CN117551798A - 一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组及试剂盒及其应用 - Google Patents

一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组及试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组及试剂盒及其应用，引物组包括金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对。试剂盒中包括多重PCR反应液和混合酶液，多重PCR反应液中包括所述PCR引物组。所述引物组和试剂盒利用多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测九种下呼吸道感染病原菌，该方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏度高、特异性高，显著缩短检测时间可以实现2‑3小时内出检测结果。

Description

一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组及试剂 盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组及试剂盒及其应用。
背景技术
下呼吸道感染(Low respiratory tract infections，LRTs)是常见的呼吸系统感染性疾病，其发病率居高不下造成较重的经济负担。2019年全球疾病负担数据提示，全球下呼吸道感染发病率为6295/10万，死亡率为34.3/10万，共造成249万人死亡和9720万伤残调整寿命年。下呼吸道感染的病原谱相对广泛，其中80％以上的病例经检测证实为细菌性感染。由于下呼吸道感染缺乏典型的症状和体征，相同的症状可能由不同的病原菌引起，也可能由几种病原菌混合感染引起，这就给病原菌的确定和患者的临床治疗增加了难度。因此，下呼吸道感染病原菌的准确和快速鉴定可以进行针对性治疗，提高诊疗效果，降低医疗负担，有效减少抗菌药物的使用。
目前下呼吸道感染的常见实验室检测方法包括：培养法、血清学方法和分子生物学方法。目前，培养法依然是病原菌鉴定的“金标准”。然而，该方法检测周期长，操作复杂，敏感性低，且易受使用抗菌药物的影响出现假阴性，造成漏诊甚至误诊，延误或者错失治疗最佳时机。血清学方法主要基于抗原抗体反应的原理进行检测，检测周期短，但敏感性和特异性低。
近年来，荧光定量PCR技术已成为病原早期快速诊断的重要分子生物学方法。尽管具有高特异性、敏感性和时效性，但也存在如下问题：(1)检测靶标通量低：受限于荧光通道，单管能检测病原菌种类有限；(2)成本高：多种病原菌同时检测，成本较高。因此，提供一种新的检测方法简单、低成本、准确度高、特异性好的联合检测九种下呼吸道感染病原菌方法具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组及试剂盒及其应用。本发明的引物组和试剂盒利用多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测九种下呼吸道感染病原菌，该方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏度高、特异性高，显著缩短检测时间可以实现2-3小时内出检测结果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对。
优选地，所述金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
优选地，所述铜绿假单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
优选地，所述肺炎克雷伯菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物。
优选地，所述大肠埃希菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物。
优选地，所述肺炎链球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物。
优选地，所述流感嗜血杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物。
优选地，所述嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物。
优选地，所述鲍曼不动杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物。
优选地，所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的下游引物。
优选地，所述PCR引物组还包括内参扩增引物对。
优选地，所述内参扩增引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的下游引物。
本发明中，对于上述的引物对的具有具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2-3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。
本发明中，将上述的引物对具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上均可。
本发明中，对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。
本发明中，各检测引物对可单独包装，也可以混合配成多重PCR混合液。所述多重PCR混合液中，上述各引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
第二方面，本发明提供第一方面所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组在制备检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中任意一种或至少两种的组合的试剂盒中的用途。
进一步的，所述用途为在制备联合检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒中的用途。
更进一步的，所述用途为在制备联合检测下呼吸道感染中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，所述试剂盒中包括多重PCR反应液和混合酶液，所述多重PCR反应液中含有第一方面所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组。
本发明中，所述试剂盒采用多重PCR技术在单管中同时进行前述九种下呼吸感染病原菌的检测，根据扩增及检测情况可分析判断金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染情况。
优选地，所述混合酶液中包括UDG酶或UNG酶，和Multiplex DNA聚合酶。
优选地，所述多重PCR反应液中还包括Multiplex PCR缓冲液。
本发明中，所述多重PCR反应液中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，例如：Multiplex PCR缓冲液。由于此类PCR常用试剂可经市场途径单独购得或者自行配制，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据用户实际需要配制，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
本发明中，所述混合酶液中包括UDG酶或UNG酶和Multiplex DNA聚合酶。这两种酶也可经过市场途径单独购得或者自行配制。
优选地，所述多重PCR反应液中，每条引物的浓度各自独立的为100-300nmol/L，例如可以是100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L或300nmol/L等。
本发明中，所述多重PCR反应液可自行配制，也可直接以市售的不含引物的通用多重PCR反应液与所述引物组混合后获得。例如，所述通用PCR反应液可以是在的MultiplexPCR缓冲液中，加入本发明的所述引物组和内参扩增引物对获得。
在一种实施方式中，以所述多重PCR反应液的总体积为基准，所述多重PCR反应液中每条引物的浓度为100-300nmol/L。
本发明中，所述试剂盒中还包括标本基因组提取试剂，所述标本基因组提取试剂可以市购或自行配制。
优选地，所述试剂盒中还包括阳性质控品和/或阴性质控品。
优选地，所述阳性质控品为含九种病原菌的基因组DNA和含人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA的混合物。
优选地，所述阴性质控品为TE缓冲液。
本发明中，所述阴性质控品为TE缓冲液，可单独市购或根据现有技术自行配制。
优选地，所述人DNA内参特异核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
本发明中，所述阳性质控品可单独市购或根据现有技术自行构建。
第四方面，本发明提供了第三方面所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)标本进行前处理后，提取标本基因组DNA；
(2)配制PCR混合液：根据待测样本、阳性对照和阴性对照的数量，按照比例取多重PCR反应液和混合酶液，充分混匀成PCR混合液；
(3)加样：将样品DNA、阳性质控品或阴性质控品分别加入装有所述的PCR混合液管中，加矿物油密封，获得对应的标本反应管、阳性反应管或阴性反应管；
(4)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(5)PCR反应结束后，使用全自动毛细管电泳仪分析结果。
步骤(1)中，提取样品标本基因组DNA为本领域的现有技术。
在一种实施方式中，步骤(4)中，PCR反应的条件设置如表1所示：
表1
第五方面，本发明提供第三方面所述试剂盒在制备下呼吸道感染病原菌检测产品中的用途。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的PCR引物组可以联合检测或鉴定九种下呼吸道感染病原菌，检测方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏度高、特异性高，显著缩短检测时间，可以实现2-3小时内可出检测结果。人DNA内参可以确保从核酸提取、PCR扩增的检测过程中对核酸质量进行质控，避免因核酸提取质量、PCR扩增的问题导致假阴性的问题。多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测九种下呼吸道感染病原菌，保证检测的通量且成本较低，适合疾控中心、医院及其它医疗机构使用。
附图说明
图1为本发明实施例2中的金黄色葡萄球菌的毛细管电泳分离结果图。
图2为本发明实施例2中的铜绿假单胞菌的毛细管电泳分离结果图。
图3为本发明实施例2中的肺炎克雷伯菌的毛细管电泳分离结果图。
图4为本发明实施例2中的大肠埃希菌的毛细管电泳分离结果图。
图5为本发明实施例2中的肺炎链球菌的毛细管电泳分离结果图。
图6为本发明实施例2中的流感嗜血杆菌的毛细管电泳分离结果图。
图7为本发明实施例2中的嗜麦芽窄食单胞菌的毛细管电泳分离结果图。
图8为本发明实施例2中的鲍曼不动杆菌的毛细管电泳分离结果图。
图9为本发明实施例2中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的毛细管电泳分离结果图。
图10为本发明实施例2中的阳性质控品的毛细管电泳分离结果图。
图11为本发明对比例2中引物对1的扩增效果。
图12为本发明对比例2中引物对2的扩增效果。
图13为本发明对比例2中引物对3的扩增效果。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，所述PCR引物组包括：
1)金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
2)铜绿假单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
3)肺炎克雷伯菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物。
4)大肠埃希菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物。
5)肺炎链球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物。
6)流感嗜血杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物。
7)嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物。
8)鲍曼不动杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物。
9)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的下游引物。
10)内参扩增引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的下游引物。
上述引物对的核苷酸序列如表2所示。
表2
实施例2
本实施例提供一种联合检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒。
分别合成金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对和内参扩增引物对，其核苷酸序列如表2所示。
所述试剂盒还含有阳性质控品。所述阳性质控品为含九种病原菌的基因组DNA和含人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA的混合物。
所述试剂盒还含有阴性质控品，所述阴性质控品为TE缓冲液。
所述试剂盒还含有Multiplex PCR缓冲液和Multiplex DNA聚合酶预混液(UDG)(货号E024-YBAB，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)、核酸提取试剂盒(磁珠法)(备案号：渝械备20220099，重庆巴斯德生物医药科技有限公司)。
所述试剂盒中包括多重PCR反应液和混合酶液，所述多重PCR反应液中包括所述PCR引物组，所述混合酶液中包括UDG酶或UNG酶，和Multiplex DNA聚合酶。
所述试剂盒中还包括标本基因组提取试剂，所述标本基因组提取试剂可以市购或自行配制。
所述试剂盒中还包括阳性质控品、阴性质控品，所述阳性质控品为含九种病原菌的基因组DNA和含人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA的混合物。所述人DNA内参特异核酸片段的核苷酸序列见表3中SEQ ID NO.21。可单独市购或根据现有技术自行构建。所述阴性质控品为TE缓冲液，可单独市购或根据现有技术自行配制。
表3
实施例3对试剂盒进行检测效果评价
本实施例提供一种实施例2中试剂盒的具体使用方式，将表2中所示的各检测引物对、人DNA内参扩增引物对与购于苏州近岸蛋白质科技股份有限公司的Multiplex PCR缓冲液混合均匀，获得多重PCR反应液，多重PCR反应液中各引物的浓度见表4。
表4
1、按照标准操作采集患者下呼吸道标本(痰液、肺泡灌洗液等)，采集后应立即放置于冰袋中，并马上送检。
2、标本进行前处理后，按照核酸提取试剂盒(磁珠法)说明书提取标本中DNA，获得待测DNA样本。
3、PCR反应体系配制与检测
(1)根据待测标本、阳性对照和阴性对照的数量，按照比例(多重PCR反应液16.7μL人份+混合酶液0.8μL/人份)取对应体积的多重PCR反应液和混合酶液，充分混匀成PCR混合液。
(2)根据检测需求设置排版方式，根据排版将PCR混合液加入8联管或96孔板中，每孔加PCR混合液17.5μL，并往反应孔中依次加入2.5μL的阴性质控品(TE缓冲液)、待测DNA样本和阳性质控品(含九种病原菌的基因组DNA和含人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA的混合物)，盖好盖子。
(3)充分混匀并离心。
(4)上述配制好的试剂进行反应。
4、设置PCR程序
按照PCR仪操作说明书设置PCR程序，PCR反应扩增条件见下表5。
表5
(2)PCR扩增结束后，将扩增板/管进行短暂离心，然后小心打开管盖，使用全自动毛细管电泳仪进行检测。
5、结果分析
通过检测反应产物片段大小判断样本检测结果。阴性对照管中应无反应产物片段。否则，此次实验结果无效，重新检测。阳性质控品检测反应体系中，在72-80bp和下表6所示范围内各有一反应产物片段，否则此次实验结果无效，重新检测。对于样本检测反应体系，在72-80bp范围内应有内参反应产物片段，否则，此次实验结果无效，重新检测。若样本检测结果为阳性，可以根据反应产物信号强度和对应片段大小，判定为该病原菌阳性。金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性判断方法：当金黄色葡萄球菌为阳性且耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为阴性时，判定为金黄色葡萄球菌阳性；当金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均为阳性时，判定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性。除以上情况外，其余情况均不能判定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性。整个检测流程约为2-3小时。
参见图1-图10所示的实验检测数据，各检测对象对应的片段大小值见下表6。
表6
检测对象 片段大小
金黄色葡萄球菌 105-120bp
铜绿假单胞菌 130-145bp
肺炎克雷伯菌 155-175bp
大肠埃希菌 180-200bp
肺炎链球菌 220-240bp
流感嗜血杆菌 255-275bp
嗜麦芽窄食单胞菌 280-305bp
鲍曼不动杆菌 325-350bp
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 415-445bp
人DNA内参 72-80bp
实施例4试剂盒的灵敏度和特异性分析
(1)灵敏度分析
所有菌株购于广东省微生物菌种保藏中心和中国医学菌种保藏中心(表7)。为确定试剂盒的灵敏度，分别对将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行梯度稀释，浓度分别为1×106CFU/mL、5×105CFU/mL、1×105CFU/mL、5×104CFU/mL、1×104CFU/mL、5×103CFU/mL、1×103CFU/mL、5×102CFU/mL、1×102CFU/mL，每个梯度稀释液重复3-5份样本，利用与实施例3中相同的，确定的九种下呼吸道细菌多重PCR检测体系，进行多重PCR扩增和片段分析检测，直至检测不到信号，每份进行20次的重复检测，以95％的阳性检出率水平作为最低检测下限(LOD)，即为灵敏度。
相关病原菌株如下表7所示。
表7
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本发明试剂盒的检测灵敏度，如表8所示。
表8
检测指标 LOD(CFU/mL)
金黄色葡萄球菌 5×104
铜绿假单胞菌 5×104
肺炎克雷伯菌 5×103
大肠埃希菌 1×104
肺炎链球菌 1×104
流感嗜血杆菌 1×104
嗜麦芽窄食单胞菌 5×104
鲍曼不动杆菌 5×104
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 5×104
(2)特异性分析
本发明建立的检测方法的特异性主要表现特异性引物的特异性。设计的引物都经过primer-blast比对分析，具有高度保守性和特异性，能特异性区分九种下呼吸道感染细菌。为了确定试剂盒的特异性，选择核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或易并发其他病原菌作为特异性验证样本，表9中所列病原菌株购于广东省微生物菌种保藏中心和中国医学菌种保藏中心。将1×106CFU/mL浓度以上病原菌株分别与人内参对照质粒(pUC57)混合，利用核酸提取试剂盒(磁珠法)进行核酸提取，使用与实施例3中相同的，确定的9种下呼吸道细菌多重PCR检测体系，进行多重PCR扩增和片段分析检测，验证本发明试剂盒引物设计的特异性。相关病原菌株如表9所示。
表9
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结果显示，仅能扩增出人内参条带，无其他扩增条带。从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，表明试剂盒的特异性强。
实施例5试剂盒应用于临床标本检验
选取临床微生物实验室培养及药敏试验的方法作为“参比方法”，应用本发明实施例3和一代测序技术检测痰液和肺泡灌洗液的临床标本。本次试验共检测疑似/确诊下呼吸道感染患者的痰液和肺泡灌洗液共计20例标本。标本检测结果见下表10。
表10
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根据以上检测数据可以得出，本发明方法的检测结果与培养检测方法以及一代测序检测的结果具有较高的符合性。
对比例1
本对比例提供了一系列对比引物组1-10，见下表11。
表11
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区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.1-2所示的引物替换为SEQ IDNO.22-23所示的引物获得对比引物组1。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-4所示的引物替换为SEQ ID NO.24-25所示的引物获得对比引物组2。将实施例1的引物组中SEQ IDNO.5-6所示的引物替换为SEQ ID NO.5-26所示的引物获得对比引物组3。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7-8所示的引物替换为SEQ ID NO.7-27所示的引物获得对比引物组4。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9-10所示的引物替换为SEQ ID NO.28-29所示的引物获得对比引物组5。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11-12所示的引物替换为SEQ ID NO.30-31所示的引物获得对比引物组6。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.13-14所示的引物替换为SEQID NO.32-33所示的引物获得对比引物组7。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.15-16所示的引物替换为SEQ ID NO.34-16所示的引物获得对比引物组8。将实施例1的引物组中SEQ IDNO.17-18所示的引物替换为SEQ ID NO.35-36所示的引物获得对比引物组9。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.19-20所示的引物替换为SEQ ID NO.37-38所示的引物获得对比引物组10。
最低检出限验证按照实施例4的方法进行最低检出限验证。实施例3与对比例的最低检出限对比如下表12。
表12
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由表12可知，对于样本中痕量的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
特异性验证按照实施例4的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物对的反应结果均为阴性。
由实施例4和对比例的对比可以看出，本发明的方法可以一次性检测出九种下呼吸道感染病原菌，灵敏度高，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。
对比例2
本对比例以大肠埃希菌为例，对比了不同的引物对的扩增检测效果。大肠埃希菌引物序列及筛选：对3组引物组合，先用单重PCR扩增筛选引物扩增效果，单重检测结果发现引物对3扩增效率较低，引物对1和2可以基本满足后续实验需要(如图11至图13所示)，需要加入多重PCR法中做进一步验证。将引物对1和2分别加入多重PCR体系中进行扩增，检测结果如下：
引物对1
F-1：(SEQ ID NO.39)TGCGTGAACAGGCACAGG
R-1：(SEQ ID NO.40)GTACAGGTAACTGCGGGCTTGT
引物对2
F-2：(SEQ ID NO.7)TCGACAAGCCCGCAGTTA
R-2：(SEQ ID NO.8)CGCCAATTTGCCCACAAG
引物对3
F-3：(SEQ ID NO.41)TCAGTTGGTGAGCGATGCTG
R-3：(SEQ ID NO.42)CTGTCATTACGTTGCGGATTAG
引物对1加入多重PCR体系检测结果：引物对1使得肺炎克雷伯菌扩增效率变低，可能引物对1和肺炎克雷伯菌引物对之间有竞争抑制或者有引物二聚体导致该引物对扩增效率降低，从而影响后续检测的需求。引物对2加入多重PCR体系检测结果：各引物对扩增效率基本无改变。从多方面综合考虑，选择引物对2为大肠埃希菌在多重PCR检测体系中的引物对，该体系经过反复验证，满足检测要求。
综上，本发明提供了一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组及试剂盒，所述引物组和试剂盒利用多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测九种下呼吸道感染病原菌，该方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏高、特异性高，显著缩短检测时间，可以实现2-3小时内可出检测结果。同时，以人DNA内参可以确保从核酸提取、PCR扩增的检测过程中对核酸质量进行质控，避免因核酸提取质量、PCR扩增的问题导致假阴性的问题。所述引物组和试剂盒的应用场景丰富，具有重要的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对。
2.根据权利要求1所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；
优选地，所述铜绿假单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；
优选地，所述肺炎克雷伯菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物；
优选地，所述大肠埃希菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物；
优选地，所述肺炎链球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物；
优选地，所述流感嗜血杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物；
优选地，所述嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物；
优选地，所述鲍曼不动杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物；
优选地，所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的下游引物。
3.根据权利要求1或2所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组还包括内参扩增引物对；
优选地，所述内参扩增引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的下游引物。
4.权利要求1-3中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组在制备检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中任意一种或至少两种的组合的试剂盒中的用途。
5.一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括多重PCR反应液和混合酶液，所述多重PCR反应液中含有权利要求1-3中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组。
6.根据权利要求5所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述混合酶液中包括UDG酶或UNG酶，和Multiplex DNA聚合酶。
7.根据权利要求5或6所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应液中还包括Multiplex PCR缓冲液。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应液中，每条引物的浓度各自独立的为100-300nmol/L。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性质控品和/或阴性质控品；
优选地，所述阳性质控品为含九种病原菌的基因组DNA和含人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA的混合物；
优选地，所述阴性质控品为TE缓冲液。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述人DNA内参特异核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
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