CN116179753A - 一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用 - Google Patents

一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，属于分子生物学技术领域，所述引物包括正向引物：5′‑TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG‑3′，反向异物：5′‑CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG‑3′，先建立标准曲线，然后以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增，然后将测定样品DNA的Ct值代入建立好的标准曲线中，算出靶斑病菌量，从而在烟草达到最低发病量前，施药预防烟草靶斑病的扩散和发展，对烟草靶斑病的快速检测、提前防治以及降低经济损失具有重要意义。

Description

一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用。
背景技术
靶斑病病原菌为瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk]，其无性世代为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)，病害症状易与常见的烟草赤星病和烟草野火病相混淆，造成误诊，并且病害发生速度快，一旦发生，流行迅速、危害严重，因此，需要通过田间土壤和叶片上病原积累程度与发病临界值准确分析，预测病害发生趋势，为病害防控用药时间提供依据。
现有的靶斑病定量检测体系主要是应用探针法进行检测，但是探针法存在合成周期长、合成成本高且无法利用熔解曲线分析定量结果的可信度等缺点。
因此，目前急需寻找一种合成成本低、可利用熔解曲线判定定量结果的烟草靶斑病检测方法，对烟草靶斑病进行快速检测、从而进行提前防治，降低经济损失。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，解决检测烟草靶斑病时合成周期长，合成成本高且无法利用溶解曲线分析定量结果的可信度的问题。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种烟草靶斑病菌检测引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列为：5′-TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG-3′(序列1)，所述反向引物的核苷酸序列为：5′-CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG-3′(序列2)。
本发明还公开了应用上述烟草靶斑病菌检测引物建立的一种烟草靶斑病菌的检测方法，所述检测方法如下：
A：烟草靶斑病菌基因组DNA提取：采集靶斑病侵染后的叶片提取DNA，得到烟草靶斑病菌基因组DNA；
B：模板制备：以烟草靶斑病菌基因组DNA为模板，用烟草靶斑病菌特异性引物进行常规PCR扩增，得到276bp的PCR产物，将PCR产物进行凝胶电泳后胶回收，连接到pTOPO-Blunt Simple载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性菌落过夜培养；
C：标准曲线绘制：提取含有目的DNA片段的大肠杆菌标准质粒，以10倍梯度稀释后的标准质粒作为扩增模板进行q-PCR扩增，以拷贝数的对数(lgCt)为横坐标，循环阈值(Ct)为纵坐标制作标准曲线，根据标准曲线所得数据分析拷贝数与Ct值之间的关系，并建立数学模型，检验相关性；
D：烟草靶斑病实时荧光定量PCR检测：以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行PCR扩增，将测定样品DNA的Ct值代入建立的标准曲线中，即可得到烟草靶斑病菌量，在Ct值为20.34时，靶斑病菌含量为12.01pg·μL-1，达到烟草靶斑病的最低发病菌量。
进一步，所述步骤B中凝胶电泳浓度为2％。
进一步，所述步骤B中过夜培养温度为37℃。
进一步，所述步骤D中PCR扩增体系为SYBR Green I实时荧光定量PCR检测体系。
相较于普通PCR，利用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测体系，实时荧光定量PCR能够检测到浓度为1×10-3ng·μL-1的标准质粒，是常规PCR灵敏度的100倍，提高对烟草靶斑病的检测灵敏度。
进一步，所述步骤D中SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增反应体系为：2×SYBR荧光定量混合液10μL，10μmol/L正、反向引物各1μL，待测DNA样品1μL，ddH2O补足至20μL。
进一步，所述步骤D中SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增反应条件为：98℃预变性30s；扩增循环40×(98℃10s，55℃10s，72℃10s)；72℃延伸10min。
进一步，所述步骤D中PCR扩增产物长度为276bp。
进一步，所述烟草靶斑病菌检测引物在检测烟草靶斑病菌中的应用。
有益效果：
1.本发明公开的一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，公开的引物在检测烟草靶斑病菌时，特异性强，灵敏度高，可以很好的对烟草靶斑病菌进行检测。
2.本发明公开的一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，通过以田间待测烟草DNA为模板，利用正、反向引物进行PCR扩增，将测定样品DNA的Ct值代入建立好的标准曲线中，得到靶斑病菌量，可在烟草达到最低发病菌量之前施药进行预防，为烟草靶斑病菌病害的发生提供早期预警，早期防治后用药少，防治效果明显，该引物在烟草靶斑病害预测预报中有非常好的应用前景。
3.本发明公开的一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，设计了实时荧光定量检测引物，实时荧光定量检测引物合成成本低，可利用熔解曲线判定定量结果的可信度，利用该引物对田间烟草靶斑病高发地进行检测，可对烟草靶斑病发生节点进行较为准确的预测，对烟草靶斑病快速检测、提前防治以及降低经济损失具有重要意义。
附图说明
图1：为本发明正、反向引物的引物实时荧光定量PCR扩增曲线；
图2：为本发明绘制的标准曲线图；
图3：为本发明引物特异性检测中PCR扩增产物电泳图；
图4：为本发明灵敏性分析中PCR扩增产物电泳图；
图5：为本发明烟草靶斑病菌接种示意图；
图6：为本发明K326叶片接种烟草靶斑病菌菌饼不同天数靶斑病菌含量检测图；
图7：为本发明实验二中田间采样定量测定图；
图8：为本发明实验二中田间病叶图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：
下述实施例和实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：特异性引物筛选
提取烟草靶斑病菌DNA,利用真菌ITS通用引物ITS4/5进行普通PCR扩增，回收扩增片段后送至北京擎科生物科技有限公司测序。将测序结果在NCBI上进行序列比对，BLAST结果显示其与烟草靶斑病菌Rhizoctonia solani AG-3菌株相似性达到100％。利用DNAMAN9.0软件将测序结果与NCBI中烟草赤星病菌、烟草棒孢霉叶斑病菌等rDNA-ITS区序列进行序列比对，寻找三种病原菌rDNA-ITS区序列的差异位点，再利用Primer3web version4.1.0设计特异引物，设计得到正向引物：5′-TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG-3′(序列1)，反向引物：5′-CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG-3′(序列2)。
实施例2：烟草靶斑病菌检测方法：
A：烟草靶斑病菌基因组DNA的提取：采集田间靶斑病侵染后的叶片，取0.1g叶片样品在液氮中快速研磨成粉状，加入1mL65℃预热好的CTAB置于65℃水浴裂解45-60min，每10min混匀一次，于4℃条件下12000r/min离心15min；吸取上清液800μL，在上清液中加入等体积的酚：氯仿：异丙醇(25:24:1)溶液充分颠倒混匀后4℃条件下12000r/min离心13min，重复操作两次；取上清液600μL，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，于-20℃放置2h；于4℃条件下12000r/min离心15min，弃上清，用移液器将剩余液体吸干，管底的沉淀物用70％的乙醇充分洗涤两次，12000r/min离心3min，弃上清，用移液器将剩余液体吸干，放置3-5min待乙醇挥发后，加入60μL ddH2O溶解沉淀DNA，得到烟草靶斑病菌基因组DNA；
B：模板制备：以步骤A中提取的烟草靶斑病菌基因组DNA为模板，用烟草靶斑病菌特异性引物进行常规PCR扩增，得到276bp的PCR产物，将PCR产物进行2％凝胶电泳后胶回收，连接到pTOPO-Blunt Simple载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性菌落37℃过夜培养，将含有目的DNA片段的菌液送至北京擎科生物科技有限公司进行测序；
C：标准曲线绘制：提取含有目的DNA片段的大肠杆菌标准质粒，以10倍梯度稀释后的标准质粒作为扩增模板，采用SYBR qPCR Master Mix(购自重庆葆光生物技术有限公司)推荐的反应体系进行q-PCR扩增，以拷贝数的对数(lgCt)为横坐标，循环阈值(Ct)为纵坐标制作标准曲线，根据标准曲线所得数据分析拷贝数与Ct值之间的关系，并建立数学模型，检验相关性；
D：烟草靶斑病实时荧光定量PCR检测：以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增(扩增反应体系：2×SYBR荧光定量混合液10μL，10μmol/L正、反向引物各1μL，待测DNA样品1μL，ddH2O补足至20μL；反应体系条件：98℃预变性30s；扩增循环40×(98℃10s，55℃10s，72℃10s)；72℃延伸10min)，产物长度为276bp，将测定样品DNA的Ct值代入建立好的标准曲线中，得到靶斑病菌量。
结果分析：
绘制的标准曲线如图2所示：标准曲线为y＝-3.5574x+27.74，R2为0.9954，说明其线性程度非常高，准确性也非常高。
实施例3：特异性检测
实施例3对序列1和序列2所示的引物的特异性进行检测，具体步骤如下：
(1)对烟草上常见的真菌的DNA进行提取，常见真菌包括靶斑病菌、赤星病菌、棒孢霉，具体提取方法如下：
S1：将靶斑病菌、赤星病菌、棒孢霉在固体PDA活化后，挑取菌盘接种到液体PDA培养基中，培养7天后收集菌丝，用灭菌滤纸压干后用于提取基因组DNA；
S2：分别取200mg的菌丝体，放入研钵中，液氮研磨至粉末状，把研磨好的样品放入到已在液氮中预冷的1.5mL离心管中，每管约0.1g；加入400μL DNA裂解缓冲液(100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB)，65℃水浴40min，每10min颠倒混匀一次；冷却至室温后加入200μL苯酚、192μL氯仿以及8μL异戊醇并颠倒混匀，然后4℃、12000rpm离心10min；吸取上清，转移至新离心管中，加入1/10体积的CTAB-NaCl溶液轻轻混匀，取等体积苯酚/氯仿/异戊醇轻轻混匀，4℃、12000rpm离心10min；吸取上清后转移至新离心管中，再加入等体积的冰冻异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀，置于-20℃，15-30min后，4℃、12000rpm离10min；倒掉上清，加入1mL70％乙醇洗涤沉淀2次，沉淀晾干后加入100μL TE，37℃过夜，取出在-20℃保存；
(2)以步骤(1)中提取的3种基因组DNA为模板，序列1和序列2所示正、反向引物分别进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL，其中DNA模板2.0μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，2×Es Taq MasterMix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，PCR扩增程序为：98℃预变性5min；扩增循环35×(94℃30s，55℃30s，72℃30s)；72℃终延伸10min。
结果分析：
PCR扩增电泳后结果如图3所示：其中M：DL 2000DNA marker；泳道1：靶斑病菌DNA；泳道2：赤星病菌DNA；泳道3：棒孢霉DNA；N：阴性对照(ddH2O)，靶斑病菌在276bp扩增出了单一条带(泳道1)，而其他供试菌株均未扩增出特异性条带(泳道2-3)，表明本发明所设计的引物具有很好的特异性，可用于烟草靶斑病的特异性检测。
实施例4：灵敏性分析
实施例4对序列1和序列2所示的引物的灵敏性进行检测，具体步骤如下：
(1)DNA浓度稀释：以1×102ng·μL-1为标准质粒DNA浓度，按照10倍浓度依次进行稀释得到1×102ng·μL-1、1×10ng·μL-1、1×1ng·μL-1、1×10-1ng·μL-1、1×10-2ng·μL-1、1×10-3ng·μL-1、1×10-4ng·μL-1、1×10-5ng·μL-1共8个浓度；
(2)PCR扩增灵敏性检测：PCR扩增体系为25μL，其中DNA模板2.0μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，2×Es Taq MasterMix 12.5μL，ddH2O 9.5μL；PCR扩增程序为：98℃预变性5min；扩增循环35×(94℃30s，55℃30s，72℃30s)；72℃终延伸10min，之后取10μL PCR扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统对电泳结果进行拍照分析；
结果分析：
检测结果如图4所示：其中M：DL 2000DNA marker；泳道1-8：DNA浓度分别为1×102ng·μL-1、1×10ng·μL-1、1×1ng·μL-1、1×10-1ng·μL-1、1×10-2ng·μL-1、1×10-3ng·μL-1、1×10-4ng·μL-1、1×10-5ng·μL-1；N：阴性对照(ddH2O)，利用本发明所设计的正向引物(序列1)和反向引物(序列2)可以扩增出一条276bp的特异性条带(泳道1-4)，而在DNA浓度为1×10-2ng·μL-1、1×10-3ng·μL-1、1×10-4ng·μL-1、1×10-5ng·μL-1时，未能扩增出目的条带(泳道5-8)，说明该PCR反应的最小检测浓度为1×10-1ng·μL-1。
实验一：烟草靶斑病菌最低发病菌量测定实验
采用K326烟草叶片进行最低发病菌量测定，用针均匀刺伤烟草叶片，造成伤口，然后将活化15d的直径为1cm2的靶斑菌菌饼接种在烟草叶片上，以同等大小的水琼脂培养基接种健康烟草叶片为对照，设置三个生物学重复，接种后密封放置于室内室温26℃条件下进行观察；从0h开始每间隔24h取一次样，取两个接种菌饼之间的叶片样品0.1g(如图5所示)检测靶斑病菌含量，同时观察接种处发病情况，以病斑出现前一次取样的病菌含量为最低发病菌量，得到结果如图6所示。
结果分析：
1.根据图6可知：24-72h之间含菌量变化较小，没有显著性差异，接种处无病斑出现；第96h与第24h相比，含菌量显著上升，并且有较大的病斑出现，在72h时，即Ct值为20.34，靶斑病菌含量为12.01pg·μL-1时，达到了烟草靶斑病的最低发病菌量。
实验二：烟草靶斑病菌检测引物的应用验证实验
于田间进行烟草靶斑病菌检测引物的应用的验证，从烟草的团棵期开始，每隔5天对田间烟草叶片进行取样，提取叶片DNA，以提取的叶片DNA为模板，利用正、反向引物进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增(扩增反应体系：2×SYBR荧光定量混合液10μL，10μmol/L正、反向引物各1μL，待测DNA样品1μL，ddH2O补足至20μL；反应体系条件：98℃预变性30s；扩增循环40×(98℃10s，55℃10s，72℃10s)；72℃延伸10min)，根据扩增曲线读取Ct值，观察不同Ct值下烟草的情况，得到结果如图7、8所示。
结果分析：
在检测的Ct值达到19-23后一周，田间叶片即有靶斑病的明显症状(图7、8)，说明建立的体系可用于检查测田间烟草靶斑病的发病节点。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (9)

1.一种烟草靶斑病菌检测引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列1所示，所述反向引物的核苷酸序列如序列2所示。
2.应用权利要求1所述引物建立的烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述方法如下：
A：烟草靶斑病菌基因组DNA提取：采集靶斑病侵染后的叶片提取DNA，得到烟草靶斑病菌基因组DNA；
B：模板制备：以烟草靶斑病菌基因组DNA为模板进行PCR扩增得到PCR产物，将PCR产物进行凝胶电泳后胶回收，连接到载体上，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性菌落过夜培养；
C：标准曲线绘制：提取含有目的DNA片段的大肠杆菌标准质粒，以10倍梯度稀释后的标准质粒作为扩增模板进行q-PCR扩增，绘制标准曲线；
D：烟草靶斑病菌实时荧光定量PCR检测：以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行PCR扩增，将测定样品DNA的Ct值代入建立的标准曲线中，即可得到烟草靶斑病菌量，在Ct值为20.34时，靶斑病菌含量为12.01pg·μL-1，达到烟草靶斑病的最低发病菌量。
3.根据权利要求2所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤B中凝胶电泳时凝胶浓度为2％。
4.根据权利要求3所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤B中过夜培养温度为37℃。
5.根据权利要求4所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤D中PCR扩增体系为SYBR Green I实时荧光定量PCR检测体系。
6.根据权利要求5所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤D中SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增反应体系为：2×SYBR荧光定量混合液10μL，10μmol/L正、反向引物各1μL，待测DNA样品1μL，ddH2O补足至20μL。
7.根据权利要求6所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤D中SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增反应条件为：98℃预变性30s；扩增循环40×(98℃10s，55℃10s，72℃10s)；72℃延伸10min。
8.根据权利要求7所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤D中PCR扩增产物长度为276bp。
9.如权利要求1所述烟草靶斑病菌检测引物在检测烟草靶斑病菌中的应用。
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