4/72；和部件酶B，SEQ ID NO:75；LTFRCB5/72)和装配促进剂(AF1，SEQ ID NO:76；AF-LTFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BL的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于BL内存在的底物2a或以单独的独立分子形式提供的底物2。在这一实施例中，独立底物2用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑淬灭剂(“IB”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示Dz中与BL中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Bio/指示3’端生物素化。
-反应组分
以含1％(w/v)固体的储存缓冲液(100mM硼酸盐，pH 8.5+0.01％BSA+0.05％20+10mM EDTA+≤0.1％NaN3)形式提供3μm的涂布抗生蛋白链菌素的二氧化硅微球体(Bangs Laboratories)。每个反应取出2μL微球体混悬液，并且在使用之前于1x PBST缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.3-7.5)、137mM氯化钠以及2.7mM氯化钾(Amresco)和0.05％Tween-20(Promega))中洗涤三次。简要地说，这涉及将微球体悬浮于100μL 1x PBST缓冲液中，随后在13000x g下离心30秒以形成微球体团粒。接着移除上清液，并且将微球体团粒再悬浮于新鲜的1x PBST缓冲液中。再重复这个过程两次，随后再悬浮于原始的每一反应2μL体积的新鲜1x PBST缓冲液中。接着将洗涤的微球体与100nM BL(C(R22h)-Bio)和75nM Dz2(Dz77_55(8:9))一起孵育。使孵育混合物一起在室温下预先杂交30分钟，随后于1xPBST缓冲液中再洗涤三次。
添加微球体孵育混合物至如表25中所列的以下寡核苷酸中，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图24图i)中说明的结构。
表25
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在54℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计148分钟。
-结果
图24图ii)说明了来自反应A和B的荧光信号。用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物2可由Dz2裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz2的释放和活化。对于反应A(‘无AF1’，以具有方形符号的线显示)，存在对底物2的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间仅略微增加。这指示Dz2通过与BL杂交而保持完全非活性的。对于反应B(‘存在AF1’，以含有菱形符号的线显示)，存在初始迟滞期，随后FAM信号随时间逐渐增加，从而指示Mz1正裂解底物1，导致Dz2自环释放，其中Dz2起作用以裂解环的BL内的底物2a或代之以裂解单独的荧光标记的底物2。来自反应B的荧光信号增加也指示在添加至两种反应中之前经过彻底洗涤的微球体群体含有栓系于微球体的准环，并且这些准环可以按与游离于溶液中的准环类似的方式起作用。
实施例23
实施例23说明了使用模板分子来指导由不同引物(引物2)引发的引物(引物1)的合成，如最初于图13图iii)中所描绘。然而，在这一实施例中，引物模板主要由发夹状结构组成，其中一条链含有邻近于RE识别位点合成新引物1的模板，而另一链与模板部分互补(图25图i))。这条部分互补的链在3’端含有错配碱基对以防止它像活性引物1一样起作用，并且还在序列的中心内具有另一错配以破坏它与部分阻断的发夹状Dz1模板的环内存在的引物1结合位点之间的潜在杂交。这个错配碱基对不影响它与发夹状引物模板中的引物1结合位点杂交，因为此时它存在于热力学稳定性更强的发夹结构内。因此，这条部分互补的链的唯一目的在于帮助防止新合成的引物1与其它引物模板再杂交，因为未使用的那些引物模板将保持闭合的发夹构象。发夹状引物模板结构的环链与引物2互补，以使得当引物2结合这个环时，引物2可由链置换聚合酶延伸，从而导致打开发夹以及合成完整RE识别位点与邻近引物1两者的同时进行。当切口酶存在时，它可识别完整RE识别位点，并且在上游引物2与下游引物1序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物2，所述引物由聚合酶延伸以合成另一引物1拷贝，并且自模板链置换预先存在的拷贝。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生若干活性引物1分子。
如最初于实施例15中所述，也存在由BL部分组成的‘部分阻断的’发夹状DNA酶模板，所述BL部分是含有一个底物结合臂和约一半的催化核心序列的部分DNA酶。这个部分催化核心也含有失活性突变碱基。在聚合酶存在下，使用Dz模板作为复制模板，BL的3’端能够延伸这一序列，由此使在发夹分子的3’端的非活性DNA酶的序列完整。然而，由于核心区域中存在突变，即使当发夹打开时，突变DNA酶也是呈非活性的。一旦合成以及自模板置换，引物1即可与‘部分阻断的’发夹状DNA酶模板结构的环杂交，并且在它的3’端由链置换聚合酶延伸，如最初于实施例9中所述。引物1延伸导致通过使用部分阻断的发夹状DNA酶模板作为复制模板来合成DNA酶的一个新的并且完整的拷贝。引物1的延伸还使双链切口酶识别位点完整。切口酶可识别这个位点，并且在上游引物1与下游DNA酶序列之间的区域处对新合成的链选择性切口。因此，切口产生新引物1，所述引物由聚合酶延伸以合成另一DNA酶拷贝，并且自Dz模板置换预先存在的拷贝。切口、聚合和置换的这一循环可接着自主发生以产生若干能够裂解它们自身的底物的活性DNA酶分子(描绘于图25图i中))。
-寡核苷酸
使用了发夹状引物模板(SEQ ID NO:79；hpPRF(R12b))提供通过引物2(SEQ ID NO:80；PR(R12b)PRF)的延伸来合成引物1(SEQ ID:49；PR(R8b)Dz45(14))的模板。‘部分阻断的’发夹状Dz1模板(SEQ IDNO:47；hp(R11b)ADz45)被用于提供待合成的能够裂解底物1(Sub45，SEQ ID NO:3)的Dz1的模板。在这一实施例中，Sub45用6-荧光素(“6-FAM”)部分在5’端标记以及用爱荷华黑淬灭剂(“IB”)部分在3’端标记。还将自发夹状Dz1模板合成的Dz1的催化活性与相应非发夹状阳性对照Dz1(SEQ ID NO:45；Dz45(9:9))的催化活性相比较。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。斜体的碱基是指‘部分发夹状’DNA酶模板结构内的DNA酶序列和发夹状引物模板内的引物1序列。加下划线的碱基表示在引物1序列与发夹状DNA酶模板之间具有互补性的区域。突出显示的碱基表示部分切口酶识别位点。加框的碱基表示对应于DNA酶的催化核心的碱基。
-反应组分
反应A、B、C、D、E、F、G以及H被设置成含有如表26中所列的以下寡核苷酸片段、聚合酶和切口酶，其中参照先前章节中的寡核苷酸和图25图i)中说明的结构。
表26
寡核苷酸是自IDT或Biosearch technologies购买。聚合酶Bst 2.0warm start(3’→5’外切)和切口酶Nt.AlwI是自New England Biolabs购买。所有反应都含有1x NEB缓冲液2(New England Biolabs)和无核酸酶的水(Ambion)。反应C-H还含有200μM dNTP(Bioline)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在52℃下在CFX96热循环仪中进行。在通道1(FAM)上测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计148分钟。
-结果
图25图ii)说明由图25图i)中描绘的策略达成的荧光信号。可由Dz1在它自‘部分阻断的’发夹状Dz模板合成之后裂解的底物1用FAM荧光团和淬灭剂染料标记。所述图(FAM)概述了来自这个FAM荧光团的荧光信号。对于‘部分阻断的’发夹状Dz模板独立存在的反应C(反应C，‘’仅部分阻断的’发夹状Dz模板-无PR’，以具有三角形符号的显示线)和将它与引物2放在一起的反应E(反应E，‘’仅部分阻断的’发夹状Dz模板-存在PR2’，以具有由一个垂直相交线和两个斜相交线组成的符号的线显示)，荧光信号存在极少增加甚至不存在增加，因为不存在引物1来引发Dz1的合成，并且因此，无底物1裂解。当‘部分阻断的’发夹状Dz模板具有发夹状引物模板时(反应F，‘’部分阻断的’发夹状Dz模板+发夹状引物模板-无PR’，以具有由两个斜相交线组成的符号的线显示)，荧光信号也存在极少增加甚至不存在增加，因为引物1不存在，并且不能被合成。反应C、E和F是相较于含有阴性对照的反应A(‘阴性对照’，含有方形符号的线)来显示，所述反应A仅含有相同荧光标记的底物1。
反应D(‘’仅部分阻断的’发夹状Dz模板-存在PR1’，含有圆圈符号的线)和反应G(‘’部分阻断的’发夹状Dz模板+hp引物模板-存在PR1’，含有由一个垂直相交线和一个水平相交线组成的符号的线)，两者均含有‘部分阻断的’发夹状Dz模板和引物1，其中反应G还包含发夹状引物模板。由于这些反应中存在引物1，故信号存在快速增加，在约20分钟内快速到达平台期，从而指示引物1正引发Dz1的合成，所述Dz1转而裂解底物1。在这两个反应之间，荧光信号极其类似，从而指示反应G中发夹状引物模板的存在不阻碍荧光信号。对于包含‘部分阻断的’发夹状DNA酶模板、发夹状引物模板和引物2的反应H(‘’部分阻断的’发夹状Dz模板+hp引物模板-存在PR2’，含有实心黑色方形符号的线)，存在初始迟滞期，随后信号逐渐增加，在约70分钟时到达平台期。因为引物2不能直接引发Dz1的合成，所以这指示引物2正结合发夹状引物模板，并且引发引物1的合成。因此，引物1可通过‘部分阻断的’发夹状Dz模板引发Dz1的合成，从而导致产生Dz1分子，接着裂解底物1。由于在引物1转而能合成Dz1之前，合成引物1需要时间，故来自反应H的信号慢于反应D和G的信号。来自反应D、G和H的信号是相较于含有阳性对照的反应B(‘阳性对照’，含有菱形符号的线)来显示，所述反应B由相同浓度的底物1和游离阳性对照Dz1组成。
实施例24
以下实施例说明通过与自催化准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例19中所说明。在本实施例24(描绘于图26图i中))中，说明了多路检测反应，其中将两种独立的自催化准环一起放在同一反应管中。通过由不同MNA酶裂解BL内存在的底物来引发各级联反应，所述MNA酶各自可在由它们的独特靶标序列介导的装配之后起作用。环A包含DNA酶(Dz2)和BLA。BLA在它的5’端和3’端由与一部分Dz2杂交，从而导致Dz2的暂时失活的序列组成。BLA还含有由底物1和底物2a的邻近序列组成的中间区域。底物1可由Mz1在它的靶标装配促进剂(AF1)存在下裂解。一旦Dz2已通过Mz1裂解底物1而自BLA释放，底物2a即能够由Dz2裂解。
环B包含DNA酶(Dz4)和BLB。BLB在它的5’端和3’端由与一部分Dz4杂交，从而导致Dz4的暂时失活的序列组成。BLB还含有由底物3和底物4a的邻近序列组成的中间区域。底物3可由Mz3在它的靶标装配促进剂(AF3)存在下裂解。一旦Dz4已通过Mz3裂解底物3而自BLB释放，底物4a即能够由Dz4裂解。为独立地监测各级联反应，还以已用不同荧光团和淬灭剂对标记的线性序列形式提供底物2和底物4以个别地监测分别由Dz2和Dz4达成的裂解。
-寡核苷酸
在本实施例中，BLA(SEQ ID NO:68；C(R22h))主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:71；Dz77_55(8:9))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且作为两个邻近底物序列底物1和底物2a的中心部分，所述底物2a相当于底物2(Sub77_55，SEQ ID No:55)，但缺乏3’末端的‘C’核苷酸。利用BLA，通过使BLA与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。由部件酶(部件酶1A，SEQ IDNO:74，LTFRCA4/72；和部件酶1B，SEQ ID NO:75；LTFRCB5/72)和装配促进剂靶标(AF1，SEQ ID NO:76；AF-LTFRC)组成的MNA酶(Mz1)被用于裂解BLA的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于BLA内存在的底物2a。
BLB(SEQ ID NO:81；C(R27a))主要由以下各物组成：(i)与Dz4(SEQ ID NO:82；Dz3(8:9))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且作为底物3和底物4a的邻近序列的中心部分，所述底物4a与底物4的序列(Sub3，SEQ ID No:83)相同。利用BLB，通过使BLB与Dz4预先杂交，来阻断Dz4的活性。由部件酶(部件酶3A，SEQ ID NO:84，RO5A4/56-P；和部件酶3B，SEQ ID NO:85；RO5B5/56-P)和装配促进剂靶标(AF3，SEQ ID NO:62；AF-RO5)组成的MNA酶(Mz3)被用于裂解BLB的底物3部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz4的释放，从而允许它作用于BLB内存在的底物4a。
Dz2和Dz4也都能分别作用于不作为准环的组分的单独的独立形式的底物2和底物4。在这一实施例中，独立底物2用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑淬灭剂(“IB”)部分在3’端进行末端标记。独立底物4用得克萨斯红(TR)部分在5’端以及用黑洞淬灭剂2(“BHQ2”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶和部件酶的催化核心。突出显示的碱基表示Dz中与BL中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基。/3Phos/指示3’磷酸化。
-反应组分
反应A、B、C、D、E以及F被设置成含有如表27中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图26图i)中说明的结构。对于所有含有BLA和Dz2和/或BLB和Dz4的反应，最初使各DNA酶和BL组合在室温下单独预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表27
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在52℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)和通道3(TxR)中测量荧光信号以分别监测FAM和得克萨斯红，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：全通道)，持续总计154分钟。
-结果
图26图ii)显示了比较当两种独立的自催化DNA酶准环单独或一起放置在反应管中时，来自它们的荧光信号的结果。用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物2可由Dz2裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz2的释放和活化。或者，底物4用TxR荧光团和淬灭剂标记，并可由Dz4裂解，并且因此可通过TxR的荧光变化来监测Dz4的释放和活化。图‘FAM’和‘TxR’分别概述了来自FAM荧光团和TxR荧光团的荧光信号。
在图FAM中，对于环A独立存在而不存在任何AF1的反应A(‘仅环A，无AF’，以具有方形符号的线显示)，最初存在对底物2的极少裂解，并且因此，在反应时间期间，FAM信号仅略微增加。这指示Dz2在准环复合物内保持呈非活性的。这是相较于反应E(‘环A+环B，无AF’，以具有由两个斜相交线和一个垂直相交线组成的符号的线显示)和反应G(‘环A+环B，存在AF3’，含有由一个垂直相交线和一个水平相交线组成的符号的线)来显示，所述两种反应在一个反应中一起含有环A和环B，并且AF都不存在(反应E)或仅AF3存在(反应G)。在环A独立存在并且AF1也存在的反应B(‘仅环A，存在AF1’，含有菱形符号的线)中，FAM信号存在略微滞后，随后即刻增加，快速到达平台期。这指示AF1装配Mz1，所述Mz1裂解底物1，并且由此触发Dz2活化和底物2(和底物2a)裂解事件的级联。这个信号是相较于环A与环B两者一起在一个反应中并且存在AF1的反应F(‘环A+环B，存在AF1’，含有由两个斜相交线组成的符号的线)的信号来显示。在反应A、E和G的信号之间以及在反应B和F的信号之间，FAM信号极其类似，从而指示环B的存在极少影响环A的活性，并且Dz4自环B释放在FAM通道中不产生信号，从而显示系统中不存在相互影响或非特异性。
在有关TxR的图中，对于环B独立存在而不存在任何AF3的反应C(‘仅环B，无AF’，以具有三角形符号的线显示)，存在极少对底物4的裂解，并且因此，TxR信号极少增加，仅在接近反应时间结束时开始略微增加。这指示Dz4在准环B复合物内保持呈非活性的。这是相较于反应E和F来显示，这两种反应均由环B和环A一起在一个反应中组成，并且AF不存在(反应E)或仅AF1存在(反应F)。在环B独立存在，并且AF3也存在的反应D(‘仅环B，存在AF3’，含有圆圈符号的线)中，TxR信号存在略微滞后，随后增加。这指示AF3装配Mz3，所述Mz3裂解底物3，并且由此触发Dz4活化和底物4(和底物4a)裂解事件的级联。这个信号是相较于环B与环A一起在一个反应中并且存在AF3的反应G的信号来显示。在反应C、E和F的信号之间以及在反应D和G的信号之间，TxR信号也极其类似，从而指示环A的存在极少影响环B的活性，并且Dz2自环A释放在TxR通道中不产生信号，从而显示系统中不存在相互影响或非特异性。FAM通道(对于反应F)中以及TxR通道(对于反应G)中存在的信号也指示两种靶标能够同时被检测。
在由环A或环B独立组成的反应之间，或当环A和环B一起组合在同一反应管内时，产生的荧光信号是类似的。这指示在两种环之间存在极小的非所要相互作用，并且它们可用于在检测两种独特靶标序列之后放大信号。
实施例25
以下实施例说明通过与自催化准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例19中所说明。在本实施例25中，通过靶标序列(靶标1)与BL内的底物(底物1)杂交来引发级联，所述杂交募集RE的活性以对BL选择性切口(图27，图i))。底物1和靶标1各自包含RE识别序列所需的双链体的一条链，以使两者结合在一起导致形成完整的双链识别位点。BL分子在它的5’端和3’端由与一部分DNA酶(Dz2)杂交，从而导致Dz2的暂时失活的序列组成。BL还含有邻近于底物1的第二底物序列(即底物2a)，一旦Dz2已通过靶标依赖性RE介导的底物1切口而自BL释放，所述第二底物序列即能够由Dz2裂解。此外，底物2是以线性序列形式提供，它已用荧光团和淬灭剂修饰以监测Dz2裂解反应。仅当靶标1与RE都存在时，底物1将被切口，从而引发自催化级联。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:86；C(R39c))主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:71；Dz77_55(8:9))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1和底物2a的邻近序列组成的中心部分，所述底物2a与底物2(Sub77_55，SEQ ID No:55)相同，但缺乏这个序列的3’末端的‘C’核苷酸。利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。
靶标1(SEQ ID NO:88；AF-(R38e))被用于募集RE的活性以选择性裂解BL的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2的释放，从而允许它作用于BL内存在的底物2a。Dz2也可作用于不作为准环的组分的单独的独立底物2。在这一实施例中，这种独立底物2用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑淬灭剂(“IB”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示(a)Dz中与BL中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基与(b)BL和靶标1内的部分RE识别位点两者。
-反应组分
反应A、B、C和D被设置成含有如表28中所列的以下寡核苷酸，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图27图i)中说明的结构。对于所有含有BL和Dz2的反应，最初使这两种寡聚物一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸组分。
表28
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。所有反应都含有1x PCR缓冲液II(AppliedBiosystems)、无核酸酶的水(Ambion)和25mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在52℃下在CFX96热循环仪中进行，并且在通道1(FAM)中测量荧光信号，并且被编程成每30秒进行读取(扫描模式：仅FAM)，持续总计126分钟。
-结果
图27图ii)显示了比较在存在或不存在靶标1与RE两者下的荧光信号的结果。用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物2可由Dz2裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz的释放和活化。
在反应A(‘无RE，无靶标1’，以具有方形符号的线显示)、反应B(‘无RE，存在靶标1’，以具有菱形符号的线显示)和反应C(‘存在RE，无靶标1’，以具有三角形符号的线显示)中，存在对底物2的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间极少增加。对于反应A和B，这是因为不存在RE，所以无论是否存在靶标1来与BL杂交，仍然不存在RE可用于裂解底物1，并且这一Dz2不自准环释放。对于反应C，RE是可用的，但不存在靶标1，所以RE识别位点尚不完整，并且Dz2不自准环释放。相比之下，对于反应D(‘存在RE，存在靶标1’，含有圆圈符号的线)，在整个反应过程期间，FAM信号存在逐渐增加，从而指示靶标1可与底物1杂交，并且这可导致形成双链体RE识别位点，并且因此RE能够对底物1选择性切口。底物1的切口接着导致Dz2的释放和活化，从而触发Dz2活化和底物2a裂解事件的自催化级联。因为底物2也是以独立的荧光标记形式提供，所以发生荧光信号的累积。因此，这一结果说明，利用DNA酶准环策略的自催化级联可通过RE以靶标依赖性方式进行裂解来引发。
实施例26
以下实施例说明通过与准环状结构内的互补BL分子杂交来使DNA酶失活，如先前在实施例1中所说明。在本实施例26中，通过适配酶发生对BL内的底物(底物1)的裂解(图28，图i))。适配酶由与适体结构域共价连接的DNA酶结构域(Dz1)组成。在这一实施例中，适体结合配体三磷酸脱氧腺苷(dATP)。在不存在dATP下，由于存在与Dz1共有一定碱基对同源性的适体结构域而使Dz1呈非活性的。然而，在dATP存在下，适体结构域可结合dATP，此导致适配酶结构的构象变化。这导致DNA酶结构域的构象变化，从而恢复Dz1的催化活性，以使它现在可裂解准环内的底物1。底物1的裂解导致Dz2自准环释放，由此恢复它的催化活性，并且允许它裂解它的底物(底物2)。底物2已用荧光团和淬灭剂标记以使裂解产生可检测的荧光信号。在存在密切相关的分析物(如三磷酸核苷酸dCTP、dGTP和dTTP)下，不存在荧光信号增加，从而指示在本发明中可以按靶标特异性方式活化适配酶以引发催化核酸自BL分子释放。
-寡核苷酸
在本实施例中，BL(SEQ ID NO:64；C(R43e))主要由以下各物组成：(i)与Dz2(SEQ ID NO:73；Dz3(8:10))的一部分互补的5’端和3’端以及(ii)连接所述5’端和3’端并且由底物1组成的中心部分。利用BL，通过使BL与Dz2预先杂交，来阻断Dz2的活性。当因存在dATP而活化时，适配酶分子(SEQ ID NO:87；Dz1-(R40a))被用于裂解BL的底物1部分。这一靶标依赖性裂解事件促进Dz2自BL释放，从而允许它作用于底物2(SEQ ID NO:83；Sub3)。在这一实施例中，底物2用FAM部分在5’端以及用爱荷华黑(“IB”)部分在3’端进行末端标记。
以下自5’至3’列出这些寡核苷酸的序列。大写的碱基是脱氧核糖核苷酸，而小写的碱基是核糖核苷酸。加下划线的碱基表示BL中与一部分Dz互补的区域。斜体的碱基是指对应于BL分子内的底物序列的区域。加框的碱基表示DNA酶的催化核心。用灰色突出的核苷酸表示(a)Dz2中与BL中加下划线的碱基互补并且由所述加下划线的碱基阻断的碱基与(b)适配酶内的适体结构域两者。
-反应组分
反应A、B、C、D和E被设置成含有如表29中所列的以下寡核苷酸和配体，其中参照先前章节中所列的寡核苷酸和图28图i)中说明的结构。对于所有反应，最初使BL和Dz2一起在室温下预先杂交30分钟，随后添加任何其它寡核苷酸或配体组分。
表29
寡核苷酸是自Integrated DNA Technologies(IDT)或Biosearchtechnologies购买。dATP、dCTP、dGTP和dTTP溶液是自Bioline购买。所有反应都含有1x Immobuffer(Bioline)、无核酸酶的水(Ambion)和45mM MgCl2(Ambion)。所有反应的总体积都是25μL。所有反应都一式两份在CFX96热循环仪中进行。在两步热循环方案下操作反应，第一步由42℃持续30分钟组成，而第二步是在52℃下持续60分钟。在第二步期间，每10秒在通道1(FAM)中测量荧光信号(扫描模式：仅FAM)。
-结果
图28图iii)说明由于适配酶引发准环状DNA酶结构而在dATP靶标分析物存在下特异性达成的荧光信号。用FAM荧光团和淬灭剂标记的底物2可由Dz2裂解，并且因此，可通过FAM的荧光变化来监测Dz2的释放和活化。
在反应A(‘无配体’，以具有方形符号的线显示)、反应C(‘存在dCTP’，以具有三角符号的线显示)、反应D(‘存在dGTP’，以具有圆圈符号的线显示)和反应E(‘存在dTTP’，以具有由两个垂直相交线和一个水平相交线组成的符号的线显示)中，存在对底物2的极少裂解，并且因此，FAM信号随时间极少增加。这是因为适配酶的Dz1结构域已由于存在适体结构域而成为非活性的。然而，在反应B(‘存在dATP’，含有菱形符号的线)中，FAM荧光信号存在即刻增加，从而指示dATP正结合适配酶的适体结构域，并且导致适配酶的构象变化，以使Dz1结构域现在是具有活性的。活性Dz1可接着裂解准环的BL内存在的底物1。Dz2接着自准环的BL释放，并且可裂解底物2，从而产生荧光信号增加。因存在dATP而非其它密切相关的三磷酸核苷酸分子所产生的信号指示适配酶可用作以靶标依赖性方式特异性引发催化核酸自BL分子释放的酶，并且因此可用于引发级联反应。

Claims (169)

1.一种组合物，包含：
(i)第一分子复合物，包含：第一催化核酸酶；或其催化部分；或与所述酶或所述其催化部分互补的核苷酸序列；通过互补碱基配对与第一阻断寡核苷酸(BL)杂交，其中至少一个：
所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与催化核心核苷酸互补的核苷酸与所述第一BL杂交，并且
所述第一催化核酸酶不是适配酶；
以及
(ii)能够由所述第一催化核酸催化修饰的核酸底物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与所述催化核心核苷酸互补的核苷酸；
与所述第一阻断寡核苷酸或其部分杂交。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中仅一个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与所述催化核心核苷酸互补的核苷酸；
不与所述第一阻断寡核苷酸杂交。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与所述催化核心核苷酸互补的核苷酸；
不与所述第一阻断寡核苷酸杂交。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中：
所述阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段，各自通过互补碱基配对：
与所述第一酶或所述其催化部分的不同杂交臂杂交；以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；并且
所述中间区段包含第二催化核酸酶的底物，并且所述底物中至少一段不与所述第一酶或其催化部分杂交。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述中间区段部分或完全跨越：所述第一催化核酸酶或其催化部分的所述催化核心；或所述互补核苷酸序列的与所述催化核心互补的核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述其催化部分是部件酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一阻断寡核苷酸的5’末端与所述第一催化核酸酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列的3’末端相对。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一阻断寡核苷酸的5’末端与所述第一催化核酸酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列的5’末端相对。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述中间区段包含第一底物和任选的第二底物，并且每一所述底物中至少一段不与所述第一酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列杂交。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述第一底物和所述第二底物包含不同核苷酸序列。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的组合物，其中所述中间区段还包含第三底物，所述第三底物包含与所述第一底物和所述第二底物不同的核苷酸序列，并且所述第三底物中至少一段不与所述第一酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列杂交。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中每一所述底物中至少一部分包含相同核苷酸序列。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中所述中间区段的任何所述底物都包含限制酶的部分识别位点。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述第一BL；所述第一酶或所述其催化部分；所述序列的与催化核心核苷酸互补的所述核苷酸；或所述核酸底物中的任一种被栓系于不溶性载体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述底物是借助于抗生蛋白链菌素-生物素相互作用被栓系。
17.根据权利要求10所述的组合物，还包含第二分子复合物，所述第二分子复合物包含通过互补碱基配对与第二BL杂交的所述第二催化核酸酶，其中：
所述第二BL包含各自通过互补碱基配对与所述第二酶的不同杂交臂杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；
所述中间区段任选包含所述第一底物的拷贝和第三底物，并且每一所述底物中至少一段不与所述第二酶杂交；并且
所述第一酶能够杂交和裂解所述第三底物，并且所述第二酶能够杂交和裂解所述第二底物。
18.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶具有不同底物特异性。
19.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶具有相同底物特异性。
20.根据权利要求5至19中任一项所述的组合物，其中任何所述分子复合物的所述中间区段中的核苷酸数目都超过催化核心核苷酸的数目。
21.根据权利要求5至19中任一项所述的组合物，其中任何所述复合物的所述中间区段中的核苷酸数目都等于催化核心核苷酸的数目。
22.根据权利要求5至21中任一项所述的组合物，还包含将所述第一阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述第一催化核酸酶、其催化部分或所述互补核苷酸序列的一个末端的发夹环。
23.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，包含第一阻断寡核苷酸和第二阻断寡核苷酸以及第一催化核酸酶和第二催化核酸酶，其中：
所述第一酶和所述第二酶各自包含两个独立杂交臂；
所述第一阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段，分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交；
所述第二阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段，分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交；
所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述第一区段和所述第二区段各自与不同杂交臂杂交；
所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸各自包含在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段，其中各中间区段不与所述第一酶或所述第二酶杂交；并且
所述中间区段中的任一个或两个包含催化核酸酶的底物。
24.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述第一酶、所述其催化部分或所述互补核苷酸序列的每个核苷酸都与所述第一BL杂交。
25.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述杂交的阻断寡核苷酸提供自所述第一分子复合物延伸的单链3’或5’突出区段。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述突出区段或其一部分与能够杂交所述突出部分并且使所述第一催化核酸酶或其催化部分自所述BL解离的释放寡核苷酸(RL)互补。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述释放寡核苷酸不包含与所述第一催化核酸酶或其催化部分相同的核苷酸序列。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的组合物，其中所述第一酶提供自所述复合物延伸的单链3’突出区段。
29.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，还包含将所述阻断寡核苷酸的一端连接于所述第一酶的一端的发夹环。
30.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，还包含与第二催化核酸酶杂交形成第二分子复合物的第二BL，其中：
第一发夹环将所述第一BL连接于所述第一催化核酸酶，并且第二发夹环将所述第二BL连接于所述第二催化核酸酶；
所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸提供分别自所述第一分子复合物和所述第二分子复合物延伸的单链突出区段；
所述第一分子复合物的突出区段的一部分通过互补碱基配对与所述第二分子复合物的突出区段的一部分杂交；并且
各突出区段的未杂交部分组合以形成包含与释放寡核苷酸(RL)的中间区段的碱基对互补性的区段。
31.根据权利要求25至29中任一项所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的中间区段。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸中含有限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的核苷酸不与所述第一酶杂交。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的组合物，其中所述限制性核酸内切酶识别位点是切口核酸内切酶识别位点。
34.根据权利要求29所述的组合物，其中所述发夹环包含茎，在所述茎中一条链提供可由链置换聚合酶延伸的引物的结合位点，和/或所述阻断寡核苷酸和/或所述第一酶各自被3’磷酸化。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述链置换聚合酶选自由克林诺片段、Bst、Sequenase 2.0、Vent、Phi29、Pyrophage 3137或其任何变体组成的组。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶或其部分是DNA酶、核糖酶、或MNA酶的组分。
37.根据权利要求5至22中任一项所述的组合物，其中所述第二催化核酸酶是DNA酶、核糖酶或MNA酶。
38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述DNA酶、核糖酶或MNA酶能够裂解底物。
39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述DNA酶、核糖酶或MNA酶能够裂解底物。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的组合物，其中所述第一催化核酸酶是DNA酶。
41.一种试剂盒，包括根据权利要求1至40中任一项所述的组合物。
42.一种试剂盒，包括根据权利要求5至23中任一项所述的组合物，以及以下组分中的任一种或两种：
能够在由所述第一催化核酸酶和/或所述第二催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；
对所述中间区段的底物具有特异性的引发催化核酸酶或其催化组分。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述引发催化酶是DNA酶、核糖酶、适配酶、适配MNA酶或MNA酶。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的试剂盒，其中任何所述BL都包含限制酶的部分识别位点，并且所述试剂盒还包括所述限制酶。
45.一种试剂盒，包括根据权利要求25至30中任一项所述的组合物，以及以下组分中的任何一种或多种：
包含与所述阻断寡核苷酸互补的序列并且对所述阻断寡核苷酸的与所述第一催化核酸酶互补的区域具有结合亲和力的释放寡核苷酸；
能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；
核酸外切酶；
包含与所述阻断寡核苷酸的区段互补的序列并且当与所述阻断寡核苷酸杂交时能够募集核酸外切酶活性的核酸酶识别片段。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶选自由核酸外切酶III和T7核酸外切酶组成的组。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的试剂盒，其中所述第二催化核酸酶是核糖酶、DNA酶或MNA酶。
48.一种试剂盒，包括根据权利要求31至33中任一项所述的组合物，以及以下组分中的任何一种或多种：
包含与所述阻断寡核苷酸互补的序列并且对所述阻断寡核苷酸的与所述第一催化核酸酶互补的区域具有结合亲和力的释放寡核苷酸；
能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；
对在所述释放寡核苷酸和所述阻断寡核苷酸杂交后形成的识别序列具有特异性的限制性核酸内切酶。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述识别序列中由所述释放寡核苷酸提供的组分包含硫代磷酸酯键联，从而防止所述释放寡核苷酸被所述限制性核酸内切酶裂解。
50.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述识别序列是针对切口核酸内切酶，并且所述限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
51.一种试剂盒，包括根据权利要求34或权利要求35所述的组合物，以及以下组分中的任何一种或多种：
对所述结合位点具有特异性的引物；
链置换聚合酶或其组分；
能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物。
52.一种试剂盒，包括：
通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交的第一催化核酸酶，和将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述催化核酸第一酶的一个末端的发夹环；
能够在由所述第一催化核酸酶进行催化修饰后提供可检测信号的报道底物；
对靶标分子具有特异性的引发催化核酸酶；
对所述发夹环的区段具有特异性的引物寡核苷酸；
链置换聚合酶或其组分；
对在所述引物与所述发夹环的所述区段杂交以及任选随后使用所述阻断寡核苷酸作为模板由所述链置换聚合酶延伸所述引物后形成的识别序列具有特异性的限制性核酸内切酶。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述识别序列中由所述发夹环的所述区段提供的组分包含硫代磷酸酯键联，从而防止所述区段被所述限制性核酸内切酶裂解。
54.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述识别序列是针对切口核酸内切酶，并且所述限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的试剂盒，其中所述第一酶的每个核苷酸都与所述BL杂交。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的试剂盒，其中链置换聚合酶选自由克林诺片段、Bst、Sequenase 2.0、Vent、Phi29、Pyrophage3137或其任何变体组成的组。
57.根据权利要求41至56中任一项所述的试剂盒，其中所述第一催化核酸酶是DNA酶、核糖酶或MNA酶。
58.一种用于检测样本中存在或不存在第一靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
至少一种包含BL和第一催化核酸酶的分子复合物，所述BL包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含催化核酸酶的第一底物的中间区段，其中所述第一底物中至少一段不与所述第一酶杂交；
第一引发酶和报道底物；其中，
所述第一引发酶对所述第一靶标以及所述中间区段的所述第一底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述第一引发酶的杂交诱导所述第一引发酶的催化活性，由此促进所述第一底物在与所述第一引发酶杂交时的裂解；
所述第一底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离；并且
所述分子复合物的所述第一酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后能够与所述报道底物杂交并将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述第一靶标的可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述第一靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述第一靶标分子不存在。
59.根据权利要求58所述的方法，其中与所述样本接触的所述分子复合物具有的所述阻断寡核苷酸的5’末端与所述催化核酸酶的5’末端相对。
60.根据权利要求58所述的方法，其中与所述样本接触的所述分子复合物具有的所述阻断寡核苷酸的5’末端与所述催化核酸酶的3’末端相对。
61.根据权利要求58或权利要求59所述的方法，包括使所述样本与第一分子复合物和第二分子复合物接触，其中
所述第一分子复合物包含所述BL和所述第一催化核酸酶，并且在所述第一区段与所述第二区段之间的所述中间区段包含所述第一底物和第二底物；
所述第二分子复合物包含第二BL和第二催化核酸酶，所述第二BL包含通过互补碱基配对与所述第二酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含所述第一底物的拷贝和第三底物的中间区段；
所述引发酶对所述靶标以及每一所述中间区段的所述第一底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，由此促进每一所述中间区段的所述第一底物在与所述引发酶杂交时裂解；
每一所述中间区段的所述第一底物的裂解导致每一所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；
所述第一酶对所述第三底物具有结合特异性，并且所述第二酶对所述第二底物具有结合特异性；并且
在每一所述分子复合物解离之后，所述第一酶能够杂交和裂解另一第二分子复合物的第三底物，并且所述第二酶能够杂交和裂解另一第一分子复合物的第二底物，由此放大所述可检测信号。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述第一底物、所述第二底物或所述第三底物与所述报道底物相同。
63.根据权利要求61所述的方法，其中
所述分子复合物的所述中间区段的所述底物与所述报道底物相同，并且
在自所述阻断寡核苷酸进行所述解离后，第一所述分子复合物的所述第一催化核酸酶可杂交和裂解第二所述分子复合物的所述中间区段的所述底物，
由此促进所述可检测信号的放大。
64.根据权利要求60所述的方法，其中在所述第一区段与所述第二区段之间的所述中间区段形成包含所述第一底物的所述至少一段的发夹环结构。
65.根据权利要求59所述的方法，其中所述中间区段包含第二引发催化核酸酶的第二底物，并且所述方法还包括
使所述样本与所述第二引发催化核酸酶接触；其中所述第二引发酶对靶标以及所述中间区段的所述第二底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述第二引发酶的杂交诱导所述第二引发酶的催化活性，由此促进所述第二底物在与所述第二引发酶杂交时裂解；其中
所述第二底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离，由此允许所述第一催化核酸酶与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供可检测信号。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二引发酶对不同于所述第一靶标的第二靶标具有结合特异性。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述第二引发酶对所述第一靶标具有结合特异性。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述中间区段包含第三引发催化核酸酶的第三底物，并且所述方法还包括
使所述样本与所述第三引发催化核酸酶接触；其中所述第三引发酶对靶标以及所述中间区段的所述第三底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述第三引发酶的杂交诱导所述第三引发酶的催化活性，由此促进所述第三底物在与所述第三引发酶杂交时裂解；其中
所述第三底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离，由此允许所述第一催化核酸酶与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供可检测信号。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述第三引发酶对不同于所述第一靶标和所述第二靶标的第三靶标具有结合特异性。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述第三引发酶对所述第一靶标具有结合特异性。
71.根据权利要求65至70中任一项所述的方法，其中所述中间区段的所述第一底物和所述第二底物共有共同的核苷酸区段，所述核苷酸区段包含所述第一底物的5’末端和所述第二底物的3’末端，或反之亦然。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述共同的核苷酸区段在所述第一底物的3’部分中开始，并且在所述第二底物的5’部分中终止。
73.根据权利要求59中任一项所述的方法，其中所述报道底物与所述第二底物相同，并且所述分子复合物的所述第一催化核酸酶能够杂交和裂解所述第二底物。
74.根据权利要求65至72中任一项所述的方法，其中所述报道底物不同于所述中间区段的任何所述底物，并且所述第一催化核酸酶不能杂交和裂解所述中间区段的任何所述底物。
75.根据权利要求58至74中任一项所述的方法，其中所述第一催化核酸、所述第一底物、所述第一引发酶和所述报道底物中的任何一种或多种被栓系于不溶性载体。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述中间区段的所述底物是借助于抗生蛋白链菌素-生物素相互作用栓系于所述载体。
77.根据权利要求59至76中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过以下方式来检测另一靶标：
(a)进一步使所述样本与以下各物接触：
包含另一BL和另一催化核酸酶的另一分子复合物，所述另一BL包含各自通过互补碱基配对与所述另一酶杂交的两个末端区段，以及在所述两个末端区段之间并且包含另一催化核酸酶的至少一种其它底物的中间区段，其中所述其它底物中至少一部分不与所述另一酶杂交；另一引发催化核酸酶；和另一报道底物；其中，
所述另一靶标不同于所述第一靶标，
所述中间区段的所述至少一种其它底物不同于所述第一底物，
所述另一报道底物不同于所述第一报道底物，
所述另一引发催化核酸酶不同于所述第一引发催化核酸酶，
所述另一引发酶对所述另一靶标以及所述中间区段的所述其它底物具有结合特异性，并且所述另一靶标与所述另一引发酶的杂交诱导所述另一引发酶的催化活性，由此促进所述其它底物在与所述另一引发酶杂交时裂解；
所述其它底物的裂解导致所述另一分子复合物中所述另一阻断寡核苷酸和所述另一催化核酸酶的杂交链解离；并且
所述另一分子复合物的所述另一酶对所述另一报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述另一报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述另一靶标的另一可检测信号；以及
(b)确定通过所述进一步接触是否产生另一可检测信号，其中检测到所述信号指示所述另一靶标分子存在，而未能检测到所述另一信号指示所述另一靶标分子不存在。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述另一报道底物与所述至少一种其它底物相同，并且所述另一分子复合物的所述另一催化核酸酶能够杂交和裂解所述至少一种其它底物。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述另一报道底物不同于所述至少一种其它底物，并且所述另一分子复合物的所述另一催化核酸酶不能杂交和裂解所述至少一种其它底物。
80.根据权利要求59所述的方法，其中
任何所述分子复合物的任何所述底物都包含部分限制酶识别位点，并且任何所述靶标都包含所述部分限制酶识别位点的互补部分；
所述方法还包括使所述样本与能够识别和裂解所述限制酶识别位点的限制酶接触；
所述靶标能够通过互补碱基配对与包含所述部分识别位点的所述BL杂交，由此使所述限制酶识别位点完整，借此允许所述限制酶将包含所述部分识别位点的所述BL裂解，从而导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；并且
所述分子复合物的所述催化核酸酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述靶标的可检测信号。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述报道底物与由所述分子复合物的所述催化核酸酶裂解的所述底物相同。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述报道底物不同于包含所述部分识别位点的所述底物，以及所述分子复合物的所述催化核酸酶。
83.根据权利要求58至79中任一项所述的方法，其中
任何所述引发酶都包含适体；
在不存在所述靶标下，所述适体采用阻止所述引发酶的催化活性的构象；并且
在存在所述靶标下，所述适体结合所述靶标，并且采用允许所述引发酶具有催化活性的构象，由此裂解所述分子复合物的所述底物。
84.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
报道底物；以及
至少一种包含BL和第一催化核酸酶的分子复合物，所述BL包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含适体的中间区段，其中所述适体中至少一段不与所述第一酶杂交；其中，
与所述样本接触的所述分子复合物具有的阻断寡核苷酸的5’末端与所述催化核酸酶的5’末端相对，并且在所述第一区段与所述第二区段之间的所述中间区段包含所述适体，
所述靶标对所述适体具有结合亲和力，并且所述靶标与所述适体的杂交诱导所述第一酶的催化活性，由此促进所述第一底物的裂解；
所述靶标与所述BL的所述适体部分的结合导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离；并且
所述分子复合物的所述第一酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述报道底物杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述第一靶标的可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述第一靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述第一靶标分子不存在。
85.根据权利要求58所述的用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
第一分子复合物和第二分子复合物，其中所述第一复合物包含第一BL和第一催化核酸酶，其中所述第二复合物包含第二BL和第二催化核酸酶，所述第一BL和所述第二BL各自包含通过互补碱基配对与所述酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含催化核酸酶的底物的中间区段，其中所述底物中至少一段不与所述第一酶或所述第二酶杂交；以及
引发酶，其中
所述引发酶对所述靶标以及所述第一分子复合物的所述底物具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，由此促进所述底物在与所述引发酶杂交时裂解；
所述第一分子复合物的所述底物的裂解导致所述第一分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；
所述第一分子复合物的所述催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述第二分子复合物的所述底物，从而导致所述第二分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的杂交链解离；
所述第二分子复合物的所述催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解另一所述第一分子复合物的所述底物，从而导致所述另一所述第一分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述催化核酸酶的解离；并且
所述第一分子复合物和所述第二分子复合物的任一种或两种底物是当裂解时能够提供可检测信号的报道底物；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
86.根据权利要求63或权利要求85所述的方法，其中所述第一分子复合物和所述第二分子复合物中的任一种或两种包含将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述催化核酸酶的一个末端的发夹环。
87.一种用于检测样本中存在或不存在多个靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
包含第一阻断寡核苷酸和第二阻断寡核苷酸以及第一催化核酸酶和第二催化核酸酶的分子复合物，其中所述第一酶和所述第二酶各自包含两个独立杂交臂；所述第一阻断寡核苷酸包含分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交的第一区段和第二区段；所述第二阻断寡核苷酸包含分别与所述第一酶和所述第二酶的单一杂交臂杂交的第一区段和第二区段；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述第一区段和所述第二区段各自与不同杂交臂杂交；所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸各自包含在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段，其中各中间区段不与所述第一酶或所述第二酶杂交；并且所述中间区段中的任一个或两个包含催化核酸酶的底物；和
多种引发催化核酸酶；以及多种报道底物，其中
第一引发催化核酸酶对第一靶标分子具有结合特异性，并且第二引发催化核酸酶对第二靶标分子具有结合特异性；
所述第一引发酶和所述第二引发酶对所述分子复合物的所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸中任一种或两种的所述中间区段的所述底物具有结合特异性；
每一所述靶标与每一所述引发酶的杂交诱导每一所述引发酶的催化活性，由此促进每一所述阻断寡核苷酸的所述底物在与所述引发酶杂交时裂解；
每一所述底物的裂解导致所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的杂交链自所述分子复合物的所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶的所述杂交臂解离；并且
每一所述催化核酸酶对至少一种报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后，能够与所述报道底物中至少一种杂交，并且将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述靶标分子的可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述分子复合物的所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述中间区段包含相同底物。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述分子复合物的所述第一阻断寡核苷酸和所述第二阻断寡核苷酸的所述中间区段包含不同底物。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的方法，其中所述多个靶标分子包含由不同引发酶杂交的不同靶标分子。
91.根据权利要求87至90中任一项所述的方法，其中所述多种报道底物包含不同报道底物。
92.根据权利要求87至91中任一项所述的方法，其中所述分子复合物的所述第一催化核酸酶和所述第二催化核酸酶具有不同底物特异性，并且每一所述酶杂交和裂解不同报道底物。
93.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中任何所述分子复合物都包含通过互补碱基配对与催化核酸杂交的阻断寡核苷酸(BL)，并且所述酶的至少一个但非所有催化核心核苷酸与所述BL杂交。
94.根据权利要求58至63、85或86中任一项所述的方法，其中所述接触包括使所述样本与根据权利要求1至10或17至21中任一项所述的组合物接触。
95.根据权利要求87至92中任一项所述的方法，其中所述接触包括使所述样本与根据权利要求23所述的组合物接触。
96.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
至少一种包含阻断寡核苷酸和第一催化核酸酶的分子复合物，所述阻断寡核苷酸包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与所述第一酶杂交的中间区段，其中所述阻断寡核苷酸提供自所述分子复合物延伸的单链3’或5’突出区段；以及
引发催化核酸酶、前体底物和报道底物，其中
所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供释放寡核苷酸；
所述释放寡核苷酸包含与以下各物具有碱基对互补性的序列：
由所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸提供的所述突出区段中的至少一部分；以及
通过互补碱基配对与所述分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交的所述阻断寡核苷酸的至少一部分；
所述释放寡核苷酸的核苷酸序列与所述催化核酸酶的核苷酸序列不相同；
当存在时，所述释放寡核苷酸可与所述阻断寡核苷酸杂交，从而形成双链体并由此导致所述分子复合物中所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交链解离；并且
所述分子复合物的所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述分子复合物包含将所述阻断寡核苷酸的一端连接于所述第一催化核酸酶的一端的发夹环。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述接触包括使多种所述分子复合物与所述样本接触，其中；
第一所述分子复合物的所述突出区段的一部分通过互补碱基配对与第二所述分子复合物的所述突出区段的一部分杂交；
所述释放寡核苷酸包含
与所述第一分子复合物的所述突出区段的一部分以及杂交所述第一分子复合物的所述第一催化核酸酶的所述阻断寡核苷酸的一部分具有碱基对互补性的第一区段；
与所述第二分子复合物的所述突出区段的一部分以及杂交所述第二分子复合物的所述第一催化核酸酶的所述阻断寡核苷酸的一部分具有碱基对互补性的第二区段；以及
在所述第一区段与第三区段之间并且与每一所述阻断寡核苷酸的所述突出区段的至少一部分具有碱基对互补性的中间区段；
所述释放寡核苷酸的所述第一区段对所述第一分子复合物中通过互补碱基配对与所述第一分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交的所述阻断寡核苷酸的一部分具有结合亲和力；所述释放寡核苷酸的所述第二区段对所述第二分子复合物中通过互补碱基配对与所述第二分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交的所述阻断寡核苷酸具有结合亲和力；
当存在时，所述释放寡核苷酸可与每一所述阻断寡核苷酸杂交，从而导致每一所述分子复合物中所述催化核酸和所述阻断寡核苷酸的杂交链解离；并且
每一所述分子复合物的所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
99.根据权利要求96至98中任一项所述的方法，其中所述前体底物是或包含所述靶标。
100.根据权利要求96所述的方法，另外包括通过使所述样本与核酸外切酶接触来放大所述可检测信号，所述核酸外切酶当与所述释放寡核苷酸杂交时能够消化所述阻断寡核苷酸，其中所述消化释放出所述释放寡核苷酸，所述释放寡核苷酸可接着结合第二所述分子复合物，并且引发另外的可检测信号的产生。
101.根据权利要求100所述的方法，其中通过所述释放寡核苷酸与所述阻断寡核苷酸杂交而形成的所述双链体包含具有至少四个核苷酸的3’突出区段和相对钝端。
102.根据权利要求100或权利要求101所述的方法，其中所述核酸外切酶选自ExoIII和T7核酸外切酶。
103.根据权利要求96所述的方法，另外包括通过使所述样本与切口核酸内切酶接触来放大所述可检测信号，所述切口核酸内切酶当与所述释放寡核苷酸杂交时能够裂解所述阻断寡核苷酸，由此使所述释放寡核苷酸自所述双链体释放并允许其与第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，并且引发另外的可检测信号的产生。
104.根据权利要求96所述的方法，另外包括通过使所述样本与限制性核酸内切酶接触来放大所述可检测信号，所述限制性核酸内切酶当与所述释放寡核苷酸杂交时能够裂解所述阻断寡核苷酸，由此使所述释放寡核苷酸自所述双链体释放并允许其与第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，并且引发另外的可检测信号的产生。
105.根据权利要求104所述的方法，其中
所述限制性核酸内切酶在结合由所述释放寡核苷酸和所述阻断寡核苷酸的区段形成的识别位点之后将所述阻断寡核苷酸裂解，每一所述区段都包含部分识别位点；
由所述释放寡核苷酸区段提供的所述部分识别序列包含硫代磷酸酯键联，从而防止所述释放寡核苷酸被所述限制性核酸内切酶裂解；并且
所述阻断寡核苷酸的所述部分识别位点不与所述分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交。
106.根据权利要求104所述的方法，其中
所述限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶；
所述切口核酸内切酶在结合由所述释放寡核苷酸和所述阻断寡核苷酸的区段形成的识别位点之后将所述阻断寡核苷酸裂解，每一所述区段都包含部分识别位点；并且
所述阻断寡核苷酸的所述部分识别位点不与所述分子复合物的所述第一催化核酸酶杂交。
107.根据权利要求96所述的方法，另外包括通过使所述样本与引物寡核苷酸和链置换聚合酶或其组分接触来放大所述可检测信号，其中
所述分子复合物还包含自所述阻断寡核苷酸的一个末端延伸的发夹环，其中所述第一催化核酸酶与邻近于所述发夹环末端的所述阻断寡核苷酸杂交；
所述发夹环包含茎，在所述茎中一条链提供所述引物的结合位点；
当存在时，所述阻断寡核苷酸、所述第一催化核酸酶和所述释放寡核苷酸各自被3’磷酸化；
当存在时，所述释放寡核苷酸可与所述阻断寡核苷酸杂交，从而形成双链体，由此导致所述分子复合物中所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交链解离，并且形成包含所述引物结合位点的3’突出区段；
所述引物能够与所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的新多核苷酸的合成；并且
所述合成使所述释放寡核苷酸自所述双链体释放，从而允许其与第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，并且引发另外的可检测信号的产生。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述发夹环是连接于所述阻断寡核苷酸。
109.根据权利要求96至98和权利要求108中任一项所述的方法，其中，
所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含与含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的释放寡核苷酸，并且发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述释放寡核苷酸的一个末端；
所述释放寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物中的至少一部分杂交的中间区段；并且
所述引发催化核酸酶对所述前体底物的裂解导致所述阻断寡核苷酸和所述释放寡核苷酸的杂交链解离。
110.根据权利要求96所述的方法，其中
所述前体底物是所述报道底物；
所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含通过互补碱基配对与包含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的释放寡核苷酸；
所述释放寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与所述前体底物中的至少一部分杂交的中间区段；并且
所述分子复合物的所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述前体底物，由此提供可检测信号。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述前体复合物包含将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述释放寡核苷酸的一个末端的发夹环。
112.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
至少一种包含阻断寡核苷酸和第一催化核酸酶的分子复合物，所述阻断寡核苷酸包含通过互补碱基配对与所述第一酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且不与所述第一酶杂交的中间区段，其中所述阻断寡核苷酸提供自所述分子复合物延伸的单链3’或5’突出区段；以及
引发催化核酸酶、核酸外切酶、前体底物和报道底物，其中：
所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，
所述引发酶的催化活性促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供核酸酶识别片段；
所述核酸酶识别片段包含与所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸的所述3’或5’突出区段中至少一部分具有碱基对互补性的第一区段，和至少四个核苷酸长度并且不与所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸共有碱基对互补性的第二区段；
当存在时，所述核酸酶识别片段可与所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸杂交，从而形成能够引发所述核酸外切酶对所述阻断核苷酸的降解的双链体；
所述核酸外切酶对所述双链体的降解使所述阻断核苷酸消化，从而以独立实体形式释放所述分子复合物的所述核酸酶识别片段和所述第一催化核酸；
所述第一催化核酸酶在所述降解之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；并且
所述核酸酶识别片段可结合第二所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸的所述3’或5’突出区段中的至少一部分；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
113.根据权利要求112所述的方法，其中
所述前体底物是所述报道底物；
所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含与含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的核酸酶识别片段，并且发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述释放寡核苷酸的一个末端；
所述前体复合物的所述核酸酶识别片段包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物的至少一部分杂交的中间区段；并且
在所述核酸外切酶对所述双链体的所述降解之后，所述分子复合物的所述第一催化核酸酶能够杂交和裂解所述前体底物，由此提供可检测信号。
114.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
包含通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交的第一催化核酸酶或其组分的分子复合物；
引发催化核酸酶；
前体底物，
报道底物；
第一限制性核酸内切酶；以及
链置换聚合酶或其组分；其中
所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供引物寡核苷酸；
所述阻断寡核苷酸提供自所述分子复合物延伸的单链突出区段，所述突出区段包含所述第一限制性核酸内切酶的第一部分识别位点；
所述突出区段包含形成所述引物的结合位点的核苷酸；
所述引物能够与所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第二催化核酸酶的合成；
所述第二催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；
所述引物的所述杂交和/或所述合成使所述第一部分识别位点完整，并且所述第一限制性核酸内切酶能够在所述引物与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第三催化核酸酶的合成；并且
所述第三催化核酸酶的所述合成导致所述第二催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第二催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
115.根据权利要求114所述的方法，其中由所述突出区段提供的所述部分识别位点包含硫代磷酸酯键联，从而防止其被所述限制性核酸内切酶裂解。
116.根据权利要求114所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶，并且所述突出区段包含所述切口核酸内切酶的部分识别位点。
117.根据权利要求114至116中任一项所述的方法，其中所述突出区段被修饰成形成将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述酶的一个末端的发夹环，所述发夹环中至少一个区段的相对核苷酸不共有碱基对互补性，所述发夹环的所述区段包含形成所述限制性核酸内切酶的部分识别位点和所述引物的结合位点的核苷酸。
118.根据权利要求114至117中任一项所述的方法，其中
所述前体底物是所述报道底物；
所述前体底物是前体复合物的组分，所述前体复合物包含与含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的所述引物，并且发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述引物的一个末端；
所述前体复合物的所述引物包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物的至少一部分杂交的中间区段；并且
所述第一催化核酸酶、所述第二催化核酸酶或所述第三催化核酸酶中的任何一种或多种在所述解离之后能够杂交和裂解所述前体底物，由此提供可检测信号。
119.根据权利要求114至117中任一项所述的方法，其中
所述引物寡核苷酸是前体复合物的组分，所述前体复合物包含通过互补碱基配对与包含所述前体底物的阻断寡核苷酸杂交的所述引物寡核苷酸；
所述引物寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述前体复合物的所述阻断寡核苷酸的独立区段杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与第三区段之间并且不与所述前体底物中的至少一部分杂交的中间区段；
所述引发催化核酸酶是能够在靶标存在下与所述前体底物杂交的MNA酶；并且
所述MNA酶对所述样本中所述靶标的识别促进所述MNA酶对所述前体底物的裂解，由此释放所述引物寡核苷酸。
120.根据权利要求119所述的方法，其中在所述前体复合物中，发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述引物寡核苷酸的一个末端。
121.根据权利要求114至117中任一项所述的方法，另外包括通过以下方式来放大所述可检测信号：
提供模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸包含各自含有与所述引物互补的核苷酸序列的第一5’区段和第二3’区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的中间区段；以及
使所述模板与所述引物寡核苷酸、另一限制酶，以及链置换聚合酶或其组分接触；
其中，
所述引物与所述模板的所述第一区段杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述模板互补的新链的合成；
所述引物的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整，并且提供所述引物的与所述第二区段互补的第一拷贝；并且
所述完整的部分识别位点位于所述引物的所述第一拷贝附近并在其5’端，从而形成接点，并且所述另一限制性核酸内切酶在所述接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发所述引物的与所述第二区段互补的第二拷贝的合成，并且置换所述引物的所述第一拷贝，由此引发另外的可检测信号的产生。
122.根据权利要求121所述的方法，其中
所述模板寡核苷酸是作为发夹结构的组分提供，所述发夹结构包含通过互补碱基配对与所述模板的所述第二区段和所述中间区段中的至少一部分杂交的第二链；
所述第一区段中至少一部分存在于在所述模板的一端处形成的发夹环中，所述发夹环连接所述第一链和所述第二链的末端；并且
所述第一区段的与所述引物互补的所述核苷酸序列不与所述模板或所述第二链杂交。
123.根据权利要求114至117中任一项所述的方法，另外包括通过以下方式来产生多种所述引物寡核苷酸：
提供包含以下各物的模板寡核苷酸：
包含与引发引物互补的核苷酸序列的第一5’区段；
包含与所述引物互补的核苷酸序列的第二3’区段；和
在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含限制性核酸内切酶识别位点的单链组分的中间区段；
以及使所述模板与所述引发引物、另一限制酶和链置换聚合酶或其组分接触，其中
所述引发引物与所述模板的所述第一区段杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述模板互补的新链的合成；
所述引发引物的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整，并且提供所述引物寡核苷酸的与所述第二区段互补的第一拷贝；并且
所述完整的部分识别位点位于所述引物寡核苷酸的所述第一拷贝附近并在其5’端，从而形成接点，并且所述另一限制性核酸内切酶在接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发所述引物寡核苷酸的与所述第二区段互补的第二拷贝的合成，并且置换所述引物寡核苷酸的所述第一拷贝。
124.根据权利要求121至123中任一项所述的方法，其中所述中间区段中的所述限制性核酸内切酶识别位点的所述组分包含硫代磷酸酯键联，从而防止其被所述另一限制性核酸内切酶裂解。
125.根据权利要求121至123中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
126.根据权利要求114至118中任一项所述的方法，其中
所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸还包含第二区段，所述第二区段含有与所述引物寡核苷酸互补的核苷酸序列；并且
与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的所述第二催化核酸酶的所述合成提供所述引物寡核苷酸的第一拷贝。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸的包含与所述引物互补的核苷酸序列的所述第二区段位于所述阻断寡核苷酸的包含与所述第一催化核酸酶互补的核苷酸序列的第一区段的3’端。
128.根据权利要求126或权利要求127所述的方法，其中
所述阻断寡核苷酸包含在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段，所述中间区段包含限制性核酸内切酶的第二部分识别位点；并且
与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的所述第二催化核酸酶的所述合成提供所述引物寡核苷酸的第一拷贝，并且使所述第二部分识别位点完整，所述识别位点接着能够被另一限制性核酸内切酶识别和裂解。
129.根据权利要求121至125或128中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶与所述第一限制性核酸内切酶相同。
130.根据权利要求121至125或128中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶不同于所述第一限制性核酸内切酶。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述方法还包括使所述样本与所述另一限制性核酸内切酶接触。
132.根据权利要求126至131中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶能够在所述第二催化核酸酶与所述引物的所述第一拷贝之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发所述引物的第二拷贝的合成，并且导致所述引物的所述第一拷贝自所述BL解离。
133.根据权利要求128至132中任一项所述的方法，其中限制性核酸内切酶的所述第二部分识别位点包含硫代磷酸酯键联，从而防止其被所述限制性核酸内切酶裂解。
134.根据权利要求128至133中任一项所述的方法，其中所述另一限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶。
135.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
包含通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交的第一催化核酸酶或其组分的分子复合物；
引发催化核酸酶；
前体底物，
报道底物；
具有磷酸酶活性的酶；以及
链置换聚合酶或其组分；其中
所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供在3’端包含2’3’环磷酸基团的引物寡核苷酸的非活性形式；
所述具有磷酸酶活性的酶能够自所述引物寡核苷酸的所述非活性形式移除所述2’3’环磷酸基团，由此提供所述引物寡核苷酸的活性形式；
所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸中一部分是单链，并且包含形成所述引物寡核苷酸的所述活性形式的结合位点的全部或一部分的核苷酸；
所述引物寡核苷酸的所述活性形式能够通过互补碱基配对与所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第二催化核酸酶的合成；
所述第二催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在于所述样本中，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在于所述样本中。
136.根据权利要求135所述的方法，另外包括使所述样本与限制性核酸内切酶接触，其中
所述阻断寡核苷酸的包含所述引物寡核苷酸的所述活性形式的所述结合位点的全部或一部分的所述单链区段还包含所述限制性核酸内切酶的部分识别位点；
所述引物的所述活性形式的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整；并且
所述限制性核酸内切酶能够在所述引物与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述阻断寡核苷酸具有碱基对互补性的第三催化核酸酶的合成；并且
所述第三催化核酸酶的所述合成导致所述第二催化核酸酶和所述阻断寡核苷酸的杂交区段解离，并且所述第二催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号。
137.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
包含催化核酸酶或其组分的第一模板(ASDz)的分子复合物，所述第一模板通过互补碱基配对与阻断寡核苷酸杂交；
引发催化核酸酶；
前体底物，
报道底物；
具有磷酸酶活性的酶；
限制性核酸内切酶；以及
链置换聚合酶或其组分；
所述引发酶对所述靶标具有结合特异性，并且所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此提供在3’端包含2’3’环磷酸基团的引物寡核苷酸的非活性形式；
所述具有磷酸酶活性的酶能够自所述引物寡核苷酸的所述非活性形式移除所述2’3’环磷酸基团，由此提供所述引物寡核苷酸的活性形式；
所述分子复合物的所述阻断寡核苷酸中一部分是单链，并且包含形成所述引物寡核苷酸的所述活性形式的结合位点的全部或一部分的核苷酸，其中所述结合位点包含所述限制性核酸内切酶的部分识别位点；
所述引物寡核苷酸的所述活性形式能够通过互补碱基配对与所述结合位点杂交，从而使所述部分识别位点完整，并且提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述ASDz模板具有碱基对互补性的催化核酸酶的合成，并且由此导致(i)所述BL；和(ii)所述ASDz模板的杂交区段解离；
所述限制性核酸内切酶能够在所述引物与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述ASDz模板具有碱基对互补性的第二催化核酸酶的合成；
所述第二催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述ASDz模板的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在于所述样本中，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在于所述样本中。
138.根据权利要求135至107中任一项所述的方法，其中
所述阻断寡核苷酸的所述单链部分是呈发夹环形式，所述发夹环将所述阻断寡核苷酸的一个末端连接于所述第一核酸酶的一个末端；
所述发夹环中至少一段的相对核苷酸不共有碱基对互补性；并且
所述发夹环的所述至少一段是所述引物的所述活性形式的结合位点。
139.根据权利要求135至138中任一项所述的方法，其中所述引发催化核酸酶对所述前体底物的所述催化修饰在所述引物寡核苷酸的所述非活性形式的3’端形成所述2’3’环磷酸基团。
140.根据权利要求135至139中任一项所述的方法，其中所述具有磷酸酶活性的酶是具有多核苷酸磷酸酶活性的酶。
141.根据权利要求135至140中任一项所述的方法，其中所述具有磷酸酶活性的酶是T4多核苷酸激酶。
142.根据权利要求135至141中任一项所述的方法，其中所述前体底物也是所述报道底物。
143.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
使所述样本与以下各物接触：
包含通过互补碱基配对与引物模板链杂交的阻断寡核苷酸(BL)链的发夹状引物模板，其中：
所述引物模板链包含与第一引物寡核苷酸互补的第一核苷酸区段和与第二引物寡核苷酸互补的第二核苷酸区段，以及在所述第一区段与所述第二区段中间的部分限制酶识别位点，
所述BL和所述引物模板链当通过互补碱基配对最佳地杂交在一起时包含至少一个内部错配核苷酸，并且
所述BL链和所述引物模板链是由包含未杂交核苷酸的发夹部分连接在一起，所述未杂交核苷酸提供所述第二引物寡核苷酸的结合位点；
链置换聚合酶或其组分；
第一限制性核酸内切酶；以及
对所述靶标和前体底物具有结合特异性的引发酶，其中所述靶标与所述引发酶的杂交诱导所述引发酶的催化活性，从而促进所述前体底物在与所述引发酶杂交时的催化修饰，由此产生所述第二引物寡核苷酸；
其中：
由所述引发酶产生的所述第二引物寡核苷酸通过互补碱基配对与所述发夹环部分的所述结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述引物模板链具有碱基对互补性的第一新寡核苷酸链的合成，同时使所述BL的杂交部分自所述引物模板链解离，
所述新寡核苷酸链包含初始第一引物寡核苷酸和第二引物寡核苷酸，以及位于所述第一引物寡核苷酸和所述第二引物寡核苷酸中间的部分限制酶识别位点，所述部分限制酶识别位点是所述引物模板链的所述部分限制酶识别位点的互补序列，
所述新寡核苷酸链的产生使所述引物模板链的所述部分识别位点完整，从而提供所述第一限制性核酸内切酶的裂解位点，
所述第一限制性核酸内切酶能够在所述新寡核苷酸链中引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述引物模板链的所述第一核苷酸区段具有碱基对互补性的另一第一引物的合成，并且
所述另一第一引物寡核苷酸的所述合成导致与所述引物模板链杂交的所述初始第一引物寡核苷酸的解离；以及
另外使所述样本与以下各物接触：
包含通过互补碱基配对与包含阻断寡核苷酸的第二链杂交的第一链的分子复合物，所述第一链包含第一催化核酸酶或其组分的模板，其中所述BL包含所述第一催化核酸酶的具有至少一个取代的催化核心核苷酸的部分核苷酸序列，所述部分核苷酸序列不与所述第一催化核酸酶或其组分的所述模板共有碱基对互补性，并且其中所述第一催化核酸酶或其组分在所述分子复合物的一个末端提供单链突出区段；
能够使用所述突出部分作为模板以使所述BL序列沿所述第一催化核酸酶或其组分的全长延伸的聚合酶，
第二限制性核酸内切酶和报道底物；其中
所述分子复合物的所述第一链和所述第二链是由发夹部分连接，所述发夹部分包含另一引物寡核苷酸结合位点和第二限制性核酸内切酶的另一个部分识别位点；
所述另一引物寡核苷酸能够与所述另一引物寡核苷酸结合位点杂交，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述第一链模板具有碱基对互补性的第一催化核酸酶或其组分的合成；
所述另一引物寡核苷酸的所述杂交和/或所述合成使所述另一个部分识别位点完整，并且所述第二限制性核酸内切酶能够在所述另一引物寡核苷酸与所述第二催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述第一链模板具有碱基对互补性的另一催化核酸酶或其组分的合成；并且
所述另一催化核酸酶的所述合成导致所述第一催化核酸酶和所述第一链模板的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触和所述另外接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是相同的。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是不同的。
146.根据权利要求143至145中任一项所述的方法，其中所述第一引物和所述另一引物是相同的。
147.根据权利要求143至145中任一项所述的方法，其中所述第一引物和所述另一引物是不同的。
148.一种用于检测样本中存在或不存在靶标分子的方法，所述方法包括：
(a)使所述样本与以下各物接触：
包含引物和第一阻断寡核苷酸(BL)的部分发夹状引物复合物，所述第一BL具有通过互补碱基配对与所述引物杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含催化核酸酶的第一底物的中间区段，其中
所述第一底物中至少一段不与所述引物杂交，并且
所述第一BL在所述部分发夹状引物复合物的一个末端提供第一单链突出区段；
包含第一催化核酸酶或其组分的模板链的部分发夹状分子复合物，所述模板链与第二BL杂交，其中
所述第二BL包含所述第一催化核酸酶或其组分的具有至少一个取代的催化核心核苷酸的部分核苷酸序列，所述部分核苷酸序列不与所述模板链共有碱基对互补性，
所述部分发夹状分子复合物包含含有未杂交核苷酸的发夹环部分，所述未杂交核苷酸提供所述引物复合物中所述引物的结合位点和限制性核酸内切酶的部分识别位点，并且
所述模板在所述分子复合物的一个末端提供第二单链突出区段；
第一聚合酶，其中所述第一聚合酶使用所述第一突出区段作为模板，促进所述引物链沿所述部分发夹状引物复合物中的所述第一BL的全长延伸，以形成完整发夹状引物复合物；
第二聚合酶，其中所述第二聚合酶使用所述第二突出区段作为模板，促进所述第二BL沿所述部分发夹状分子复合物中的所述模板链的全长延伸，以形成完整发夹状分子复合物；
第二催化核酸酶，能够特异性杂交和裂解所述第一BL的所述中间区段，从而导致所述第一BL和所述引物的杂交区段解离，并且所述引物在所述解离之后能够通过互补碱基配对与所述完整发夹状分子复合物的发夹环部分杂交，由此提供游离的3’羟基；
链置换聚合酶或其组分，能够使用所述游离的3’羟基来引发与所述分子复合物的所述模板链具有碱基对互补性的所述第一催化核酸酶或其组分的合成，其中所述引物寡核苷酸的所述杂交和/或所述合成使所述部分识别位点完整；
第二限制性核酸内切酶，能够在所述引物与所述第一催化核酸酶之间的接点处引入单链切口，由此提供游离的3’羟基供所述链置换聚合酶或其组分引发与所述分子复合物的所述模板链具有碱基对互补性的另一第一催化核酸酶或其组分的合成，并且所述另一第一催化核酸酶的所述合成导致所述分子复合物中所述第一催化核酸酶和所述模板链的杂交区段解离，并且所述第一催化核酸酶在所述解离之后能够杂交和裂解所述报道底物，由此提供可检测信号；以及
(b)确定通过所述接触是否产生可检测信号，其中检测到所述信号指示所述靶标分子存在，而未能检测到所述信号指示所述靶标分子不存在。
149.根据权利要求96至148中任一项所述的方法，其中任何所述分子复合物都包含通过互补碱基配对与催化核酸杂交的阻断寡核苷酸(BL)，并且所述酶的至少一个但非所有催化核心核苷酸与所述BL杂交。
150.根据权利要求96、97或99至111中任一项所述的方法，包括使所述样本与根据权利要求23至29中任一项所述的组合物接触。
151.根据权利要求98或99所述的方法，包括使所述样本与根据权利要求30所述的组合物接触。
152.根据权利要求103至106或109中任一项所述的方法，包括使所述样本与根据权利要求33至35中任一项所述的组合物接触。
153.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，包括使所述样本与根据权利要求36或权利要求37所述的组合物接触。
154.根据权利要求58至153中任一项所述的方法，其中所述靶标是所述引发催化核酸酶的催化活性所需的作为辅因子的离子化合物。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述靶标是单价或二价金属离子。
156.根据权利要求154或权利要求155所述的方法，其中所述靶标选自Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+以及Pb2+中的任何一个或多个。
157.根据权利要求100至109、112或114至117中任一项所述的方法，其中所述前体底物是或包含所述靶标分子。
158.根据权利要求58至157中任一项所述的方法，其中所述第一催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
159.根据权利要求58至158中任一项所述的方法，其中所述引发催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
160.根据权利要求87至93、95或114至142中任一项所述的方法，其中所述第二催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
161.根据权利要求114至134、136或137中任一项所述的方法，其中所述第三催化核酸酶是核糖酶、DNA酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶。
162.根据权利要求58至153中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是包含DNA、RNA、配体或其组合的核酸。
163.根据权利要求107至109、111或114至142中任一项所述的方法，其中所述链置换聚合酶或其组分选自由克林诺片段、Bst、Sequenase 2,0、Vent、Phi29、Pyrophage 3137链置换聚合酶或其任何变体组成的组。
164.根据权利要求103、106、116、125、136或137中任一项所述的方法，其中所述切口核酸内切酶选自由Nt.AlwI、Nb.BsmAI、Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、Nt.BhaIII、Nt.BsmAI、Nb.BsmI、Nt.CviPII、Nb.Mva1269I、Nt.BspQI、Nb.BtsI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI组成的组。
165.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中
所述阻断寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述第一酶或所述其催化部分的不同杂交臂杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；
所述第一阻断寡核苷酸的5’末端与所述第一催化核酸酶或其催化部分的3’末端相对，并且
所述中间区段包含适体，并且所述适体中至少一段不与所述第一酶或其催化部分杂交。
166.根据权利要求1至4所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸的一端还包含含有至少一部分自身互补性的发夹环。
167.根据权利要求5至35中任一项所述的组合物，还包含选自由DNA酶、核糖酶、适配酶、MNA酶或适配MNA酶组成的组的引发催化核酸酶或其催化组分；其中所述引发催化核酸酶或其催化组分能够催化修饰所述中间区段的所述底物。
168.根据权利要求10所述的组合物，其中所述第一酶能够催化修饰所述第一底物和/或所述第二底物。
169.根据权利要求5所述的组合物，其中所述BL的所述第一区段或所述第二区段是通过发夹环区段接合于所述第一酶或所述其催化部分的杂交臂。
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